期李海利等猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定及药敏试验 / 只产生两种,9: 毒素血清型毒力的强弱与,9: 毒素种类有关产,9: 和,9: 的血清型毒力最强本研究对临

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斑子井
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1 中国畜牧兽医 22! " # 猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定及药敏试验李海利徐引弟宋毓民朱文豪张青娴王克领冯亚杰候自花河南省农业科学院畜牧兽医研究所郑州山东省临沂市兰山区畜牧兽医局临沂摘要为了解猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌 #!& #,&, &,-- 的血清型及耐药情况本研究根据 # 数据库设计对引物特异性的扩增 0 9 核苷酸片段对血清型,-- 进行分子鉴定及药敏试验显示所得 -) 产物经过测序与 # 已发表的血清型,-- 的同源性达 00> 以上所分离菌株耐药性较强大多为多重耐药通过对血清型,-- 进行分子鉴定及药敏试验为猪传染性胸膜肺炎的鉴定诊断及防制提供了基础关键词猪传染性胸膜肺炎胸膜肺炎放线杆菌血清型药敏试验中图分类号 / B 0 文献标识码, 文章编号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猪接触传染性胸膜肺炎 9'#$ %" 9!#"'9 #"1-)- 是危害养猪业的主要疾病之一世界上许多国家发生了该病其病原胸膜肺炎放线杆菌 #!& #,&, &,-- 是影响呼吸系统疾病的主要病原之一近年来该病在中国呈多发趋势血清型众多是该病很难彻底净化的主要根源,-- 共有个血清型不同血清型菌株之间交叉免疫性不强其中的个血清型能产生种溶血毒素毒素单元有其典型的结构特征没有任何一种血清型能同时产生种,9: 毒素大多数只产生种 / 少数血清型收稿日期 / 基金项目河南省农业科学院优秀青年科技基金. 河南省农业科学院自主创新基金作者简介李海利 0/ 男河南开封人博士助理研究员研究方向动物传染病临床诊断及防控 *1!!/0 1 通信作者王克领 0 男河南柘城人学士主要从事动物传染病的防控工作 *1! 0== 1

2 期李海利等猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定及药敏试验 / 只产生两种,9: 毒素血清型毒力的强弱与,9: 毒素种类有关产,9: 和,9: 的血清型毒力最强本研究对临床分离的,-- 菌株进行鉴定和药敏试验建立了,-- 分子鉴定方法为,-- 的临床诊断和治疗提供依据材料与方法, 材料 %)! -2 +, 聚合酶 -)"8#' 均购自 # * %!! 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,+ 购自宝生物工程大连有限公司. 柱式 +, 胶回收试剂盒 -) 产物克隆试剂盒质粒 +, 提取试剂盒细菌基因组提取试剂盒 (8# # %) $$+ 等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司脑心浸液琼脂含 > 犊牛血清和 %1(,+ 购自北京陆桥生物工程有限公司血清型,-- 标准阳性血清购自中国兽药监察所药敏纸片购自北京天坛生物技术有限公司, 细菌培养及血清型鉴定细菌培养把临床分离保存的菌株接种于脑心浸液琼脂含 > 犊牛血清和 %1(,+ 平板上置于 > ) 培养箱中培养收集纯化培养的细菌保存于 /? 冰箱中备用细菌血清型鉴定取纯培养的细菌制备适宜浓度的细菌悬液与不同血清型,-- 标准阳性血清进行平板凝集试验观察凝集现象确定分离菌的血清型, 分子鉴定,-- 基因组提取及模板制备将,-- 接种于脑心浸液琼脂含 > 犊牛血清和 %1(,+ 平板上置于 > ) 培养箱中培养按细菌基因组提取试剂盒 (8# # %) $$ + 进行 +, 的提取引物设计与合成从 # 下载编码荚膜多糖的基因序列利用 -'1#'-'#1#' 软件设计并合成对引物引物序列上游引物 <,, ),, ),),),< 下游引物 <) ),)) ),,,),,) < 预期扩增片段为 0 9 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 -) 扩增反应 -) 反应体系 ( 无菌超纯水 (C "8#' % B (- A11! ( ( 上下游引物 91! ( 各 A ( 2+, 聚合酶 ( ( 模板 (-) 反应条件 0? 预变性 1 0? 变性 1? 退火 1? 延伸 1 共个循环? 延伸 1 -) 产物经 > 琼脂糖凝胶电泳进行检测 -) 产物的鉴定用. 柱式 +, 胶回收试剂盒回收,---) 扩增产物将其连接至 9 +/ 克隆载体转化大肠杆菌 +5 感受态细胞挑取转化的单个菌落用 ( 培养基? 培养用质粒提取试剂盒提取质粒利用 (#& 和进行双酶切鉴定鉴定后的阳性克隆送宝生物工程大连有限公司进行测序鉴定将测序后的进行同源性比对分析, 药敏试验,-- 的药敏试验按照美国临床试验室标准化协会 )( 制定的抗菌纸片法敏感性试验的实施标准 / 执行然后量取抑菌圈直径记录最小抑菌浓度 ) 判断其的耐药性与分析, 细菌血清型鉴定菌株的纯培养物分别与血清型,-- 标准阳性血清进行平板凝集试验发现分离到的株菌均与血清型,-- 标准阳性血清呈现明显的凝集现象与其他标准阳性血清和生理盐水对照均不发生凝集反应凝集试验表明分离到的株菌均为血清型,--, 扩增 -) 产物经 > 琼脂糖凝胶电泳在凝胶成像仪中观察见图由图可知扩增产物在 0 9 处可见特异性 +, 扩增条带与预期大小相符, 克隆载体的酶切鉴定及测序利用 (#& 和酶切鉴定构建的克隆载体见图由图可知重组质粒经过酶切在 0 9 处可见特异性 +, 扩增条带表明克隆载体构建成功挑取酶切鉴定的阳性样品送上海生工生物工程技术服务有限公司测序测序结果表明与 # 已发表的血清型,-- 同源性达 00> 以上

柱式 +, 胶回收试剂盒 -) 产物克隆试剂盒质粒 +, 提取试剂盒细菌基因组提取试剂盒 (8# # %) $$+ 等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司脑心浸液琼脂含 > 犊牛血清和 %1(,+ 购自北京陆桥生物工程有限公司血清型,-- 标准

3 / 中国畜牧兽医卷 +(+, ' #' 阴性对照分离菌株 -) 扩增产物 +(+, ' #' #% $&#$'!-) 9'" $ 8! $# 图扩增电泳图!,-*!!#!$ '# 图重组克隆载体的酶切鉴定电泳图!,3$"&-!'#!$ -!$ $#$ 6#, 药敏特性采用药敏纸片琼脂扩散法对分离菌进行药敏试验见表由表可知分离菌对多黏菌素头孢唑肟头孢美唑头孢克罗头孢哌酮舒巴坦头孢他美头孢噻肟头孢他啶头孢地嗪头孢呋辛钠头孢噻肟克拉维酸头孢他啶克拉维酸头孢西丁头孢吡肟和头孢曲松敏感对头孢噻吩和头孢克肟等中等敏感对头孢唑林头孢氨苄头孢拉定头孢匹胺头孢哌酮头孢羟氨苄头孢丙烯及青霉素类半合成抗生素内酰胺类抗生素多烯类抗生素香豆素类抗生素酰胺醇类抗生素内酰胺内酰胺抑制剂复合物氨基糖苷类大环内酯类磺胺类糖肽类和呋喃类耐药从以上药敏可以看出分离菌株呈现多重耐药讨论猪接触传染性胸膜肺炎在世界各国流行给养猪业造成严重的经济损失常以突然发病纤维素性肺炎肺脏出血胸腔积液局部肺脏坏死和肺炎为主要特征该病在猪群暴发后引起猪生长缓慢饲料报酬降低等本研究对临床分离保存的,-- 进行了血清型鉴定和药敏试验血清型是 /0,-- 常发生的血清型,-- 传统的血清型鉴定方法常用平板凝集试验而平板凝集试验常常定型不准确本研究利用分子方法对,-- 血清型进行了分子鉴定所得正确经测序与数据库中血清型,-- 同源性达 00> 以上该研究为,-- 临床定型和疫苗筛选提供参考和借鉴目前猪接触传染性胸膜肺炎是引起猪呼吸道疾病最主要的疾病之一,-- 血清型较多不同国家和地区流行的血清型不同中国主要为血清 /0 型英国主要为血清和 / 型加拿大和美国主要为血清型北美主要是血清型韩国主要为血清型德国主要为血清 0 型日本主要为血清型澳洲主要为血清型墨西哥主要是血清和型

头孢西丁头孢吡肟和头孢曲松敏感对头孢噻吩和头孢克肟等中等敏感对头孢唑林头孢氨苄头孢拉定头孢匹胺头孢哌酮头孢羟氨苄头孢丙烯及青霉素类半合成抗生素内酰胺类抗生素多烯类抗生素香豆素类抗生素酰胺醇类抗生素内酰

4 期李海利等猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定及药敏试验 / 表药敏试验 '#' $#!-!!' '*#!!!#&# '# +'"% # "!$ +'"% # "!$ +'"% # "!$ 多黏菌素 - 利福平, 新霉素头孢唑肟 ) 4 美洛培南 - 小诺霉素 ) 头孢美唑 ) 4 杆菌肽依替米星 * 头孢克罗 )*) 替考拉宁 )( 四环素 * 头孢哌酮舒巴坦 ) - 新生霉素多西环素 + 头孢他美 ) 磷霉素左氧氟沙星 ( 头孢噻肟 ) 2 氯霉素 ) 萘啶酸,( 头孢他啶 ),4 氨苄西林苏巴坦, 氟罗沙星 (* 头孢地嗪 )+4 替卡西林克拉维酸 )), 加替沙星头孢呋辛钠 )2 阿莫西林克拉维酸, 2), 培氟沙星 -* 头孢噻肟克拉维酸 ) 2), 哌拉西林他唑巴坦 - -, 罗美沙星 ( * 头孢他啶克拉维酸 ),4), 阿莫西林舒巴坦, 2 依诺沙星 * 头孢西丁 2 阿洛西林,4( 司帕沙星 - 头孢吡肟 *- 头孢唑林 )4 阿奇霉素,4 头孢曲松 ) 头孢氨苄 )2 克林霉素 ) 头孢噻吩 ) 头孢拉定 )*+ 红霉素 * 头孢克肟 )*2 头孢匹胺 )- 克拉霉素 )(, 环丙沙星 ) - 头孢哌酮 ) - 罗红霉素 2 诺氟沙星头孢羟氨苄 )+2 麦迪霉素 + 氧氟沙星 ( 头孢丙烯 )-4 交沙霉素 6 青霉素 - 卡那霉素磺胺甲唑甲氧苄啶 2 哌拉西林 - - 庆大霉素磺胺甲唑 2 阿莫西林, 2 阿米卡星, 万古霉素, 氨苄西林,1 奈替米星 * 去甲万古霉素, 羧苄西林 ) 妥布霉素呋喃唑酮苯唑西林 2 链霉素呋喃妥因美洛西林 *4 大观霉素 - 奥卜托新 *- 敏感中介耐药 "#9$!# $#'1# $##$$,-- 感染后很难从猪场根除患病早期用抗生素治疗有效反复用药和不规则用药易导致耐药性的产生本研究药敏试验表明,-- 出现多重耐药只对极个别的出现敏感性如多黏菌素头孢类部分敏感这些菌株中是否有超级耐药菌株出现还需进一步的研究多重耐药菌株的出现给猪接触传染性胸膜肺炎的防制带来了困难这也是临床难治愈的根本原因之一,-- 血清型众多目前市场上没有一种疫苗可防制所有血清型所以对发病猪场进行细菌的分离鉴定耐药监测和血清型鉴定才能有针对性的选用疫苗和进行预防和控制参考文献 %2) # % #$! &#'#:9'# 89'# #$ #8# # # '#$ #$#1!& #,&, & 8# $ 9%6 '#!// / % 2# 6% #$! # 1 8#'## # $ ## #!& #,&, & #'$39# $ #' $'"$ $''9$ 1 % #'$39#6"# & & '$# ", '#1! 3 +( '#6#$! &#! %# #$# $ 8!18'1 $ 8#!& 1 #,&, & 6! "# & & 7%(. 7 % #$!#, #1 '#="'#8'$'1#'"$$' 9'$#',9 1# $# #!& #,&, & # "$ %%'#% $ 8!18'1 $ 9 $ %#$3 6!"# &1 & /

5 / 中国畜牧兽医卷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责任编辑董晓云

《安徒生童话》（四）

《安徒生童话》（四） ! " # $ !"# $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!%" $$$$$$$$$$$$$$$$$$!& $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!&" $$$$$$$$$$$$$$$$$$!&# $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!&( $$$$$$$$$$$$!#) $$$$$$$$$$$$$$$$$$$!)" $$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$!!" $$$$$$$$$$$$$$$$$!!!

期 李 海 利 等 猪 接 触 传 染 性 胸 膜 肺 炎 放 线 杆 菌 血 清 型 分 子 鉴 定 及 药 敏 试 验 / 只 产 生 两 种,9: 毒 素 血 清 型 毒 力 的 强 弱 与,9: 毒 素 种 类 有 关 产,9: 和,9: 的 血 清 型 毒 力 最 强 本 研 究 对 临

期李海利等猪接触传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分子鉴定及药敏试验 / 只产生两种,9: 毒素血清型毒力的强弱与,9: 毒素种类有关产,9: 和,9: 的血清型毒力最强本研究对临