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1 一 简 介 流 式 细 胞 仪 ( 一 ) 流 式 细 胞 仪 概 念 流 式 细 胞 术 (Flow Cytometry,FCM) 是 一 种 对 处 在 液 流 中 的 细 胞 或 其 它 生 物 微 粒 ( 如 细 菌 ) 逐 个 进 行 多 参 数 的 快 速 定 量 分 析 和 分 选 的 技 术 简 言 之, 流 式 细 胞 仪 是 测 量 染 色 细 胞 标 记 物 荧 光 强 度 的 细 胞 分 析 仪, 是 在 单 个 细 胞 分 析 和 分 选 基 础 上 发 展 起 来 的 对 细 胞 的 物 理 或 化 学 性 质, 如 大 小 内 部 结 构 DNA RNA 蛋 白 质 抗 原 等 进 行 快 速 测 量 并 可 分 类 收 集 的 高 技 术,FCM 以 其 快 速 灵 活 大 量 灵 敏 和 定 量 的 特 色, 广 泛 应 用 于 基 础 研 究 和 临 床 实 践 各 个 方 面, 包 括 细 胞 生 物 学 肿 瘤 学 血 液 学 免 疫 学 药 理 学 遗 传 学 及 临 床 检 验 学 等, 在 各 学 科 领 域 发 挥 着 重 要 的 作 用 ( 二 ) 原 理 待 测 样 本 的 细 胞 悬 液, 在 鞘 液 的 包 围 和 约 束 下, 细 胞 排 成 单 列 高 速 由 流 动 室 喷 嘴 喷 出, 形 成 细 胞 液 柱 当 液 柱 通 过 检 测 区, 在 入 射 的 激 光 束 照 射 下 产 生 前 向 散 射 光 (FSC) 和 侧 向 散 射 光 (SSC), 它 们 分 别 反 映 细 胞 大 小 和 颗 粒 度, 根 据 这 些 特 性 可 以 将 细 胞 分 类 经 一 种 或 几 种 特 殊 荧 光 标 记 的 样 本, 在 激 光 束 的 激 发 下 所 产 生 的 特 定 荧 光, 可 被 光 学 系 统 检 测 并 输 送 到 计 算 机 进 行 分 析, 得 到 细 胞 相 应 的 各 种 特 性 ( 三 ) 流 式 细 胞 仪 检 测 的 细 胞 特 性 细 胞 结 构 组 成 大 小 粒 度 DNA RNA 含 量 蛋 白 质 含 量 钙 离 子 ph 值 膜 电 位 细 胞 功 能 细 胞 表 面 胞 浆 核 特 异 性 抗 原 细 胞 活 性 胞 内 细 胞 因 子 激 素 结 合 位 点 酶 活 性

2 二 流 式 细 胞 仪 的 临 床 检 验 项 目 目 前 在 国 内 最 常 见 的 临 床 应 用 有 两 大 类 : 一 为 肿 瘤 细 胞 的 DNA 含 量 析 ; 另 一 为 细 胞 表 面 的 表 型 测 定, 包 括 淋 巴 细 胞 亚 型 分 析 免 疫 功 能 监 测 白 血 病 和 淋 巴 瘤 免 疫 分 型 残 余 白 血 病 检 测 以 及 HLA-B27 组 织 抗 原 检 测 等 等 1 淋 巴 细 胞 亚 群 分 析 淋 巴 细 胞 亚 群 分 析 可 以 通 过 相 对 计 数 绝 对 计 数 与 率 的 变 化 监 控 疾 病 状 态 下 的 免 疫 状 况 ( 如 肿 瘤 感 染 性 疾 病 免 疫 性 疾 病 等 ), 以 此 辅 助 诊 断 追 踪 病 情 发 展 及 决 定 用 药 时 机 检 测 原 理 : 利 用 各 种 单 克 隆 抗 体 与 淋 巴 细 胞 表 面 的 抗 原 结 合, 再 配 合 多 色 荧 光 染 料, 即 可 以 把 各 种 不 同 功 能 的 淋 巴 亚 群 区 分 开 来, 进 而 得 到 各 亚 群 的 相 对 比 例 最 常 检 测 的 亚 群 包 括 T 细 胞 (CD3) B 细 胞 (CD19) NK 细 胞 (CD16+56) 辅 助 性 T 细 胞 (CD3+CD4+) 和 抑 制 性 T 细 胞 (CD3+CD8+) 等 应 用 实 例 :MultiSET 系 统 利 用 CD14/CD45 设 门 技 术 精 确 检 测 淋 巴 细 胞 亚 群 比 例 * 其 中 绿 色 细 胞 群 体 为 淋 巴 细 胞, 红 色 为 单 核 细 胞, 蓝 色 为 粒 细 胞

3 2 DNA 分 析 肿 瘤 细 胞 的 DNA 倍 体 分 析 是 流 式 技 术 另 一 重 要 应 用, 临 床 上 可 对 一 些 恶 性 肿 瘤 进 行 早 期 诊 断, 跟 踪 随 访 和 早 期 治 疗, 大 大 提 高 一 些 肿 瘤 的 治 愈 率 和 生 存 率 检 测 原 理 : 正 常 人 体 细 胞 的 DNA 含 量 是 二 倍 体, 细 胞 群 体 具 有 特 定 的 增 殖 比 例 通 过 检 测 细 胞 的 DNA 含 量 和 增 殖 比 例, 可 以 了 解 细 胞 群 体 的 倍 体 性 和 增 殖 能 力 具 体 操 作 时, 先 将 实 体 组 织 制 备 成 单 细 胞 悬 液, 用 固 定 或 去 污 剂 在 细 胞 膜 上 打 孔, 使 DNA 特 异 的 荧 光 染 料 如 PI( 碘 化 丙 啶 ) 导 入 细 胞 核,PI 和 DNA 缄 基 对 特 异 结 合 后 上 机 检 测 PI 的 荧 光 强 度, 并 进 行 数 据 分 析 应 用 实 例 : 乳 腺 癌 病 人 的 手 术 标 本 分 析 图 * 其 中 红 色 群 体 为 二 倍 体, 黄 色 群 体 为 异 倍 体 3 白 血 病 和 淋 巴 瘤 免 疫 分 型 正 常 白 细 胞 在 其 分 化 过 程 中, 随 着 系 列 的 不 同 成 熟 阶 段 的 差 异, 会 在 细 胞 膜 表 面 表 达 不 同 的 分 化 抗 原 白 血 病 细 胞 则 在 癌 变 的 过 程 中, 丧 失 了 正 常 细 胞 底 系 列 专 一 性 和 分 化 阶 段 规 律 性, 在 本 质 上 有 别 于 正 常 骨 髓 细 胞 应 用 此 特 点 可 进 行 免 疫 表 型 分 析, 以 鉴 别 各 种 白 血 病 和 淋 巴 瘤, 辅 助 临 床 诊 断 评 估 疗 效 和 预 后 常 用 的 抗 原 包 括 :CD3 CD5 CD7 CD19 CD20 CD22 CD10 HLA-DR CD13 CD14 CD33 CD34 GLY-A MPO 等 等 应 用 实 例 : 利 用 CD45 三 色 分 析 急 性 髓 性 白 血 病

4 * 左 图 为 正 常 骨 髓, 绿 色 为 正 常 淋 巴 细 胞, 深 红 为 单 核 细 胞, 玫 瑰 红 为 成 熟 粒 细 胞, 浅 蓝 为 有 核 红 细 胞, 深 蓝 为 未 成 熟 细 胞 ; 右 图 为 急 性 髓 性 白 血 病 图 形, 可 见 与 正 常 明 显 的 差 别 4 残 余 白 血 病 检 测 残 余 白 血 病 是 指 经 过 适 当 的 治 疗 疾 病 缓 解 后 仍 残 留 在 病 人 血 中 的 极 少 量 白 血 病 细 胞 通 常 白 血 病 病 人 经 过 化 疗 后 的 疾 病 复 发 率 为 60-80%, 经 过 自 体 或 异 体 骨 髓 移 植 后 的 复 发 率 仍 偏 高 (20-50%) 所 以 如 果 能 早 期 检 测 到 复 发 的 迹 象, 即 白 血 病 细 胞 的 再 增 生, 则 可 以 提 前 给 予 病 人 及 时 恰 当 的 治 疗 依 照 不 同 的 白 血 病, 选 用 不 同 的 抗 体 组 合 ( 如 下 表 ) 来 检 测 残 余 白 血 病 流 式 细 胞 术 可 在 一 万 个 骨 髓 细 胞 中 检 测 到 一 个 白 血 病 细 胞 ; 尤 其 是 TdT 的 应 用 大 大 提 高 了 检 测 灵 敏 度 白 血 病 种 类 T-ALL B-ALL Pre-B-ALL AML 可 选 择 的 抗 体 组 合 cyto CD3/TdT CD13/TdT,CD33/TdT cyto μ/tdt CD13/TdT, CD33/TdT, CD7/TdT 5 网 织 红 细 胞 分 析 网 织 红 细 胞 计 数 是 骨 髓 红 细 胞 造 血 功 能 的 重 要 指 标 传 统 手 工 计 数 耗 时 耗 力, 缺 乏 准 确 性 流 式 细 胞 仪 网 织 红 细 胞 计 数 系 统 由 于 采 用 系 统 试 剂 与 全 自 动 软 件, 可 在 短 时 内 分 析 大 量 细 胞, 低 水 平 网 织 红 细 胞 也 可 达 到 统 计 分 析 精 度, 省 时 省 力, 结 果 正 确 可 靠

5 * 左 图 中 红 色 群 体 为 红 细 胞, 右 图 利 用 RNA 染 料 噻 唑 橙 (TO) 区 分 成 熟 红 细 胞 和 网 织 红 细 胞 6 造 血 干 祖 细 胞 检 测 在 治 疗 恶 性 血 液 病 时, 大 剂 量 化 疗 或 放 疗 摧 毁 有 病 的 骨 髓 后, 干 细 胞 移 植 保 证 了 健 康 的 干 祖 细 胞 重 建 骨 髓, 产 生 正 常 的 血 细 胞, 实 体 肿 瘤 病 人 亦 可 通 过 干 细 胞 移 植 抗 衡 大 剂 量 化 疗 导 致 的 致 死 性 血 液 毒 性 与 大 剂 量 化 疗 相 配 合 的 干 细 胞 移 植 已 在 临 床 大 大 提 高 了 某 些 肿 瘤 病 人 的 长 期 存 活 率, 如 乳 腺 癌 儿 童 神 经 母 细 胞 瘤 卵 巢 癌 等 另 外, 干 细 胞 移 植 与 再 生 障 碍 想 贫 血 免 疫 缺 隐 血 红 蛋 白 病 等 非 恶 性 造 血 系 统 疾 病 治 疗 的 相 关 性 也 正 在 研 究 中 * 上 图 中 红 色 群 体 是 经 过 多 参 数 设 门 后 精 确 设 定 的 CD34 阳 性 细 胞 群 体, 绿 色 部 分 是 进 行 定 量 计 数 的 标 准 微 球

6 7 血 小 板 疾 病 及 活 化 血 小 板 检 测 通 过 血 小 板 膜 糖 蛋 白 的 检 测 可 以 诊 断 先 天 性 或 获 得 性 血 小 板 疾 病 如 Bernard-Soulier 综 合 征 (CD42b-42a), 血 小 板 无 力 症 (CD41-CD61), 免 疫 性 血 小 板 减 少 等 等 评 价 血 小 板 活 化 程 度 的 应 用 领 域 包 括 : 缺 血 性 冠 状 动 脉 疾 病 如 心 绞 痛 心 肌 梗 死 血 管 成 形 术 心 肺 旁 路 术 等 ; 缺 血 性 脑 血 管 病 如 脑 梗 塞 TIA 脑 动 脉 硬 化 等 ; 糖 尿 病 ; 恶 性 肿 瘤 ; 高 血 压 病 ; 高 脂 蛋 白 血 症 ; 高 粘 滞 血 症 ; 抗 血 小 板 药 物 机 制 研 究 与 疗 效 监 测 ; 吸 烟 ; 情 绪 性 应 急 等 应 用 实 例 :CD61/CD62P/PAC-1 三 色 标 记 分 析 血 小 板 活 化 8 HLA-B27 检 测 由 流 行 病 学 统 计 结 果 显 示,HLA-B27 基 因 型 阳 性 的 人 患 数 个 遗 传 性 免 疫 疾 病 的 机 率, 比 一 般 人 要 高 很 多, 以 强 直 性 脊 柱 炎 为 例, 约 为 87 倍 因 此 HLA-B27 检 测 可 以 有 效 帮 助 临 床 鉴 别 诊 断 强 直 性 脊 柱 炎 等 血 清 阴 性 骨 关 节 疾 病 其 他 相 关 性 疾 病 有 : 遗 传 性 关 节 炎 如 Reiter s 综 合 征, 反 应 性 关 节 炎, 肠 性 关 节 炎 等 检 测 时 选 用 CD3/HLA-B27 双 标 记 抗 体, 圈 定 T 淋 巴 细 胞 亚 群, 再 分 析 其 细 胞 表 面 是 否 表 现 HLA-B27 组 织 抗 原 因 为 T 细 胞 表 面 只 表 达 ClassⅠ 型 HLA 抗 原, 可 避 免 ClassⅡ 型 HLA 抗 原 引 起 的 误 差 应 用 此 法 无 需 分 离 细 胞, 比 传 统 的 微 量 细 胞 毒 实 验 节 约 时 间, 且 检 测 结 果 更 敏 感 客 观 容 易 判 读

7 9 器 官 移 植 的 配 型 及 免 疫 状 态 监 控 以 流 式 细 胞 仪 进 行 器 官 移 植 前 配 对 (Flow Cytometry Cross Match,FCCM) 的 优 势 在 于 抗 体 检 测 的 特 异 性 敏 感 度 以 及 检 测 结 果 和 手 术 成 功 率 之 相 关 一 致 性 利 用 多 参 数 测 定, 可 了 解 受 者 血 中 是 否 有 抗 供 者 抗 体, 此 抗 体 与 供 者 的 哪 种 白 细 胞 反 应, 以 及 该 抗 体 是 否 会 造 成 细 胞 毒 性 移 植 前 的 评 估 包 括 HLA 配 型 及 混 合 淋 巴 细 胞 反 应, 移 植 后 的 评 估 包 括 外 周 血 淋 巴 细 胞 亚 群 测 定 抗 供 者 抗 体 检 测 等 等 移 植 后 定 期 检 查 外 周 血 淋 巴 细 胞 亚 群, 可 以 预 估 排 异 反 应, 以 及 病 毒 感 染 等 问 题 10 AIDS 诊 断 及 治 疗 监 控 由 于 特 定 细 胞 群 体 的 绝 对 计 数 在 临 床 诊 断 与 治 疗 上 具 有 极 大 意 义, 如 CD4+ 细 胞 绝 对 计 数 可 辅 助 HIV 监 控 治 疗, 也 可 通 过 定 量 标 准 微 球 得 到 亚 群 的 绝 对 数 值 应 用 实 例 : 检 测 艾 滋 病 人 血 中 辅 助 T 细 胞 和 抑 制 T 细 胞 的 比 例 及 绝 对 数

8 三 流 式 细 胞 仪 的 临 床 / 医 学 研 究 流 式 细 胞 仪 应 用 的 灵 活 性 允 许 临 床 医 生 科 学 家 们 充 分 发 挥 想 象, 满 足 他 们 的 临 床 研 究 需 要 : 细 胞 免 疫 功 能 细 胞 凋 亡 胞 内 细 胞 因 子 胞 内 Ca2+ 及 PH 值 多 药 耐 药 性 寄 生 虫 细 菌 病 毒 环 境 科 学 等 等 流 式 细 胞 仪 多 参 数 分 析 配 合 细 胞 分 选, 可 以 提 供 样 本 的 更 多 有 效 信 息 细 胞 分 选 是 确 认 细 胞 形 态 进 行 后 续 分 子 生 物 学 研 究 ( 如 FISH PCR 等 ) 或 细 胞 功 能 性 研 究 的 理 想 手 段 四 流 式 细 胞 技 术 应 用 的 发 展 及 国 内 现 况 从 1930 年,Caspersson 和 Thorell 以 细 胞 的 计 数 开 始, 试 图 寻 找 研 究 细 胞 的 新 工 具, 到 1973 年,BD 公 司 与 美 国 斯 坦 福 大 学 合 作, 研 制 开 发 并 生 产 了 世 界 第 一 台 商 用 流 式 细 胞 仪 FACS I, 流 式 细 胞 术 进 入 了 一 个 空 前 飞 速 发 展 的 时 代 进 入 九 十 年 代, 流 式 细 胞 术 作 为 一 门 生 物 检 测 技 术 已 经 日 臻 完 善, 仪 器 的 硬 件 平 台 也 已 达 到 稳 定 的 技 术 状 态, 科 学 家 们 仪 器 制 造 商 们 又 纷 纷 将 研 究 焦 点 转 向 荧 光 染 料 的 开 发 单 克 隆 抗 体 技 术 细 胞 的 制 备 方 法 和 提 高 电 子 信 号 的 处 理 能 力 上 来, 以 拓 展 日 趋 广 泛 的 应 用 领 域 流 式 细 胞 技 术 的 强 大 生 命 力 植 根 于 生 物 学 医 学 的 各 个 领 域, 正 是 无 数 日 新 月 异 变 化 多 样 的 应 用 项 目 在 全 球 范 围 内 推 动 了 流 式 细 胞 技 术 的 发 展 自 1981 年, 北 京 师 范 大 学 生 物 系 引 进 中 国 第 一 台 流 式 细 胞 仪 (FACS Ⅲ, BDIS) 至 今, 各 种 型 号 的 流 式 细 胞 仪 在 国 内 安 装 使 用 已 超 过 400 台, 其 中 BD 公 司 的 流 式 细 胞 仪 超 过 300 台 (FACSCalibur 已 超 过 220 台, 详 见 附 录 2 BD 公 司 国 内 流 式 细 胞 仪 用 户 名 单 ) 从 仪 器 引 入 中 国 二 十 年 的 发 展 历 史 来 看, 最 早 的 流 式 细 胞 仪 大 都 应 用 在 纯 科 研 领 域 随 着 流 式 技 术 的 发 展, 方 法 学 的 成 熟, 尤 其 是 越 来 越 多 的 用 于 临 床 的 试 剂 推 出, 流 式 细 胞 仪 已 成 为 国 内 各 大 教 学 医 院 和 医 学 中 心 重 要 的 诊 断 工 具, 被 广 泛 地 应 用 于 新 的 临 床 实 验 上

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