前 言 发 酵 工 艺 学 是 生 物 工 程 及 其 相 关 专 业 的 主 要 课 程 之 一, 在 我 国 高 等 院 校 中 的 开 设 有 四 十 多 年 的 历 史 但 直 到 1995 年 沈 阳 药 科 大 学 熊 宗 贵 教 授 的 发 酵 工 艺 原 理 教 材 ( 药 学 类

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1 主 编 : 陈 今 朝 长 江 师 范 学 院 生 命 科 学 与 技 术 实 验 教 学 中 心 2010 年 6 月

2 前 言 发 酵 工 艺 学 是 生 物 工 程 及 其 相 关 专 业 的 主 要 课 程 之 一, 在 我 国 高 等 院 校 中 的 开 设 有 四 十 多 年 的 历 史 但 直 到 1995 年 沈 阳 药 科 大 学 熊 宗 贵 教 授 的 发 酵 工 艺 原 理 教 材 ( 药 学 类 ), 才 由 中 国 医 药 科 技 出 版 社 出 版 面 世 ;1996 年 华 南 理 工 大 学 姚 汝 华 教 授 的 微 生 物 工 程 工 艺 原 理 教 材 ( 食 品 类 ), 由 华 南 理 工 大 学 出 版 社 出 版 但 迄 今 为 止, 仍 无 配 套 的 实 验 教 材 为 了 适 应 生 命 科 学 系 新 开 设 各 专 业 教 学 和 生 命 科 学 系 改 革 发 展 的 需 要, 现 对 原 来 编 写 的 讲 义 ( 自 1991 级 以 来 各 个 年 级 使 用 ) 进 行 修 订, 删 除 了 一 些 欠 合 适 的 内 容, 增 加 了 许 多 新 内 容, 并 更 名 为 发 酵 工 艺 学 实 验 指 导, 目 的 是 为 了 更 好 地 适 应 生 命 科 学 系 的 生 物 教 育 学 生 命 科 学, 生 物 技 术 和 生 物 工 程 等 专 业 的 教 学 及 课 程 建 设 的 需 要 在 修 订 过 程 中, 尽 可 能 地 反 应 本 课 程 的 特 点, 内 容 侧 重 于 基 本 理 论 的 验 和 基 本 技 术 的 培 养 本 教 材 的 修 订 是 根 据 白 秀 峰 教 授 编 写 的 发 酵 工 艺 学 教 材 ( 高 等 教 育 十 五 国 家 级 规 划 教 材,2003 年 ) 的 内 容, 结 合 我 院 的 实 际 情 况, 介 绍 了 与 发 酵 工 艺 学 密 切 相 关 的 工 艺 原 理 及 基 本 技 术 性 实 验 主 要 包 括 AB 菌 发 酵 丁 酸 发 酵 酒 精 发 酵 乳 酸 发 酵 啤 酒 发 酵 醋 酸 发 酵 微 生 物 多 糖 发 酵 甜 酒 酿 的 酿 制 谷 氨 酸 的 提 取 和 菌 种 选 育 等 实 验 由 于 编 者 水 平 有 限, 教 材 的 编 写 尚 存 在 一 些 不 足, 请 读 者 批 评 指 正 1

3 课 程 说 明 发 酵 工 艺 学 实 验 是 发 酵 工 艺 学 的 重 要 组 成 部 分 和 必 要 环 节, 发 酵 工 艺 学 实 验 指 导 是 根 据 发 酵 工 艺 学 实 验 教 学 大 纲 编 写 的, 它 是 在 学 生 学 习 了 基 础 化 学 生 物 化 学 普 通 生 物 学 微 生 物 学 等 课 程, 并 具 有 一 定 的 基 础 理 论 及 基 本 技 能 后 开 设 的 发 酵 工 艺 学 实 验 是 一 门 技 术 性 较 强 的 学 科, 通 过 发 酵 工 艺 学 的 学 习, 目 的 在 于 培 养 学 生 利 用 已 掌 握 的 知 识 和 技 能, 通 过 发 酵 工 艺 学 实 验, 要 求 学 生 较 熟 练 地 掌 握 生 物 工 程 的 基 本 技 术 和 基 本 方 法, 通 过 具 体 的 实 验 操 作, 分 析 实 验 结 果 和 完 成 实 验 作 业, 加 深 对 发 酵 工 艺 学 原 理 的 理 解 ; 验 证 并 巩 固 所 学 理 论 知 识 通 过 实 验, 培 养 学 生 观 察 思 考 分 析 问 题 和 解 决 问 题 的 能 力, 为 今 后 的 教 学 和 科 研 工 作 奠 定 基 础 为 了 保 证 实 验 的 质 量, 提 高 教 学 效 果, 要 求 学 生 做 到 以 下 几 点 : 1 每 次 实 验 前 必 须 对 实 验 内 容 进 行 预 习, 明 确 实 验 要 求, 了 解 实 验 的 原 理 方 法, 熟 悉 实 验 操 作 步 骤 及 过 程 2 在 实 验 过 程 中, 必 须 严 肃 认 真 严 格 按 照 实 验 的 步 骤 进 行 操 作, 特 别 要 遵 守 无 菌 操 作 规 程, 以 保 证 实 验 结 果 的 准 确 性 3 在 实 验 过 程 中, 认 真 做 好 记 录, 实 验 结 果 必 须 如 实 记 载, 认 真 分 析, 得 出 结 论 对 于 本 次 实 验 不 能 得 到 结 果 而 需 要 连 续 记 录 的 实 验, 要 记 录 下 每 次 观 察 到 的 现 象 和 结 果, 以 便 分 析 4 在 实 验 过 程 中 所 用 药 品 试 剂 仪 器 及 器 皿 等, 应 做 到 从 哪 里 拿, 用 后 必 须 放 回 原 处, 需 要 洗 涤 的 器 皿 必 须 洗 净 后 放 回 ( 或 置 于 干 燥 箱 中 ) 实 验 2

4 中 所 用 菌 种 及 物 品 未 经 教 师 许 可 不 得 带 出 室 外 5 实 验 结 束 后, 认 真 观 察, 分 析 实 验 结 果, 以 实 事 求 是 的 态 度 写 出 实 验 报 告, 并 对 实 验 过 程 中 观 察 到 的 现 象 及 问 题 进 行 解 释 和 讨 论 6 离 开 实 验 室 前, 认 真 做 好 清 洁, 并 关 好 门 窗 及 水 电 开 关 3

5 实 验 一 A B 菌 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 并 掌 握 菌 体 的 扩 大 培 养 方 法 2. 熟 悉 以 菌 体 作 为 产 品 的 发 酵 产 物 的 生 产 方 法 3. 了 解 A B 菌 制 剂 的 用 途 二 基 本 原 理 A B 菌 是 一 类 以 菌 体 为 发 酵 产 品 的 典 型 发 酵 过 程 A B 菌 作 为 一 种 植 物 广 谱 抗 生 细 菌 是 贵 州 省 林 业 科 学 院 森 林 保 护 研 究 所 所 长 胡 炳 福 研 究 员 经 过 十 几 年 的 研 究, 从 松 叶 上 分 离, 纯 化 筛 选 出 来 的 经 反 复 的 研 究 试 验, 结 果 表 明 此 细 菌 制 剂 ( 活 菌 体 ) 不 仅 能 防 治 各 种 林 木 虫 害 和 松 毛 虫, 而 且 对 农 作 物 如 水 稻 小 麦 玉 米 烤 烟 和 蔬 菜 等 也 有 防 病 增 产 的 特 殊 效 果 并 于 1991 年 9 月 25 日 获 国 家 发 明 专 利 ( 专 利 号 为 ),1991 年 12 月 通 过 林 业 部 科 技 成 果 鉴 定 1992 年 在 首 届 中 国 专 利 新 技 术 新 产 品 博 览 会 上 获 金 奖, 经 中 国 科 学 院 鉴 定 后 命 名 为 P 751 (A 菌 ),BC 752 (B 菌 ) A B 菌 的 特 征 :A 菌 (P 751 ) 为 革 兰 氏 阴 性 菌, 菌 体 杆 状, 单 个 无 芽 孢, 大 小 为 0.5~ 微 米 ; 斜 面 培 养 菌 苔 呈 乳 白 色, 有 光 泽 B 菌 (BC 752 ) 为 革 兰 氏 阳 性 菌, 杆 状, 大 小 为 1.4~ 微 米 芽 孢 中 生, 呈 不 明 显 膨 大, 无 伴 孢 晶 体 ; 斜 面 培 养 菌 苔 为 白 色, 无 光 泽 A B 菌 的 培 养 温 度 为 28±1 三 实 验 材 料 1. 菌 种 :A(P 751 ) B(BC 752 ) 2. 恒 温 振 荡 培 养 器, 双 人 净 化 工 作 台 3. 锥 形 瓶 200ml 高 压 灭 菌 锅 和 显 微 镜 等 4

6 4. 毛 细 玻 璃 管 载 玻 片 盖 玻 片 血 球 计 数 板 纱 布 牛 皮 纸 线 绳 和 接 种 棒 等 5. 培 养 基 ( 略 ) 四 方 法 与 步 骤 1. 斜 面 培 养 基 的 配 制 A B 菌 斜 面 培 养 基 的 组 成 为 : 牛 肉 膏 0.3%, 蛋 白 胨 0.5%,NaCl0.5% Agar 2.0% ph7.5 按 此 配 方 配 好 斜 面 培 养 基 制 成 斜 面, 作 无 菌 检 查 后, 接 入 A B 菌, 待 培 养 成 熟 后 供 本 次 实 验 用 2. 发 酵 培 养 基 的 配 制 A 菌 培 养 基 的 组 成 为 : 牛 肉 膏 0.3%, 蛋 白 胨 1.0%,K 2 HPO %,MgSO % 葡 萄 糖 0.5%,pH7.5 B 菌 培 养 基 的 组 成 为 : 牛 肉 膏 0.3%, 蛋 白 胨 0.5%, 酵 母 膏 0.1%, 葡 萄 糖 0.5%,MgSO %, K 2 HPO %, 淀 粉 0.5%,pH7.5. 按 A B 菌 的 培 养 基 组 成 配 方, 各 配 制 800ml 发 酵 培 养 基, 然 后 分 别 装 入 20 个 200ml 锥 形 瓶, 用 八 层 纱 布 封 口 牛 皮 纸 包 好, 做 好 记 号 0.1MPa, 121 灭 菌 30min, 然 后 取 出 冷 却 3. 接 种 待 A B 菌 培 养 基 温 度 降 至 30 时, 在 无 菌 操 作 条 件 下, 分 别 接 入 A B 菌 菌 种, 每 个 锥 形 瓶 接 入 一 环, 然 后 用 绳 子 扎 好 瓶 口 4. 发 酵 将 接 种 后 的 锥 形 瓶 分 别 置 于 恒 温 振 荡 培 养 器 上, 温 度 控 制 在 28±1, A 菌 培 养 24h,B 菌 培 养 36h 分 别 测 定 各 个 锥 形 瓶 菌 体 的 数 量 ph 值, 并 做 镜 检, 注 意 取 样 过 程 中 避 免 污 染 5

7 5. 实 验 结 束 后, 将 发 酵 液 用 无 菌 瓶 装 好, 用 石 蜡 封 口 备 用 五 实 验 报 告 1. 结 果 将 实 验 所 测 数 据 分 别 记 入 下 表 瓶 号 菌 数 /ml ph 染 菌 否 结 论 2. 思 考 题 (1) 就 上 表 数 据 进 行 分 析 比 较, 说 明 其 原 因 (2) 发 酵 结 束 后, 应 怎 么 样 操 作 才 能 避 免 发 酵 液 被 污 染? 发 酵 液 作 为 一 种 产 品 有 何 用 途? 6

8 实 验 二 丁 酸 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 并 了 解 发 酵 培 养 基 的 灭 菌 方 法 2. 熟 悉 丁 酸 型 发 酵 的 一 般 原 理 3. 了 解 丁 酸 发 酵 在 工 农 业 生 产 中 的 应 用 二 基 本 原 理 果 胶 淀 粉 和 其 它 多 糖 类 有 机 物, 经 梭 状 芽 孢 杆 菌 厌 氧 菌 分 解 后, 因 为 产 物 中 有 丁 酸 等 有 机 酸 产 生 培 养 液 中 的 恶 臭 味, 主 要 来 自 丁 酸 多 糖 类 有 机 物 的 厌 氧 发 酵, 常 常 成 为 丁 酸 型 发 酵 不 同 梭 菌 的 最 终 发 酵 产 物 除 丁 酸 外, 还 可 分 别 产 生 乙 酸 乙 醇 丁 醇 丙 酮 异 丙 酮 等 丁 酸 细 菌 分 布 很 广, 土 壤 堆 肥 污 水 及 一 些 作 物 的 秸 秆 上 都 存 在, 为 专 性 的 厌 氧 性 细 菌, 最 适 生 长 温 度 为 30-40, 当 环 境 中 的 ph 值 逐 渐 降 低 时, 丁 酸 菌 的 生 长 就 会 受 到 抑 制 三 实 验 材 料 1. 直 径 1cm 的 麻 杆 数 根 2. 显 微 镜 电 炉 等 3. 带 橡 皮 塞 的 试 管 (30 200mm) 玻 璃 棒 染 色 液 剪 刀 棉 线 等 四 方 法 与 步 骤 1. 麻 杆 的 准 备 取 直 径 为 1cm 左 右 的 麻 杆 一 根, 剪 成 4cm 左 右 的 小 段, 用 棉 线 捆 成 一 束, 并 在 中 间 插 上 一 根 玻 璃 棒 2. 煮 沸 灭 菌, 除 去 可 溶 性 物 质 将 与 玻 璃 棒 捆 在 一 起 的 麻 杆 束 放 入 大 试 管 中, 加 水 淹 没 麻 杆, 水 浴 煮 7

9 沸 1-2min 后, 将 水 倒 掉, 除 去 麻 杆 中 的 可 溶 性 物 质, 减 少 其 它 微 生 物 可 利 用 的 营 养 3. 接 种 与 培 养 在 试 管 中 重 新 加 入 开 水, 至 试 管 高 度 2/3 处, 冷 至 30 左 右 时, 投 入 一 小 段 未 煮 过 的 麻 杆 或 根, 轻 轻 提 起 玻 棒, 将 其 压 在 试 管 底 部, 用 橡 皮 塞 塞 紧 管 口, 于 30 下 培 养 7d 4. 检 测 取 出 玻 棒, 拿 出 一 根 经 过 厌 氧 发 酵 的 麻 杆, 用 镊 子 轻 轻 撕 下 一 块 麻 皮, 用 靠 木 质 部 的 一 面 在 载 玻 片 上 涂 抹, 烘 干 并 用 结 晶 紫 染 色, 在 高 倍 镜 或 油 镜 下, 即 可 看 到 ( 分 解 果 胶 质 的 ) 厌 氧 芽 孢 杆 菌 五 实 验 报 告 1 结 果 绘 出 你 所 观 察 到 的 厌 氧 芽 孢 杆 菌 的 形 态 结 构 图 2 思 考 题 附 : 丁 酸 发 酵 在 麻 类 纤 维 加 工 中 有 何 作 用? 丁 酸 测 定 的 方 法 纸 上 层 析 法 纸 上 层 析 法 是 利 用 滤 纸 作 为 惰 性 支 持 物 在 密 闭 容 器 中 使 溶 剂 在 滤 纸 上 渗 透 的 一 种 方 法 主 要 是 由 于 被 分 离 的 物 质 在 静 置 的 水 相, 和 沿 纸 流 动 的 有 机 相 不 同 的 分 配 所 致 由 于 被 分 离 物 质 的 分 配 系 数 不 同, 因 此 样 品 中 各 种 不 同 的 组 成 就 可 以 彼 此 分 开 原 点 到 层 析 中 心 距 离 移 动 速 率 用 Rf= 原 点 到 溶 剂 前 沿 多 距 离 8

10 对 各 种 物 质 来 讲, 在 一 定 的 条 件 下,Rf 值 为 一 常 数, 因 此, 可 用 来 将 丁 酸 菌 发 酵 液 中 Rf 值 与 已 知 标 准 丁 酸 样 品 的 Rf 值 来 做 比 较 如 果 来 两 者 的 Rf 值 基 本 接 近, 则 说 明 发 酵 液 中 的 丁 酸 为 该 丁 酸 菌 所 产 生 操 作 方 法 如 下 : 1. 滤 纸 采 用 新 华 一 号 滤 纸, 展 开 方 法 为 上 升 法, 展 开 滤 纸 长 25cm 点 样 宜 点 在 滤 纸 的 正 面 2. 试 剂 与 样 品 的 配 制 展 开 剂 : 以 正 丁 醇 100ml,1.5N 氨 水 50ml, 置 于 分 液 漏 斗 中 充 分 摇 匀, 静 置 4h 以 上, 可 分 离 得 正 丁 醇 透 明 液 将 分 离 的 正 丁 醇 层 ( 上 层 溶 液 ) 作 扩 展 剂, 下 层 氨 水 溶 液 为 外 用 液 展 开 放 入 二 重 皿 中, 外 用 液 放 在 小 烧 杯 中 显 色 剂 :0.04% 溴 甲 酚 紫 乙 醇 溶 液 标 准 丁 酸 : 2% 丁 酸 样 品 处 理 : 取 丁 酸 菌 培 养 液 2ml, 用 0.1N NaOH 滴 至 微 红 色 3. 点 样 先 用 铅 笔 在 离 滤 纸 一 段 2-3cm 处 轻 轻 划 一 直 线 样 品 点 距 为 2-3cm 样 品 点 样 量 为 ml, 用 毛 细 管 分 四 次 点 完 每 一 次 用 吹 风 机 凉 风 吹 干, 点 样 直 径 为 cm 左 右 4. 展 开 和 展 开 条 件 把 展 开 剂 和 外 用 液 放 入 玻 璃 钟 罩 放 在 玻 璃 平 板 上, 然 后 放 进 展 开 剂 与 外 用 液, 让 钟 罩 内 被 展 开 剂 的 蒸 汽 饱 和 约 1min 将 卷 好 的 滤 纸 卷 成 筒 形, 用 棉 线 连 接 起 来, 点 样 的 一 面 朝 外, 样 品 点 位 于 滤 纸 顶 端 放 入 钟 罩 内 二 9

11 重 皿 上 的 玻 璃 架 上, 让 饱 和 蒸 汽 薰 4-12h, 平 衡 后 将 滤 纸 倒 过 来, 使 滤 纸 浸 入 二 重 皿 的 正 丁 醇 溶 液 中, 在 室 温 下 展 开 展 开 距 离 为 20cm, 待 溶 剂 走 至 滤 纸 顶 端 约 2cm 时 取 出 5. 滤 纸 干 燥 取 出 滤 纸, 用 电 吹 风 吹 干 滤 纸 至 无 正 丁 醇 味 为 止 6. 显 色 取 适 量 的 溴 甲 酚 紫 显 色 剂 用 0.1N NaOH 调 节 至 微 碱 性 (ph7.5-ph8.0), 调 好 后 用 喷 雾 器 在 滤 纸 上, 有 丁 酸 处 呈 黄 色 斑 点, 无 丁 酸 处 呈 紫 色 将 黄 色 斑 点 用 铅 笔 划 上, 否 则 会 消 失 根 据 Rf 值 可 确 定 是 否 是 丁 酸, 并 且 根 据 斑 点 大 小 与 标 准 样 品 对 照 可 确 定 大 概 含 量 10

12 实 验 三 酒 精 发 酵 一 目 的 要 求 1. 掌 握 酒 精 发 酵 的 原 理 2. 学 习 酵 母 菌 的 培 养 及 酒 精 发 酵 的 方 法 3. 了 解 酒 精 及 酒 类 的 生 产 方 法 二 基 本 原 理 在 无 养 条 件 下, 在 酵 母 菌 中, 葡 萄 糖 经 酵 解 途 径 生 成 丙 酮 酸 ; 在 丙 酮 酸 脱 羧 酶 作 用 下, 丙 酮 酸 脱 羧 成 乙 醛 ; 乙 醛 在 乙 醇 脱 氧 酶 作 用 下, 接 受 氢 被 还 原 为 乙 醇, 称 为 酒 精 发 酵 反 应 式 如 下 : 丙 酮 酸 脱 羧 酶 丙 酮 酸 乙 醛 +CO 2 丙 酮 酸 脱 羧 酶 需 要 焦 磷 酸 硫 胺 素 为 辅 酶, 并 需 要 Mg 2+, 所 生 成 的 乙 醛 在 乙 醇 脱 氢 酶 作 用 下 成 为 受 氢 体, 被 还 原 成 乙 酸 反 应 式 如 下 : 乙 醛 NADN+H + NADH + 乙 醇 由 葡 萄 糖 生 成 乙 醇 的 总 反 应 式 为 : C 6 H 12 O 6 +2ADP+2CH 3 CH 2 OH+2CO 2 +2ATP+104.6KJ 乙 醇 的 理 论 转 化 率 为 : %=51.1% 但 生 产 中 约 有 5% 葡 萄 糖 用 于 合 成 酵 母 细 胞 和 副 产 物, 实 际 上 乙 醇 生 成 量 约 为 理 论 值 的 95%, 则 乙 醇 对 糖 的 转 化 率 约 为 48.5% 在 酒 精 生 产 中, 酵 母 菌 的 培 养 是 在 液 体 条 件 下 进 行 的, 其 培 养 基 一 般 为 2% 左 右 的 麦 芽 糖 ( 或 葡 萄 糖 ) 溶 液,pH 值 为 4.0 左 右 ( 用 盐 酸 调 节 ) 11

13 灭 菌 后, 在 温 度 为 28 下 培 养 2-3d, 作 为 生 产 用 菌 种 生 产 菌 种 的 质 量 有 规 定 的 要 求 如 要 求 菌 体 健 壮 大 小 均 匀, 有 一 定 的 发 芽 率, 单 位 体 积 的 培 养 液 内 酵 母 菌 的 活 菌 数 必 须 在 一 定 的 数 量 以 上, 而 且 种 子 无 杂 菌 在 酒 精 的 工 业 生 产 中, 由 于 酵 母 菌 的 种 类 不 同, 对 碳 源 的 利 用 也 有 差 异 酒 精 发 酵 是 生 产 各 种 酒 类 的 基 础, 生 产 酒 精 所 用 原 料 一 般 为 各 种 淀 粉 质 原 料, 但 酵 母 菌 不 能 直 接 利 用 淀 粉 在 使 用 前, 必 须 先 进 行 水 解 ( 在 酿 酒 时 可 用 酒 曲 ), 使 淀 粉 转 化 成 葡 萄 糖 后, 才 能 进 行 酒 精 发 酵 测 定 发 酵 过 程 中 生 成 的 CO 2 和 发 酵 醪 中 酒 精 的 含 量, 可 以 用 来 测 定 酵 母 的 发 酵 能 力 三 实 验 材 料 1. 菌 种 : 究 竟 酵 母 灭 菌 锅 净 化 工 作 台 培 养 箱 试 管 和 锥 形 瓶 等 3. 淀 粉 水 解 物 ( 或 葡 萄 糖 蔗 糖 ),NH 4 NO 3 KH 2 PO 4 MgSO 4 7H 2 O NaHSO 3 豆 芽 汁 淀 粉 酶 和 糖 化 酶 等 四 方 法 与 步 骤 ( 一 ) 酒 母 的 培 养 1. 培 养 基 的 制 备 制 取 浓 度 为 13 Bx 的 麦 芽 汁 (1) 试 管 斜 面 培 养 基 取 浓 度 为 13 Bx 的 麦 芽 汁 100ml, 加 入 2%Agar, 融 化 后 分 装 于 试 管 中, 0.05MPa,112 灭 菌 15min (2) 液 体 试 管 培 养 基 取 浓 度 为 13 Bx 的 麦 芽 汁 8ml, 分 装 于 支 管 中, 0.05MPa,112 灭 菌 15min (3) 三 角 瓶 扩 大 培 养 基 取 浓 度 为 13 Bx 的 麦 芽 汁 80ml 分 装 于 三 角 瓶 12

14 中, 以 6N H 2 SO 4 调 节 ph 值 至 ,0.05MPa,112 灭 菌 15min 2. 接 种 与 扩 大 培 养 (1) 取 酵 母 菌 1308 移 接 于 试 管 斜 面, 在 下 培 养 (2) 取 上 述 培 养 后 的 斜 面, 接 一 环 于 液 体 试 管 中,30 ; 培 养 20-24h (3) 取 上 述 液 体 酵 母 菌 接 种 于 三 角 瓶 扩 大 培 养,28-30 培 养 20-24h 3. 酒 母 质 量 检 查 镜 检 时 要 求 形 态 整 齐, 细 胞 内 原 生 质 稠 密, 无 空 泡, 无 杂 菌, 细 胞 数 亿 个 /ml, 出 芽 率 17%-20% ( 二 ) 发 酵 培 养 基 的 制 备 1. 淀 粉 的 水 解 ( 糊 化 ) 以 1:35 的 淀 粉 和 水 的 比 例, 用 的 温 水 调 粉 浆 1000ml, 加 BF-7658 淀 粉 酶 0.1%( 调 匀 后 液 温 应 高 于 65 ), 于 电 炉 上 加 热 至 90-93, 保 持 5min, 并 继 续 加 热 煮 沸 1h, 使 其 充 分 液 化, 并 补 充 水 分 2. 糖 化 取 上 述 液 化 醪 冷 却 至 60-62, 加 入 糖 化 酶 糖 化 30min 后, 分 装 锥 形 瓶, 每 瓶 装 400ml/500ml 瓶, 并 检 查 醪 液 质 量 ( 要 求 糖 度 Bx, 还 原 糖 4%-6%, 酸 度 2-3 ), 然 后 灭 菌 冷 却 待 用 ( 三 ) 发 酵 取 培 养 成 熟 的 酒 母 以 无 菌 操 作 接 入 到 盛 有 400ml 糖 化 醪 的 发 酵 瓶 中, 30 培 养 72h ( 四 ) 生 成 的 酒 精 测 定 1. 首 先 接 按 图 1 装 好 蒸 馏 装 置 2. 准 确 量 取 100ml 发 酵 液 于 500ml 蒸 馏 瓶 中, 同 时 加 入 等 量 的 蒸 馏 水, 13

15 连 接 好 冷 凝 器, 勿 使 漏 气, 用 电 炉 加 热 馏 出 液 收 集 于 100ml 量 筒 中, 酒 精 表 与 温 度 计 同 时 插 入 量 筒, 测 定 酒 精 度 和 温 度 3. 根 据 测 定 的 酒 精 度 和 温 度, 查 换 算 表, 换 算 成 20 时 的 酒 精 度 ( 换 算 表 见 表 录 ) 五 实 验 报 告 1. 结 果 蒸 馏 液 的 酒 精 度 为 度, 温 度 为, 换 算 成 20 时, 酒 精 度 为 度 2. 思 考 题 (1) 若 要 有 氧 条 件 下, 其 产 物 是 什 么? (2) 在 发 酵 过 程 中, 应 注 意 什 么? 附 : 酵 母 斜 面 培 养 基 组 成 酵 母 膏 1%, 蛋 白 胨 2%, 葡 萄 糖 2%,Agar2%,0.05MPa 灭 菌 15min 2. 发 酵 培 养 基 亦 可 用 下 列 配 方 蔗 糖 100g,20% 豆 芽 汁 20ml,MgSO 4.7H 2 O 5g,NH 4 NO 3 5.7g,KH 2 PO 4 5g, 水 1000ml 14

16 实 验 四 乳 酸 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 乳 酸 菌 的 培 养 方 法 2. 学 习 并 掌 握 乳 酸 发 酵 的 原 理 3. 学 习 酸 乳 的 制 作 方 法 二 基 本 原 理 乳 酸 发 酵 分 为 同 型 乳 酸 发 酵 和 异 型 乳 酸 发 酵 两 种 类 型, 前 者 在 发 酵 产 物 中 只 有 乳 酸, 后 者 的 产 物 中 除 乳 酸 外, 还 有 乙 醇 和 CO2 两 者 的 发 酵 菌 种 不 同, 发 酵 的 机 制 也 不 一 样 同 型 乳 酸 发 酵 是 乳 酸 菌 利 用 葡 萄 糖 经 糖 酵 解 途 径 生 成 丙 酮 酸 由 于 大 多 数 乳 酸 菌 不 具 有 脱 羧 酶, 因 此, 丙 酮 酸 不 能 脱 羧 生 成 乙 醛, 而 在 乳 酸 脱 氢 酶 催 化 作 用 下 ( 需 要 还 原 型 辅 酶 I), 丙 酮 酸 为 受 氢 体, 被 还 原 为 乳 酸 其 过 程 如 下 : 葡 萄 糖 3 磷 酸 甘 油 醛 1.3 二 磷 酸 甘 油 酸 丙 酮 酸 乳 酸 总 反 应 式 为 : C6H12O 6 +2ADP+2H 3 PO4 2CH3CHOHCOOH+2ATP KJ 90 2 理 论 转 化 率 为 : 100%=100% 180 进 行 同 型 乳 酸 发 酵 的 菌 种 主 要 有 : 乳 酸 链 球 菌 酪 乳 杆 菌 保 加 利 亚 乳 杆 菌 和 德 氏 乳 杆 菌 等 异 型 乳 酸 发 酵 除 生 成 乳 酸 外, 还 可 生 成 CO2 和 乙 醇 或 乙 酸, 其 合 成 途 径 有 两 种, 即 6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸 途 径 和 双 歧 途 径 进 行 异 型 乳 酸 发 酵 菌 种 有 : 肠 膜 明 串 珠 菌 和 葡 萄 糖 明 串 珠 菌 等 15

17 工 业 乳 酸 生 产 菌 种 均 用 德 氏 乳 酸 杆 菌, 而 酸 乳 工 业 用 菌 种 为 乳 酸 链 球 菌 和 乳 酸 杆 菌 等 本 实 验 主 要 介 绍 酸 乳 的 生 产 方 法, 生 产 工 艺 流 程 为 : 原 料 鲜 奶 过 滤 辅 料 原 料 无 水 黄 油 ( 熔 油 ) 水 预 热 60 均 质 Kg/cm 2 杀 菌 90 5min( 或 118,3s) 冷 却 45 发 酵 剂 接 种 灌 装 ( 如 瓶 或 杯 ) 发 酵 冷 却 5 8 后 熟 6 酸 乳 的 生 产 时 先 将 牛 乳 消 毒, 然 后 接 种 乳 酸 链 球 菌 和 乳 酸 杆 菌 进 行 纯 种 发 酵 所 得 到 的 酸 奶 制 品 风 味 好 质 量 高, 对 人 体 具 有 营 养 及 保 健 作 用 由 于 酸 乳 中 含 有 乳 酸 菌 体 及 代 谢 产 物, 它 对 人 体 肠 道 内 的 致 病 病 菌 有 一 定 16

18 的 抑 制 作 用 因 此, 它 对 人 的 肠 胃 消 化 疾 病 也 有 治 疗 作 用 三 实 验 材 料 1. 菌 种 : 乳 酸 链 球 菌, 乳 酸 杆 菌 等 2. 鲜 牛 奶 ( 或 奶 粉 ), 蔗 糖,Agar 和 食 用 香 精 等 3. 试 管, 锥 形 瓶, 奶 瓶, 铝 锅, 培 养 箱 和 洁 净 工 作 台 等 四 方 法 与 步 骤 1. 乳 酸 菌 种 的 培 养 斜 面 培 养 脱 脂 奶 试 管 锥 形 瓶 扩 大 制 备 生 产 发 酵 剂 (1) 斜 面 保 存 培 养 基 :MRS 培 养 基,pH 灭 菌 条 件 :0.1MPa,121 30min, 培 养 时 间 为 41-42,24h (2) 斜 面 传 代 培 养 基 :A. 脱 脂 奶 粉 100g 溶 于 1000ml 蒸 馏 水 中, 煮 沸 溶 解, 于 121 灭 菌 10min B.25-30g Agar 及 2.5g 酵 母 膏 加 入 300ml 蒸 馏 水 中, 煮 沸 溶 解,0.1MPa,121 灭 菌 20min 趁 热 将 A 与 B 混 合, 制 成 斜 面 培 养 时 间 为 41-42,24h (3) 试 管 培 养 基 : 脱 脂 奶 粉 120g 溶 于 1000ml 蒸 馏 水 中, 于 95 保 持 20min, 间 歇 灭 菌 三 次 培 养 时 间 为 42-43,5-7h (4) 锥 形 瓶 培 养 基 : 组 成 同 试 管 培 养 基, 用 自 来 水 代 替 蒸 馏 水 培 养 时 间 为 43-45,2-3h, 再 扩 大 培 养 时 可 培 养 1.5-3h 2. 发 酵 乳 ( 培 养 基 ) 的 制 备 将 鲜 牛 奶 ( 或 奶 粉 按 1:7 比 例 复 原 牛 奶 溶 液 ) 倒 入 量 筒 中, 剂 量 其 体 积, 然 后 根 据 需 要 加 入 各 种 添 加 剂 ( 如 加 入 8% 的 蔗 糖 等 ), 用 巴 氏 消 毒 法 进 行 灭 菌 ( 如 100 1min 或 118 3s), 降 温 至 接 种 17

19 在 无 菌 操 作 条 件 下, 按 3%-5% 的 种 量 接 入 发 酵 剂, 搅 拌 均 匀, 分 装 在 各 奶 瓶 中, 封 口 4. 培 养 将 各 奶 瓶 置 于 下 培 养 3-4h, 待 蛋 白 质 凝 结 成 乳 酪 状 后, 再 于 4-7 下 贮 存 24h 以 上 5. 品 评 ( 检 测 ) 取 出 酸 奶, 观 察 其 凝 固 情 况, 闻 气 味 品 尝 其 质 量 以 品 尝 为 准, 以 有 凝 块 状 表 面 光 洁, 酸 度 适 中 芳 香 不 能 有 异 味 否 则, 应 取 样 检 测 其 乳 酸 菌 的 生 长 情 况 及 污 染 情 况 五 实 验 报 告 1. 结 果 根 据 你 检 测 的 结 果, 自 己 对 该 方 法 的 掌 握 情 况 作 一 简 单 评 价 2. 思 考 题 (1) 在 酸 奶 制 作 过 程 中 有 哪 些 注 意 事 项? (2) 你 能 用 鲜 奶 自 然 发 酵 生 产 酸 奶 吗? 如 何 控 制? 附 录 一 : 两 种 培 养 基 1.MRS 培 养 基 蛋 白 胨 10g 牛 肉 膏 10g 酵 母 粉 5g C6H12O6 20g 土 温 80 1g 柠 檬 酸 铵 2g MgSO4 0.1g MnSO4 0.05g CH2COONa 5g Na2HPO4 2g Agar 15g 蒸 馏 水 1000ml ph 乳 酸 菌 种 培 养 基 脱 脂 牛 奶 10-12% CaCO3 2% 酵 母 膏 0.3% 蛋 白 胨 1.5% Agar 2% ph kg/cm 2 灭 菌 20min 18

20 附 录 二 凝 固 型 酸 牛 奶 配 方 1. 高 脂 酸 奶 ( 含 脂 大 于 6%) 全 脂 牛 奶 83% 奶 油 4% 白 砂 糖 8% 发 酵 剂 5% 2. 全 脂 酸 奶 ( 含 脂 大 于 3%) 全 脂 鲜 牛 奶 89% 白 砂 糖 8% 发 酵 剂 3% 3. 脱 脂 酸 奶 ( 含 脂 小 于 0.3%) 全 脂 鲜 牛 奶 89% 白 砂 糖 8% 发 酵 剂 3% 4. 蜂 蜜 酸 奶 全 脂 鲜 牛 奶 87% 蜂 蜜 8% 白 砂 糖 2% 发 酵 剂 3% 5. 早 餐 酸 奶 全 脂 鲜 牛 奶 83.7% 白 砂 糖 7% 大 麦 2% 小 麦 2% 果 仁 1% 复 合 稳 定 剂 0.3% 发 酵 剂 4% 6. 茶 叶 酸 奶 全 脂 酸 奶 84.73% 白 砂 糖 5% 食 盐 0.25% 发 酵 剂 5% 茉 莉 花 香 精 0.02% 茶 汁 ( 浓 度 25%)5% 7. 酒 味 酸 奶 全 脂 鲜 奶 75.75% 稀 奶 油 5% 白 砂 糖 7% 果 糖 2% 葡 萄 糖 酒 5.5% 淀 粉 0.75% 发 酵 剂 4% 8. 椰 子 酸 奶 全 脂 鲜 奶 64% 白 砂 糖 8% 乳 清 粉 1.5% 酪 蛋 白 酸 钠 2.5% 椰 子 原 汁 20% 椰 子 香 精 0.01% 发 酵 剂 4% 9. 菠 萝 酸 奶 ( 上 浮 果 料 块 ) 脱 脂 鲜 奶 81.45% 白 砂 糖 5% 鲜 菠 萝 块 (0.25cm 3 )3% 菠 萝 香 精 0.05% 19

21 姜 鱼 色 素 0.15ml/Kg 发 酵 剂 3% 10. 食 用 菌 酸 奶 全 脂 鲜 奶 83.9% 白 砂 糖 8% 黄 原 胶 0.15% 灵 芝 冬 虫 夏 草 丝 5% 发 酵 剂 3.5% 附 录 三 : 搅 拌 型 酸 奶 生 产 工 艺 流 程 脱 脂 奶 粉 重 组 全 脂 鲜 奶 新 鲜 脱 脂 鲜 奶 或 全 脂 奶 无 水 黄 油 过 滤 添 加 剂 配 料 预 热 60 均 质 Kg/cm 3 杀 菌 90 5min(118,3s) 冷 却 45 辅 料 搅 拌 均 匀 灌 装 冷 却 后 熟

22 搅 拌 型 酸 牛 奶 的 配 方 与 凝 固 型 相 似 发 酵 工 艺 学 实 验 教 材 21

23 实 验 五 啤 酒 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 啤 酒 发 酵 的 原 理 2. 学 习 发 酵 过 程 的 中 间 控 制 方 法 3. 了 解 啤 酒 的 工 业 生 产 方 法 二 基 本 原 理 以 大 麦 和 其 它 谷 物 为 原 料, 并 添 加 少 量 酒 花, 利 用 制 麦 芽 糖 化 和 发 酵 等 特 定 工 艺 酿 制 而 成 的 一 种 低 度 酿 造 酒 啤 酒 1. 其 生 产 工 艺 过 程 为 : 麦 芽 糖 辅 料 粉 水 糊 化 糖 化 过 滤 煮 沸 麦 芽 汁 酵 母 (7-12 ) 前 发 酵 -1-0 后 发 酵 过 滤 嫩 啤 酒 装 瓶 杀 菌 成 品 啤 酒 的 生 产 过 程 可 分 为 制 麦 芽 糖 化 发 酵 及 后 处 理 等 四 大 工 序, 共 有 20 多 个 步 骤 啤 酒 的 发 酵 分 为 前 发 酵 和 后 发 酵 两 个 阶 段 酵 母 液 由 增 殖 池 倒 入 主 发 酵 池 后, 其 溶 解 氧 已 基 本 耗 尽, 与 新 鲜 麦 汁 混 匀 后 进 行 为 期 5-10d 的 主 发 酵, 起 始 稳 定 为 5-7, 发 酵 过 程 控 制 温 度 8-10, 最 终 降 为 外 观 糖 度 从 12% 降 至 3.5%-5.5%, 前 发 酵 完 成 后 的 发 酵 液 呈 嫩 啤 酒 或 新 酒, 应 经 较 长 时 间 的 后 发 酵 后 才 可 以 饮 用 后 发 酵 也 称 为 后 熟 或 贮 藏 阶 段, 后 发 酵 期 间 的 管 理 主 要 有 酒 龄 温 度 罐 压 及 酒 质 等 四 项 指 标 酒 龄 即 后 发 酵 周 期, 一 般 为 12 Bx 啤 酒 35-45d 温 度 前 期 控 制 在 2-3, 后 期 为 -1-1 CO2 的 压 力 保 持 在 40 KPa 到 50KPa 在 发 酵 后 期, 还 应 定 期 用 烧 杯 取 酒 样 观 察 澄 清 度 和 品 尝 口 味, 检 查 是 否 污 染 杂 菌, 如 发 现 问 题 应 及 时 采 取 相 应 措 施 22

24 2. 前 发 酵 过 程 的 主 要 物 质 变 化 (1) 糖 的 发 酵 1/2C12H22O11+1/2H2O+2CH2H5OH+2CO2+11KJ 在 生 成 乙 醇 和 CO2 的 同 时 尚 有 许 多 杂 醇 油 : 乙 醛 双 乙 酰 有 机 酸 和 酯 类 等 风 味 物 质 的 形 成 (2) 含 氮 物 质 的 变 化 在 发 酵 过 程 中, 麦 汁 中 各 类 含 氮 物 质 的 总 量 均 下 降 1/3 其 中 一 部 分 氨 基 酸 及 低 分 子 肽 被 用 于 酵 母 菌 繁 殖, 另 一 部 分 蛋 白 质 - 多 酚 物 质 复 合 物 沉 淀 析 出 另 外 酵 母 表 面 附 着 一 些 蛋 白 质, 泡 盖 也 带 走 一 部 分 蛋 白 质 3. 后 发 酵 的 物 质 变 化 主 要 是 在 低 温 下 进 一 步 完 成 前 发 酵 未 完 成 的 发 酵 过 程, 同 时 形 成 一 些 风 味 物 质 的 成 份, 即 后 熟 过 程 三 实 验 材 料 1. 啤 酒 酵 母 : 下 层 啤 酒 酵 母 2. 大 麦 芽, 大 米, 酒 花 3. 锥 形 瓶 250ml, 糊 化 杯, 糖 化 杯, 天 平, 温 度 计, 电 热 恒 温 培 养 箱, 电 炉 和 双 人 净 化 工 作 台 等 四 方 法 与 步 骤 1. 麦 芽 汁 的 制 备 称 取 大 麦 芽 140g, 大 米 60g, 加 水 390ml 在 45 下 糊 化 20min, 然 后 再 65 下 保 温 60min, 静 置 10min 过 滤, 煮 沸 得 原 麦 汁 2. 酵 母 培 养 斜 面 菌 种 25,24h 5ml 麦 芽 汁 试 管 活 化 25,24h 麦 芽 汁 试 23

25 管 25,24h 250ml 麦 汁 试 管 备 用 3. 前 发 酵 麦 芽 汁 ,5 10d 发 酵 嫩 啤 酒 4. 后 发 酵 5. 品 评 嫩 啤 酒 2-1,45d 酵 母 啤 酒 取 啤 酒 样 品, 观 察 其 外 观, 即 颜 色 泡 沫 等 闻 气 味, 并 品 尝, 要 求 清 爽 泡 沫 丰 富, 具 有 一 定 的 杀 口 力 五 实 验 报 告 1. 结 果 品 评 啤 酒, 并 对 实 验 结 果 进 行 讨 论 2. 思 考 题 (1) 如 何 制 备 麦 芽 汁? (2) 在 啤 酒 发 酵 过 程 中 应 注 意 什 么? 24

26 实 验 六 醋 酸 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 醋 酸 发 酵 的 原 理 2. 学 习 好 气 性 微 生 物 的 培 养 方 法 3. 了 解 生 物 转 化 在 发 酵 工 业 上 的 意 义 4. 了 解 食 醋 的 生 产 方 法 二 基 本 原 理 微 生 物 将 乙 醇 氧 化 成 醋 酸 的 过 程, 称 为 醋 酸 发 酵 进 行 醋 酸 发 酵 的 微 生 物 主 要 是 醋 酸 菌, 这 些 细 菌 在 有 氧 条 件 下, 通 过 有 氧 呼 吸 过 程 将 乙 醇 氧 化 成 醋 酸, 从 而 获 得 能 量 反 应 过 程 如 下 : CH3CH2OH+O2 HAc 菌 CH3COOH+H2O+ATP 醋 酸 菌 还 可 以 使 自 然 界 中 其 它 带 有 醇 基 和 醛 基 的 一 有 机 物 进 行 类 似 的 氧 化 作 用 例 如 在 酸 败 的 水 果 中, 醋 酸 菌 使 葡 萄 糖 氧 化 成 葡 萄 糖 酸 食 醋 酿 造 就 是 利 用 醋 酸 发 酵 的 原 理 进 行 的 其 特 点 是 在 生 产 过 程 中 要 充 分 供 氧, 醋 酸 菌 生 活 在 与 醋 酸 共 存 的 低 ph 环 境 中, 利 用 糖 质 原 料 发 酵 生 成 醋 酸 主 要 生 产 菌 种 有 醋 酸 杆 菌 属 (Acetobacter) 葡 萄 糖 杆 菌 属 (Gluconobacter) 等 醋 酸 菌, 醋 酸 杆 菌 (A.aceti) 是 具 有 代 表 性 的 优 良 菌 种 传 统 的 食 醋 生 产, 是 利 用 淀 粉 质 原 料 虽 然 醋 酸 菌 不 能 直 接 利 用 淀 粉, 但 是 在 接 入 的 曲 种 中, 不 仅 含 有 醋 酸 菌 酵 母 菌, 而 且 含 有 淀 粉 原 料 糖 化 的 黑 曲 霉 和 黑 根 霉 其 生 化 反 应 过 程 如 下 : 霉 菌 酵 母 菌 醋 酸 菌 淀 粉 糖 乙 醇 醋 在 有 氧 条 件 下 在 无 氧 条 件 下 在 有 氧 条 件 下 虽 然 工 艺 过 程 简 单, 但 生 产 过 程 劳 动 强 度 较 大, 发 酵 时 间 长 本 实 验 25

27 采 用 乙 醇 培 养 醋 酸 菌 的 方 法 进 行 三 实 验 材 料 1. 菌 种 : 醋 酸 菌 2.95% 乙 醇, 牛 肉 膏, 蛋 白 胨,NaCl,pH 试 纸 等 3. 冰 箱, 洁 净 工 作 台 和 恒 温 振 荡 培 养 器 四 方 法 与 步 骤 ( 一 ) 醋 酸 菌 种 的 培 养 1. 制 作 牛 肉 膏 蛋 白 胨 液 体 培 养 基 300ml 2. 分 装 入 容 量 为 150ml 的 锥 形 瓶 中 ( 装 30ml) 3. 灭 菌,0.1MPa,121 20min 4. 冷 却 接 种 HAc 菌 5. 置 恒 温 振 荡 器 30 下 培 养 24h 6. 镜 检 : 成 熟 的 菌 种 要 求 菌 体 数 量 多 生 长 健 壮, 无 杂 菌 菌 体 整 齐 ( 二 ) 发 酵 : 1. 配 制 培 养 基 将 95% 的 乙 醇 ( 食 用 级 ) 用 无 菌 水 以 无 菌 操 作 方 法 稀 释 到 5.5% 左 右 600ml, 作 为 发 酵 培 养 基 2. 分 装 将 上 述 培 养 基 分 装 于 150ml 无 菌 三 角 瓶 中, 每 瓶 装 30ml 3. 接 种 将 培 养 成 熟 的 菌 种 接 入 发 酵 培 养 基 中, 种 量 为 3% 4. 培 养 将 接 种 后 的 锥 形 瓶 置 于 恒 温 震 荡 培 养 器, 在 28 下 培 养 72h, 或 者 静 26

28 置 培 养, 但 在 培 养 过 程 中, 每 隔 一 段 时 间 应 摇 动 一 下 锥 形 瓶 5. 检 验 在 发 酵 结 束 时, 可 闻 到 醋 味, 用 ph 试 纸 检 查 即 可 发 现 有 HAc 产 生 五 实 验 报 告 1. 结 果 品 评 醋 酸 溶 液 2. 思 考 题 (1) 醋 酸 生 产 中 应 注 意 什 么 问 题? (2) 为 什 么 传 统 的 食 醋 生 产 中 要 加 入 种 曲? (3) 液 体 发 酵 法 生 产 食 醋 有 何 优 缺 点? 附 录 : 醋 酸 菌 种 培 养 基 组 成 : 牛 肉 膏 0.3%, 蛋 白 胨 1%,NaCl0.5%,Agar 2%,pH 7.2,0.1MPa,121 灭 菌 30min 27

29 实 验 七 微 生 物 多 糖 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 并 掌 握 通 气 对 好 气 性 微 生 物 发 酵 的 影 响 2. 学 习 微 生 物 多 糖 发 酵 的 原 理 3. 了 解 微 生 物 多 糖 在 工 农 业 生 产 中 的 应 用 二 基 本 原 理 黄 原 胶 是 由 野 油 菜 单 胞 杆 菌 经 发 酵 产 生 的 一 种 微 生 物 多 糖, 六 十 年 代 初 由 美 国 农 业 部 北 方 地 区 研 究 所 发 现 由 于 它 具 有 其 它 多 糖 类 物 质 所 没 有 的 独 特 性 能, 可 以 作 为 优 良 的 增 稠 剂 悬 浮 剂 分 散 剂 乳 化 剂 及 稳 定 剂 因 此, 在 美 国 加 拿 大 英 国 法 国 和 德 国 等 国 家 广 泛 用 于 石 油 工 业 食 品 工 业 以 及 纺 织 印 染 陶 瓷 炸 药 和 涂 料 等 方 面 近 年 来, 我 国 研 究 生 产, 应 用 开 发 黄 原 胶 的 工 作 得 到 迅 速 发 展, 已 筛 选 出 了 几 株 具 有 优 良 性 能 的 黄 原 胶 生 产 菌 种 如 四 川 抗 生 素 工 业 研 究 所 筛 选 得 到 Axc 58 或 Axc 85213, 天 津 南 开 大 学 筛 选 的 NK-01, 以 及 中 国 科 学 院 微 生 物 研 究 所 和 河 南 省 食 品 发 酵 研 究 所 等 都 分 别 以 野 油 菜 黄 单 胞 菌 为 出 发 菌 株, 筛 选 得 到 一 些 优 良 的 生 产 菌 种 黄 单 胞 菌 是 一 种 好 气 菌, 实 验 室 采 用 摇 瓶 进 行 培 养, 也 可 以 采 用 小 型 (20L) 不 锈 钢 ( 或 玻 璃 钢 ) 发 酵 罐 进 行 培 养 培 养 基 所 使 用 的 碳 源 有 淀 粉 葡 萄 糖 和 蔗 糖 等, 氮 源 有 KNO3 NaNO3 Ca(NO3) NH4NO3 NH4Cl 尿 素 蛋 白 胨 酵 母 膏 牛 肉 膏 黄 豆 粉 和 鱼 粉 等 此 外 还 要 添 加 一 些 无 机 盐, 如 K2HPO4,MgSO4 及 其 它 微 量 元 素, 发 酵 初 期 近 中 性,pH 一 般 为 , 发 酵 温 度 为 28-30, 发 酵 过 程 要 注 意 保 持 ph 在 中 性 附 近, 同 时 要 适 量 通 风 发 酵 结 束 后, 先 测 定 黄 原 胶 的 粘 度, 再 提 取 黄 原 胶 对 于 工 业 产 品 来 28

30 说, 不 必 除 菌 体, 可 直 接 用 真 空 浓 缩 发 酵 液 3-4 倍, 然 后 用 喷 雾 干 燥 的 方 法 进 行 干 燥, 直 接 回 收 也 可 调 节 ph, 添 加 沉 淀 剂, 如 氯 化 钙 或 季 铵 盐 等 使 其 沉 淀 后 分 离 干 燥 还 可 采 用 加 有 机 溶 剂, 如 乙 醇 甲 醇 和 异 丙 醇 等 直 接 沉 淀 对 于 食 品 级 产 品 来 说, 需 将 发 酵 液 稀 释, 然 后 用 硅 藻 土 过 滤 除 去 菌 体, 再 采 用 上 述 方 法 制 得 产 品 黄 原 胶 在 食 品 工 业 上 的 使 用 浓 度 为 0.05%-0.5%, 在 其 它 工 业 上 的 使 用 量 一 般 为 0.05%-0.2% 左 右 本 实 验 采 用 Axc 菌 种, 其 形 态 特 征 为 : 菌 体 细 菌 为 短 杆 状, 革 兰 氏 染 色 阴 性, 产 生 夹 膜, 具 有 多 型 性, 细 胞 大 小 为 微 米 菌 种 在 斜 面 培 养 基 上, 可 生 长 成 厚 厚 的 一 层 黄 色 或 浅 黄 色 粘 稠 而 光 滑 的 菌 苔, 在 平 板 上 有 大 小 菌 落 之 分, 菌 落 呈 圆 形 光 滑 粘 稠, 边 缘 整 齐 三 实 验 材 料 1. 菌 种 : 野 油 菜 黄 单 胞 杆 菌 (Xanthomonas campestris) 2. 恒 温 震 荡 培 养 器 r/min 3. 锥 形 瓶 纱 布 牛 皮 纸 线 绳 和 接 种 工 具 等 4. 高 压 灭 菌 锅 洁 净 工 作 台 NDJ-1 型 旋 转 粘 度 计 ( 上 海 天 平 仪 器 厂 生 产 ) 5. 培 养 基 ( 略 ) 四 方 法 与 步 骤 1. 培 养 基 的 制 备 斜 面 培 养 基 组 成 : 淀 粉 1% 蔗 糖 2% NaNO3 0.1% MgSO4 0.05% K2HPO4 0.05% ph7.0 + H2O 1000ml 按 配 方 配 好 培 养 基 分 装 于 10 只 500ml 锥 形 瓶 中, 瓶 口 用 八 层 纱 布 封 口, 用 牛 皮 纸 包 扎,0.1MPa,121 灭 菌 30min, 取 出 冷 却 至 30 左 右 29

31 2. 接 种 待 培 养 基 冷 却 至 30 时, 在 无 菌 条 件 下, 每 瓶 接 入 一 环 在 斜 面 培 养 成 熟 的 黄 原 胶 菌 种, 并 做 好 标 记 3. 摇 瓶 发 酵 将 锥 形 瓶 固 定 在 恒 温 振 荡 培 养 器 上, 在 下 恒 温 震 荡 培 养 72h 以 上, 测 定 粘 度 ph 值 等 五 实 验 报 告 1. 结 果 : 将 测 量 锥 形 瓶 中 发 酵 液 的 粘 度 ph 值 色 泽 产 胶 率 和 转 化 率 分 别 填 入 下 表, 并 做 镜 检 是 否 染 菌 2. 思 考 题 (1) 在 粘 度 的 测 定 过 程 中 应 注 意 哪 些 问 题? 为 什 么? (2) 黄 原 胶 在 工 业 生 产 中 有 何 用 途? 三 角 瓶 摇 瓶 结 果 记 录 瓶 号 粘 度 产 胶 率 转 化 率 ph 值 色 泽 染 菌 否 结 论 实 验 八 甜 酒 酿 的 酿 制 30

32 一 目 的 要 求 1. 学 习 甜 酒 酿 的 酿 制 方 法 2. 学 习 根 霉 的 分 离 纯 化 及 培 养 方 法 二 基 本 原 理 甜 酒 酿 因 其 具 有 香 甜 醇 味 而 倍 受 喜 爱, 酿 制 历 史 悠 久 其 酿 制 实 质 是 一 种 混 合 微 生 物 的 序 列 发 酵 过 程 初 步 学 会 和 掌 握 酿 制 方 法 并 不 难, 但 要 酿 制 出 甜 醇 可 口 的 佳 酿 却 非 易 事 其 方 法 要 点 为 : 酒 酿 种 曲 质 量 优 良, 即 种 曲 中 应 含 有 糖 化 率 高 的 优 质 根 霉 孢 子 或 菌 丝 体 ; 优 质 的 糯 米 ; 严 格 无 菌 操 作, 尽 量 避 免 杂 菌 污 染 和 合 理 控 制 酿 制 条 件 等 酿 制 甜 酒 酿 的 原 理 较 简 单, 即 将 糯 米 煮 熟 后, 降 温 至 室 温 时 接 种 酒 酿 种 曲, 然 后 在 适 宜 的 条 件 下 培 养, 使 种 曲 中 的 根 霉 孢 子 萌 发 成 菌 丝 体, 经 大 量 繁 殖 后 通 过 淀 粉 酶 的 作 用 将 淀 粉 转 化 为 葡 萄 糖 根 霉 糖 化 之 后 再 由 根 霉 或 种 曲 中 所 含 的 酵 母 菌 ( 或 野 生 酵 母 ) 继 续 将 糖 化 后 的 部 分 葡 萄 糖 转 化 为 乙 醇 经 过 后 熟 使 甜 酒 酿 具 有 独 特 的 甜 醇 口 味 三 实 验 材 料 1. 菌 种 : 市 售 甜 酒 曲 或 自 制 酒 曲 2. 培 养 基 : 糯 米 马 铃 薯 等 3. 其 它 : 研 钵 烧 杯 瓷 盆 盘 培 养 箱 冰 箱 和 电 炉 等 四 方 法 与 步 骤 1. 选 择 原 料 : 选 择 品 质 好 米 质 新 鲜 的 糯 米 2. 蒸 煮 将 米 淘 干 净 后 浸 泡 过 夜, 使 米 粒 充 分 吸 水, 以 利 蒸 煮 时 米 粒 分 散 和 熟 透 均 匀 将 吸 水 充 足 的 糯 米 捞 起, 放 在 蒸 锅 内 搁 架 的 纱 布 上 隔 水 蒸 煮, 至 31

33 米 完 全 熟 透 为 止, 然 后 从 锅 内 取 出, 在 室 温 下 摊 开 冷 却 至 30 左 右 3. 接 入 种 曲 按 干 糯 米 重 量 换 算 接 种 量, 一 般 用 量 为 每 50g 甜 酒 药 酿 制 2-3kg 糯 米 ( 或 先 做 预 备 实 验 确 定 其 用 量 ) 为 了 使 接 种 均 匀, 可 先 将 酒 药 块 在 研 钵 中 捣 碎 后, 再 与 糯 米 拌 匀 4. 发 酵 接 种 后 的 糯 米 可 装 坛 发 酵 ( 通 常 在 坛 子 中 间 留 一 道 散 热 孔 ) 发 酵 温 度 可 控 制 在 30 左 右, 发 酵 初 期 可 见 米 饭 表 面 产 生 大 量 纵 横 交 错 的 菌 丝 体, 同 时 糯 米 饭 的 粘 度 逐 渐 下 降, 糖 化 液 渐 渐 溢 出 和 增 多, 若 在 发 酵 中 米 饭 出 现 干 燥 时, 可 在 培 养 18-24h 后 补 加 一 些 凉 开 水 5 后 热 ( 发 酵 ) 48h 后, 甜 酒 就 酿 已 初 步 成 熟, 但 往 往 略 带 酸 味 这 时 可 将 坛 置 于 8-10 下 继 续 培 养 2-3d 或 更 长 一 段 时 间 进 行 后 发 酵, 则 可 去 尽 酸 味 6. 品 评 : 成 熟 的 甜 酒 酿 酒 香 浓 郁, 醪 液 充 沛, 清 澈 半 透 明 和 甜 醇 爽 口 注 意 : 淘 洗 的 糯 米 要 充 分 吸 水 后 隔 水 蒸 煮 熟 透, 使 饭 粒 饱 满 分 散, 利 于 接 种 后 的 根 霉 孢 子 能 在 输 送 透 气 的 条 件 下 良 好 的 生 长 繁 殖, 使 淀 粉 充 分 糖 化 五 实 验 报 告 1. 结 果 从 甜 酒 酿 的 外 观 ( 酿 醅 团 块 醪 液 量 色 泽 和 粘 稠 度 等 ) 和 香 味, 口 感 等 方 面 评 估 自 己 酿 制 甜 酒 酿 的 质 量 2. 思 考 题 (1) 酿 制 甜 酒 酿 的 甜 酒 曲 中 主 要 含 有 何 种 微 生 物? 它 的 发 酵 原 理 是 什 32

34 么? (2) 刚 酿 制 成 的 酒 酿 往 往 带 有 酸 味, 经 低 温 存 放 ( 或 称 后 熟 ) 后 则 酸 味 消 失, 并 获 得 醇 香 的 风 味, 其 原 因 是 什 么? 附 录 : 甜 酒 曲 中 根 霉 德 分 离 纯 化 和 鉴 定 甜 酒 曲 的 优 劣 势 酿 制 甜 酒 酿 的 关 键 因 此, 选 育 优 良 的 菌 种, 便 可 以 便 生 产 优 质 的 酒 曲 酒 曲 中 根 霉 的 分 离 纯 化 和 初 步 鉴 定 方 法 如 下 : 1. 配 制 培 养 基 : 配 制 PDA 培 养 基, 灭 菌 倒 平 皿 备 用 2. 根 霉 的 分 离 : (1) 稀 释 涂 布 法 : 与 其 它 微 生 物 的 稀 释 操 作 法 相 同 先 将 酒 曲 在 置 有 玻 璃 珠 的 三 角 瓶 中 打 散 成 孢 子 悬 浮 液, 然 后 以 10 倍 系 列 稀 释 法 稀 释, 此 法 也 可 作 为 计 数 酒 曲 的 孢 子 含 量 的 方 法 ( 曲 中 含 菌 数 是 酒 曲 质 量 控 制 的 标 准 之 一 ) (2) 稀 释 划 线 法 : 用 接 种 环 取 适 当 稀 释 度 的 孢 子 悬 浮 液 在 PDA 平 板 表 面 作 划 线 分 离 接 种, 以 获 取 单 菌 落 3. 挑 取 纯 菌 落 : 将 分 离 效 果 好 的 根 霉 单 菌 落 及 时 移 接 到 新 鲜 斜 面 上, 观 察 其 生 长 情 况 及 形 态 特 征 4. 初 步 鉴 定 : 用 载 片 培 养 法 初 步 观 察 根 霉 的 假 根 孢 子 囊 孢 囊 孢 子 等 形 态 特 征 市 售 甜 酒 曲 中 常 见 的 根 霉 味 米 根 霉 (Rhizopus oryxae), 有 时 也 有 华 根 霉 (R.chinensis), 故 可 根 据 此 两 种 根 霉 的 特 征 来 判 断 酒 曲 的 优 劣 若 分 离 到 的 单 菌 落 大 多 为 非 根 霉 菌 的 丝 状 真 菌, 则 该 酒 曲 质 量 太 差, 应 舍 弃 不 用 5. 糖 化 试 验 : 分 离 得 到 的 根 霉 菌 应 作 糖 化 试 验, 以 确 定 其 糖 化 的 速 率 和 糖 化 率 的 高 低, 方 法 如 下 : 33

35 (1) 蒸 煮 糯 米 : 每 只 250ml 三 角 瓶 内 装 干 糯 米 10g, 经 淘 洗 干 净 并 让 其 吸 足 水 分 后 再 加 压 蒸 汽 灭 菌 锅 内 蒸 煮 灭 菌 成 米 饭, 蒸 熟 后 趁 热 打 散 (2) 接 种 根 霉 : 分 别 将 各 单 菌 落 斜 面 根 霉 菌 种 接 入 相 应 的 三 角 烧 瓶 米 饭 中, 每 支 斜 面 接 3 只 重 复 三 角 瓶, 接 种 后 将 米 饭 与 菌 种 拌 匀 (3) 糖 化 培 养 : 打 开 三 角 瓶 口 的 8 层 无 菌 纱 布, 扎 好 瓶 口, 置 于 28 恒 温 培 养 箱 中 培 养 24h, 之 后 将 各 三 角 瓶 再 次 拍 匀, 继 续 培 养 至 糖 化 彻 底 为 止 (4) 肉 眼 观 察 : 在 培 养 过 程 中, 可 观 察 根 霉 菌 的 生 长 特 征 和 初 步 判 断 其 糖 化 速 度 ( 即 视 其 米 饭 粘 度 下 降 出 液 时 间 和 米 粒 糊 化 情 况 等 ), 并 作 记 录 (5) 测 定 糖 化 率 : 将 培 养 至 48-72h 的 培 养 物, 统 一 用 碘 量 法 测 定 据 此 判 断 根 霉 菌 种 的 糖 化 率, 从 而 确 定 各 种 曲 的 特 点 和 优 劣 实 验 九 谷 氨 酸 的 提 取 34

36 一 目 的 要 求 1. 了 解 谷 氨 酸 发 酵 醪 的 一 般 性 质 2. 学 习 并 掌 握 提 取 谷 氨 酸 的 方 法 二 基 本 原 理 谷 氨 酸 发 酵 液 是 以 葡 萄 糖 尿 素 等 为 主 要 培 养 成 分 所 进 行 的 细 菌 类 发 酵, 所 以 谷 氨 酸 的 含 量 一 般 为 4%-8%, 以 谷 氨 酸 铵 盐 的 形 式 存 在 还 有 总 量 0.5% 以 下 的 其 它 氨 基 酸 ( 如 丙 氨 酸 天 门 冬 氨 酸 焦 谷 氨 酸 等 ) 腺 嘌 呤 有 机 酸 ( 主 要 为 乳 酸 和 丙 酮 酸 ) 1% 以 下 的 葡 萄 糖 0.5%-0.8% 的 NH4+ 微 量 的 K + Na + Mg 2+ Ca 2+ Fe 2+ Cl + 3- SO42- 和 PO4 有 机 分 子 离 子 有 机 色 素 以 及 约 0.9% 的 干 菌 体 这 些 杂 物 不 仅 影 响 谷 氨 酸 的 提 取, 而 且 还 使 谷 氨 酸 的 提 取 废 液 污 染 环 境, 特 别 是 菌 体 NH4+ 蛋 白 质 和 其 它 氨 基 酸 等 在 提 取 谷 氨 酸 时 必 须 考 虑 这 些 因 素 的 影 响 在 选 择 提 取 谷 氨 酸 方 法 时 应 以 工 艺 简 单 提 取 效 率 高 产 品 纯 度 高 劳 动 强 度 小 设 备 简 单, 原 材 料 药 品 价 廉 来 源 广 国 内 一 般 采 用 的 方 法 有 : 等 电 点 法 离 子 交 换 法 盐 酸 盐 法 和 锌 盐 法 也 可 以 将 这 几 种 方 法 结 合 使 用 本 实 验 采 用 等 电 点 法, 工 艺 流 程 如 下 : 发 酵 液 加 盐 酸 ph ( 育 晶 2h) 加 盐 酸 ph 降 温 不 停 搅 拌 16h 离 心 分 离 ( 母 液 ) 谷 氨 酸 三 材 料 1. 谷 氨 酸 ( 或 谷 氨 酸 发 酵 液 ) 2. 浓 盐 酸, 氢 氧 化 钠 3. 搅 拌 机 (50w) 35

37 4. 其 它 :500ml 烧 杯 瓷 杯 玻 璃 棒 和 试 纸 等 四 方 法 与 步 骤 1. 谷 氨 酸 的 溶 解 : 每 组 称 取 谷 氨 酸 13g, 溶 解 在 盛 有 200ml 水 的 烧 杯 中, 制 成 谷 氨 酸 溶 液 ( 或 发 酵 液 ) 备 用 2. 向 烧 杯 中 缓 慢 加 入 浓 盐 酸 至 溶 液 的 ph 值 至 , 注 意 酸 不 能 加 得 过 快, 否 则 会 生 成 大 量 晶 核, 使 谷 氨 酸 颗 粒 太 小, 产 量 太 低 3. 停 止 加 酸 育 晶 2h, 必 要 时 可 加 入 晶 种 4. 继 续 缓 慢 加 入 浓 盐 酸, 至 ph 值 为 停 止 搅 拌 16h 同 时 进 行 降 温, 温 度 越 低 越 好 6. 过 滤, 烘 干, 称 量 7. 计 算 提 取 效 率 : 提 取 率 = 提 取 所 得 谷 氨 酸 质 量 (g) 溶 液 中 的 谷 氨 酸 总 含 量 (g) 100% 注 意 : 等 电 点 的 ph 值 一 定 要 正 确, 通 过 复 测, 严 格 控 制 在 工 艺 要 求 的 范 围 内 离 心 分 离 时 间 要 充 分, 使 母 液 分 离 干 净 五 实 验 报 告 1. 结 果 将 实 验 结 果 填 入 下 表 并 算 出 提 取 率 和 平 均 提 取 率 组 别 谷 氨 酸 重 (g) 提 取 物 重 (g) 提 取 率 平 均 提 取 率 2. 思 考 题 36

38 (1) 谷 氨 酸 的 发 酵 液 有 何 特 点? (2) 根 据 实 验 数 据, 对 你 的 结 果 作 一 简 要 说 明 实 验 十 诱 变 育 种 37

39 一 目 的 要 求 1. 学 习 发 酵 工 业 菌 种 的 育 种 原 理 2. 熟 悉 诱 变 育 种 的 方 法 3. 了 解 育 种 在 工 业 生 产 中 的 应 用 二 基 本 原 理 微 生 物 诱 变 育 种 技 术 对 发 酵 工 业 建 立 了 不 朽 的 功 勋, 生 产 菌 种 均 是 经 诱 变 育 种 而 大 幅 度 提 高 产 量 但 随 着 生 物 技 术 的 飞 速 发 展, 育 种 的 方 法 多 样 化, 但 诱 变 育 种 仍 是 一 种 育 种 的 好 方 法 微 生 物 菌 种 的 质 量 对 工 业 生 产 有 极 其 重 要 的 影 响, 其 基 础 是 生 物 体 的 遗 传 变 异 规 律 诱 变 育 种 是 以 人 工 诱 发 基 因 突 变 或 染 色 体 畸 变 为 基 础, 方 法 有 物 理 诱 变 ( 如 紫 外 线 X 射 线 等 ), 化 学 诱 变 ( 如 硫 酸 二 乙 酯 亚 硝 基 胍 等 ) 本 实 验 用 紫 外 线 作 诱 变 剂 进 行 诱 变 以 产 生 淀 粉 酶 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 BF-7658 为 出 发 菌 株 根 据 枯 草 芽 孢 杆 菌 BF-7658 诱 变 后 在 淀 粉 培 养 基 上 透 明 圈 直 径 的 大 小, 来 指 示 诱 变 效 应 一 般 透 明 圈 越 大, 淀 粉 酶 活 性 越 强 三 材 料 1. 菌 种 : 枯 草 芽 孢 杆 菌 BF 淀 粉 培 养 基, 吸 管, 无 菌 试 管, 无 菌 生 理 盐 水, 玻 璃 刮 棒, 血 球 计 数 板, 紫 外 灯 (15w) 等 3. 显 微 镜, 电 炉, 灭 菌 锅, 冰 箱, 超 净 工 作 台 和 培 养 箱 等 四 方 法 与 步 骤 1. 菌 悬 液 的 制 备 (1) 取 培 养 48h 后 的 BF-7658 斜 面 菌 种 一 支, 用 无 菌 生 理 盐 水 洗 下 菌 38

40 苔, 并 倒 入 盛 有 玻 璃 珠 的 小 三 角 烧 杯 中, 振 荡 30min, 打 碎 菌 块 (2) 取 上 述 菌 液 离 心 (3000rmp 15min), 弃 去 上 层 清 液 ; 取 菌 体 用 无 菌 生 理 盐 水 洗 涤 2-3 次, 最 后 制 成 菌 悬 液 (3) 用 显 微 镜 直 接 计 数 法 计 数, 调 整 细 胞 浓 度 为 10 8 个 /ml 2. 平 板 制 作 取 灭 菌 后 的 淀 粉 琼 脂 培 养 基, 冷 至 45 左 右 时 倒 平 板, 凝 固 待 用 3. 将 盛 有 菌 悬 液 的 平 皿 置 于 磁 力 搅 拌 器 上, 在 距 离 为 30cm 功 率 为 15w 的 紫 外 线 灯 下 分 别 照 射 1-3min 4. 稀 释 在 红 灯 下, 将 上 述 经 紫 外 线 处 理 后 的 菌 悬 液 以 10 倍 稀 释 至 个 /ml 5. 涂 平 板 -5 取 和 10-6 三 个 稀 释 度 涂 平 板, 每 个 稀 释 度 涂 3 只 平 板, 每 只 平 板 加 稀 释 液 0.1ml, 用 无 菌 玻 璃 刮 棒 涂 抹 均 匀 同 时, 以 未 经 紫 外 线 照 射 处 理 的 稀 释 平 板 作 对 照 6. 培 养 将 涂 抹 均 匀 的 平 板, 用 黑 纸 包 好, 置 培 养 箱 中 于 37 下 培 养 48h, 注 意 每 个 平 皿 要 标 明 处 理 时 间 稀 释 度 和 操 作 者 姓 名 7. 计 数 将 培 养 48h 的 平 板 取 出 进 行 菌 落 计 数, 然 后 根 据 对 照 平 板 上 的 菌 落 数, 计 算 存 活 率 和 致 死 率 8. 观 察 诱 变 效 应 在 菌 落 计 数 后 的 平 板 中, 选 取 菌 落 数 为 5-6 个 左 右 的 平 板 向 其 中 加 入 39

41 碘 液, 在 菌 落 周 围 将 出 现 透 明 圈, 分 别 测 量 透 明 圈 直 径 与 菌 落 直 径 并 计 算 其 比 值 (HC 值 ) 与 对 照 平 板 进 行 比 较, 说 明 其 诱 变 效 应, 并 选 HC 值 大 者 作 复 筛 五 实 验 报 告 1. 结 果 枯 草 芽 孢 杆 菌 BF-7658 的 菌 落 直 径 为 mm, 透 明 圈 直 径 为 mm, HC 值 为 2. 思 考 题 (1) 经 紫 外 线 照 射 后 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 存 活 率 和 致 死 率 各 为 多 少? (2) 在 稀 释 BF-7658 菌 液 过 程 中 为 什 么 要 充 分 振 荡? 实 验 十 一 生 产 菌 种 保 藏 40

42 一 目 的 要 求 1. 学 习 生 产 菌 种 保 藏 的 原 理 2. 熟 悉 不 同 菌 种 的 保 藏 方 法 3. 保 藏 发 酵 实 验 菌 种 二 基 本 原 理 工 业 生 产 中 使 用 的 菌 种 保 藏 要 求 与 分 类 学 上 菌 株 保 存 要 求 不 同 生 产 菌 种 保 藏 除 要 菌 种 不 发 生 变 异 外, 还 主 要 是 保 持 菌 种 的 生 产 能 力 以 及 相 关 的 优 异 特 性 不 发 生 变 化 菌 种 保 藏 的 方 法 虽 多, 但 其 共 同 目 标 都 是 把 菌 株 的 优 良 性 状 保 存 下 来, 防 止 退 化 死 亡 或 污 染 杂 菌 因 此, 在 保 藏 过 程 中 应 采 取 相 应 措 施, 如 低 温 干 燥 隔 绝 空 气 和 断 绝 营 养 供 应 等, 使 菌 株 暂 时 保 持 休 眠 状 态 常 用 菌 种 保 藏 方 法 有 低 温 保 藏 法 ( 最 常 用 ) 低 温 定 期 移 植 法 液 体 石 蜡 保 藏 法 砂 土 保 藏 法 冷 冻 干 燥 法 和 液 氮 超 低 温 保 藏 法 等 无 论 采 用 哪 种 方 法, 要 求 是 既 能 保 持 菌 种 的 优 良 性 状 不 发 生 变 化, 又 要 操 作 上 经 济 简 便 但 究 竟 采 用 哪 一 种 方 法 须 根 据 菌 种 特 性 及 实 验 室 条 件 而 定, 本 实 验 采 用 低 温 保 藏 法 三 材 料 1. 菌 种 :AB 菌 乳 酸 菌 HAc 菌 NK-01 酒 精 酵 母 啤 酒 酵 母 和 根 霉 菌 等 2. 脱 脂 乳 粉, 无 菌 水,95% 乙 醇, 牛 肉 膏, 蛋 白 胨, NaCl,Agar,NaNO3,K2HPO4,KCl,MgSO4,FeSO4, 蔗 糖, 葡 萄 糖 和 甘 露 醇 等 3. 无 菌 吸 管, 无 菌 培 养 皿, 喷 灯, 超 净 工 作 台, 冰 箱 和 接 种 工 具 等 四 方 法 与 步 骤 41

43 1. 培 养 基 的 制 备 根 据 AB 菌, 乳 酸 菌,NK-01, 酵 母 及 根 霉 菌 菌 种 的 培 养 基 组 成 成 分 分 别 配 制 培 养 基, 分 装 灭 菌, 制 成 斜 面 各 种 菌 种 的 培 养 基 组 成 参 见 本 教 材 相 应 的 实 验 内 容 2. 接 种 培 养 将 制 好 的 空 白 斜 面 培 养 基 经 无 菌 培 养, 确 定 其 灭 菌 彻 底 后, 将 挑 选 出 的 优 良 纯 种 转 接 于 新 鲜 斜 面 上, 在 各 种 菌 种 的 最 适 温 度 下 培 养 2-7d 各 种 菌 种 的 最 适 生 长 温 度 和 培 养 时 间 参 见 本 教 材 相 应 的 实 验 内 容 3. 检 查 仔 细 检 查 各 支 新 转 接 的 斜 面 菌 种, 确 认 其 无 污 染 而 且 生 长 健 壮 者, 将 各 种 菌 种 分 别 用 牛 皮 纸 包 成 一 把 (10 支 ), 并 写 上 菌 种 名 称 日 期 及 操 作 者 姓 名 4. 保 藏 将 已 包 好 的 菌 种 置 于 4 冰 箱 中 保 藏 五 实 验 报 告 1. 结 果 把 所 保 藏 的 菌 种 名 称 做 好 记 录, 以 便 定 期 检 查 2. 思 考 题 (1) 菌 种 的 保 藏 方 法 有 哪 些? 如 何 选 择 保 藏 方 法? (2) 常 用 菌 种 应 采 用 什 么 保 藏 方 法, 问 什 么? 实 验 十 二 生 物 固 氮 42

44 一 目 的 要 求 1. 学 习 根 瘤 菌 与 豆 科 植 物 结 瘤 固 氮 的 原 理 2. 观 察 豆 科 植 物 结 瘤 后 的 生 长 情 况 3. 了 解 根 瘤 菌 制 剂 在 农 业 生 产 中 的 应 用 二 基 本 原 理 生 物 固 氮 是 指 自 然 界 的 一 些 微 生 物 和 蓝 绿 藻 将 大 气 中 的 不 能 被 植 物 利 用 的 氮 气 变 成 可 利 用 的 氮 的 过 程 其 实 质 是 固 氮 生 物 等 通 过 其 体 内 的 固 氮 酶 活 动, 将 空 气 中 的 分 子 态 固 定 下 来, 转 变 成 为 氨 态 氮 固 氮 微 生 物 有 两 大 类, 即 固 氮 细 菌 和 固 氨 蓝 细 菌 ( 固 氮 蓝 藻 ), 两 者 共 59 个 属 它 们 在 固 氮 过 程 中 需 要 能 量 如 果 固 氮 细 菌 含 有 色 素 能 利 用 光 能 进 行 固 氮 则 是 自 身 固 氮 类 ; 有 些 固 氮 细 菌 与 其 它 生 物 生 活 在 一 起 时 固 氮 ( 共 生 固 氮 类 型 ) 因 相 互 联 系 程 度 不 同 又 分 为 联 合 固 氮 和 共 生 固 氮, 其 中 以 根 瘤 菌 与 豆 科 植 物 的 共 生 固 氮 量 最 大, 为 主 要 的 生 物 固 氮 形 式 据 估 计, 地 球 上 的 全 部 氮 素 约 有 吨, 其 中 97.8% 存 在 于 地 壳 岩 石 里,0.2%( 吨 ) 存 在 于 地 表 水 层 岩 里,2%( 吨 ) 存 在 于 空 气 中 在 空 气 中, 氮 素 占 整 个 空 气 组 成 的 80% 左 右 地 球 上 每 年 总 固 氮 量 为 吨, 燃 烧 约 吨, 大 气 层 中 臭 氧 作 用 约 吨, 工 业 和 成 氨 吨 生 物 固 氮 为 吨, 其 中 根 瘤 菌 - 豆 科 植 物 共 生 固 氮 约 吨, 非 豆 科 植 物 共 生 固 氮 约 吨, 蓝 绿 藻 约 吨, 自 身 固 氮 约 0.01~ 吨, 其 它 约 吨 生 物 固 氮 的 研 究 已 有 一 百 多 年 的 历 史, 生 物 固 氮 的 应 用 也 十 分 广 泛, 遍 及 欧 美 加 拿 大 澳 大 利 亚 及 亚 洲 的 中 国 菲 律 宾 等 国 如 我 国 广 西 农 学 院 主 持 的 生 物 技 术 领 域 固 氮 专 题 高 效 固 氮 大 豆 根 瘤 菌 的 研 制 和 应 用 取 得 突 破 性 进 43

45 展, 此 菌 剂 在 黑 龙 江 推 广 50 万 亩, 平 均 每 亩 增 产 大 豆 28.2kg 另 一 项 基 因 工 程 菌 剂 ( 耐 氨 型 固 氮 菌 ) 正 在 广 东 广 西 江 西 和 福 建 等 8 个 省 区 的 150 万 亩 稻 田 中 推 广 应 用, 应 用 面 积 处 于 世 界 领 先 地 位 生 物 固 氮 的 研 究 现 在 已 向 非 豆 科 植 物 ( 粮 食 作 物 ) 转 移, 目 的 是 使 农 林 和 牧 等 植 物 能 自 动 向 大 气 摄 取 氮 素 养 料, 但 其 机 理 很 复 杂, 尚 需 进 行 深 入 研 究 三 材 料 1. 菌 种 : 大 豆 粉 瘤 菌, 豇 豆 根 瘤 菌 2. 广 口 瓶 ( 或 锥 形 瓶 500ml) 锥 形 瓶 200ml 3. 电 炉, 接 种 工 具 和 洁 净 工 作 台 等 4. 大 豆 种 子, 培 养 材 料 ( 略 ) 四 方 法 与 步 骤 1. 灭 菌 锥 形 瓶 取 200ml( 内 有 滤 纸 片 ) 500ml 锥 形 瓶, 以 八 层 纱 布 封 口, 在 0.1MPa 下 灭 菌 60min 2. 配 制 水 培 液 其 组 成 为 : CaSO4 0.46g K2HPO g MgSO4 0.06g KCl 0.075g Ca(NO3)2 0.03g 柠 檬 酸 铁 0.075g * 微 量 元 素 1ml 水 1000ml * 微 量 元 素 成 分 :MnSO4 1.81g ZnSO4 0.22g CuSO4 0.8g 铝 酸 0.02g 硼 酸 2.86g 水 1000ml 配 制 2000ml 的 溶 液, 煮 沸 2min, 倒 入 无 菌 的 500ml 锥 形 瓶 中 ( 每 瓶 500ml), 用 纱 布 将 瓶 口 密 封 44

46 3. 催 芽 将 大 豆 种 子 用 0.2% 升 汞 水 灭 菌 5-10min, 以 无 菌 水 冲 洗 7-8 次, 将 种 子 置 于 有 滤 纸 片 的 的 锥 形 瓶 中, 在 下, 催 芽 3-4d 待 主 根 长 至 4-5cm, 须 根 还 未 出 现 的 时 候 播 种 播 种 时 大 豆 必 须 除 去 种 皮, 以 免 种 皮 干 后 影 响 子 叶 脱 落, 造 成 长 势 不 一 致 4. 接 种 取 斜 面 菌 种 试 管 一 支, 加 入 无 菌 水 3-4ml 刮 洗 菌 苔, 制 成 菌 悬 液 将 根 粘 上 菌 悬 液, 插 入 锥 形 瓶 内 纱 布 内, 每 瓶 两 株 也 可 将 菌 悬 液 均 匀 接 入 2 个 500ml 锥 形 瓶 中 ( 另 外 2 个 锥 形 瓶 作 为 CK); 然 后, 种 子 周 围 用 无 菌 棉 花 塞 紧, 防 止 尘 埃 落 入 瓶 内, 造 成 污 染 5. 培 养 调 节 温 度 与 光 照, 使 植 物 体 内 的 合 成 与 分 解 的 矛 盾 达 到 平 衡, 才 有 利 于 发 挥 豆 科 作 物 的 共 生 固 氮 作 用 在 培 养 期, 晴 天 最 高 气 温 可 达 30-35, 夜 晚 阴 天 时, 白 天 保 持 25 左 右, 夜 晚 培 养 40-50d, 就 能 进 入 初 花 期, 即 共 生 固 氮 最 旺 盛 的 时 期 在 培 养 期 应 添 加 1-2 次 冷 开 水, 即 当 瓶 内 降 至 1/3 时, 补 加 冷 开 水 至 2/3 处 为 宜 6. 注 意 所 有 用 具 均 应 灭 菌, 在 培 养 过 程 中 三 角 瓶 不 能 淋 雨, 否 则 会 造 成 污 染 在 根 瘤 尚 未 建 立 共 生 固 氮 体 系 前, 可 补 加 少 量 氮 素, 以 促 进 幼 苗 生 长 发 育 五 实 验 报 告 1. 结 果 将 实 验 结 果 填 入 下 表 45

47 项 目 株 高 瘤 数 ( 个 / 株 ) 瘤 重 (g/ 个 ) 地 上 部 分 地 上 部 分 处 理 (cm) 主 根 支 根 主 瘤 支 瘤 鲜 重 (g/ 含 氮 (%) 瘤 瘤 重 重 株 ) CK 实 验 菌 种 2. 思 考 题 (1) 在 进 行 根 瘤 菌 - 豆 科 植 物 结 瘤 固 氮 试 验 时 应 注 意 什 么? (2) 豆 科 植 物 根 瘤 菌 能 够 在 非 豆 科 植 物 上 结 瘤 固 氮, 为 什 么? 46

48 实 验 十 三 食 用 菌 液 体 发 酵 一 目 的 要 求 1. 学 习 食 用 菌 的 液 体 培 养 方 法 2. 了 解 食 用 菌 菌 丝 制 备 的 意 义 及 用 途 3. 学 习 固 体 栽 培 食 用 菌 的 一 般 方 法 二 基 本 原 理 一 般 来 说, 液 体 培 养 是 研 究 食 用 菌 生 化 特 征 及 生 理 代 谢 的 最 适 方 法 食 用 菌 菌 丝 体 在 液 体 培 养 基 里 分 散 状 态 好, 营 养 吸 收 及 氧 气 等 气 体 交 换 容 易 生 长 快 发 育 成 熟 的 菌 丝 体 及 发 酵 液 可 制 成 药 物 或 饮 料 和 食 品 添 加 剂 等 在 固 体 栽 培 时, 用 液 体 菌 种 代 替 固 体 原 种 ( 由 斜 面 菌 种, 俗 称 母 种 扩 大 培 养 而 成 的 菌 种 ) 时, 由 于 其 流 动 性 大, 易 于 分 散, 很 快 就 能 布 满 整 瓶, 大 大 缩 短 培 养 时 间 培 养 方 法 可 影 响 菌 丝 的 形 态 和 生 理 特 征 菌 丝 体 的 多 少 除 与 培 养 基 有 关 外, 还 和 环 境 条 件, 尤 其 是 与 液 体 培 养 时 的 转 速 有 关 一 定 时 期 菌 丝 体 的 干 重 大 小 反 映 食 用 菌 的 生 长 好 坏, 而 测 定 液 体 菌 丝 片 段 的 存 活 数, 可 作 为 菌 丝 均 质 效 果 的 指 标 瓶 栽 袋 料 栽 培 及 段 木 露 天 栽 培 等 是 食 用 菌 大 规 模 生 产 的 方 法 本 实 验 以 侧 耳 为 材 料, 学 习 食 用 菌 液 体 培 养 和 固 体 栽 培 技 术 一 级 种 ( 斜 面 菌 种 ) 二 级 种 ( 摇 瓶 种 子 ) 均 质 菌 丝 ( 或 菌 丝 ) 固 体 栽 培 三 器 材 发 酵 培 养 1. 菌 种 侧 耳 (Pleurotus ostreatus 俗 称 平 菇 北 风 菌 等 ); 金 针 菇 ; 47

49 杏 孢 菇 ; 鸡 腿 菇 ; 香 菇 等 2. 培 养 基 马 铃 薯 培 养 基, 玉 米 粉 蔗 糖 培 养 基, 酵 母 膏 麦 芽 汁 琼 脂, 玉 米 粉 综 合 培 养 基, 棉 籽 壳 培 养 基 3. 溶 液 或 试 剂 含 2% 硫 酸 铵,0.8% 酒 石 酸 的 溶 液 4. 其 它 用 具 恒 温 摇 床, 接 种 铲, 接 种 针, 三 角 瓶, 灭 菌 玻 璃 珠, 灭 菌 大 口 吸 管, 干 燥 小 离 心 管,550ml 罐 头 瓶 四 操 作 步 骤 1. 液 体 培 养 (1) 一 级 种 ( 斜 面 菌 种, 俗 称 母 种 母 种 斜 面 移 种 后 成 原 种 ) 培 养 用 无 菌 接 种 铲 铲 下 侧 耳 斜 面 菌 丝 一 块, 接 种 于 马 铃 薯 培 养 基 斜 面 中 部, 静 止 培 养 7d 食 用 菌 的 细 胞 分 裂 仅 限 于 菌 丝 顶 端 细 胞, 若 用 接 种 环 刮 下 表 面 菌 苔 接 种, 因 切 断 菌 丝,DNA 流 失 严 重, 大 多 生 长 不 好 (2) 二 级 种 ( 摇 瓶 种 子 ) 培 养 将 一 级 种 用 无 菌 接 种 铲 铲 下 约 0.5cm 2 的 菌 块 至 装 有 50ml 的 玉 米 粉 蔗 糖 培 养 基 的 250ml 锥 形 瓶 中 静 止 培 养 2d, 再 摇 床, 同 样 温 度, r/min, 培 养 3d. 静 止 培 养, 促 使 铲 断 菌 丝 的 愈 合, 有 利 于 繁 殖 大 规 模 菌 丝 生 产, 一 般 都 进 行 二 级 摇 瓶 种 子 培 养 若 系 作 为 固 体 栽 培 的 种 子, 则 在 菌 丝 球 数 量 达 到 最 高 峰 时 (3d 左 右 ), 放 入 10 颗 左 右 灭 菌 玻 璃 珠, 适 度 旋 转 摇 动 5min,10min 均 质 菌 丝, 将 这 种 均 质 化 的 菌 丝 悬 液 作 为 接 种 物 ( 或 用 匀 浆 器, 均 质 一 定 时 间 ) 取 1ml 涂 布 在 酵 母 膏 麦 芽 汁 琼 脂 平 板 上, 重 复 3 份, 置 28 培 养 3d 后 计 算 菌 落 数 作 为 菌 丝 断 片 成 活 试 验 48

50 用 摇 瓶 种 子 可 以 直 接 作 固 体 栽 培 种, 而 用 均 质 菌 丝 悬 液 作 为 栽 培 种, 发 育 点 多 接 种 效 果 好 也 可 以 用 成 熟 的 摇 瓶 种 子 接 种 处 理 好 的 麦 粒, 制 成 液 体 - 麦 粒 栽 培 种, 细 胞 菌 龄 一 致, 老 化 菌 丝 少, 用 作 栽 培 种, 则 生 产 时 间 缩 短, 污 染 率 低, 可 增 产 5%-25% (3) 发 酵 培 养 摇 瓶 种 子 无 杂 菌 污 染 即 可 分 别 以 10% 接 种 量 接 入 3 个 玉 米 粉 综 合 培 养 基 中 (50ml/250ml 锥 形 瓶 ),25-28 培 养 3-4d 从 第 一 天 起 至 结 束, 每 天 取 已 知 重 量 的 干 燥 小 离 心 管 3 个, 分 别 重 复 取 样 2.0ml,400r/min 10min, 弃 去 上 清 液, h 干 燥 至 恒 重 发 酵 液 由 稠 变 稀, 菌 丝 略 有 自 溶 即 应 暂 停 培 养 发 酵 液 经 过 不 同 处 理 制 成 各 种 用 途 2. 固 体 栽 培 (1) 配 制 装 瓶 和 消 毒 3 个 550ml 罐 头 瓶 按 比 例 称 好 330g 棉 籽 壳 培 养 基, 依 法 配 制 及 时 装 瓶 底 部 料 压 得 松 一 些, 瓶 口 压 紧 一 些, 中 间 扎 一 直 径 约 1.5cm 洞 穴, 用 牛 皮 纸 扎 封 瓶 口,128 消 毒 1.5-2h 大 生 产 也 可 以 用 常 压 灭 菌,100,8h (2) 接 种 培 养 待 培 养 基 温 度 降 至 时, 用 大 口 无 菌 吸 管 于 中 部 接 入 摇 瓶 种 子 5% 或 均 质 悬 浮 液 3%, 培 养 基 表 面 少 留 点 扎 好 牛 皮 纸 移 入 培 养 室 也 可 接 种 液 体 麦 粒 栽 培 种 种 子 若 系 普 通 固 体 栽 培 种, 则 应 去 除 表 面 老 化 菌 丝, 接 种 5% 以 上 (3) 发 酵 管 理 1 发 菌 (spaawn running) 即 菌 丝 在 营 养 基 质 中 向 四 周 扩 散 生 长 室 温 49

51 控 制 在 20-23, 相 对 湿 度 70%-75%,7d 后 菌 丝 伸 长 最 快, 室 内 CO2 浓 度 升 高, 要 早 晚 各 通 风 一 次, 保 持 空 气 新 鲜 约 25-30d 菌 丝 长 满 全 瓶, 及 时 给 予 散 射 光 照 继 续 培 养 4-5d, 让 其 达 到 生 理 成 熟 菌 丝 繁 殖 时, 瓶 内 实 际 温 度 一 般 高 于 室 内 温 度 4-6, 瓶 内 温 度 不 应 高 于 29 侧 耳 菌 丝 在 黑 暗 中 能 正 常 生 长, 有 光 可 使 菌 丝 生 长 速 度 减 缓 2 桑 椹 期 菌 丝 成 熟 后 给 予 200Lx 左 右 散 射 光 照, 将 瓶 子 移 至 培 养 室 进 行 周 期 低 温 刺 激, 一 般 3-5d 后 瓶 口 内 略 见 空 隙 和 小 水 珠, 产 生 瘤 状 突 起, 这 是 子 实 体 原 基, 原 基 (primordium) 形 成 期, 形 似 桑 椹, 故 又 称 桑 椹 期 适 当 通 风, 相 对 湿 度 要 求 80%-85% 低 温 刺 激, 促 进 原 基 形 成 温 差 达 8-10, 一 般 可 用 室 外 温 差 来 调 节 光 照 强 度 必 须 在 50Lx 以 上 散 射 光, 一 般 在 200Lx 左 右 凤 尾 菇 (P.sjorcaju) 要 求 Lx 散 射 光 才 能 出 现 原 基 3 珊 瑚 期 原 基 分 化, 形 成 菌 柄, 菌 盖 尚 未 形 成, 小 凸 起 各 自 伸 长, 参 差 不 齐, 状 似 珊 瑚 条 件 适 合, 只 要 1d 桑 椹 期 就 能 转 入 珊 瑚 期 湿 度 控 制 90% 左 右, 通 气 量 也 要 逐 步 加 大 4 幼 蕾 期 菌 盖 已 形 成, 菌 褶 开 始 出 现 保 持 90% 左 右 的 湿 度,18-20 温 度 培 育 同 上 述 散 射 光, 通 风 良 好 5 成 熟 期 当 菌 盖 充 分 展 开, 菌 盖 下 凹 处 产 生 茸 毛, 要 立 即 不 留 茬 采 收 从 菌 蕾 发 生 到 采 收 约 需 7-8d 采 收 后 瓶 口 内 如 有 杂 物 或 死 菇 等 要 清 除 掉, 包 上 牛 皮 纸, 继 续 培 约 10d 左 右, 瓶 口 的 料 面 上 又 会 发 出 小 菇 蕾, 再 打 开 牛 皮 纸 继 续 进 行 湿 度 温 度 通 风 和 散 射 光 的 管 理 大 约 7-10d 又 会 出 现 一 批 菇 蕾 第 二 茬 菇 采 光 后, 袋 内 水 分 养 分 消 耗 太 多, 此 时 应 补 水 和 追 加 营 养 硫 酸 铵 酒 石 酸 溶 液 50

52 浸 没 在 该 溶 液 中 一 昼 夜, 挤 干 水 分, 再 用 牛 皮 纸 包 扎, 很 快 又 能 出 第 三 茬 菇 每 次 采 下 的 鲜 菇 即 称 重 量, 计 算 生 物 学 效 率 ( 一 定 含 水 量 子 实 体 鲜 重 / 基 质 干 重 100% ) 三 茬 菇 以 后, 菇 潮 不 能 再 成 批 出 现, 而 是 变 成 零 星 发 生 了 侧 耳 子 实 体 的 分 化 和 发 育 必 须 有 散 射 光, 黑 暗 下 不 产 生 子 实 体 直 射 光 不 利 于 子 实 体 的 形 成 与 生 长 相 对 湿 度 在 55% 时 子 实 体 遇 散 射 光 生 长 缓 慢,40%-45% 时 小 菇 干 缩, 高 于 95% 时 菌 盖 易 变 色 腐 烂 等 适 宜 的 温 度 范 围, 子 实 体 发 育 快 个 大 肉 质 厚 ; 温 度 低 则 生 长 慢 个 小 肉 质 薄 缺 氧 不 利 于 子 实 体 形 成 子 实 体 成 熟 后 应 适 时 采 收, 晚 了 食 品 性 差, 且 大 量 担 孢 子 落 到 培 养 料 上 也 影 响 下 茬 菇 的 生 长 五 实 验 报 告 1. 结 果 (1) 计 算 菌 丝 的 干 重 (2) 计 算 栽 培 侧 耳 的 生 物 学 效 率 (3) 试 做 出 h 菌 丝 干 重 对 时 间 的 变 化 曲 线 2. 思 考 题 大 规 模 进 行 食 用 菌 栽 培 时, 制 备 各 种 形 式 栽 培 种 的 优 缺 点 51

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