Microsoft PowerPoint - 染色體異常分析

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1 基 因 毒 性 試 驗 基 因 毒 性 試 驗 ( 毒 性 試 驗 規 範 ) 目 的 : 偵 測 化 合 物 直 接 或 間 接 引 發 之 基 因 傷 害 與 程 度 基 因 突 變, 廣 泛 性 的 染 色 體 缺 失 或 重 組, 或 染 色 體 數 量 改 變 等 基 因 損 害 皆 可 能 會 導 致 遺 傳 疾 病 或 體 細 胞 之 變 性. 試 驗 物 質 會 導 致 上 述 傷 害, 則 該 產 品 可 能 為 人 體 致 癌 物 或 致 突 變 原, 可 能 會 導 致 癌 症 或 遺 傳 缺 陷 基 因 毒 性 試 驗 有 助 於 預 測 試 驗 物 質 的 致 癌 性, 且 有 助 於 致 癌 性 試 驗 的 結 果 分 析 基 因 毒 性 試 驗 可 分 為 活 體 與 體 外 測 試, 測 試 指 標 包 括 基 因 突 變, 染 色 體 變 異 或 基 因 損 害 等 1

2 參 考 指 標 基 因 毒 性 測 試 方 法 ( 毒 性 試 驗 規 範 ) 測 試 方 法 基 因 突 變 1. Gene mutation test with bacteria 2. Gene mutation test with mammalian cells in culture 3. Test with Drosophila melanogaster 4. Spot test with mice 5. Specific locus test with mice 染 色 體 變 異 1. Chromosomal aberration test with mammalian cells in culture 2. Chromosomal aberration test with bone marrow cells or rodents 3. micronucleus test with rodents 4. Chromosomal aberration test with genotypes of rodents 5. Dominant lethal test with rodent 基 因 受 損 6. Reciprocal translocation test with mice 1. Phage induction test with bacteria 2. DNA repair test with bacteria 3. Unscheduled DNA synthesis test (UDS) with mammalian cells 4. Sister chromatid exchange (SCE) test with mammalian cells 其 他 測 試 1. Mitotic recombination and gene conversion test with yeast 2. Sperm abnormality test 綜 合 基 因 毒 性 試 驗 ( 毒 性 試 驗 規 範 ) 測 試 項 目 微 生 物 突 變 分 析 體 外 哺 乳 類 細 胞 遺 傳 毒 性 分 析 測 試 方 法 1. 細 菌 基 因 突 變 測 試 法 (Ames test) 1. 體 外 哺 乳 類 細 胞 的 染 色 體 異 常 分 析 法 (In vitro chromosomal aberration test with mammalian cells in culture) 2. 體 外 鼷 鼠 淋 巴 瘤 tk 分 析 法 (In vitro mouse lymphoma tk assay) 動 物 活 體 基 因 毒 性 分 析 1. 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 染 色 體 異 常 測 試 法 (Chromosomal aberrations in bone marrow cells of rodents) 2. 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 之 微 核 測 試 法 (Micronuclei in bone marrow cells of rodents) 3. 囓 齒 類 周 邊 血 液 之 微 核 測 試 法 (Micronuclei in peripheral blood of rodents) 2

3 Office of Food Additive Safety Redbook 2000 Toxicological Principles for the Safety Assessment of Food Ingredients July 7, 2000 Short-Term Tests for Genetic Toxicity Genetic changes known to be associated with adverse human health effects include gene mutations, chromosomal rearrangements or deletions, and loss or gain of whole chromosomes (aneuploidy 染 色 體 不 正 常 ) or chromosomal segments. Genotoxicity tests are in vitro and in vivo tests designed to detect compounds that induce genetic damage. 3

4 Recommended Tests 1. A test for gene mutations in bacteria 2. An in vitro test with cytogenetic evaluation of chromosomal damage using mammalian cells or an in vitro mouse lymphoma thymidine kinase +/- gene mutation assay 3. An in vivo test for chromosomal damage using mammalian hematopoietic cells. The mutation assays specified in the standard battery are capable of detecting different spectra of genetic damage. The tests for gene mutations in bacteria detect point mutations which involve substitution, addition, or deletion of one or a few DNA base pairs. Point mutations may also be detected in in vitro mammalian cell mutagenicity assays. The mouse lymphoma tk +/- assay specified in the battery also detects large deletions, translocations, mitotic recombination/gene conversion and aneuploidy in addition to point mutations, making this the assay with the broadest spectrum of detectable genetic damage in the battery. 4

5 Mouse Lymphoma Thymidine Kinase Gene Mutation Assay An in vitro mammalian cell gene mutation test can be used to detect gene alterations induced by chemical substances. While there are a number of cell lines that can be used, the L5178Y TK+/ C mouse lymphoma cell line using the thymidine kinase (TK) gene is the cell line and assay of choice. The assay detects mutations known to be important in the etiology of cancer and other human genetically mediated illnesses. There is evidence that the assay detects gene mutations (point mutations) and chromosomal events (deletions, translocations, mitotic recombination/gene conversion and aneuploidy). The efficiency of detection of all of these mutational events is still under investigation. Other in vitro mammalian gene mutation assays exist including those that use either Chinese hamster cell lines (CHO, AS52, and V79) or human lymphoblastoid cells (TK6). In these cell lines the most commonly used genetic endpoints measure mutation at either the hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HPRT), a transgene of xanthineguanine phosphoribosyl transferase (XPRT), or TK. The TK, HPRT and XPRT mutation tests detect different spectra of genetic events. The autosomal location of TK allows for the detection of genetic events that are not detected at the HPRT locus on the Xchromosome 5

6 細 胞 基 因 突 變 分 析 將 細 胞 (tk+/-) 先 以 測 試 樣 品 處 理, 然 後 再 經 篩 選 藥 物 的 篩 選, 如 此, 只 有 突 變 細 胞 (tk- /-) 可 形 成 菌 落 經 由 觀 察 細 胞 群 落 生 成 數 目 的 多 寡, 即 可 判 斷 受 測 試 物 質 致 突 變 能 力 的 強 弱 同 時, 經 由 細 胞 群 落 的 大 小, 也 可 以 區 分 出 來 各 種 不 同 形 態 的 遺 傳 物 質 改 變 的 細 胞 Principle of the Test Method Cells deficient in thymidine kinase (TK) due to the mutation TK +/- to TK -/- are resistant to the cytostatic effects of the pyrimidine analogue trifluorothymidine (TFT). TK +/- cells are sensitive to TFT, which causes the inhibition of cellular metabolism and halts further cell division. Thus, mutant cells are able to proliferate in the presence of TFT, whereas normal cells, which contain the TK enzyme, are not. 6

7 原 理 : 細 胞 基 因 突 變 分 析 ( 一 ) 1. TK (TK6, L5178Y) -- trifluorothymidine 敏 感 TK +/- TK -/- 2. HPRT(V79) -- 6-thioguanine 敏 感 HPRT + HPRT - 在 哺 乳 類 細 胞 中, 有 兩 段 基 因 常 被 用 來 作 為 研 究 對 象, 一 是 與 purine salvage pathway 所 需 的 酵 素 hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase 有 關 的 hgprt 基 因 另 一 段 則 是 與 thymidine kinase 的 作 用 有 關 的 tk 基 因 二 者 在 致 變 異 實 驗 的 結 果 上, 並 無 明 顯 的 差 異 因 為 以 tk 基 因 進 行 實 驗 時, 其 express time 較 短, 故 以 tk 基 因 進 行 致 變 異 試 驗 7

8 細 胞 基 因 突 變 分 析 ( 二 ) 嘌 呤 嘧 定 合 成 主 要 途 徑 folic acid reductase aminopterin X 嘧 定 合 成 次 要 途 徑 嘌 呤 合 成 次 要 途 徑 TK + thymidine kinase HPRT + hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase 新 合 成 的 DNA Preparation of Target Cells L5178Y cells will be cultured for 24 hours in the presenceof thymidine, hypoxanthine, methotrexate and glycine to poison the TK-/- cells. 經 由 要 藥 物 (CHAT) 溶 液 篩 選 後 得 到 的 tk+/- 細 胞, 須 再 經 CHT 溶 液 處 理, 讓 細 胞 恢 復 正 常 的 生 長, 然 後 再 逐 漸 地 置 換 掉 CHT 溶 液, 此 時, 細 胞 才 可 用 於 下 一 步 驟 的 藥 物 處 理 8

9 細 胞 基 因 突 變 分 析 ( 二 ) L5178Y TK+/- 自 發 性 突 變 株 去 除 Treated with mutagen (-S9) Treated with mutagen (+S9) Resuspended in growth medium for 72 hours Resuspended in growth medium for 72 hours Plated at low density w/n selective agent Plated at high density with selective agent Plated at low density w/n selective agent Plated at high density with selective agent P.E. C.E. P.E. C.E. M.F. M.F. CHAT +Sample + 篩 選 試 劑 (TFT) 9

10 篩 選 試 劑 的 作 用, 主 要 是 讓 tk-/- 細 胞 能 夠 長 出 細 胞 群 落, 而 tk+/- 細 胞 則 不 能 在 篩 選 試 劑 的 選 擇 上,6-thioguanine (6- TG) ouabain (OUA) 和 trifluorothymidine (TFT) 等, 因 為 具 有 對 特 殊 細 胞 的 專 一 性, 所 以 最 普 遍 通 常, 我 們 以 trifluorothymidine (TFT) 來 篩 選 tk-/- 突 變 株 的 生 成 tk 基 因 所 引 起 的 突 變 可 分 為 兩 類 : 十 天 時 觀 察 所 得 的 normal growth mutants (NG) Normal growth tk-/- mutants 可 能 是 由 鹼 基 對 被 取 代 frame shift 或 是 基 因 序 列 的 插 入 或 缺 失 所 引 起 二 十 天 時 觀 察 所 得 的 slow growth mutants (SG) slow growth tk-/- mutants 則 是 因 為 整 段 tk 基 因 的 改 變 造 成, 可 能 是 經 由 基 因 conversion/recombination 的 機 制 而 造 成 整 段 DNA 的 被 刪 除 10

11 以 此 方 法 來 測 試 致 變 異 研 究 時, 須 注 意 有 偽 陽 性 及 偽 陰 性 結 果 的 出 現 偽 陽 性 結 果 是 測 試 樣 品 本 身 並 不 具 有 致 突 變 性, 但 是 由 於 測 試 時 ph, osmolality 的 改 變, 或 是 因 為 樣 品 本 身 毒 性 極 高 而 造 成 偽 陰 性 結 果 的 發 生, 則 是 因 為 樣 品 作 用 機 制 的 不 同, 導 致 的 致 變 異 效 應, 不 能 由 使 用 的 測 試 方 法 所 測 得, 故 即 使 樣 品 本 身 是 致 癌 物, 但 仍 得 到 負 結 果 這 些 問 題, 是 實 驗 者 在 從 事 測 試 時 應 注 意 的 11

12 This protocol has been written to comply with OECD Guideline for the Testing of Chemicals, Guideline 476 (In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test), July 年 Scott 等 人 已 經 探 討 過 細 胞 的 基 因 毒 性 包 括 ph 值 在 動 物 實 驗 暴 露 酸 霧 滴 的 基 因 作 用 和 有 關 效 應 目 前 尚 無 詳 細 資 料 可 以 利 用, 然 而 ph 值 減 少 引 起 的 效 應 已 經 被 探 討 了 1983 年 Singer and Grunberger 等 人 發 現 低 的 ph 值 會 增 加 萃 取 DNA 的 去 嘌 呤 化 程 度 (depurination),1986 年 Brusick 等 人 發 現 極 端 的 ph 值 將 會 減 少 DNA 複 製 與 酵 素 修 補 作 用 時 的 精 確 度 但 低 的 ph 值 並 不 會 影 響 鼠 傷 寒 桿 菌 (Salmonella typhimurium) 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) Neurospora crassa 或 酵 母 菌 (Saccharomyces cerevisiae) 點 突 變 的 頻 率, 可 是 會 使 酵 母 菌 產 生 基 因 倒 轉 (conversion), 蠶 豆 (Vicia faba) 根 尖 發 生 染 色 體 缺 失 和 曾 受 低 ph 值 環 境 處 理 的 海 膽 精 蟲 產 下 之 胎 兒 與 後 代 會 有 異 常 的 有 絲 分 裂 發 生 在 哺 乳 動 物 的 研 究 發 現, 低 ph 值 狀 況 下 似 乎 僅 在 有 S9 基 因 者 會 增 加 基 因 毒 性 效 應 1986 年 Brusick 等 人 發 現 只 有 在 含 有 S9 的 中 國 倉 鼠 卵 巢 細 胞 暴 露 在 低 ph 值 之 下 會 導 致 染 色 體 缺 失, 然 而 Morita 等 (1989) 發 現 在 相 同 的 細 胞 不 含 S9, 低 ph 值 (5.5 或 更 低 ) 之 下 亦 有 染 色 體 缺 失 的 現 象, 但 含 S9 會 增 加 此 效 應 在 ph 值 為 5.1 下 大 鼠 (rat) 淋 巴 球 的 培 養 不 管 有 沒 有 S9 都 沒 有 染 色 體 異 常 在 小 鼠 (mouse) 淋 巴 球 L5178Y 細 胞 發 現 暴 露 低 ph 值 不 管 有 沒 有 S9 都 會 導 致 染 色 體 突 變 12

13 染 色 體 突 變 Mitosis 有 絲 分 裂 (mitosis) Interphase 細 胞 週 期 13

14 染 色 體 玻 片 製 作 加 入 秋 水 仙 素 於 有 絲 分 裂 中 期 之 圓 亮 細 胞 ( 抑 制 紡 綞 絲 形 成 ) 加 入 低 張 溶 液 (0.075M KCl) 後 細 胞 膨 脹 加 入 固 定 液 : 甲 醇 / 冰 醋 酸 mixture 細 胞 分 散 於 玻 片 上, 細 胞 脹 破, 染 色 體 散 佈 開 來 Simple stain 染 色 體 玻 片 染 色 方 法 G-banding C-banding Q-banding 14

15 染 色 體 異 常 分 析 測 試 項 目 形 成 原 因 測 試 系 統 分 析 方 法 染 色 體 結 構 變 異 (Chromosomal aberration, CA) 姊 妹 染 色 分 體 交 換 (Sister chromatid exchange, SCE) 微 核 測 試 (Micronucleus test, MN) 染 色 體 斷 裂, 缺 失 或 重 組 染 色 體 斷 裂 與 修 復 染 色 體 斷 裂, 或 紡 錘 絲 損 壞 1. 體 內 測 試 : lymphocyte 2. 體 外 測 試 : 哺 乳 類 細 胞 株 1. 體 內 測 試 : lymphocyte 2. 體 外 測 試 : 哺 乳 類 細 胞 株 1. 體 內 測 試 :bone marrow or peripheral bood 2. 體 外 測 試 : 哺 乳 類 細 胞 株 1. 收 集 藥 物 處 理 後 之 分 裂 細 胞 2. 製 作 染 色 體 玻 片 3. Giemsa stain 1. 收 集 藥 物 處 理 後 之 分 裂 細 胞 2. 製 作 染 色 體 玻 片 3. differential stain 1. 收 集 藥 物 處 理 後 之 細 胞 2. 直 接 抹 片 後 觀 察 3. acridine orange stain 測 試 細 胞 劑 量 範 圍 測 試 系 統 ( 染 色 體 變 異 與 姊 妹 染 色 分 體 交 換 ) -lymphocyte -Chinese hamster ovary cell (CHO), Chinese hamster lung(v79) ( 優 點.. 分 裂 時 間 短 / 染 色 體 大 但 數 目 少 / 穩 定 之 染 色 體 核 型 ) -quality control: * Colony forming efficiency: % * Spontaneous mutation frequency: 0-20 x 10-6 最 高 劑 量 :50% 細 胞 抑 制 濃 度 ( 收 集 足 夠 之 分 裂 細 胞 ) 採 樣 時 間 Background frequency Positive control 染 色 體 變 異 : 藥 物 處 理 後 第 一 次 有 絲 分 裂 期 (M1) 姊 妹 染 色 分 體 交 換 : 藥 物 處 理 後 第 二 次 有 絲 分 裂 期 (M2) 染 色 體 變 異 :< 1%, 姊 妹 染 色 分 體 交 換 : < 15 SCE/cell Direct acting (no activation needed) -ethyl methanesulfonate (EMS), mitomycin Promutagen (requiring activation): cyclophosphamide 15

16 染 色 體 變 異 (chromosomal aberration) 測 試 項 目 : 染 色 體 結 構 之 變 異 結 構 變 異 :deletion, duplication, inversion, translocation 一 般 毒 性 測 試 主 要 觀 察 缺 失 (deletion) 與 交 換 (exchange) 形 成 原 因 : DNA 發 生 中 斷 (discontinuities) 或 斷 裂 (break) 造 成, 若 斷 裂 無 法 再 結 合 (reunion), 則 會 造 成 缺 失 (deletion), 而 錯 誤 之 再 結 合 則 造 成 交 換 (exchange) 種 類 染 色 體 型 (chromosome-type): 兩 股 染 色 分 體 皆 發 生 變 異 染 色 分 體 型 (chromatid-type): 只 有 一 股 染 色 分 體 有 變 異 染 色 體 型 結 構 變 異 Centric ring dicentric 16

17 染 色 體 分 型 結 構 變 異 quadriradials break 實 驗 步 驟 接 種 細 胞 加 入 測 試 物 質 培 養 至 適 當 時 機 ( 如 CHO/V79 cells, 8-12 h) 加 入 紡 錘 絲 抑 製 劑 ( 如 秋 水 仙 素,colcemid) 收 集 第 一 次 有 絲 分 裂 細 胞 製 作 染 色 體 玻 片 Giemsa stain 資 料 分 析 ( 毒 性 試 驗 規 範 ).. 於 顯 微 鏡 下 觀 察 染 色 體 數 目 與 形 態 每 個 劑 量 組 製 備 2 片, 每 片 至 少 觀 察 100 個 分 裂 中 期 細 胞 在 描 述 細 胞 形 態 異 常 時, 需 註 明 染 色 體 或 染 色 分 體 之 結 構 變 異 種 類 試 驗 結 果 以 表 格 方 式 描 述 染 色 體 變 異 之 種 類 與 數 量, 並 計 算 含 染 色 體 結 構 變 異 細 胞 之 頻 率 17

18 姊 妹 染 色 分 體 交 換 (sister chromatid exchange,sce) 染 色 體 於 細 胞 分 裂 時 複 製 為 兩 條 染 色 分 體 (chromatid), 此 兩 條 染 色 分 體 互 成 為 姊 妹 染 色 分 體 姊 妹 染 色 分 體 交 換 發 生 於 DNA 複 製 期 間 姊 妹 染 色 分 體 在 相 同 位 置 互 相 交 換 遺 傳 物 質 不 會 造 成 結 構 改 變, 需 用 differential staining 分 辨 姊 妹 染 色 分 體 發 生 機 制 可 能 與 DNA 斷 裂 與 再 接 合 (break and reunion) 有 關 ( 分 子 機 制 仍 不 明 ) 用 於 毒 性 試 驗 : 一 些 具 突 變 性 或 致 癌 性 化 學 物 質 會 提 高 SCE 頻 率 Differential staining-- 分 辨 姊 妹 染 色 分 體 步 驟 : 於 培 養 基 中 加 入 DNA 鹼 基 類 似 物 bromodeoxyuridine ( 簡 稱 BrdU),DNA 複 製 過 程 中 會 以 BrdU 取 代 thymidine, 放 入 新 合 成 的 DNA 中, 細 胞 經 過 兩 次 分 裂 後, 姊 妹 染 色 分 體 之 BrdU 取 代 程 度 不 同, 以 螢 光 染 料 Hoechst 與 Giemsa 染 色 後 (Fluorescence-plus- Giemsa), 則 會 使 兩 條 姊 妹 染 色 分 體 顏 色 深 淺 不 同, 同 時 亦 可 看 出 二 者 間 是 否 有 有 交 換 產 生 18

19 Differential staining-- 分 辨 姊 妹 染 色 分 體 原 理 : Hoechst 螢 光 染 劑 : 結 合 在 DNA 之 A-T base BrdU-DNA: Hoechst 螢 光 染 劑 無 法 結 合 --> 螢 光 減 弱 對 光 線 不 穩 定 --> 以 UV 照 射 分 解 之 eluted by hot salt solution (65 C, 2XSSC) Giemsa 染 色 較 淡 ( 或 螢 光 減 弱 ) 收 集 第 二 次 分 裂 之 細 胞 (M2) AT CG TA AT GC TA BA TA First Division GC GC in BrdU (B) AT AB BA TA CG CG AT AB Second Division in BrdU (B) AB AB CG CG BA TA AB AB GC GC BA TA AT AB CG CG BA BA AT AB GC GC BA BA Original DNA helix Metaphase chromosome unifilarly substituted Second Division in BrdU (B) with an exchange at the centromere Metaphase chromosome bifilarly substituted AB AB AB AT CG CG CG CG TA BA BA BA AB AB AT AB GC GC GC GC BA TA BA BA SCEs are seen as sharp demarcations in the staining pattern 19

20 實 驗 步 驟 接 種 細 胞 加 入 測 試 物 質 與 BrdU 培 養 至 適 當 時 機 ( 如 CHO/V79 cells, h) 加 入 紡 錘 絲 抑 製 劑 ( 如 秋 水 仙 素,colcemid) 收 集 第 二 次 有 絲 分 裂 細 胞 製 作 染 色 體 玻 片 differential stain Differential stain: Hoechst stain(0.5 ug/ml) for min wash UV(365 nm) at cm for h (variable) wash C 2X SSC for 30 min 3 % Giemsa stain 5-10 min 姊 妹 染 色 分 體 交 換 資 料 分 析 NORMAL 1. 觀 察 50 個 以 上 M2 分 裂 細 胞 2. SCE/cell or SCE/chromosome 3. 與 陰 性 對 照 組 比 較 harlequin chromosome (SCE) 20

21 微 核 測 試 (micronucleus test) 一 般 受 試 物 質 只 需 要 進 行 一 項 動 物 活 體 基 因 毒 性 試 驗, 囓 齒 類 骨 髓 細 胞 微 核 試 驗 法 或 染 色 體 異 常 試 驗 法, 由 於 微 核 試 驗 法 較 為 敏 感, 所 以 是 國 際 間 測 試 毒 藥 物 誘 發 染 色 體 變 異 方 法 中 最 常 用 的 體 內 測 試 方 法 實 驗 動 物 一 般 選 用 小 鼠, 如 因 受 試 物 質 的 性 質 而 需 加 做 28 天 基 因 毒 性 試 驗, 則 選 用 大 鼠 或 倉 鼠 微 核 試 驗 是 用 來 測 量 周 邊 血 或 骨 髓 中 血 球 細 胞 發 生 微 核 事 件 頻 率 的 技 術 血 球 細 胞 中 以 紅 血 球 為 微 核 試 驗 的 最 佳 樣 品, 因 為 紅 血 球 在 生 成 過 程 中 丟 失 細 胞 核 後, 形 成 網 織 紅 血 球 (RET), 並 在 三 天 內 成 為 成 熟 紅 血 球 網 織 紅 血 球 與 成 熟 紅 血 球 因 其 胞 漿 內 只 殘 留 少 量 的 核 酸 物 質, 便 提 供 一 相 對 低 背 景 值, 故 這 些 細 胞 便 帶 有 微 核, 因 富 含 核 酸 物 質, 很 容 易 可 以 核 酸 特 異 性 染 劑 來 辨 識 21

22 骨 髓 (bone marrow) 是 製 造 紅 血 球 的 場 所 ( 特 別 是 紅 骨 髓 ) 當 紅 血 球 分 化 完 成 之 後, 這 些 細 胞 就 會 開 始 製 造 血 紅 素, 但 是 最 後 會 失 掉 它 們 的 細 胞 核 以 及 裡 面 的 胞 器 骨 髓 內 較 年 輕 的 紅 血 球 仍 然 保 有 一 些 核 糖 體, 所 以 看 起 來 好 像 有 網 狀 結 構 一 般, 如 果 利 用 特 殊 的 染 色, 可 以 把 這 些 網 狀 結 構 染 出 來, 所 以 這 些 細 胞 就 叫 做 網 狀 球 (reticuocyte) 在 正 常 情 況 下, 只 有 成 熟 的 紅 血 球 ( 已 經 完 全 失 去 核 糖 體 ) 才 會 離 開 骨 髓, 進 入 血 液 循 環 內 但 是 如 果 紅 血 球 不 正 常 地 大 量 製 造, 在 血 液 中 就 可 以 找 到 很 多 網 狀 球 紅 血 球 之 生 長 分 化 過 程 骨 髓 周 邊 血 液 小 時 3-10 小 時 小 時 2 天 最 排 母 細 胞 後 正 染 性 紅 除 多 染 性 紅 血 時 期 一 血 球 母 細 細 球 (PCE) 次 胞 胞 有 染 微 核 絲 色 核 分 體 形 裂 斷 成 裂 藥 物 誘 變 處 理 可 計 數 微 核 之 細 胞 期 網 狀 紅 血 球 (RET) 可 計 數 微 核 之 細 胞 期 120 天 成 熟 紅 血 球 22

23 微 核 實 際 上 是 紡 錘 體 著 絲 點 功 能 障 礙 形 成 的 整 條 染 色 體 或 染 色 體 的 斷 片, 從 微 核 形 成 機 制 來 說, 它 主 要 是 來 源 於 有 絲 分 裂 後 期 的 無 著 絲 點 斷 片, 因 無 紡 錘 絲 牽 拉 而 游 離 於 子 細 胞 漿 中 因 此 微 核 率 和 染 色 體 變 異 有 很 好 的 相 關 性 試 驗 方 法 是 先 以 受 試 物 灌 胃 餵 食 小 鼠 兩 次, 間 隔 不 超 過 24 小 時, 第 2 次 餵 食 後 小 時 間 取 樣 尾 靜 脈 血, 製 備 血 液 抹 片 如 欲 分 析 骨 髓, 則 可 第 2 次 餵 食 後 6 小 時 間 處 死 小 鼠, 收 集 2 個 股 骨 內 之 骨 髓, 並 製 備 骨 髓 液 抹 片 爾 後 分 析 抹 片 中 之 網 狀 紅 血 球 (reticulocytes), 每 隻 動 物 至 少 觀 察 1000 個 網 狀 紅 血 球, 記 錄 微 核 發 生 的 數 目, 同 時 計 算 網 狀 紅 血 球 佔 全 部 紅 血 球 的 比 例 如 微 核 細 胞 大 於 對 照 組 則 為 陽 性 反 應 23

24 微 核 測 試 (micronucleus test) 微 核.. 細 胞 質 之 染 色 小 體, 源 自 於 細 胞 分 裂 後 未 包 含 於 細 胞 核 之 染 色 體 或 無 著 絲 點 片 段 (fragment) 細 胞 分 裂 末 期 以 後, 單 獨 形 成 一 個 或 數 個 規 之 次 核, 被 包 含 於 子 細 胞 之 細 胞 質 而 形 成, 由 於 比 細 胞 核 小, 所 以 稱 為 微 核 形 狀 構 造 與 染 色 性 質 與 細 胞 核 類 似 形 成 機 制.. 染 色 體 發 生 斷 裂 或 染 色 體 移 動 延 遲 (lagging)( 紡 錘 絲 損 害 或 其 他 抑 制 有 絲 分 裂 之 機 制 ) 用 途.. 偵 測 染 色 體 斷 裂 或 染 色 體 數 目 異 常 測 試 細 胞.. 完 成 細 胞 分 裂 之 細 胞 測 試 系 統 微 核 測 試 之 優 缺 點 優 點 : 簡 便 與 靈 敏, 不 受 細 胞 週 期 限 制, 操 作 與 計 數 方 法 簡 單 缺 點 : 無 法 偵 測 不 會 引 起 染 色 體 斷 裂 或 染 色 體 延 遲 現 象 之 化 學 物 質 動 物 試 驗 觀 察 目 標 ( 紅 血 球 系 列 細 胞 ).. 骨 髓 之 多 染 性 紅 血 球 細 胞 (polychromatic erythrocyte, PCE) 周 邊 血 液 之 網 狀 紅 血 球 細 胞 (reticulocyte, RET) 體 外 測 試 Lymphocyte/ 哺 乳 類 細 胞 株 區 別 分 裂 細 胞.. 於 試 驗 末 期, 加 入 細 胞 質 分 裂 抑 制 劑 (cytokinesis inhibitor), 例 如 cytochalasin B (Cyt B), 使 分 裂 細 胞 之 細 胞 質 不 分 離 而 細 胞 核 分 離 24

25 網 狀 紅 血 球 細 胞 實 驗 操 作 動 物 試 驗 藥 物 處 理 h 處 死 動 物 收 集 骨 髓 細 胞 製 作 抹 片 染 色 觀 察 藥 物 處 理 h 收 集 周 邊 血 液 製 作 抹 片 染 色 觀 察 體 外 測 試.. 藥 物 處 理 h 加 入 cytochalasin B 製 作 細 胞 抹 片 染 色 觀 察 染 色 方 法 Giemsa stain: PCE/RET: 灰 藍 色, 微 核.. 深 紅 或 深 藍 色 Acridine organe stain( 螢 光 染 色 ): PCE/RET.. 橘 紅 色, 微 核.. 黃 綠 色 25

26 測 試 結 果 微 核 (micronucleus) RBC 微 核 RET 體 外 測 試.. 以 cytochalasin B 處 理 後 有 micronucleus 出 現 之 雙 核 細 胞 (binucleate cell) 動 物 試 驗 : 收 集 周 邊 血 液 後 以 acridine orange 染 色 26

27 測 試 結 果 資 料 分 析 ( 動 物 試 驗 ).. - 觀 察 1000 PCE or RET/animal - 記 錄 微 核 數 目 - 計 算 PCE/RBC( 細 胞 毒 性 指 標 ) - 陽 性 反 應 : 統 計 上 之 顯 著 增 加 且 有 劑 量 程 度 關 反 應 計 數 微 核 紅 血 球 傳 統 方 法 為 用 Giemsa 染 劑 染 色 後 配 合 顯 微 鏡 檢, 每 隻 動 物 計 數 1000 個 多 染 性 紅 血 球 或 網 狀 紅 血 球, 微 核 率 指 多 染 性 紅 血 球 或 網 狀 紅 血 球 中 微 核 發 生 的 數 目, 以 千 分 率 表 示 改 進 方 法 為 採 用 Acridine orange 染 劑 染 色 後 配 合 螢 光 顯 微 鏡 檢, 可 以 觀 察 網 狀 紅 血 球 中 微 核 的 發 生 率, 取 代 多 染 性 紅 血 球, 唯 此 法 仍 需 大 量 人 員 工 時, 不 易 大 量 推 廣 特 別 是 當 毒 藥 物 引 起 骨 髓 及 周 邊 血 液 之 網 狀 紅 血 球 數 目 減 少 時, 人 工 計 數 法 便 相 當 耗 時, 往 往 成 為 毒 性 試 驗 專 責 機 構 服 務 績 效 的 一 個 瓶 頸 27

28 結 語 明 顯 之 染 色 體 變 異 通 常 容 易 觀 察 與 偵 測, 例 如 deletion, 但 細 胞 可 能 無 法 存 活, 因 此 較 不 具 生 物 關 連 性 與 判 斷 其 長 久 之 影 響 不 易 偵 測 之 細 微 染 色 體 變 異, 例 如 translocation 或 inversion 等, 可 能 對 健 康 有 更 大 之 影 響 未 來 發 展 也 許 可 條 紋 染 色 (banding stain) 或 利 用 螢 光 雜 交 技 術 (FISH), 以 不 同 顏 色 之 螢 光 標 記 標 識 DNA 探 針, 偵 測 到 染 色 體 之 多 種 變 異 28

29 結 語 基 因 毒 性 綜 合 測 試 法 ( 包 括 體 外 與 活 體 ) 因 實 驗 條 件 會 導 致 假 陰 性 或 假 陽 性 反 應, 所 以 即 使 基 因 毒 性 試 驗 結 果 呈 陽 性 反 應, 不 一 定 表 示 試 驗 物 質 會 對 人 體 產 生 基 因 毒 性 或 致 癌 性 ( 反 之 亦 然 ) 因 此 以 上 的 基 因 毒 性 測 試 方 法 只 能 提 供 基 本 的 基 因 毒 性 資 訊, 應 依 試 驗 物 質 的 性 質 加 入 其 他 的 基 因 毒 性 測 試 方 法 若 試 驗 物 質 在 體 外 測 試 系 統 中 呈 陰 性 反 應, 則 只 須 進 行 一 種 動 物 活 體 基 因 毒 性 測 試 若 試 驗 物 質 在 體 外 測 試 系 統 中 呈 陽 性 反 應, 則 須 進 行 動 物 活 體 基 因 毒 性 及 骨 髓 或 血 液 以 外 的 組 織 進 行 更 多 活 體 測 試, 以 便 獲 取 進 一 步 的 資 訊 若 活 體 與 體 外 測 試 的 試 驗 結 果 不 一 致 時, 則 須 依 個 案 加 以 解 釋 29

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