中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 51 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 对 照 品 栀 子 苷 ( 批 号 ) 甘 草 苷 ( 批 号 ) 连 翘 酯 苷

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1 50 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 凉 膈 散 汤 剂 HPLC-DAD 指 纹 图 谱 研 究 * 胡 建 兰, 邵 萌, 余 林 中 南 方 医 科 大 学 中 医 药 学 院, 广 东 广 州 摘 要 : 目 的 研 究 凉 膈 散 汤 剂 HPLC-DAD 指 纹 图 谱, 建 立 该 方 汤 剂 整 体 特 征 的 质 量 评 价 方 法 方 法 采 用 HPLC 法, 二 极 管 阵 列 检 测 器 (DAD),Zorbax Eclipse XDB-C 18 色 谱 柱 (250 mm.6 mm,5 μm), 以 甲 醇 -0.1% 磷 酸 水 溶 液 为 流 动 相 梯 度 洗 脱, 检 测 波 长 25 nm, 柱 温 8 以 黄 芩 苷 作 为 参 照 峰, 测 定 10 批 凉 膈 散 汤 剂 及 各 缺 味 药 材 阴 性 对 照 色 谱 图 结 果 建 立 凉 膈 散 汤 剂 的 HPLC 指 纹 图 谱,10 批 样 品 的 相 似 度 均 在 0.9 以 上 标 定 了 22 个 共 有 峰, 均 归 属 到 各 药 材, 其 中 8 个 色 谱 峰 可 明 确 其 化 学 成 分 结 论 建 立 的 HPLC-DAD 指 纹 图 谱 准 确 稳 定 重 复 性 好, 体 现 了 凉 膈 散 汤 剂 组 分 的 整 体 特 征, 提 高 了 对 中 药 复 方 质 量 控 制 的 专 属 性 关 键 词 : 凉 膈 散 汤 剂 ;HPLC; 指 纹 图 谱 ; 中 药 复 方 ; 质 量 控 制 中 图 分 类 号 :R 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (201) DOI: /j.issn HPLC-DAD fingerprint of Lianggesan Decoction HU Jian-lan, SHAO Meng, YU Lin-zhong Southern Medical University School of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou , China Abstract: Objective To study the fingerprint of Lianggesan Decoction and to establish a quality evaluation method for the overall features of the decoction. Methods The fingerprint was established by HPLC with Diode Array Detector (DAD) and Zorbax Eclipse XDB-C 18 column (250 mm.6 mm, 5 μm), gradient eluted with methanol-0.1% phosphoric acid as mobile phase. The detection wavelength was at 25 nm, and column temperature was at 8. Using baicalin peak as reference, the chromatograms of 10 batches of Lianggesan and negative control decoctions were established. Results The HPLC fingerprint of Lianggesan Decoction was established, the similarity of the 10 batches of samples was above 0.9, 22 common peaks were marked and attributed to the herbs. Eight chromatographic peaks were identified. Conclusion The established HPLC-DAD fingerprint is accurate, stable, and reproducible, which could reflect the overall characteristics of Lianggesan Decoction and improve the specificity for quality control of Chinese herbal formula. Key words: Lianggesan Decoction; HPLC; fingerprint; Chinese herbal formula; quality control 凉 膈 散 出 自 太 平 惠 民 和 剂 局 方, 由 连 翘 大 黄 栀 子 黄 芩 甘 草 薄 荷 和 芒 硝 味 药 组 成, 该 方 具 有 泻 火 通 便 清 上 泻 下 功 效, 主 治 上 中 二 焦 火 热 症 [1], 方 中 连 翘 为 君 药, 黄 芩 栀 子 大 黄 为 臣 药 目 前 关 于 方 中 各 单 味 药 的 质 量 标 准 相 关 研 究 已 有 不 少 文 献 报 道 [2-6], 但 尚 无 凉 膈 散 全 方 汤 剂 的 指 纹 图 谱 相 关 研 究 现 行 的 通 过 1~2 种 化 学 成 分 表 征 中 药 质 量 的 质 控 方 法 无 法 反 映 中 药 复 方 的 物 质 基 础 和 化 学 成 分 群 的 整 体 性 和 复 杂 性, 难 以 全 面 控 制 中 药 制 剂 内 在 质 量 [-9] [10-11] 本 研 究 采 用 HPLC-DAD 法 建 立 凉 膈 散 汤 剂 指 纹 图 谱, 并 对 指 纹 色 谱 峰 所 代 表 的 化 学 成 分 进 行 归 属, 为 该 方 的 物 质 基 础 研 究 及 质 量 控 制 提 供 科 学 依 据 1 仪 器 和 材 料 十 万 分 之 一 天 平 (Denver 公 司 );Agilent 1260 高 效 液 相 色 谱 仪 ( 包 括 G11C1260 Quat 四 元 泵 G29B 1260ALS 进 样 器 G15D 1260DAD VL 检 测 器, 美 国 安 捷 伦 公 司 ); 超 声 波 清 洗 仪 ( 昆 山 市 超 声 仪 器 有 限 公 司 ) 甲 醇 ( 色 谱 纯,Merk 公 司 ) 屈 臣 氏 蒸 馏 水, 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 ( ) 作 者 简 介 : 胡 建 兰 (1989 ), 女, 硕 士 研 究 生, 研 究 方 向 为 中 药 抗 炎 免 疫 药 理 Tel: (020) * 通 信 作 者 余 林 中 (1962 ), 男, 博 士 生 导 师 Tel: (020)

2 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 51 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 对 照 品 栀 子 苷 ( 批 号 ) 甘 草 苷 ( 批 号 ) 连 翘 酯 苷 A( 批 号 ) 连 翘 苷 ( 批 号 ) 黄 芩 苷 ( 批 号 ) 黄 芩 素 ( 批 号 ) 大 黄 酸 ( 批 号 ) 大 黄 素 ( 批 号 ) 均 购 自 中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院 10 批 次 凉 膈 散 复 方 药 材 由 南 方 医 科 大 学 中 医 药 学 院 中 药 鉴 定 教 研 室 刘 传 明 教 授 鉴 定, 分 别 为 木 犀 科 植 物 连 翘 Forsythia suspense (Thunb.) Vahl 的 干 燥 果 实 ; 蓼 科 植 物 掌 叶 大 黄 Rheum palmatum L. 的 干 燥 根 及 根 茎 ; 唇 形 科 植 物 黄 芩 Scutellaria baicalensis Georgi 的 干 燥 根 ; 茜 草 科 植 物 栀 子 Gardenia jasminoides Ellis. 的 干 燥 成 熟 果 实 ; 豆 科 植 物 甘 草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 的 根 及 根 茎 ; 唇 形 科 植 物 薄 荷 Mentha haplocalyx Briq. 的 地 上 干 燥 部 分 ; 硫 酸 盐 类 矿 物 芒 硝 Natrii Sulfas 药 材 来 源 见 表 1 2 方 法 与 结 果 2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱 为 Zorbax Eclipse XDB-C 18 柱 (250 表 1 凉 膈 散 汤 剂 药 材 来 源 Table 1 Sources of traditional Chinese medicinal materials in Lianggesan Decoction 编 号 药 材 来 源 产 地 连 翘 大 黄 黄 芩 栀 子 甘 草 薄 荷 芒 硝 S1 广 东 致 信 中 药 饮 片 有 限 公 司 河 南 四 川 河 北 江 西 广 东 安 徽 湖 南 S2 广 州 采 芝 林 药 业 有 限 公 司 山 西 四 川 黑 龙 江 广 西 内 蒙 古 广 东 广 西 S 广 州 济 和 堂 连 锁 药 业 有 限 公 司 山 西 四 川 河 北 江 西 新 疆 江 苏 广 东 S 广 州 一 笑 堂 医 药 连 锁 有 限 公 司 山 西 四 川 河 北 广 西 甘 肃 江 苏 湖 北 S5 广 东 致 信 中 药 饮 片 有 限 公 司 河 南 四 川 河 北 江 西 内 蒙 古 安 徽 湖 南 S6 康 美 药 业 股 份 有 限 公 司 山 西 四 川 河 北 江 西 内 蒙 古 江 苏 青 海 S 广 州 仁 和 堂 药 业 连 锁 有 限 公 司 江 西 河 南 河 北 贵 州 内 蒙 古 广 西 广 西 S8 广 州 济 善 堂 药 店 陕 西 安 徽 安 徽 广 西 宁 夏 贵 州 广 西 S9 广 州 康 宁 大 药 房 山 西 四 川 河 北 江 西 新 疆 江 苏 广 东 S10 北 京 同 仁 堂 广 州 药 业 连 锁 有 限 公 司 山 西 甘 肃 内 蒙 古 江 西 内 蒙 古 江 苏 安 徽 mm.6 mm,5 μm); 流 动 相 为 甲 醇 -0.1% 磷 酸 水 溶 液, 梯 度 洗 脱 程 序 :0~ min,5%~25% 甲 醇 ; ~0 min,25%~% 甲 醇 ;0~60 min,%~ 0% 甲 醇 ;60~80 min,0%~95% 甲 醇 ;80~85 min,95% 甲 醇 ; 柱 温 为 8 ; 体 积 流 量 为 1 ml/min; 检 测 波 长 为 25 nm; 进 样 量 为 10 μl; 检 测 时 间 为 85 min 2.2 供 试 品 溶 液 的 制 备 按 处 方 比 例 称 取 连 翘 2 g 大 黄 12 g 栀 子 6 g 黄 芩 6 g 甘 草 12 g 薄 荷 6 g 芒 硝 12 g 药 材 煎 煮 前 10 倍 量 水 浸 泡 0 min, 先 煎 连 翘 栀 子 甘 草 黄 芩 10 min, 后 下 大 黄 薄 荷 煎 煮 10 min 6 倍 量 水 二 煎 15 min, 合 并 2 次 煎 液, 趁 热 加 入 芒 硝, 四 层 纱 布 滤 过, 浓 缩 至 200 ml, 保 存 精 密 移 取 2 ml 浓 缩 液 加 入 80% 甲 醇 定 容 至 10 ml, 超 声 20 min 后 放 至 室 温,80% 甲 醇 补 足 至 刻 度,0.22 μm 微 孔 滤 膜 滤 过, 取 续 滤 液, 得 供 试 品 溶 液 2. 对 照 品 溶 液 的 制 备 精 密 称 取 各 对 照 品 适 量, 加 80% 甲 醇 配 制 成 含 黄 芩 苷 12 μg/ml 黄 芩 素 100 μg/ml 大 黄 素 1.6 μg/ml 大 黄 酸.2 μg/ml 连 翘 苷 100 μg/ml 连 翘 酯 苷 A 20 μg/ml 栀 子 苷 100 μg/ml 甘 草 苷 20 μg/ml 的 混 合 对 照 品 溶 液 2. 参 照 峰 的 选 择 在 凉 膈 散 汤 剂 指 纹 图 谱 中, 选 择 峰 面 积 较 大 且 稳 定, 分 离 度 较 好 的 号 峰 ( 黄 芩 苷 ) 作 为 参 照 峰 在 以 下 研 究 中, 均 以 各 供 试 品 溶 液 色 谱 图 中 黄 芩 苷 色 谱 峰 保 留 时 间 和 峰 面 积 值 为 参 照, 计 算 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 2.5 方 法 学 考 察 精 密 度 试 验 取 2.2 项 下 供 试 品 溶 液, 连 续 进 样 5 次, 检 测 指 纹 图 谱 考 察 各 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积 的 RSD 结 果 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 RSD<0.%, 相 对 峰 面 积 RSD<.0%, 表 明 精 密 度 良 好

3 52 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 稳 定 性 试 验 取 2.2 项 下 供 试 品 溶 液, 分 别 在 h 进 样, 检 测 指 纹 图 谱 结 果 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 RSD<0.5%, 相 对 峰 面 积 的 RSD<.0%, 表 明 供 试 品 溶 液 2 h 内 稳 定 2.5. 重 复 性 试 验 取 同 批 次 药 材 5 份, 按 2.2 项 下 方 法 制 备 成 供 试 品 溶 液, 检 测 指 纹 图 谱 结 果 共 有 峰 的 相 对 保 留 时 间 RSD<2.0%, 相 对 峰 面 积 的 RSD<2.0%, 表 明 该 方 法 重 复 性 良 好 2.6 指 纹 图 谱 研 究 指 纹 图 谱 的 建 立 及 相 似 度 评 价 精 密 吸 取 10 批 供 试 品 溶 液 和 混 合 对 照 品 溶 液 各 10 μl, 按 上 述 色 谱 条 件 进 样 分 析, 检 测 指 纹 图 谱, 结 果 见 图 1 采 用 国 家 药 典 委 员 会 颁 布 的 中 药 色 谱 指 纹 图 谱 相 似 度 评 价 系 统 进 行 相 似 度 计 算, 相 似 度 测 定 结 果 S1~S10 分 别 为 由 此 可 知,S A B S S9 S8 S S6 S5 S S S2 S1 C t / min - 栀 子 苷 - 甘 草 苷 10- 连 翘 酯 苷 A 12- 连 翘 苷 - 黄 芩 苷 18- 黄 芩 素 20- 大 黄 酸 22- 大 黄 素 -gardenoside -liquiritin 10-forsythoside A 12-phillyrin -baicalin 18-baicalein 20-rhein 22-emodin 图 1 混 合 对 照 品 (A) 10 批 样 品 (B) 的 HPLC 图 及 生 成 的 对 照 指 纹 图 谱 (C) Fig. 1 HPLC of mixed reference substances (A), 10 batches of samples (B) and comparative fingerprint (C)

4 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 5 S S S8 S9 相 似 度 良 好, 均 大 于 0.95;S1 S2 S5 S6 S10 相 似 度 大 于 0.9, 均 符 合 要 求 共 检 测 出 22 个 共 有 色 谱 峰, 以 号 峰 黄 芩 苷 为 参 照 峰 (S), 计 算 各 色 谱 峰 相 对 保 留 时 间 和 相 对 峰 面 积, 结 果 相 对 保 留 时 间 的 RSD<1.0%, 相 对 峰 面 积 的 RSD 介 于 5.8%~9.6% 可 知, 各 批 次 药 材 共 有 物 质 出 峰 时 间 大 致 相 同, 成 分 较 稳 定, 但 其 量 相 差 较 大 指 纹 图 谱 与 组 方 药 材 的 相 关 性 分 析 精 密 吸 取 供 试 品 及 缺 连 翘 大 黄 黄 芩 栀 子 甘 草 药 材 阴 性 对 照 溶 液 各 10 μl 进 行 HPLC 分 析, 色 谱 图 见 图 2 结 合 各 峰 紫 外 吸 收 图, 通 过 对 比 分 析, 对 22 个 共 有 峰 进 行 归 属, 其 中 号 峰 出 自 连 翘, 号 峰 出 自 大 黄, 号 峰 出 自 甘 草, 号 峰 出 自 栀 子, 号 峰 出 自 黄 芩 全 方 缺 甘 草 缺 栀 子 缺 黄 芩 缺 大 黄 缺 连 翘 t / min 图 2 各 缺 味 药 汤 剂 阴 性 对 照 图 Fig. 2 Negative control fingerprint of each lack of medicine in Lianggesan Decoction 使 用 已 有 对 照 品 对 共 有 峰 的 成 分 进 行 指 认, 共 指 认 了 8 个 色 谱 峰, 分 别 为 号 峰 ( 栀 子 苷 ) 号 峰 ( 甘 草 苷 ) 10 号 峰 ( 连 翘 酯 苷 A) 12 号 峰 ( 连 翘 苷 ) 号 峰 ( 黄 芩 苷 ) 18 号 峰 ( 黄 芩 素 ) 20 号 峰 ( 大 黄 酸 ) 22 号 峰 ( 大 黄 素 ) 2.6. 样 品 色 谱 数 据 的 系 统 聚 类 分 析 以 10 批 次 凉 膈 散 汤 剂 共 有 峰 相 对 峰 面 积 为 变 量, 运 用 SPSS.0 软 件 采 用 欧 式 距 离 进 行 系 统 聚 类 分 析, 见 图 将 10 批 样 品 分 为 类, 其 中 S1 S S S9 分 在 第 I 类,S2 S8 S10 分 在 第 II 类,S S5 分 在 第 III 类,S6 分 在 第 IV 类 由 分 析 结 果 可 知, 不 同 批 次 凉 膈 散 汤 剂 质 量 存 在 一 定 差 异 讨 论.1 煎 煮 方 法 的 选 择 实 验 初 步 考 察 了 浸 泡 及 煎 煮 时 间 对 有 效 成 分 溶 出 的 影 响 结 果 发 现, 药 材 浸 泡 0 60 min 后 煎 煮 差 异 不 大, 但 煎 煮 时 间 长 短 对 有 效 成 分 溶 出 存 在 很 大 影 响, 考 虑 到 药 材 本 身 及 其 他 因 素, 最 终 选 定 case S S9 S S1 S2 S8 S10 S S5 S6 图 聚 类 分 析 Fig. Cluster analysis 2.2 项 下 供 试 品 溶 液 制 备 方 法.2 色 谱 条 件 的 选 择 实 验 分 别 对 甲 醇 - 水 乙 腈 - 水 乙 腈 -0.1% 磷 酸 水 甲 醇 -0.1% 磷 酸 水 体 系 进 行 了 梯 度 洗 脱 试 验 结 果 表 明, 甲 醇 -0.1% 磷 酸 水 梯 度 洗 脱 系 统 有 助 于 各 色 谱 峰 的 分 离, 出 峰 数 最 多, 分 离 度 最 好, 且 85 min 内 出 峰 完 全 实 验 采 用 DAD 检 测 器 进 行 200~00 nm 范 围

5 5 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 全 波 长 扫 描, 对 nm 波 长 下 的 色 谱 图 进 行 分 析 比 较 结 果 表 明, 供 试 品 在 25 nm 检 测 波 长 下 出 峰 数 最 多, 各 峰 分 离 良 好, 特 征 峰 明 显 且 峰 形 较 好, 从 图 谱 中 可 以 较 全 面 的 获 取 色 谱 组 分 信 息, 故 选 择 25 nm 作 为 检 测 波 长 依 次 考 察 了 不 同 柱 温, 结 果 表 明, 柱 温 的 变 化 对 色 谱 峰 峰 形 保 留 时 间 影 响 较 大, 尤 其 是 8 号 峰 的 分 离, 在 8 柱 温 条 件 下 各 峰 整 体 分 离 效 果 较 好. 小 结 中 药 指 纹 图 谱 研 究 作 为 一 种 多 指 标 的 质 控 模 式 可 较 全 面 反 映 复 方 中 所 含 化 学 成 分 的 种 类 和 数 量 [12], 为 中 药 质 量 评 价 提 供 了 新 思 路 和 新 方 法, 已 日 益 成 为 国 内 外 广 泛 接 受 的 中 药 质 量 评 价 模 式 [] 本 实 验 对 凉 膈 散 汤 剂 进 行 指 纹 图 谱 研 究, 共 标 定 22 个 共 有 指 纹 峰, 并 归 属 到 各 药 材, 其 中 明 确 了 8 个 色 谱 峰 的 化 学 成 分 该 方 法 简 便 易 行 且 稳 定 可 靠 重 现 性 良 好 采 用 相 似 度 分 析 和 聚 类 分 析 对 不 同 批 次 凉 膈 散 汤 剂 的 指 纹 图 谱 进 行 评 价,2 种 评 价 分 析 方 法 获 得 的 结 果 基 本 吻 合, 且 不 同 批 次 相 似 度 较 好, 均 大 于 0.9, 说 明 不 同 来 源 凉 膈 散 汤 剂 的 化 学 组 成 一 致 性 较 好, 但 各 批 次 样 品 共 有 物 质 的 量 差 异 较 大 本 研 究 采 用 HPLC-DAD 方 法 建 立 凉 膈 散 汤 剂 指 纹 图 谱, 为 其 质 量 研 究 奠 定 了 一 定 的 物 质 基 础 参 考 文 献 [1] 马 晓 梅, 穆 齐 金. 略 论 凉 膈 散 [J]. 中 国 实 用 医 药, 2008, (15): 1-2. [2] 张 继 全, 沈 平 孃, 薛 东 升, 等. 连 翘 药 材 HPLC 指 纹 图 谱 的 研 究 [J]. 上 海 中 医 药 杂 志, 2010, (5): [] Boyle S P, Doolan P J, Andrews C E, et al. Evaluation of quality control strategies in Scutellaria herbal medicines [J]. J Pharm Biomed Anal, 2011, 5(5): [] 任 淑 娟, 孙 辉, 丁 野, 等. 栀 子 药 材 的 HPLC 指 纹 图 谱 研 究 [J]. 华 西 药 学 杂 志, 2012, 2(): [5] 张 然, 胡 昌 江, 李 倩, 等. 生 大 黄 与 一 制 至 九 制 大 黄 HPLC 指 纹 图 谱 的 对 比 [J]. 华 西 药 学 杂 志, 2011, 26(): 2-5. [6] 任 子 瑜, 秦 雪 梅, 薛 黎 明, 等. 黄 芩 不 同 中 医 调 剂 品 的 HPLC 指 纹 图 谱 比 较 研 究 [J]. 中 草 药, 2010, 1(): [] 李 倩, 罗 祖 良, 杨 小 丽. 中 药 质 量 控 制 方 法 研 究 述 评 [J]. 中 医 学 报, 2012, 2(): [8] 鄢 丹, 熊 吟, 马 丽 娜, 等. 建 立 以 临 床 功 用 为 导 向 的 中 药 质 量 评 控 格 局 与 适 宜 模 式 的 设 想 [J]. 中 草 药, 20, (1): 1-5. [9] 赵 超, 李 会 军, 陈 君, 等. 中 药 复 杂 成 分 解 析 与 质 量 评 价 的 研 究 进 展 [J]. 中 国 药 科 大 学 学 报, 2012, (): [10] Zhao W C, Song L J. Simultaneous determination of multiple bioactive constituents in total alkaloid of Sophora alopecuroides by HPLC-DAD [J]. Chin Herb Med, 2011, (1): [11] 王 平, 梁 逸 曾. HPLC-DAD-MS 研 究 黄 芪 的 化 学 成 分 [J]. 中 草 药, 2011, 2(2): [12] 李 强, 李 超. 中 药 指 纹 图 谱 研 究 综 述 [J]. 齐 鲁 药 事, 2010, 29(): [] 秦 昆 明, 方 前 波, 蔡 宝 昌, 等. 指 纹 图 谱 技 术 在 方 剂 现 代 研 究 中 的 应 用 现 状 [J]. 世 界 科 学 技 术 中 医 药 现 代 化, 2009, 11(2):

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