4.8 微生物代谢的调节

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1 6 氨 基 酸 发 酵 与 控 制 6.1 概 述 6.2 氨 基 酸 发 酵 的 代 谢 控 制 6.3 氨 基 酸 发 酵 的 工 艺 控 制 6.4 谷 氨 酸 的 生 产 工 艺 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 的 代 谢 调 控

2 6.1 概 述 氨 基 酸 的 应 用 1. 食 品 工 业 : 营 养 强 化 剂 ; 鲜 味 剂 ; 甜 味 剂 2. 饲 料 工 业 : 营 养 强 化 剂 3. 医 药 工 业 : 氨 基 酸 输 液 ; 氨 基 酸 衍 生 物 ; 氨 基 酸 盐 4. 化 学 工 业 : 洗 涤 剂 ; 护 肤 品 ; 人 造 革 5. 农 业 : 无 公 害 农 药

3 6.1.2 氨 基 酸 的 生 产 方 法 1. 发 酵 法 (1) 直 接 发 酵 野 生 菌 株 营 养 缺 陷 型 突 变 抗 氨 基 酸 结 构 类 似 物 突 变 株 抗 氨 基 酸 结 构 类 似 物 突 变 株 的 营 养 缺 陷 型 菌 株 营 养 缺 陷 型 回 复 突 变 株 发 酵 (2) 添 加 前 体 的 发 酵

4 6.1.3 氨 基 酸 的 生 产 方 法 2. 酶 法 : 利 用 酶 来 制 造 氨 基 酸 3. 提 取 法 : 蛋 白 质 水 解 液 中 提 取 胱 氨 酸 半 胱 氨 酸 和 酪 氨 酸 4. 合 成 法 :DL- 蛋 氨 酸 丙 氨 酸 甘 氨 酸 苯 丙 氨 酸 传 统 的 提 取 法 酶 法 和 化 学 合 成 法 由 于 前 体 物 的 成 本 高, 工 艺 复 杂, 难 以 达 到 工 业 化 生 产 的 目 的

5 6.1.4 氨 基 酸 的 国 内 外 生 产 概 况 日 本 和 德 国 为 世 界 主 要 氨 基 酸 生 产 国 日 本 的 味 之 素 协 和 发 酵 及 德 国 的 德 固 沙 是 世 界 氨 基 酸 生 产 的 三 巨 头 它 们 能 生 产 高 品 质 的 氨 基 酸, 可 直 接 用 于 输 液 制 剂 的 生 产 日 本 在 美 国 法 国 等 建 立 了 合 资 的 氨 基 酸 生 产 厂 家, 生 产 氨 基 酸 和 天 冬 甜 精 等 衍 生 物 2006 年 世 界 味 精 产 量 约 为 205 万 吨, 占 氨 基 酸 总 产 量 2/3 左 右 它 不 仅 在 氨 基 酸 工 业, 而 且 在 整 个 发 酵 工 业 中 也 令 人 瞩 目

6 6.1.5 氨 基 酸 的 国 内 外 生 产 概 况 国 内 生 产 主 要 氨 基 酸 生 产 厂 : 天 津 氨 基 酸 公 司 湖 北 八 峰 氨 基 酸 公 司 生 产 规 模 及 产 品 质 量 与 国 外 大 厂 有 较 大 差 距 在 80 年 代 中 后 期, 我 国 从 日 本 的 味 之 素 协 和 发 酵 以 技 贸 合 作 的 方 式 引 进 输 液 制 剂 的 制 造 技 术, 1991 年 销 售 量 为 二 千 万 瓶,1996 年 达 六 千 万 瓶, 主 要 厂 家 有 无 锡 华 瑞, 北 京 费 森 尤 斯, 昆 明 康 普 莱 特, 但 生 产 原 料 都 依 赖 进 口

7 6.2 氨 基 酸 发 酵 的 代 谢 控 制 控 制 发 酵 的 环 境 条 件 氨 基 酸 发 酵 受 菌 种 的 生 理 特 性 和 环 境 条 件 的 影 响, 对 专 性 需 氧 菌 来 说 环 境 条 件 的 影 响 更 大 谷 氨 酸 产 生 菌 因 环 境 条 件 的 影 响 会 引 起 发 酵 的 转 换, 生 成 各 种 不 同 的 产 物

8 溶 解 氧 : 乳 酸 或 琥 珀 酸 谷 氨 酸 α- 酮 戊 二 酸 ( 通 气 不 足 ) ( 适 中 ) ( 通 气 过 量 ) NH 4+ : α- 酮 戊 二 酸 谷 氨 酸 谷 酰 胺 ( 缺 乏 ) ( 适 量 ) ( 过 量 ) ph: 谷 酰 胺,N- 乙 酰 谷 酰 胺 谷 氨 酸 (ph5-8, NH + 4 过 多 ) ( 中 性 或 微 碱 性 ) 磷 酸 : 缬 氨 酸 谷 氨 酸 ( 高 浓 度 磷 酸 盐 ) 生 物 素 : 乳 酸 或 琥 珀 酸 谷 氨 酸 ( 过 量 ) ( 限 量 )

9 6.2.2 控 制 细 胞 渗 透 性 代 谢 产 物 的 细 胞 透 性 是 氨 基 酸 发 酵 的 重 要 因 素, 只 有 使 细 胞 内 的 氨 基 酸 渗 透 到 细 胞 外, 才 能 大 量 积 累 氨 基 酸 (1) 生 物 素 油 酸 和 表 面 活 性 剂, 引 起 细 胞 膜 的 脂 肪 酸 成 分 的 改 变 (2) 青 霉 素 : 抑 制 细 胞 壁 的 合 成, 由 于 细 胞 内 外 的 渗 透 压 的 差 异 使 谷 氨 酸 泄 漏 出 来

10 6.2.3 控 制 支 路 代 谢 例 如 :L- 异 亮 氨 酸 的 生 物 合 成 可 由 L- 苏 氨 酸 改 为 D- 苏 氨 酸 途 径, 即 采 用 支 路 代 谢

11 6.2.4 降 低 反 馈 作 用 物 的 浓 度 控 制 反 馈 作 用 物 浓 度, 克 服 反 馈 抑 制 和 阻 遏, 使 氨 基 酸 的 生 物 合 成 反 应 能 够 顺 利 进 行

12 6.2.5 消 除 终 产 物 的 反 馈 抑 制 与 阻 遏 作 用 消 除 终 产 物 的 反 馈 抑 制 与 阻 遏 作 用, 是 通 过 使 用 抗 氨 基 酸 结 构 类 似 物 突 变 株 的 方 法 来 进 行 例 : 利 用 抗 性 突 变 株 消 除 S-(β- 氨 基 乙 酸 )-L- 半 胱 氨 酸 ( 即 AEC)( 赖 氨 酸 的 结 构 类 似 物 ) 与 L- 苏 氨 酸 的 协 同 抑 制

13 6.2.6 促 进 ATP 的 积 累, 增 加 氨 基 酸 的 生 物 合 成 氨 基 酸 的 生 物 合 成 需 要 能 量,ATP 的 积 累 可 促 进 氨 基 酸 的 生 物 合 成

14 6.3 氨 基 酸 发 酵 的 工 艺 控 制 培 养 基 1. 碳 源 : 淀 粉 水 解 糖 糖 蜜 醋 酸 乙 醇 烷 烃 碳 源 浓 度 要 适 当, 避 免 碳 源 浓 度 过 高, 否 则 对 菌 体 生 长 不 利, 氨 基 酸 的 转 化 率 降 低 菌 种 性 质 生 产 氨 基 酸 种 类 和 所 采 用 的 发 酵 操 作 决 定 碳 源 种 类

15 2. 氮 源 : 铵 盐 尿 素 氨 水 ; 同 时 调 整 ph 值 营 养 缺 陷 型 添 加 适 量 氨 基 酸 主 要 添 加 有 机 氮 源 水 解 液 需 生 物 素 和 氨 基 酸, 以 玉 米 浆 作 氮 源 尿 素 灭 菌 时 分 解 或 形 成 磷 酸 铵 镁 盐, 须 单 独 灭 菌, 40% 的 尿 素 可 在 min, 高 温 会 生 产 缩 脲 氨 水 用 ph 自 动 控 制 连 续 流 加

16 3. 碳 氮 比 氮 源 除 用 于 菌 体 生 长 外, 还 用 于 氨 基 酸 合 成, 在 氨 基 酸 发 酵 中 常 常 是 用 氨 水 尿 素 来 调 节 ph, 所 以 氨 基 酸 发 酵 所 用 的 C/N 比 一 般 微 生 物 发 酵 的 低, 或 者 说 氮 源 用 量 更 高 谷 氨 酸 发 酵 在 C/N 大 于 100:11 才 开 始 积 累 谷 氨 酸, 所 以 发 酵 的 C/N 为 100:(15~30) 合 成 菌 体 使 用 3~6% 的 氮 源 ; 合 成 谷 氨 酸 用 去 30~ 80% 氮 源

17 4. NH 4 + 浓 度 : 过 低 增 加 α- 酮 戊 二 酸 积 累, 过 高 使 谷 氨 酸 转 化 为 谷 酰 胺 5. 磷 酸 盐 : 对 发 酵 有 显 著 影 响 不 足 时 糖 代 谢 受 抑 制 6. 镁 : 是 已 糖 磷 酸 化 酶 柠 檬 酸 脱 氢 酶 和 羧 化 酶 的 激 活 剂, 并 促 进 葡 萄 糖 -6- 磷 酸 脱 氢 酶 活 力 7. 钾 : 促 进 糖 代 谢 谷 氨 酸 产 酸 期 钾 多 利 于 产 酸, 钾 少 利 于 菌 体 生 长 8. 钠 : 调 节 渗 透 压 作 用, 一 般 在 调 节 ph 值 时 加 入 9. 锰 : 是 许 多 酶 的 激 活 剂 10. 铁 : 是 细 胞 色 素 细 胞 色 素 氧 化 酶 和 过 氧 化 氢 酶 的 活 性 基 的 组 成 分, 可 促 进 谷 氨 酸 产 生 菌 的 生 长 11. 铜 离 子 : 对 氨 基 酸 发 酵 有 明 显 毒 害 作 用

18 12. 生 长 因 子 : 生 物 素 作 用 : 影 响 细 胞 膜 透 性 和 代 谢 途 径 浓 度 : 过 多 促 进 菌 体 生 长, 氨 基 酸 产 量 低 过 少 菌 体 生 长 缓 慢, 发 酵 周 期 长 与 其 它 培 养 条 件 的 关 系 : 氧 供 给 不 足, 生 物 素 过 量 时, 发 酵 向 其 它 途 径 转 化 种 类 : 玉 米 浆 麸 皮 水 解 液 甘 蔗 糖 蜜 和 甜 菜 糖 蜜 为 来 源

19 6.3 氨 基 酸 发 酵 的 工 艺 控 制 ph 对 氨 基 酸 发 酵 的 影 响 及 其 控 制 控 作 制 用 : 机 理 : 主 要 影 响 酶 的 活 性 和 菌 的 代 谢 (1) 控 制 ph 菌 方 体 法 生 : 长 流 或 加 耗 尿 糖 素 慢 和 时 氨, 水 少 量 多 次 流 加 尿 素, 避 免 ph 流 加 过 方 高 式 : 根 据 菌 体 生 长 ph 变 化 糖 耗 情 况 和 发 酵 阶 (2) 段 等 菌 因 体 素 生 决 长 定 或 耗 糖 过 快 时, 流 加 尿 素 可 多 些, 以 抑 制 菌 体 生 长 (3) 发 酵 后 期, 残 糖 少, 接 近 放 罐 时, 少 加 或 不 加 尿 素, 以 免 造 成 氨 基 酸 提 取 困 难 (4) 氨 水 对 ph 影 响 大, 应 采 取 连 续 流 加

20 6.3 氨 基 酸 发 酵 的 工 艺 控 制 温 度 对 氨 基 酸 发 酵 的 影 响 及 其 控 制 菌 体 生 长 达 一 定 程 度 后 才 开 始 产 生 氨 基 酸, 因 此 菌 体 生 长 最 适 温 度 和 氨 基 酸 合 成 的 最 适 温 度 是 不 同 的 谷 氨 酸 前 者 30~32 C, 后 者 34~37 C 菌 体 生 长 阶 段 温 度 不 宜 过 高, 否 则 菌 体 易 衰 老,pH 增 高, 糖 耗 减 慢, 酸 产 量 低 当 菌 体 生 长 温 度 过 高 时 : 要 减 少 通 风 量, 少 量 多 次 流 加 尿 素, 来 促 进 菌 体 生 长 发 酵 中 后 期 : 维 持 合 成 温 度, 以 利 氨 基 酸 合 成

21 6.3 氨 基 酸 发 酵 的 工 艺 控 制 氧 对 氨 基 酸 发 酵 的 影 响 及 其 控 制 要 求 供 氧 充 足 的 谷 氨 酸 族 氨 基 酸 发 酵 : 生 物 合 成 与 TCA 循 环 有 关 适 宜 在 缺 氧 条 件 下 进 行 的 亮 氨 酸 苯 丙 氨 酸 和 缬 氨 酸 发 酵 : 菌 体 呼 吸 受 阻 时 产 量 最 大 供 氧 不 足 时 产 酸 受 轻 微 影 响 的 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 发 酵

22 6.4 谷 氨 酸 生 产 工 艺 谷 氨 酸 生 产 概 述 1. 谷 氨 酸 市 场 : 我 国 谷 氨 酸 总 发 酵 能 力 已 接 近 160 万 吨, 约 占 全 球 谷 氨 酸 产 能 的 75%(2008 年 ); 而 日 本 的 谷 氨 酸 产 能, 包 括 日 本 味 之 素 株 式 会 社 在 本 土 和 海 外 分 公 司 产 能 在 内 只 有 不 到 60 万 吨 ; 韩 国 的 谷 氨 酸 发 酵 能 力 在 20 万 ~25 万 吨 从 市 场 需 求 来 看,2007 年 国 内 谷 氨 酸 年 产 量 约 190 万 吨, 国 内 人 均 消 费 味 精 仅 1kg, 与 日 本 香 港 台 湾 东 南 亚 等 国 家 及 地 区 的 味 精 消 费 水 平 (1.5kg) 相 比, 还 是 较 低 的

23 2. 谷 氨 酸 生 产 方 法 : 水 解 法 : 蛋 白 质 原 料 经 酸 水 解 生 成 谷 氨 酸, 利 用 谷 氨 酸 盐 酸 盐 在 盐 酸 中 的 溶 解 度 最 小 的 性 质, 将 谷 氨 酸 分 离 提 取 出 来 生 产 上 常 用 的 蛋 白 质 原 料 : 面 筋 大 豆 及 玉 米 等 提 取 法 : 以 废 糖 蜜 为 原 料, 先 将 废 糖 蜜 中 的 蔗 糖 回 收, 再 将 废 液 用 碱 法 水 解 浓 缩, 提 取 谷 氨 酸 合 成 法 : 石 油 裂 解 气 丙 烯 氧 化 氨 化 生 成 丙 烯 腈, 通 过 羰 化 氰 氨 化 水 解 等 反 应 生 成 消 旋 谷 氨 酸, 再 经 分 割 制 成 L- 谷 氨 酸 发 酵 法 : 淀 粉 质 原 料 水 解 生 成 葡 萄 糖, 或 直 接 以 糖 蜜 或 醋 酸 为 原 料, 利 用 谷 氨 酸 生 产 菌 生 物 合 成 谷 氨 酸

24 6.4.2 谷 氨 酸 生 产 菌 株 现 有 谷 氨 酸 生 产 菌 主 要 是 棒 状 杆 菌 属 短 杆 菌 属 小 杆 菌 属 及 节 杆 菌 属 中 的 细 菌 : 1. 棒 状 杆 菌 属 (Corynebacterium) 2. 短 杆 菌 属 (Brevibacterium) 3. 小 杆 菌 属 (Microbacterium) 4. 节 杆 菌 属 (Arthrobacterium)

25 1. 目 前 国 内 常 用 的 谷 氨 酸 生 产 菌 株 1 北 京 棒 杆 菌 (AS1299) 2 钝 齿 棒 杆 菌 (AS1542) 3 天 津 短 杆 菌 (T6-13) 目 前 味 精 行 业 采 用 的 主 要 菌 株 S9114 华 南 理 工 大 学 FD415 上 海 复 旦 大 学 4 北 京 棒 杆 菌 (7338) TG961 天 津 科 技 大 学 5 天 津 短 杆 菌 (T6-13) 国 内 : 产 酸 10-13%, 转 化 率 58-62% 国 际 : 产 酸 18-20%, 转 化 率 60-65%

26 2. 谷 氨 酸 生 产 菌 株 的 特 点 1. - 酮 戊 二 酸 氧 化 能 力 微 弱 : - 酮 戊 二 酸 脱 氢 酶 丧 失 或 活 性 低. 2. 谷 氨 酸 脱 氢 酶 活 性 强. 3. 还 原 性 辅 酶 Ⅱ(NADPH + H + ) 进 入 呼 吸 链 能 力 缺 陷 或 微 弱. 4. 异 柠 檬 酸 裂 解 酶 活 力 微 弱. 5. 不 利 用 谷 氨 酸. 6. 耐 高 糖 耐 高 谷 氨 酸. 7. CO 2 固 定 能 力 强. 8. 解 除 谷 氨 酸 反 馈 抑 制. 9. 具 有 向 胞 外 分 泌 谷 氨 酸 的 能 力.

27 3. 谷 氨 酸 生 产 菌 株 的 选 育 各 种 微 生 物 筛 选 的 基 本 过 程 大 致 是 相 同 的, 谷 氨 酸 发 酵 菌 的 筛 选 过 程 与 其 它 微 生 物 菌 种 一 样, 分 为 样 品 采 集 平 板 分 离 初 筛 复 筛 及 发 酵 试 验 五 个 基 本 步 骤 筛 选 不 同 类 型 的 微 生 物, 主 要 是 在 筛 选 的 条 件 及 方 法 上 有 所 不 同, 特 别 是 要 根 据 所 有 寻 找 的 微 生 物 的 形 态 和 生 理 的 特 点, 采 用 特 殊 的 条 件 和 方 法, 筛 选 出 所 需 要 的 菌 株

28 育 种 思 路 选 育 耐 高 渗 透 压 菌 种 ; 选 育 不 分 解 利 用 谷 氨 酸 突 变 株 ; 选 育 细 胞 膜 渗 透 性 好 的 突 变 株 ; 选 育 强 化 CO2 固 定 反 应 的 突 变 株 ; 选 育 减 弱 乙 醛 酸 循 环 的 突 变 株 ; 选 育 强 化 三 羧 酸 循 环 中 从 柠 檬 酸 到 α- 酮 戊 二 酸 代 谢 的 突 变 株 ; 选 育 解 除 谷 氨 酸 对 谷 氨 酸 脱 氢 酶 反 馈 调 节 的 突 变 株 ; 强 化 能 量 代 谢 ; 选 育 减 弱 HMP 途 径 后 段 酶 活 性 的 突 变 株

29 选 育 方 法 1 应 用 原 生 质 体 融 合 新 技 术 选 育 谷 氨 酸 生 产 菌 2 应 用 转 化 法 选 育 谷 氨 酸 生 产 菌 3 应 用 转 导 法 选 育 谷 氨 酸 生 产 菌 4 应 用 重 组 DNA 技 术 构 建 谷 氨 酸 工 程 菌 5 应 用 固 定 化 细 胞 技 术 发 酵 生 产 谷 氨 酸

30 4. 谷 氨 酸 生 产 菌 在 发 酵 过 程 中 的 形 态 变 化 (3) (2) (1) 种 谷 子 氨 的 酸 菌 发 体 酵 形 不 感 态 同 染 阶 噬 段 菌 的 体 菌 后 体 的 形 菌 态 体 形 态 发 斜 从 酵 面 谷 前 和 氨 期 一 酸 感 发 染 二 酵 噬 级 中 菌 种 体 子 后 培 形, 菌 养 态 体 在 的 细 不 变 胞 同 化 明 培 来 显 养 看 减 条, 大 少 件 致, 下 细 可 细 胞 以 胞 不 分 形 规 为 态 基 长 则 本 菌, 发 相 型 圆 似 细 胞 发 斜 胖 面 转, 缺 培 移 乏 养 期 "V" 的 细 菌 胞 字 体 和 形 较 产 排 细 酸 列 小 型, 有, 细 明 一 胞 显 3 种 的 二 不 细 级 同 胞 种 时 碎 子 期 片 比 的, 斜 严 细 面 重 菌 时 胞 体 出 形 大 现 态 而 拉 粗 丝 壮, 革 拉 兰 网 氏, 互 染 相 色 堆 深 在 一 多 起 为, 几 短 乎 杆 找 至 不 棒 到 杆 完 状 整, 有 的 菌 微 体 呈 弯 细 曲 胞 状, 类, 似 两 蛛 端 网 钝 或 圆 鱼, 翅 无 状 分 枝 ; 细 胞 排 列 呈 单 个 成 对 及 V 字 形, 有 栅 状 或 不 规 则 聚 块 ; 分 裂 的 细 胞 大 小 为 0.7~ 在 发 酵 中 后 期 感 染 噬 菌 体 后, 菌 体 细 胞 形 态 不 规 则, 边 缘 0.9*1.0~3.4um 由 于 生 物 素 充 足, 繁 殖 的 菌 体 细 胞 均 为 谷 不 整 齐, 有 的 边 缘 似 乎 有 许 多 毛 刺 状 的 东 西, 有 细 胞 碎 片 氨 酸 非 积 累 型 细 胞

31 5. 菌 种 的 扩 大 培 养 和 种 子 的 质 量 要 求 1) 种 子 扩 大 培 养 过 程 斜 面 菌 种 一 级 种 子 培 养 二 级 种 子 培 养 发 酵 罐

32 2) 种 子 的 质 量 要 求 a) 在 显 微 镜 下 检 查 时, 要 求 菌 体 待 续 奥 均 匀, 呈 单 个 或 八 字 形 排 列, 细 胞 呈 棒 状 略 有 弯 曲, 革 兰 氏 阳 性 菌 体 的 形 状 是 细 胞 生 理 状 态 的 一 种 表 现, 菌 体 大 小 均 匀, 呈 八 字 排 列 表 明 细 胞 生 长 繁 殖 旺 盛, 生 活 力 强 b) 二 级 种 子 培 养 过 程 中,pH 的 变 化 有 一 定 的 规 律, 从 ph6.8 上 升 到 ph8 左 右, 然 后 又 逐 步 下 降 c) 二 级 种 子 的 活 菌 浓 度 要 求 达 到 个 /ml d) 二 级 种 子 要 求 活 力 旺 盛 ( 对 数 生 长 期 )

33 (1)EMP 途 径 6.4 谷 氨 酸 生 产 工 艺 谷 氨 酸 合 成 途 径 糖 酵 解 生 成 丙 酮 酸 (2)HMP 途 径 6- 磷 酸 葡 萄 糖 在 6- 磷 酸 葡 萄 糖 脱 氢 酶 的 作 用 下 生 成 6- 磷 酸 葡 萄 糖 酸, 再 生 成 5- 磷 酸 戊 糖, 通 过 戊 糖 代 谢 分 解 成 三 碳 化 合 物 和 二 碳 化 合 物, 三 碳 化 合 物 与 EMP 途 径 联 系, 二 碳 化 合 物 进 入 TCA 循 环

34 (3)TCA 循 环 谷 氨 酸 合 成 途 径 通 过 EMP HMP 途 径 生 成 的 丙 酮 酸, 在 有 氧 条 件 下, 氧 化 脱 氢 生 成 乙 酰 CoA, 同 时 经 CO 2 固 定 作 用 生 成 草 酰 乙 酸, 二 者 在 柠 檬 酸 合 成 酶 催 化 条 件 下 生 成 柠 檬 酸 进 入 TCA 循 环 TCA

35 6.4.3 谷 氨 酸 合 成 途 径 (4)DCA 循 环 (TCA 循 环 支 路 ) 在 谷 氨 酸 发 酵 中,DCA 环 一 方 面 可 以 作 为 TCA 循 环 有 缺 陷 时 C4 二 羧 酸 的 补 充, 一 方 面 为 谷 氨 基 酸 生 产 菌 的 生 长 中 提 供 能 量 谷 氨 酸 生 成 期 中 要 封 闭 DCA 循 环, 因 为 通 过 DCA 环 提 供 C4 二 羧 酸 时 谷 氨 酸 对 糖 的 转 化 率 仅 为 54.4% 异 柠 檬 酸 裂 解 酶 DCA

36 (5)NH4+ 导 入 谷 氨 酸 合 成 途 径 合 成 谷 氨 酸 的 反 应 有 3 种 : 谷 氨 酸 脱 氢 酶 α- 酮 戊 二 酸 + NH NADPH 谷 氨 酸 + H 2 O + NADP 谷 氨 酸 转 氨 酶 α- 酮 戊 二 酸 + 天 冬 氨 酸 或 丙 氨 酸 谷 氨 酸 + α- 酮 戊 二 酸 谷 氨 酸 合 成 酶 α- 酮 戊 二 酸 + 谷 氨 酰 胺 + NADPH 2 谷 氨 酸 + NADP

37 6.4 谷 氨 酸 生 产 工 艺 谷 氨 酸 合 成 的 调 节 机 制 1 优 先 合 成 与 反 馈 调 节 ⑴ 优 先 合 成 : 谷 氨 酸 比 天 冬 氨 酸 优 先 合 成, 谷 氨 酸 合 成 过 量 后, 抑 制 和 阻 遏 自 身 的 合 成 途 径, 使 代 谢 转 向 合 成 天 冬 氨 酸 ⑵ 谷 氨 酸 脱 氢 酶 (GDH) 的 调 节 : 谷 氨 酸 对 谷 氨 酸 脱 氢 酶 存 在 着 反 馈 阻 遏 和 反 馈 抑 制 谷 氨 酸 脱 氢 酶 ⑶ 柠 檬 酸 合 成 酶 的 调 节 : 柠 檬 酸 合 成 酶 受 能 荷 调 节 谷 氨 酸 的 反 馈 阻 遏 和 顺 乌 头 酸 的 反 馈 抑 制 柠 檬 酸 合 成 酶 谷 氨 酸 对 其 反 馈 抑 制 和 反 馈 阻 遏 TCA 的 关 键 酶, 受 能 荷 调 节, 谷 氨 酸 反 馈 阻 遏, 乌 头 酸 反 馈 抑 制

38 ⑷ 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 的 调 节 细 胞 内 α- 酮 戊 二 酸 的 量 与 异 柠 檬 酸 的 量 需 维 持 平 衡 当 α- 酮 戊 二 酸 过 量 时, 将 对 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 发 生 反 馈 抑 制 作 用, 停 止 合 成 α- 酮 戊 二 酸 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 α- 酮 戊 二 酸 反 馈 抑 制 α- 酮 戊 二 酸 脱 氢 酶 在 谷 氨 酸 产 生 菌 中 先 天 性 的 丧 失 或 微 弱 磷 酸 烯 醇 式 丙 酮 酸 羧 化 酶 受 天 冬 氨 酸 的 反 馈 抑 制, 受 谷 氨 酸 和 天 冬 氨 酸 的 反 馈 阻 遏

39 2 糖 代 谢 的 调 节 (1) 能 荷 控 制 : 细 胞 内 ATP 分 解, 生 成 ADP 和 AMP, 能 荷 降 低 加 速 糖 酵 解. 当 细 胞 内 能 荷 高 时,ATP 增 加, 抑 制 糖 原 降 解 糖 酵 解 和 TCA 循 环 的 关 键 酶, 如 糖 原 磷 酸 化 酶 磷 酸 果 糖 激 酶 柠 檬 酸 合 成 酶 异 柠 檬 酸 合 成 酶, 并 激 活 糖 类 合 成 所 需 要 的 酶, 如 糖 原 合 成 酶 和 果 糖 -1,6- 二 磷 酸 酯 酶, 从 而 抑 制 糖 的 分 解, 加 速 糖 原 的 合 成 (2) 生 物 素 的 影 响 : 生 物 素 对 糖 代 谢 的 影 响, 主 要 是 影 响 糖 降 解 速 度 生 物 素 作 为 催 化 脂 肪 酸 生 物 合 成 最 初 反 应 的 关 键 酶 乙 酰 CoA 的 辅 酶, 参 与 脂 肪 酸 的 生 物 合 在, 进 而 影 响 磷 酯 的 合 成 华 南 理 工 大 学生 物 学 院

40 3 氮 代 谢 的 调 节 控 制 谷 氨 酸 发 酵 的 关 键 之 一 就 是 降 低 蛋 白 质 的 合 成 能 力, 使 合 成 的 谷 氨 酸 不 能 转 化 成 其 他 氨 基 酸 或 参 与 蛋 白 质 合 成 在 生 物 素 亚 适 量 的 情 况 下, 几 乎 没 有 异 柠 檬 酸 裂 解 酶, 琥 珀 酸 氧 化 能 力 弱, 苹 果 酸 和 草 酰 乙 酸 脱 羧 反 应 停 滞, 在 铵 离 子 适 量 存 在 下, 生 成 积 累 谷 氨 酸 生 成 的 谷 氨 酸 也 不 通 过 转 氨 作 用 生 成 其 他 氨 基 酸 和 合 成 蛋 白 质 因 此, 通 过 控 制 生 物 素 的 量 控 制 转 氨 作 用

41 6.4.5 谷 氨 酸 积 累 的 理 想 途 径 (1) 一 定 的 糖 酵 解 速 度, 不 能 走 向 乳 酸 等 的 发 酵 (2) 生 成 丙 酮 酸 后, 一 部 分 氧 化 脱 羧 生 成 乙 酰 CoA, 一 部 分 固 定 CO2 生 成 草 酰 乙 酸 或 苹 果 酸, 草 酰 乙 酸 与 乙 酰 CoA 在 柠 檬 酸 合 成 酶 作 催 化 作 用 下, 缩 合 成 柠 檬 酸, 再 经 下 面 的 氧 化 还 原 共 轭 的 氨 基 化 反 应 生 成 谷 氨 酸 (3) 生 成 的 乙 酰 CoA 不 向 脂 肪 酸 途 径 转 化, 全 部 趋 于 合 成 柠 檬 酸

42 6.4.5 谷 氨 酸 积 累 的 理 想 途 径 (4)α- 酮 戊 二 酸 氧 化 能 力 微 弱, 即 不 转 化 为 琥 珀 酸, 而 成 为 马 蹄 形 不 完 整 的 三 羧 酸 环 (5) 异 柠 檬 酸 裂 解 酶 活 性 弱, 即 不 形 成 二 羧 酸 环 (6) 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 活 性 强

43 6.4.5 谷 氨 酸 积 累 的 理 想 途 径 (7)L- 谷 氨 酸 脱 氢 酶 活 性 强, 在 NH3 存 在 下, 由 α- 酮 戊 二 酸 转 化 为 谷 氨 酸 ( 这 点 特 别 重 要 ) (8)NADPH 再 氧 化 能 力 欠 缺 谷 氨 酸 菌 有 两 种 该 类 酶, 即 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 和 L- 谷 氨 酸 脱 氢 酶 (9) 造 成 强 的 细 胞 膜 透 性, 以 便 克 服 终 产 物 反 馈 抑 制 和 阻 遏, 使 生 产 菌 产 生 的 谷 氨 酸 不 断 地 渗 到 细 胞 外 进 入 培 养 基 中

44 6.4.6 谷 氨 酸 发 酵 控 制 1. 发 酵 培 养 基 碳 源 : 目 前 所 发 现 的 谷 氨 酸 产 生 菌 均 不 能 利 用 淀 粉, 只 能 利 用 葡 萄 糖 果 糖 蔗 糖 和 麦 芽 糖 等, 有 些 菌 种 能 够 利 用 醋 酸 乙 醇 正 烷 烃 等 作 碳 源 氮 源 : 无 机 氮 源 : 尿 素 液 氮 碳 酸 氢 铵 ; 有 机 氮 源 : 主 要 是 蛋 白 质 胨 氨 基 酸 等 ; 谷 氨 酸 发 酵 的 有 机 氮 源 常 用 玉 米 浆 麸 皮 水 解 液 豆 饼 水 解 液 和 糖 蜜 等 无 机 盐 : 磷 酸 盐 硫 酸 镁 钾 盐 微 量 元 素 生 长 因 子 : 生 物 素 维 生 素 B1

45 2. 谷 氨 酸 发 酵 过 程 适 应 期 : 尿 素 分 解 出 氨 使 ph 上 升, 糖 不 利 用 2-4h 措 施 : 接 种 量 和 发 酵 条 件 控 制 使 期 缩 短 对 数 生 长 期 : 糖 耗 快, 尿 素 大 量 分 解 使 ph 上 升, 氨 被 利 用 ph 又 迅 速 下 降, 溶 氧 急 剧 下 降 后 维 持 在 一 定 水 平, 菌 体 浓 度 迅 速 增 大, 菌 体 形 态 为 排 列 整 齐 的 八 字 形, 不 产 酸 12h 措 施 : 及 时 供 给 菌 体 生 长 必 须 的 氮 源 及 调 节 ph, 在 ph 时 流 加 尿 素 ; 维 持 温 度 生 长 停 止 期 : 谷 氨 酸 合 成 措 施 : 提 供 必 须 的 氨 及 ph 维 持 在 , 大 量 通 气, 控 制 温 度 发 酵 后 期 : 菌 体 衰 老, 糖 耗 慢, 残 糖 低 措 施 : 营 养 物 耗 尽 酸 浓 度 不 增 加 时, 及 时 放 罐

46 6.4.6 谷 氨 酸 发 酵 控 制 3. 生 物 素 量 的 控 制 生 物 素 的 作 用 : (1) 促 进 EMP 和 乙 酰 Co-A 生 成 (2) 封 闭 乙 醛 酸 循 环 (DCA) (3) 控 制 菌 体 增 殖 (4) 控 制 细 胞 膜 通 透 性

47 4. 温 度 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 各 种 微 生 物 在 一 定 条 件 下, 都 有 一 个 最 适 的 生 长 温 度 范 围 谷 氨 酸 产 生 菌 的 最 适 生 长 温 度 为 30~40, 产 生 谷 氨 酸 的 最 适 为 35~37 若 温 度 过 高, 菌 体 容 易 衰 老 生 产 上 表 现 为 OD 值 增 长 慢,pH 值 高, 耗 糖 慢, 发 酵 周 期 长, 谷 氨 酸 生 成 少 应 及 时 降 温, 采 用 小 通 风, 流 加 尿 素 以 少 量 多 次 ; 必 要 是 时 可 补 加 玉 米 浆, 以 促 进 生 长 适 当 提 高 温 度 可 加 快 发 酵 速 率

48 4. 温 度 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 引 起 发 酵 过 程 温 度 变 化 的 原 因 是 发 酵 过 程 中 所 产 生 的 热 量, 叫 做 发 酵 热 发 酵 热 包 括 生 物 热 搅 拌 热 蒸 发 热 及 辐 射 热 等 (1) 生 物 热 Q1 在 发 酵 过 程 中, 由 于 菌 体 生 长 繁 殖 和 形 成 代 谢 产 物, 不 断 地 利 用 培 养 基 中 地 营 养 物 质, 将 其 分 解 氧 化 而 放 出 能 量, 其 中 一 部 分 用 于 合 成 高 能 化 合 物, 其 余 部 分 则 以 热 的 形 式 散 发 出 来 (2) 搅 拌 热 Q2 发 酵 罐 中 由 于 机 械 搅 拌 造 成 液 体 之 间 液 体 与 搅 拌 器 等 设 备 之 间 摩 擦 产 生 的 热 量

49 4. 温 度 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 引 起 发 酵 过 程 温 度 变 化 的 原 因 是 发 酵 过 程 中 所 产 生 的 热 量, 叫 做 发 酵 热 发 酵 热 包 括 生 物 热 搅 拌 热 蒸 发 热 及 辐 射 热 等 (3) 蒸 发 热 Q3 通 气 时, 引 起 发 酵 液 的 水 分 蒸 发, 被 空 气 和 蒸 发 水 分 带 走 的 热 量 (4) 辐 射 热 Q4 由 于 发 酵 罐 内 液 体 温 度 与 罐 外 环 境 温 度 不 同, 发 酵 液 的 部 分 热 量 通 过 罐 体 向 外 辐 射 发 酵 发 热 Q=Q1+Q2-Q3-Q4

50 5. ph 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 ph 值 对 微 生 物 的 生 长 和 代 谢 产 物 的 积 累 都 有 很 大 影 响 不 同 种 类 的 微 生 物 对 ph 值 的 要 求 不 同, 谷 氨 酸 生 产 菌 的 最 适 ph 值 为 , 各 种 菌 种 又 略 有 不 同, 例 如, 黄 色 短 杆 菌 的 最 适 ph 值 为 , 北 京 棒 杆 菌 为 但 它 们 均 能 在 比 较 广 泛 的 ph 值 范 围 内 生 长 对 ph 值 的 适 应 范 围 取 决 于 微 生 物 的 生 态 学

51 5. ph 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 谷 氨 酸 发 酵 在 中 性 和 微 碱 条 件 下 ( ph 值 ) 积 累 谷 氨 酸, 在 酸 性 条 件 下 ( ph 值 ) 则 容 易 形 成 谷 氨 酰 氨 和 N- 乙 酰 谷 酰 氨 在 不 同 的 培 养 阶 段 对 ph 值 的 要 求 也 往 往 不 同, 发 酵 前 期, 幼 龄 菌 体 细 胞 对 氮 的 利 用 率 较 高, ph 值 变 化 大 发 酵 前 期 ph 值 偏 低, 菌 体 生 长 旺 盛, 消 耗 营 养 成 分 快, 菌 体 转 入 正 常 代 谢, 长 菌 而 不 产 谷 氨 酸 当 ph 值 偏 高, 对 菌 体 生 长 不 利, 糖 代 谢 缓 慢, 发 酵 周 期 延 长 但 是, 在 发 酵 前 期 ph 值 稍 高 些 对 抑 制 杂 菌 生 长 有 利 因 此, 发 酵 前 期 控 制 ph 值 在 ph7.5 左 右, 发 酵 中 后 期 控 制 ph7.2 左 右, 因 为 谷 氨 酸 脱 氢 酶 的 最 适 作 用 ph 值 为 , 氨 基 转 移 酶 的 最 适 ph 值 为

52 5. ph 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 谷 氨 酸 发 酵 过 程 中, 由 于 菌 体 对 培 养 基 的 利 用 和 代 谢 产 物 的 形 成, 使 培 养 液 中 ph 值 不 断 变 化 应 根 据 具 体 情 况 调 节 控 制 ph 值 ph 值 的 调 节 方 法 主 要 有 一 下 几 种 : a) 氨 水 流 加 法 在 发 酵 过 程 中 根 据 ph 值 的 变 化, 流 加 氨 水 调 节 ph 值, 且 作 为 氮 源 但, 氨 水 作 为 快 速 氮 源, 对 发 酵 液 的 ph 值 波 动 的 影 响 较 大, 应 采 用 连 续 流 加 为 好 b) 尿 素 流 加 法 目 前 国 内 味 精 厂 普 遍 采 用 的 方 法 流 加 尿 素, 作 为 氮 源, 同 时 调 节 ph 值, 由 于 ph 值 变 化 具 有 一 定 的 规 律 性, 易 于 操 作 控 制

53 6. 供 氧 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 谷 氨 酸 生 产 菌 是 兼 性 好 氧 菌, 在 谷 氨 酸 发 酵 中, 供 氧 过 大 或 过 小 对 菌 体 生 长 和 谷 氨 酸 积 累 都 有 很 大 影 响 不 同 种 龄 种 量, 培 养 基 成 分, 发 酵 阶 段 及 发 酵 罐 大 小 要 求 通 风 量 不 同 在 长 菌 体 阶 段, 通 风 量 过 大, 生 物 素 缺 乏, 抑 制 菌 体 生 长 在 发 酵 产 酸 阶 段, 需 要 大 量 通 风 供 氧, 以 防 过 量 生 成 乳 酸 和 琥 珀 酸, 但 过 大 通 风, 则 大 量 积 累 a- 酮 戊 二 酸

54 7. 泡 沫 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 发 酵 过 程 中 产 生 的 泡 沫 过 多, 控 制 不 好, 会 引 起 大 量 逃 出 发 酵 罐 而 造 成 环 境 污 染 同 时, 泡 沫 的 渗 出 还 会 带 来 染 菌 的 风 险 发 酵 罐 中 泡 沫 太 多 还 会 影 响 氧 的 传 递, 影 响 通 风 与 搅 拌 的 效 果 因 此, 在 发 酵 过 程 中 如 何 避 免 泡 沫 的 过 多 产 生 是 保 证 发 酵 正 常 进 行 的 关 键 泡 沫 的 形 成 泡 沫 形 成 的 必 要 条 件 : (1) 气 液 相 共 存 ; (2) 有 表 面 张 力 大 的 物 质 存 在 泡 沫 形 成 的 原 因 : (1) 通 分 的 气 流 被 搅 拌 器 打 碎 而 分 散 形 成 ; (2) 菌 体 代 谢 过 程 产 生 的 气 体 聚 结 而 成

55 7. 泡 沫 对 谷 氨 酸 发 酵 的 影 响 泡 沫 的 消 除 发 酵 工 业 上 消 除 泡 沫 的 方 法 有 两 种 : 机 械 消 泡 和 化 学 消 泡 剂 消 泡 (1) 机 械 消 泡 是 借 机 械 力 将 泡 沫 打 破, 或 借 压 力 变 化 使 泡 沫 破 裂 机 械 消 泡 器 如 耙 式 消 泡 器 离 心 式 碟 片 式 等 优 点 是 不 用 向 发 酵 液 添 加 其 它 物 质, 减 少 染 菌 的 机 会 缺 点 是 不 能 从 根 本 上 消 泡, 需 要 一 定 的 设 备 和 消 耗 一 定 的 动 力 (2) 化 学 消 泡 是 指 通 过 添 加 具 有 较 低 表 面 张 力 的 表 面 活 性 剂, 使 泡 膜 局 部 的 表 面 张 力 降 低, 力 的 平 衡 打 破 而 使 泡 破 裂 优 点 是 消 泡 效 果 好, 作 用 迅 速 缺 点 是 选 择 不 当 会 影 响 菌 体 生 长 或 代 谢 产 物 的 积 累, 操 作 上 会 增 加 染 菌 的 机 会, 用 量 过 多 会 影 响 氧 的 传 递 发 酵 工 业 上 常 用 的 消 泡 剂 主 要 有 四 类 : 天 然 油 脂 类 聚 醚 类 醇 类 硅 酮 消 泡 剂

56 8. 发 酵 过 程 的 主 要 变 化 及 控 制 (1) 适 应 期 菌 体 基 本 不 生 长, 糖 等 底 物 基 本 不 消 耗 适 应 期 的 长 短 取 决 于 种 子 的 质 量 数 量 和 发 酵 条 件, 一 般 为 4 小 时 左 右 采 用 大 种 量 流 加 法 高 糖 发 酵, 适 应 期 不 到 2 小 时

57 8. 发 酵 过 程 的 主 要 变 化 及 控 制 (2) 对 数 生 长 期 菌 体 大 量 繁 殖, 代 谢 旺 盛, 培 养 物 光 密 度 迅 速 上 升, 耗 糖 速 度 加 快, 耗 氧 量 增 大 此 时 须 注 意 及 时 流 加 尿 素 补 充 氮 源 和 调 节 ph, 控 制 温 度 减 少 因 发 酵 热 大 量 放 出 而 使 泡 沫 增 加 这 阶 段 几 乎 不 产 谷 氨 酸 对 数 期 一 般 在 12 小 时 左 右

58 8. 发 酵 过 程 的 主 要 变 化 及 控 制 (3) 转 化 期 菌 体 基 本 停 止 生 长,OD 值 达 到 最 大, 菌 体 内 酶 系 活 跃, 尿 素 被 尿 酶 释 放 出 来, 使 ph 值 上 升 (4) 产 酸 期 氨 被 利 用 来 合 成 谷 氨 酸, 使 ph 值 下 降 此 时 必 须 及 时 补 加 尿 素, 保 证 形 成 谷 氨 酸 所 必 须 的 氨, 同 时 调 节 ph 值

59 6.4.7 谷 氨 酸 发 酵 过 程 中 噬 菌 体 和 杂 菌 的 防 治 1. 谷 氨 酸 发 酵 中 噬 菌 体 的 污 染 及 防 治 在 谷 氨 酸 发 酵 中 时 常 发 生 这 样 的 事 情, 发 酵 开 始 时, 菌 体 生 长 良 好, 后 来 突 然 急 剧 减 少, 短 短 几 小 时 内, 数 吨 发 酵 液 中 的 菌 体 全 部 被 破 坏, 不 再 积 累 谷 氨 酸, 往 往 伴 随 着 出 现 染 菌 噬 菌 体 对 谷 氨 酸 发 酵 的 危 害, 轻 则 减 产, 重 则 会 引 起 发 酵 液 全 部 倒 弃, 造 成 严 重 埙 失

60 a. 噬 菌 体 感 染 的 症 状 : 根 据 我 国 谷 氨 酸 发 酵 生 产 上 采 用 的 谷 氨 酸 生 产 菌 感 染 时 所 表 现 的 症 状, 可 归 纳 以 下 几 点 : (1) 发 酵 液 光 密 度 在 初 期 不 上 升 或 回 降 ; (2) 发 酵 液 ph 值 逐 渐 上 升,4-8 小 时 内 可 达 8.0 以 上, 不 再 下 降 ; (3) 耗 糖 缓 慢 或 停 止 ; (4) 产 生 大 量 泡 沫, 有 时 发 酵 液 呈 现 粘 胶 状, 可 拔 丝 ; (5) 谷 氨 酸 产 生 量 极 少 或 增 长 极 为 缓 慢, 或 停 止 ; (6) 镜 检 时 可 发 现, 菌 体 数 显 著 减 少, 菌 体 不 规 则 严 重 时, 镜 检 看 不 到 菌 体 革 兰 氏 染 色 出 现 红 色 碎 片 ; (7) 发 酵 液 残 糖 高 颜 色 重 发 灰 发 红 有 刺 激 臭 味, 粘 度 大, 泡 沫 多, 难 中 和, 过 滤 困 难

61 b. 噬 菌 体 的 来 源 : 噬 菌 体 的 来 源 可 能 有 下 列 几 种 : (1) 工 厂 生 产 环 境 的 自 然 条 件 存 在 噬 菌 体 ; (2) 或 菌 体 随 发 酵 液 ( 取 样 逃 液 种 子 液 及 带 菌 器 皿 洗 涤 水 ) 不 加 处 理 随 意 排 放 ; (3) 染 噬 菌 体 的 发 酵 罐 排 气 不 经 处 理 ; (4) 染 噬 菌 体 的 发 酵 液 不 经 处 理 放 走 ; (5) 车 间 卫 生 条 件 差

62 c. 谷 氨 酸 发 酵 中 噬 菌 体 危 害 的 防 治 : 为 了 防 治 噬 菌 体 的 污 染, 在 谷 氨 酸 发 酵 中 一 般 采 取 污 染 的 预 防, 消 灭 或 减 少 周 围 环 境 中 的 噬 菌 体 ; 选 育 使 用 抗 性 菌 株 ; 利 用 噬 菌 体 具 有 严 格 的 寄 主 对 象 范 围, 采 用 不 同 菌 种 轮 换 ; 选 择 药 物 防 治 和 改 变 培 养 基 组 成 防 治 噬 菌 体 等 方 法 (1) 规 范 工 厂 环 境 卫 生 清 洁 制 度 ; (2) 车 间 道 路 尽 量 采 用 水 泥 或 沥 青 等 光 滑 地 面, 定 期 用 药 剂 冲 刷 地 面 ; (3) 种 子 和 发 酵 工 段 的 操 作 人 员 要 严 格 执 行 无 菌 操 作 规 程 ; (4) 认 真 进 行 发 酵 罐 输 油 管 等 设 备 的 灭 菌 ; (5) 发 酵 罐 排 除 的 废 气 和 泡 沫 经 过 处 理 后 再 排 放 ; (6) 改 进 设 备 装 置, 要 易 于 清 洗 和 维 修

63 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 a. 从 染 菌 的 现 象 分 析 引 起 染 菌 的 原 因 (1) 从 染 菌 时 间 看 早 期 染 菌 除 了 种 子 带 杂 菌 外, 主 要 是 培 养 基 或 设 备 灭 菌 不 彻 底 ; 中 后 期 染 菌 可 能 与 中 间 补 料 设 备 渗 漏 以 及 操 作 不 合 理 等 有 关 (2) 从 污 染 的 杂 菌 类 型 看 污 染 耐 热 的 芽 孢 杆 菌, 多 数 是 培 养 基 灭 菌 不 彻 底 或 设 备 存 在 死 角 ; 污 染 无 芽 孢 菌 等 不 耐 热 菌, 可 能 是 冷 凝 水 带 来 的 (3) 大 批 发 酵 罐 染 菌 主 要 是 空 气 过 滤 器 除 菌 不 净 (4) 部 分 发 酵 罐 染 菌 (5) 个 别 发 酵 罐 染 菌

64 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (1) 种 子 带 菌 (2) 罐 体 与 管 件 渗 漏 (3) 空 气 系 统 染 菌 (4) 蒸 汽 压 力 与 灭 菌 (5) 操 作 不 慎 引 起 染 菌 1 罐 的 负 压 2 发 酵 罐 顶 盘 根 处 不 严, 操 作 不 慎, 部 分 料 从 根 处 跑 出 (6) 环 境 卫 生 差

65 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (7) 死 角 1 法 兰 连 接 的 死 角

66 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (7) 死 角 2 不 合 理 配 料 管 配 置 引 起 的 染 菌

67 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (7) 死 角 3 采 用 环 式 空 气 分 布 管 时, 罐 底 渣 滓 形 成 的 死 角

68 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (7) 死 角 4 压 力 表 安 装 不 合 理 造 成 的 死 角

69 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (7) 死 角 5 铁 罐 用 不 锈 钢 衬 里 造 成 死 角

70 2. 谷 氨 酸 发 酵 中 杂 菌 的 防 治 b. 造 成 杂 菌 污 染 的 主 要 途 径 (7) 死 角 6 接 种 与 接 种 管 路

71 6.4.8 谷 氨 酸 提 取 1. 谷 氨 酸 提 取 方 法 (1) 等 电 点 法 将 发 酵 液 加 盐 酸 调 ph 至 谷 氨 酸 的 等 电 点, 使 谷 氨 酸 沉 淀 析 出, 其 收 率 可 达 50-70% 等 电 点 法 是 谷 氨 酸 提 取 方 法 种 最 简 单 的 一 种 方 法 此 法 操 作 简 便 设 备 简 单, 适 用 于 像 谷 氨 酸 这 类 在 水 中 溶 解 度 较 低 的 氨 基 酸 的 提 取, 一 次 收 率 达 60% 左 右 以 等 电 点 法 为 例 讲 解 谷 氨 酸 的 提 取

72 a. 等 电 点 法 工 艺 流 程 菌 体 轻 麸 酸 发 酵 液 起 晶 中 和 点 ph 停 酸 育 晶 2 小 时 低 速 搅 拌 ph 静 置 沉 降 4-6 小 时 离 心 分 离 谷 氨 酸 20 波 美 盐 酸 母 液

73 一 次 低 温 等 电 点 提 取 浓 缩 蒸 发 浓 缩 低 温 等 电 点 提 取 工 艺 的 几 个 关 键 步 骤 除 菌 体 三 级 高 速 离 心 机 分 离 等 电 点 分 离 调 节 PH 降 温 单 罐 分 批 或 连 续 等 电 点 转 晶 加 热 溶 解 加 晶 种 迅 速 冷 却

74 b. 影 响 谷 氨 酸 结 晶 析 出 的 主 要 因 素 (1) 谷 氨 酸 含 量 当 发 酵 液 中 谷 氨 酸 在 4% 以 上 时, 等 电 (5) 搅 拌 的 影 响 使 晶 体 与 母 液 均 匀 接 触, 有 利 于 晶 体 的 长 结 晶 操 作 容 易 ; 大, 使 晶 体 大 小 均 匀 一 致, 一 般 以 20-30rpm 为 宜 ; (2) 温 度 温 度 越 低, 谷 氨 酸 的 溶 解 度 小 为 避 免 形 成 (6) 残 糖 的 影 响 发 酵 液 种 残 糖 应 越 底 越 好, 以 较 少 β- 型 结 β- 型 结 晶, 一 般 生 产 上 通 过 控 制 酸 的 流 加 速 度 来 控 制 温 晶 产 生, 提 高 等 电 结 晶 的 收 率 ; 度 缓 慢 下 降 到 30 以 下 ; (7) 菌 体 的 影 响 减 少 发 酵 液 中 菌 体 的 量, 有 利 于 提 高 收 率 ; (3) 酸 的 影 响 加 酸 调 节 发 酵 液 的 ph 值, 使 其 达 到 谷 氨 (8) 杂 菌 的 影 响 杂 菌 的 存 在 降 低 了 谷 氨 酸 的 结 晶, 使 晶 体 酸 的 等 电 点, 一 般 控 制 在 ph ; 的 质 量 下 降 (4) 晶 种 于 晶 核 形 成 之 前 投 放 一 定 的 晶 种, 便 于 结 晶, 有 利 于 收 率 的 提 高 ;

75 1. 谷 氨 酸 提 取 方 法 (2) 离 子 交 换 法 用 阳 离 子 交 换 树 脂 提 取 吸 附 谷 氨 酸 形 成 的 阳 离 子, 再 用 热 碱 洗 脱, 收 集 相 应 流 分, 再 加 盐 酸 结 晶 (3) 盐 酸 盐 法 盐 酸 水 解 时 也 使 菌 体 蛋 白 水 解 成 氨 基 酸 并 可 使 碳 水 化 合 物 破 坏, 生 成 腐 殖 质 而 被 除 去, 提 高 水 解 液 质 量, 利 用 谷 氨 酸 盐 在 浓 盐 酸 中 溶 解 度 低 而 将 谷 氨 酸 与 谷 氨 酰 胺 和 焦 谷 氨 酸 等 杂 质 分 离 (4) 锌 盐 法 利 用 谷 氨 酸 锌 在 水 溶 液 中 的 溶 解 度 低 的 原 理, 将 发 酵 液 中 谷 氨 酸 一 次 进 行 回 收 (5) 渗 透 膜 分 离 法 根 据 渗 透 膜 对 各 种 离 子 性 物 质 的 选 择 渗 透 性 不 同 而 将 谷 氨 酸 分 离, 如 点 渗 析 法

76 谷 氨 酸 谷 氨 酸 生 产 味 精 的 工 艺 活 性 炭 母 液 硫 化 碱 中 和 沉 淀 脱 色 过 滤 脱 色 过 滤 GH 15 颗 粒 活 性 炭 脱 色 浓 缩 结 晶 离 心 分 离 小 结 晶 水 ( 或 渣 水 ) 碳 酸 钠 硫 化 碱 谷 氨 酸 回 调 ph 活 性 炭 二 次 脱 色 结 晶 味 精 干 燥 拌 盐 粉 碎 粉 状 味 精 活 性 炭 活 性 炭 脱 色 硫 化 碱 晶 种 流 加 母 液 蒸 馏 水 干 燥 过 筛 粉 状 味 精

77 1. 谷 氨 酸 钠 生 产 工 艺 注 入 冷 冻 盐 水 降 至 22 加 硫 酸 中 和 ph 值 从 7.0 降 至 ~60 ph 值 调 至 5.6 控 制 在 70 以 内

78 2. 谷 氨 酸 钠 精 制 减 压 蒸 发 真 空 度 0.075~0.085MPa 温 度 为 70 浓 缩 液 浓 度 波 美 度 为 33~36 结 晶 时 间 10~14 h

79 3. 味 精 结 晶 结 晶 的 过 程 通 常 包 括 晶 核 的 形 成 和 晶 体 的 长 大 两 个 阶 段 首 先 在 溶 液 中 产 生 细 小 的 晶 核, 随 后 以 这 些 晶 核 为 中 心, 继 续 在 晶 核 表 面 吸 附 周 围 溶 质 分 子, 使 晶 粒 不 断 长 大 工 业 生 产 上 结 晶 有 三 种 不 同 起 晶 方 法 : (1) 自 然 起 晶 法 (2) 刺 激 起 晶 法 (3) 晶 种 起 晶 法 晶 种 起 晶 法 是 一 个 普 遍 被 采 用 的 方 法 溶 液 中 一 旦 形 成 晶 核 便 分 为 固 液 两 相, 固 相 晶 核 周 围 包 有 一 层 液 膜 如 果 液 膜 外 部 的 溶 液 仍 保 持 着 一 定 的 过 饱 和 状 态, 膜 外 部 的 溶 质 分 子 就 会 由 于 浓 度 差 (c-c') 的 推 动, 不 断 地 往 膜 内 扩 散, 并 被 晶 核 表 面 吸 附 一 层 一 层 地 排 列, 从 而 使 晶 体 逐 渐 长 大, 直 到 溶 液 的 浓 度 下 降 到 饱 和 浓 度 时 为 止

80 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 ( 赖 / 苏 ) 的 代 谢 调 控 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 的 生 物 合 成 途 径 1 天 冬 氨 酸 激 酶 (AK);2 高 丝 氨 酸 脱 氢 酶 (HD);3 二 氢 吡 啶 -2,6- 二 羧 酶 还 原 酶 ;4 高 丝 氨 酸 激 酶 ;5O- 琥 珀 酰 高 丝 氨 酸 转 琥 珀 酰 酶 ;6 半 胱 氨 酸 脱 硫 化 氢 酶 ;7 苏 氨 酸 脱 氨 酶 (TD);8 天 冬 氨 酸 半 醛 脱 氨 酶 ;9 二 氢 吡 啶 -2,6- 二 羧 酶 合 成 酶

81 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 ( 赖 / 苏 ) 的 代 谢 调 控 赖 氨 酸 发 酵 及 菌 种 选 育 途 径 赖 氨 酸 :L-2,6- 二 氨 基 己 酸, 为 人 体 必 需 的 八 种 氨 基 酸 之 一 菌 种 : 谷 氨 酸 棒 杆 菌 的 高 丝 氨 酸 缺 陷 型 变 异 株, 抗 赖 氨 酸 结 构 类 似 物 抗 苏 氨 酸 结 构 类 似 物 生 产 方 法 : 原 用 提 取 法 化 学 合 成 法 酶 法, 自 1960 年 日 本 直 接 发 酵 成 功 后 现 已 经 是 主 要 方 法 根 据 赖 氨 酸 的 生 物 合 成 途 径 和 代 谢 调 节 机 制, 工 业 发 酵 生 产 赖 氨 酸 主 要 选 择 谷 氨 酸 产 生 菌 为 出 发 菌 株 诱 变 选 育 所 得 的 突 变 株, 较 容 易 获 得 高 产 菌

82 1. 彻 底 解 除 有 关 的 代 谢 调 节 机 制 a. 选 育 营 养 缺 陷 突 变 株 切 断 支 路 代 谢 是 积 累 赖 氨 酸 的 有 效 措 施, 赖 氨 酸 单 独 对 自 身 合 成 途 径 中 的 酶 没 有 反 馈 调 节 作 用, 因 此 在 苏 氨 酸 限 量 培 养 下, 即 使 赖 氨 酸 过 量, 也 能 由 天 冬 氨 酸 生 成 天 冬 氨 酸 半 醛 在 苏 氨 酸 缺 陷 型 (Thr - ) 中 天 冬 氨 酸 半 醛 可 以 进 一 步 转 变 为 赖 氨 酸 和 高 丝 氨 酸, 高 丝 氨 酸 又 进 而 转 变 为 蛋 氨 酸, 但 不 能 生 成 苏 氨 酸

83 1. 彻 底 解 除 有 关 的 代 谢 调 节 机 制 a. 选 育 营 养 缺 陷 突 变 株 在 高 丝 氨 酸 营 养 缺 陷 型 (Hom - ) 中, 由 于 缺 失 高 丝 氨 酸 脱 氢 酶, 丧 失 了 合 成 高 丝 氨 酸 的 能 力, 这 就 使 天 冬 氨 酸 半 醛 全 部 转 入 赖 氨 酸 的 合 成 通 过 限 制 高 丝 氨 酸 补 给 量, 使 蛋 氨 酸 和 苏 氨 酸 的 生 成 有 限, 因 而 解 除 了 苏 氨 酸 和 赖 氨 酸 对 天 冬 氨 酸 激 酶 的 协 同 反 馈 抑 制, 使 赖 氨 酸 得 以 积 累 工 业 上 使 用 的 赖 氨 酸 生 产 菌 以 Hom - 为 主, 为 防 止 回 复 突 变 而 增 加 遗 传 标 记, 如 育 成 Hom - +Thr - 或 Hom - +Met - 的 双 重 缺 陷 型, 使 生 产 稳 定, 增 加 产 量

84 院 1. 彻 底 解 除 有 关 的 代 谢 调 节 机 制 b. 选 育 抗 类 似 物 突 变 株 学 物 选 育 抗 类 似 物 突 变 体, 可 以 得 到 学生 天 冬 氨 酸 激 酶 (AK) 对 反 馈 调 节 脱 敏 的 菌 株, 代 谢 调 节 被 遗 传 性 地 解 除, 不 受 培 养 基 成 分 的 影 响, 使 生 产 稳 定, 大 这 是 赖 氨 酸 发 酵 育 种 的 重 要 手 段, 尤 工 其 是 使 用 营 养 缺 陷 型 加 类 似 物 抗 性 的 突 变 株 理 为 增 强 南 细 菌 对 类 似 物 的 敏 感 性, 可 采 用 赖 氨 酸 类 似 物 + 苏 氨 酸 或 苏 氨 华 酸 类 似 物 + 赖 氨 酸 来 筛 选 AK 脱 敏 的 突 变 株

85 1. 彻 底 解 除 有 关 的 代 谢 调 节 机 制 (3) 选 育 营 养 缺 陷 型 与 抗 类 似 物 多 重 突 变 株 (4) 变 换 优 先 合 成 优 先 合 成 的 变 换 会 引 起 一 种 终 产 物 的 积 累 选 育 Hom L 和 thr s 突 变 株, 可 以 改 变 优 先 合 成, 积 累 赖 氨 酸

86 2. 增 加 前 体 物 的 生 物 合 成 a. 选 育 丙 氨 酸 缺 陷 型 (Ala - ); b. 增 加 前 体 物 天 冬 氨 酸 ; c. 应 用 柠 磷 酸 合 成 酶 低 活 性 突 变 株 或 磷 酸 烯 醇 丙 酮 酸 羧 化 酶 高 活 性 突 变 株 3. 解 除 代 谢 互 锁 a. 选 育 亮 氨 酸 缺 陷 型 (Leu - ) b. 选 育 抗 亮 氨 酸 类 似 物 突 变 株 综 上 所 述, 若 以 谷 氨 酸 棒 杆 菌 等 谷 氨 酸 生 产 菌 为 出 发 菌 株, 选 育 赖 氨 酸 高 产 菌, 其 定 向 育 种 的 遗 传 标 记 为 : AEC r +CCL r +CBL r +Ala - +Leu - +Hom - +Thr -

87 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 ( 赖 / 苏 ) 的 代 谢 调 控 赖 氨 酸 的 发 酵 控 制 氨 基 酸 控 制 : 苏 氨 酸 和 蛋 氨 酸 是 赖 氨 酸 产 生 菌 的 生 长 因 子 该 菌 缺 乏 蛋 白 质 分 解 酶, 有 机 氮 源 需 经 水 解 后 才 能 使 用 生 物 素 : 赖 氨 酸 生 产 菌 大 多 是 生 物 素 缺 陷 型, 限 量 的 生 物 素 有 利 于 谷 氨 酸 积 累, 大 量 的 生 物 素 抑 制 谷 氨 酸 生 成, 增 加 天 冬 氨 酸, 提 高 赖 氨 酸 产 量

88 赖 氨 酸 发 酵 的 工 艺 条 件 : 温 度 : 前 期 32, 中 后 期 34 ph:6.5~7.5, 最 适 6.5~7.0; 流 加 尿 素 或 氨 水 种 龄 和 接 种 量 : 对 数 生 长 期 种 子 ; 二 级 种 子 接 种 量 2 %, 种 龄 一 般 为 8~12h; 三 级 种 子 种 量 10%, 种 龄 6~8h 供 氧 : 充 足

89 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 ( 赖 / 苏 ) 的 代 谢 调 控 赖 氨 酸 的 提 取 与 精 制 发 酵 液 预 处 理 : 离 心 分 离 或 沉 淀 去 除 菌 体 离 子 交 换 法 提 取 赖 氨 酸 : 赖 氨 酸 等 电 点 9.59, ph=2.0 左 右 用 强 酸 性 阳 离 子 树 脂 交 换, ph= 7.0~9.0 用 弱 酸 性 阳 离 子 树 脂 交 换 采 用 铵 型 树 脂, 对 碱 性 氨 基 酸 能 选 择 性 交 换, 用 氨 水 洗 脱, 不 必 再 生 和 转 型 精 制 : 离 交 柱 洗 脱 液 中 含 游 离 氨 基 酸 和 氢 氧 化 铵, 真 空 蒸 发 去 氨, 用 盐 酸 成 盐, 结 晶, 分 离, 干 燥

90 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 ( 赖 / 苏 ) 的 代 谢 调 控 苏 氨 酸 发 酵 及 菌 种 选 育 途 径 苏 氨 酸 的 代 谢 控 制 比 赖 氨 酸 更 为 复 杂 : 苏 氨 酸 既 是 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 分 支 途 径 的 一 种 产 物, 又 是 异 亮 氨 酸 生 物 合 成 的 前 体 物 ; 苏 氨 酸 不 仅 与 赖 氨 酸 协 同 反 馈 抑 制 天 冬 氨 酸 激 酶 AK, 它 还 对 分 支 途 径 上 的 关 键 酶 高 丝 氨 酸 脱 氢 酶 HD 实 行 反 馈 调 节

91 6.5 天 冬 氨 酸 族 氨 基 酸 ( 赖 / 苏 ) 的 代 谢 调 控 苏 氨 酸 发 酵 及 菌 种 选 育 途 径 因 此, 要 想 积 累 苏 氨 酸, 根 据 代 谢 控 制 理 论 的 研 究, 必 须 选 育 营 养 缺 陷 型 和 抗 代 谢 调 节 的 多 重 突 变 株, 以 解 除 反 馈 调 节 切 断 不 必 要 的 支 路 以 及 阻 断 产 物 的 分 解, 才 能 实 现

92 1. 设 法 遗 传 性 地 解 除 自 身 的 反 馈 调 节 苏 氨 酸 发 酵 首 先 必 须 要 解 除 苏 氨 酸 本 身 对 关 键 酶 AK 和 HD 的 反 馈 调 节 选 育 AEC r 菌 株 常 作 为 解 除 赖 氨 酸 和 苏 氨 酸 对 AK 的 协 同 抑 制 及 苏 氨 酸 单 独 的 反 馈 抑 制 的 手 段

93 2. 切 断 支 路 代 谢 切 断 蛋 氨 酸 和 赖 氨 酸 的 支 路 代 谢, 育 成 AHV r +Met - +Lys -, 使 天 冬 氨 酸 半 醛 全 部 转 向 苏 氨 酸, 并 通 过 限 量 供 应 蛋 氨 酸 和 赖 氨 酸, 以 解 除 它 们 对 苏 氨 酸 合 成 途 径 中 关 键 酶 的 反 馈 调 节, 可 进 一 步 提 高 苏 氨 酸 产 量 为 了 进 一 步 提 高 产 量, 防 止 回 复 突 变, 可 以 筛 选 多 重 遗 传 标 记 突 变 株 苏 氨 酸 产 生 菌 定 向 选 育 的 遗 传 标 记 :AHV r +Met - +Lys - +AEC r +Ile - ( 或 Ile L 或 Ile s ) +SG r 华 南 理 工 大 学生 物 学 院