期 李 海 利 等 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 血 清 型 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 / 只 产 生 两 种,9: 毒 素 血 清 型 毒 力 的 强 弱 与,9: 毒 素 种 类 有 关 产,9: 和,9: 的 血 清 型 毒 力 最 强 本 研 究 对 临

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1 中 国 畜 牧 兽 医 22! " # 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 血 清 型 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 李 海 利 徐 引 弟 宋 毓 民 朱 文 豪 张 青 娴 王 克 领 冯 亚 杰 候 自 花 河 南 省 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所 郑 州 山 东 省 临 沂 市 兰 山 区 畜 牧 兽 医 局 临 沂 摘 要 为 了 解 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 #!& #,&, &,-- 的 血 清 型 及 耐 药 情 况 本 研 究 根 据 # 数 据 库 设 计 对 引 物 特 异 性 的 扩 增 0 9 核 苷 酸 片 段 对 血 清 型,-- 进 行 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 显 示 所 得 -) 产 物 经 过 测 序 与 # 已 发 表 的 血 清 型,-- 的 同 源 性 达 00> 以 上 所 分 离 菌 株 耐 药 性 较 强 大 多 为 多 重 耐 药 通 过 对 血 清 型,-- 进 行 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 为 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 的 鉴 定 诊 断 及 防 制 提 供 了 基 础 关 键 词 猪 传 染 性 胸 膜 肺 炎 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 血 清 型 药 敏 试 验 中 图 分 类 号 / B 0 文 献 标 识 码, 文 章 编 号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猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 9'#$ %" 9!#"'9 #"1-)- 是 危 害 养 猪 业 的 主 要 疾 病 之 一 世 界 上 许 多 国 家 发 生 了 该 病 其 病 原 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 #!& #,&, &,-- 是 影 响 呼 吸 系 统 疾 病 的 主 要 病 原 之 一 近 年 来 该 病 在 中 国 呈 多 发 趋 势 血 清 型 众 多 是 该 病 很 难 彻 底 净 化 的 主 要 根 源,-- 共 有 个 血 清 型 不 同 血 清 型 菌 株 之 间 交 叉 免 疫 性 不 强 其 中 的 个 血 清 型 能 产 生 种 溶 血 毒 素 毒 素 单 元 有 其 典 型 的 结 构 特 征 没 有 任 何 一 种 血 清 型 能 同 时 产 生 种,9: 毒 素 大 多 数 只 产 生 种 / 少 数 血 清 型 收 稿 日 期 / 基 金 项 目 河 南 省 农 业 科 学 院 优 秀 青 年 科 技 基 金. 河 南 省 农 业 科 学 院 自 主 创 新 基 金 作 者 简 介 李 海 利 0/ 男 河 南 开 封 人 博 士 助 理 研 究 员 研 究 方 向 动 物 传 染 病 临 床 诊 断 及 防 控 *1!!/0 1 通 信 作 者 王 克 领 0 男 河 南 柘 城 人 学 士 主 要 从 事 动 物 传 染 病 的 防 控 工 作 *1! 0== 1

2 期 李 海 利 等 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 血 清 型 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 / 只 产 生 两 种,9: 毒 素 血 清 型 毒 力 的 强 弱 与,9: 毒 素 种 类 有 关 产,9: 和,9: 的 血 清 型 毒 力 最 强 本 研 究 对 临 床 分 离 的,-- 菌 株 进 行 鉴 定 和 药 敏 试 验 建 立 了,-- 分 子 鉴 定 方 法 为,-- 的 临 床 诊 断 和 治 疗 提 供 依 据 材 料 与 方 法, 材 料 %)! -2 +, 聚 合 酶 -)"8#' 均 购 自 # * %!! 烟 酰 胺 腺 嘌 呤 二 核 苷 酸,+ 购 自 宝 生 物 工 程 大 连 有 限 公 司. 柱 式 +, 胶 回 收 试 剂 盒 -) 产 物 克 隆 试 剂 盒 质 粒 +, 提 取 试 剂 盒 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 (8# # %) $$+ 等 均 购 自 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 脑 心 浸 液 琼 脂 含 > 犊 牛 血 清 和 %1(,+ 购 自 北 京 陆 桥 生 物 工 程 有 限 公 司 血 清 型,-- 标 准 阳 性 血 清 购 自 中 国 兽 药 监 察 所 药 敏 纸 片 购 自 北 京 天 坛 生 物 技 术 有 限 公 司, 细 菌 培 养 及 血 清 型 鉴 定 细 菌 培 养 把 临 床 分 离 保 存 的 菌 株 接 种 于 脑 心 浸 液 琼 脂 含 > 犊 牛 血 清 和 %1(,+ 平 板 上 置 于 > ) 培 养 箱 中 培 养 收 集 纯 化 培 养 的 细 菌 保 存 于 /? 冰 箱 中 备 用 细 菌 血 清 型 鉴 定 取 纯 培 养 的 细 菌 制 备 适 宜 浓 度 的 细 菌 悬 液 与 不 同 血 清 型,-- 标 准 阳 性 血 清 进 行 平 板 凝 集 试 验 观 察 凝 集 现 象 确 定 分 离 菌 的 血 清 型, 分 子 鉴 定,-- 基 因 组 提 取 及 模 板 制 备 将,-- 接 种 于 脑 心 浸 液 琼 脂 含 > 犊 牛 血 清 和 %1(,+ 平 板 上 置 于 > ) 培 养 箱 中 培 养 按 细 菌 基 因 组 提 取 试 剂 盒 (8# # %) $$ + 进 行 +, 的 提 取 引 物 设 计 与 合 成 从 # 下 载 编 码 荚 膜 多 糖 的 基 因 序 列 利 用 -'1#'-'#1#' 软 件 设 计 并 合 成 对 引 物 引 物 序 列 上 游 引 物 <,, ),, ),),),< 下 游 引 物 <) ),)) ),,,),,) < 预 期 扩 增 片 段 为 0 9 引 物 由 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合 成 -) 扩 增 反 应 -) 反 应 体 系 ( 无 菌 超 纯 水 (C "8#' % B (- A11! ( ( 上 下 游 引 物 91! ( 各 A ( 2+, 聚 合 酶 ( ( 模 板 (-) 反 应 条 件 0? 预 变 性 1 0? 变 性 1? 退 火 1? 延 伸 1 共 个 循 环? 延 伸 1 -) 产 物 经 > 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 检 测 -) 产 物 的 鉴 定 用. 柱 式 +, 胶 回 收 试 剂 盒 回 收,---) 扩 增 产 物 将 其 连 接 至 9 +/ 克 隆 载 体 转 化 大 肠 杆 菌 +5 感 受 态 细 胞 挑 取 转 化 的 单 个 菌 落 用 ( 培 养 基? 培 养 用 质 粒 提 取 试 剂 盒 提 取 质 粒 利 用 (#& 和 进 行 双 酶 切 鉴 定 鉴 定 后 的 阳 性 克 隆 送 宝 生 物 工 程 大 连 有 限 公 司 进 行 测 序 鉴 定 将 测 序 后 的 进 行 同 源 性 比 对 分 析, 药 敏 试 验,-- 的 药 敏 试 验 按 照 美 国 临 床 试 验 室 标 准 化 协 会 )( 制 定 的 抗 菌 纸 片 法 敏 感 性 试 验 的 实 施 标 准 / 执 行 然 后 量 取 抑 菌 圈 直 径 记 录 最 小 抑 菌 浓 度 ) 判 断 其 的 耐 药 性 与 分 析, 细 菌 血 清 型 鉴 定 菌 株 的 纯 培 养 物 分 别 与 血 清 型,-- 标 准 阳 性 血 清 进 行 平 板 凝 集 试 验 发 现 分 离 到 的 株 菌 均 与 血 清 型,-- 标 准 阳 性 血 清 呈 现 明 显 的 凝 集 现 象 与 其 他 标 准 阳 性 血 清 和 生 理 盐 水 对 照 均 不 发 生 凝 集 反 应 凝 集 试 验 表 明 分 离 到 的 株 菌 均 为 血 清 型,--, 扩 增 -) 产 物 经 > 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 在 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 见 图 由 图 可 知 扩 增 产 物 在 0 9 处 可 见 特 异 性 +, 扩 增 条 带 与 预 期 大 小 相 符, 克 隆 载 体 的 酶 切 鉴 定 及 测 序 利 用 (#& 和 酶 切 鉴 定 构 建 的 克 隆 载 体 见 图 由 图 可 知 重 组 质 粒 经 过 酶 切 在 0 9 处 可 见 特 异 性 +, 扩 增 条 带 表 明 克 隆 载 体 构 建 成 功 挑 取 酶 切 鉴 定 的 阳 性 样 品 送 上 海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 测 序 测 序 结 果 表 明 与 # 已 发 表 的 血 清 型,-- 同 源 性 达 00> 以 上

3 / 中 国 畜 牧 兽 医 卷 +(+, ' #' 阴 性 对 照 分 离 菌 株 -) 扩 增 产 物 +(+, ' #' #% $&#$'!-) 9'" $ 8! $# 图 扩 增 电 泳 图!,-*!!#!$ '# 图 重 组 克 隆 载 体 的 酶 切 鉴 定 电 泳 图!,3$"&-!'#!$ -!$ $#$ 6#, 药 敏 特 性 采 用 药 敏 纸 片 琼 脂 扩 散 法 对 分 离 菌 进 行 药 敏 试 验 见 表 由 表 可 知 分 离 菌 对 多 黏 菌 素 头 孢 唑 肟 头 孢 美 唑 头 孢 克 罗 头 孢 哌 酮 舒 巴 坦 头 孢 他 美 头 孢 噻 肟 头 孢 他 啶 头 孢 地 嗪 头 孢 呋 辛 钠 头 孢 噻 肟 克 拉 维 酸 头 孢 他 啶 克 拉 维 酸 头 孢 西 丁 头 孢 吡 肟 和 头 孢 曲 松 敏 感 对 头 孢 噻 吩 和 头 孢 克 肟 等 中 等 敏 感 对 头 孢 唑 林 头 孢 氨 苄 头 孢 拉 定 头 孢 匹 胺 头 孢 哌 酮 头 孢 羟 氨 苄 头 孢 丙 烯 及 青 霉 素 类 半 合 成 抗 生 素 内 酰 胺 类 抗 生 素 多 烯 类 抗 生 素 香 豆 素 类 抗 生 素 酰 胺 醇 类 抗 生 素 内 酰 胺 内 酰 胺 抑 制 剂 复 合 物 氨 基 糖 苷 类 大 环 内 酯 类 磺 胺 类 糖 肽 类 和 呋 喃 类 耐 药 从 以 上 药 敏 可 以 看 出 分 离 菌 株 呈 现 多 重 耐 药 讨 论 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 在 世 界 各 国 流 行 给 养 猪 业 造 成 严 重 的 经 济 损 失 常 以 突 然 发 病 纤 维 素 性 肺 炎 肺 脏 出 血 胸 腔 积 液 局 部 肺 脏 坏 死 和 肺 炎 为 主 要 特 征 该 病 在 猪 群 暴 发 后 引 起 猪 生 长 缓 慢 饲 料 报 酬 降 低 等 本 研 究 对 临 床 分 离 保 存 的,-- 进 行 了 血 清 型 鉴 定 和 药 敏 试 验 血 清 型 是 /0,-- 常 发 生 的 血 清 型,-- 传 统 的 血 清 型 鉴 定 方 法 常 用 平 板 凝 集 试 验 而 平 板 凝 集 试 验 常 常 定 型 不 准 确 本 研 究 利 用 分 子 方 法 对,-- 血 清 型 进 行 了 分 子 鉴 定 所 得 正 确 经 测 序 与 数 据 库 中 血 清 型,-- 同 源 性 达 00> 以 上 该 研 究 为,-- 临 床 定 型 和 疫 苗 筛 选 提 供 参 考 和 借 鉴 目 前 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 是 引 起 猪 呼 吸 道 疾 病 最 主 要 的 疾 病 之 一,-- 血 清 型 较 多 不 同 国 家 和 地 区 流 行 的 血 清 型 不 同 中 国 主 要 为 血 清 /0 型 英 国 主 要 为 血 清 和 / 型 加 拿 大 和 美 国 主 要 为 血 清 型 北 美 主 要 是 血 清 型 韩 国 主 要 为 血 清 型 德 国 主 要 为 血 清 0 型 日 本 主 要 为 血 清 型 澳 洲 主 要 为 血 清 型 墨 西 哥 主 要 是 血 清 和 型

4 期 李 海 利 等 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 血 清 型 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 / 表 药 敏 试 验 '#' $#!-!!' '*#!!!#&# '# +'"% # "!$ +'"% # "!$ +'"% # "!$ 多 黏 菌 素 - 利 福 平, 新 霉 素 头 孢 唑 肟 ) 4 美 洛 培 南 - 小 诺 霉 素 ) 头 孢 美 唑 ) 4 杆 菌 肽 依 替 米 星 * 头 孢 克 罗 )*) 替 考 拉 宁 )( 四 环 素 * 头 孢 哌 酮 舒 巴 坦 ) - 新 生 霉 素 多 西 环 素 + 头 孢 他 美 ) 磷 霉 素 左 氧 氟 沙 星 ( 头 孢 噻 肟 ) 2 氯 霉 素 ) 萘 啶 酸,( 头 孢 他 啶 ),4 氨 苄 西 林 苏 巴 坦, 氟 罗 沙 星 (* 头 孢 地 嗪 )+4 替 卡 西 林 克 拉 维 酸 )), 加 替 沙 星 头 孢 呋 辛 钠 )2 阿 莫 西 林 克 拉 维 酸, 2), 培 氟 沙 星 -* 头 孢 噻 肟 克 拉 维 酸 ) 2), 哌 拉 西 林 他 唑 巴 坦 - -, 罗 美 沙 星 ( * 头 孢 他 啶 克 拉 维 酸 ),4), 阿 莫 西 林 舒 巴 坦, 2 依 诺 沙 星 * 头 孢 西 丁 2 阿 洛 西 林,4( 司 帕 沙 星 - 头 孢 吡 肟 *- 头 孢 唑 林 )4 阿 奇 霉 素,4 头 孢 曲 松 ) 头 孢 氨 苄 )2 克 林 霉 素 ) 头 孢 噻 吩 ) 头 孢 拉 定 )*+ 红 霉 素 * 头 孢 克 肟 )*2 头 孢 匹 胺 )- 克 拉 霉 素 )(, 环 丙 沙 星 ) - 头 孢 哌 酮 ) - 罗 红 霉 素 2 诺 氟 沙 星 头 孢 羟 氨 苄 )+2 麦 迪 霉 素 + 氧 氟 沙 星 ( 头 孢 丙 烯 )-4 交 沙 霉 素 6 青 霉 素 - 卡 那 霉 素 磺 胺 甲 唑 甲 氧 苄 啶 2 哌 拉 西 林 - - 庆 大 霉 素 磺 胺 甲 唑 2 阿 莫 西 林, 2 阿 米 卡 星, 万 古 霉 素, 氨 苄 西 林,1 奈 替 米 星 * 去 甲 万 古 霉 素, 羧 苄 西 林 ) 妥 布 霉 素 呋 喃 唑 酮 苯 唑 西 林 2 链 霉 素 呋 喃 妥 因 美 洛 西 林 *4 大 观 霉 素 - 奥 卜 托 新 *- 敏 感 中 介 耐 药 "#9$!# $#'1# $##$$,-- 感 染 后 很 难 从 猪 场 根 除 患 病 早 期 用 抗 生 素 治 疗 有 效 反 复 用 药 和 不 规 则 用 药 易 导 致 耐 药 性 的 产 生 本 研 究 药 敏 试 验 表 明,-- 出 现 多 重 耐 药 只 对 极 个 别 的 出 现 敏 感 性 如 多 黏 菌 素 头 孢 类 部 分 敏 感 这 些 菌 株 中 是 否 有 超 级 耐 药 菌 株 出 现 还 需 进 一 步 的 研 究 多 重 耐 药 菌 株 的 出 现 给 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 的 防 制 带 来 了 困 难 这 也 是 临 床 难 治 愈 的 根 本 原 因 之 一,-- 血 清 型 众 多 目 前 市 场 上 没 有 一 种 疫 苗 可 防 制 所 有 血 清 型 所 以 对 发 病 猪 场 进 行 细 菌 的 分 离 鉴 定 耐 药 监 测 和 血 清 型 鉴 定 才 能 有 针 对 性 的 选 用 疫 苗 和 进 行 预 防 和 控 制 参 考 文 献 %2) # % #$! &#'#:9'# 89'# #$ #8# # # '#$ #$#1!& #,&, & 8# $ 9%6 '#!// / % 2# 6% #$! # 1 8#'## # $ ## #!& #,&, & #'$39# $ #' $'"$ $''9$ 1 % #'$39#6"# & & '$# ", '#1! 3 +( '#6#$! &#! %# #$# $ 8!18'1 $ 8#!& 1 #,&, & 6! "# & & 7%(. 7 % #$!#, #1 '#="'#8'$'1#'"$$' 9'$#',9 1# $# #!& #,&, & # "$ %%'#% $ 8!18'1 $ 9 $ %#$3 6!"# &1 & /

5 / 中 国 畜 牧 兽 医 卷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责 任 编 辑 董 晓 云

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