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能型吉
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1 134 11, Vol. 32, No. 14 食品科学工艺技术刘佳, 焦士蓉 *, 唐远谋, 唐鹏程, 冯慧 ( 西华大学生物工程学院, 四川成都 639) : 对苦丁茶中多酚的提取及抗氧化活性进行研究通过单因素和响应面试验可知, 在乙醇体积分数 52% 料液比 1:24(g/mL) 提取时间 62s 微波功率 291W 条件下可获得最高的提取量 115.4mg/g 苦丁茶多酚提取液对 DPPH 自由基羟自由基超氧阴离子自由基的半清除质量浓度以及对脂质过氧化的半抑制质量浓度分别为 mg/L 表明苦丁茶多酚具有较强的抗氧化作用苦丁茶 ; 多酚 ; 提取 ; 响应面分析法 ; 抗氧化 Extraction and Antioxidant Activity of Polyphenols from Kuding Tea LIU Jia,JIAO Shi-rong*,TANG Yuan-mou,TANG Peng-cheng,FENG Hui (School of Bioengineering, Xihua University, Chengdu 639, China) Abstract :The optimal conditions for the extraction of Kuding tea polyphenols for achieving maximum extraction yield were determined by response surface methodology to be ethanol concentration of 52%, material/liquid ratio of 1:24 (g/ml), microwave power of 291 W, and microwave treatment time of 62 s. The extraction rate of polyphenols was mg/g under the optimal extraction conditions. The IC5 values of the obtained extract against DPPH, hydroxyl, superoxide anion ion free radicals and lipid peroxidation were 29.24, 34.14, mg/l and mg/l, respectively, suggesting that Kuding tea polyphenols have a remarkable antioxidant effect. Key words:kuding tea;polyphenols;extraction;response surface analysis;antioxidant 中图分类号 :TS272.2;TS272.5 文献标识码 :A 文章编号 :2-663(11) 苦丁茶是我国一大类代茶植物或代茶产品的统称冬青属苦丁茶主要产于我国南部及西南部地区, 是民间传统的药用植物据文献报道, 苦丁茶有防治心脑血管系统疾病降低血压降脂抗氧化等药理保 [1] [2] 健作用, 其粗提物均有不同程度的抑菌作用由苦丁茶冬青叶片制成的苦丁茶是民间常用中草药, 是传统 [3] 中成药甘和茶的主要原料之一, 含有丰富的黄 [4-5] 酮多酚三萜类皂甙及金属元素, 所含的各种成 [6] 分的药理作用及保健功能日益引起人们的关注, 具有 [7] 广阔的开发应用前景本实验采用响应面法, 以苦丁茶冬青树 ( Ilex Kudincha C.J.Tseng) 叶片中的多酚含量作为响应值, 对苦丁茶多酚的提取工艺进行探讨, 旨在得到最优工艺条件, 并通过几个方面研究苦丁茶多酚的抗氧化性能, 为苦丁茶保健成分的开发利用提供一定参考 1 材料与方法 1.1 材料试剂与仪器苦丁茶 ( 市售 ) 粉碎过目筛 ; 福林 - 酚试剂北京奥博星生物技术有限责任公司 ;DPPH 自由基美国 Sigma 公司 ;2- 硫代巴比妥酸上海科丰化学试剂有限公司 ; 其他常见试剂 ( 分析纯 ) 成都科龙化工试剂厂 TB-214 型电子天平美国丹佛仪器设备厂 ;HH-S 型数显恒温水浴锅金坛市金城国胜实验仪器厂 ;UV- 2 型紫外可见分光光度计 ( 配有玻璃比色皿 ) 上海尤尼柯仪器有限公司 ;MP17C-KE 家用微波炉美的集团 1.2 方法多酚提取方法称取苦丁茶粉样品 2g, 采用不同的提取溶剂, 分别探究提取时间料液比微波功率因素对多酚得率的影响收稿日期 : 基金项目 : 四川省教育厅自然科学重点项目 (9ZA158); 西华大学 8 校人才培养与引进科研项目 (R1) 作者简介 : 刘佳 (1987 ), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品营养与安全 liujia @163.com * 通信作者 : 焦士蓉 (1968 ), 女, 教授, 博士, 研究方向为食品生物技术 jsrong4@163.com

62s 微波功率 291W 条件下可获得最高的提取量 115.4mg/g 苦丁茶多酚提取液对 DPPH 自由基羟自由基超氧阴离子自由基的半清除质量浓度以及对脂质过氧化的半抑制质量浓度分别为 29.24 34.14 872.3 11.

2 工艺技术食品科学 11, Vol. 32, No 多酚提取量测定 [7-8] 采用福林 - 酚比色法, 以没食子酸为标准品, 标准曲线 y=.81x +.286,R 2 =.9999, 计算公式为 : C v n p= m 1 3 式中 :p 为总多酚类物质提取量 /(mg/g);c 为从回归方程计算得到样品中多酚类物质质量浓度 /(μg/ml); v 为苦丁茶溶液的体积 /ml;n 为稀释倍数 ;m 为茶粉质量 /g 抗氧化活性的测定对 DPPH 自由基的清除按照文献 [9] 的方法并做适当修正 : 称取 2,2- 二苯代苦味酰基 (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 标准品 mg, 无水乙醇定容至 5mL, 得质量浓度.4mg/mL 溶液取此溶液 3mL, 加入不同质量浓度样品液 1mL, 室温反应 3min, 于 517nm 波长处测定吸光度, 空白组以 1mL 无水乙醇代替样品液, 并按下式计算清除率 : A 试样 DPPH 自由基清除率 (E)/%=(1 - ) 对羟自由基的清除 [1] 按照金鸣等的比色法,.75mmoL/L 的邻二氮菲溶液 1mL, 加入 ph7.4 的磷酸缓冲溶液 (PBS)2mL 和蒸馏水 1mL, 充分混匀后, 加入.75mmol/L 硫酸亚铁溶液 1mL, 然后再加入.1% 过氧化氢 1mL, 于 37 保持 min, 在波长 536nm 处测吸光度 Ap; 用 1mL 乙醇代替 1mL 过氧化氢, 测得吸光度 A b,1ml 不同质量浓度的样液代替蒸馏水, 测得吸光度 A s 以下式计算苦丁茶多酚对 OH 自由基的清除率 (H/%): AS - Ap H/%= Ab - Ap 对 O _ 2 的清除参照文献 [11] 方法,5mmol/L ph8.2 的 Tris-HCl 缓冲液 4.5mL 于试管中, 置于 25 水浴预热 min, 然后加入不同浓度的样品.1mL,2.5mmol/L 的邻苯三酚溶液.4mL, 混匀后,25 水浴反应 4min, 用 8mol/L 盐酸两滴终止反应在 (299 ± 1)nm 处测吸光度空白组以.1mL 蒸馏水代替待测样液按照下式计算苦丁茶多酚对 O _ 2 清除率 ( S ) -(A 样品 - A 背景 ) S/%= 对脂质过氧化的抑制参考文献 [12] 的方法并做适当改进, 小鼠处死后取肝洗净, 剪碎, 用生理盐水制成 3% 的匀浆取匀浆.6mL, 加入不同浓度样液.34mL,.24% 过氧化氢.2mL,.3mmol/L 硫酸亚铁溶液.2mL, 于 37 水浴保温 min 后, 加入 2mL % 三氯乙酸及 2mL.67% TBA 溶液,9 保温 15min, 用水冷却至室温,4r/min 离心 min, 取上清液, 在 532nm 波长处测得吸光度, 以水代替 TBA 的平行试验管调零, 以蒸馏水代替料液的反应管为空白管, 抑制率 ( I /%) 计算公式为 : -(A 样品 - A 背景 ) I/%= 2 结果与分析 2.1 提取溶剂的筛选图 1 溶剂对苦丁茶多酚提取的影响 Fig.1 Effect of solvents on extraction rate of polyphenols from Kuding tea 按照节方法, 在提取时间 s 料液比 1: 微波功率 291W 条件下进行试验, 结果见图 1 由图 1 可知, 提取溶剂为丙酮时, 苦丁茶多酚提取量最高, 乙醇次之 ; 由于丙酮的毒性以及溶剂价格较高的因素, 选取乙醇作为提取溶剂 2.2 单因素试验乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取的影响水乙醇丙酮乙酸乙酯溶剂乙醇体积分数 /% 图 2 乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取的影响 Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polyphenols

2.3.1 对 DPPH 自由基的清除按照文献 [9] 的方法并做适当修正 : 称取 2,2- 二苯代苦味酰基 (2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 标准品 mg, 无水乙醇定容至 5mL, 得质量浓度.

3 136 11, Vol. 32, No. 14 食品科学工艺技术按照 2.1 节方法, 改变乙醇体积分数进行试验, 结果见图 2 由图 2 可知, 当乙醇体积分数为 5% 时, 苦丁茶多酚的提取量最高, 故乙醇体积分数选取 5% 料液比对苦丁茶多酚提取的影响 1 4 1:1 1:15 1: 1:25 1:3 料液比 (g/ml) 图 3 料液比对苦丁茶多酚提取的影响 Fig.3 Effect of material/liquid ratio on extraction rate of polyphenols 乙醇体积分数为 5%, 其他条件同节, 改变料液比进行试验, 结果如图 3 由图 3 可知, 当料液比 1: (g/ml) 时苦丁茶多酚提取量最高, 故选取料液比 1:(g/mL) 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响提取时间 /s 图 4 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响 Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polyphenols from Kuding tea 料液比 1:, 其他条件同节, 改变提取时间进行试验, 结果见图 4 由图 4 可知, 当提取时间为 s 时, 苦丁茶多酚提取量最大, 时间过长多酚提取量反而降低, 可能是因为时间过长导致部分多酚类物质被氧化或分解, 故提取时间选取 s 微波功率对苦丁茶多酚提取的影响微波功率 /W 图 5 微波功率对苦丁茶多酚提取的影响 Fig.5 Effect of microwave power on extraction rate of polyphenols 选取提取时间 s, 其他条件同节, 改变微波功率, 结果见图 5 由图 5 可知, 微波功率为 291W 时, 苦丁茶多酚提取最高, 但随着微波功率的增大多酚提取量迅速降低, 可能是因为功率过大加速了多酚类物质的氧化分解或使溶剂大量挥发, 故选取提取功率为 291W 2.3 响应曲面法结果与分析 [13-14] 响应曲面由法常用于优化最佳测试条件由单因素试验结果可知, 乙醇体积分数料液比提取时间 3 个因素对苦丁茶多酚提取率的影响较大, 故选取这 3 个因素做 Box-Behnken 设计, 并且以苦丁茶多酚提取量作为响应值, 设计及结果见表 1 表 1 Box-Behnken 设计试验因素水平及编码 Table 1 Factors and levels in Box-Behnken design 变量代码编码水平未编码编码乙醇体积分数 /% X1 A 4 5 液料比 (ml/g) X2 B 提取时间 /s X3 C 5 7 注 :A=(X1-5)/1;B=(X2 - )/5;C=(X3 - )/1 表 2 Box-Behnken 试验设计及结果 Table 2 Results of Box-Behnken design tests 试验号 A B C 利用 Design Expert 软件对上述结果进行分析, 得到多酚含量 (Y) 对乙醇体积分数 (A) 料液比 (B) 提取时间 (C) 的二次多项回归方程 : Y= A+3.92B-2.87C+1.56AB+1.2AC+ 4.7BC A 2-3.6B C 2 试验所选用模型 P 值为.19, 极显著 (P <.5), 决定系数 R 2 =.9741, 说明响应值的变化有 97.41% 来源于所选变量, 该方程的拟合情况好

2.1 节, 改变料液比进行试验, 结果如图 3 由图 3 可知, 当料液比 1: (g/ml) 时苦丁茶多酚提取量最高, 故选取料液比 1:(g/mL) 2.2.3 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响 11 15 9 85 4 提取时间 /s 图 4 提取时间对苦丁茶多酚提取的影响 Fig.

4 工艺技术食品科学 11, Vol. 32, No 响应面图形是响应值对各试验因素 X 1 X 2 X 3 所构成的三维空间的曲面图, 从响应面分析图上形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用当特征值均为正值时, 响应面分析图为山谷形曲面, 有极小值存在 ; 当特征值为负值时, 为山丘曲面, 有极大值存在 ; 当特征值有正有负时, 为马鞍形曲面, 无极值存在 B : 料液比 a. 乙醇体积分数与料液比 C : 提取时间 -1. b. 料液比与提取时间 C : 提取时间 A : 乙醇体积分数 B : 料液比 A : 乙醇体积分数 c. 乙醇体积分数与提取时间固定水平 : 均为零水平图 6 各两因素交互作用对多酚提取量的响应面图 Fig.6 Response surface plot for the effect of cross-interaction between ethanol conceration, material-liquid ratio and extraction time on the extraction rate of polyphenols 由图 6A 可知, 乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取量影响比较大, 表现为曲线较陡, 料液比对苦丁茶多酚提取量影响不是很大, 表现为曲线较为平缓当乙醇体积分数在水平, 即 5% 时, 多酚提取量最大, 说明过高过或过低的乙醇体积分数均不适合苦丁茶多酚的提取由图 6B 可知, 料液比对苦丁茶多酚提取量影响比较小, 而提取时间对苦丁茶多酚提取影响较大, 且较短的时间更有利于提取图 6C 进一步说明乙醇体积分数对苦丁茶多酚提取量影响比较大, 曲线较陡 2.4 验证实验通过辅助软件 Design Expert 优化提取条件得到多酚提取量最高的超过 114.mg/g 的 5 组数据, 分析这 5 组数据, 得到苦丁茶多酚含量超过 114.mg/g 的各参数的范围为乙醇体积分数 51%~53% 料液比 1:23~1:25 (g/ml) 提取时间 ~64s 经以上分析, 再综合实验的好操作性, 选取乙醇体积分数 52% 料液比 1:24 提取时间 62s, 进行验证实验根据回归方程, 计算其预测值为 mg/g 进行 3 次平行实验, 得到平均结果为 115.4mg/g, 相对误差为.8%, 证明响应面优化苦丁茶多酚的提取工艺可行 2.5 抗氧化活性测定对 DPPH 自由基的清除 y=1.858x R 2 = 图 7 苦丁茶多酚对 DPPH 自由基清除作用 Fig.7 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on DPPH free radicals 如图 7 所示, 由回归方程得苦丁茶多酚对 DPPH 自由基的半清除质量浓度 EC5=29.24mg/L 对羟自由基的清除 y=.918x R 2 = 图 8 苦丁茶多酚对羟自由基的清除作用 Fig.8 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on hydroxyl free radicals 由图 8 回归方程可得, 苦丁茶多酚对 OH 自由基的半清除质量浓度 HC5=34.14mg/L 对 O 2 的清除

值时, 为山丘曲面, 有极大值存在 ; 当特征值有正有负时, 为马鞍形曲面, 无极值存在 115 11 15 1..5. -.5 -.5..51. -1. -1. 115. 11.25 15.5.75 96. B : 料液比 a. 乙醇体积分数与料液比 1..5.-.5 115. 19.75 14.5 99.25 94.

5 138 11, Vol. 32, No. 14 食品科学工艺技术 y=.447x+1.62 R 2 = W 时提取苦丁茶多酚含量达到 115.4mg/g 3.3 由抗氧化实验可知, 苦丁茶多酚对 DPPH 自由基羟自由基 O 2 的清除能力以及对脂质过氧化的抑制能力都随苦丁茶多酚浓度呈线性增加, 其对 DPPH 自由基羟自由基 O 2 的半清除质量浓度分别为 mg/L, 对脂质过氧化的半抑制质量浓度为 11.48mg/L 图 9 苦丁茶多酚对 O 2 的清除作用 Fig.9 Scavenging rate of polyphenols from Kuming tea on superoxide anion ion free radicals 由图 9 回归方程计算可得, 苦丁茶多酚对 O 2 的半清除质量浓度 SC5=872.3mg/L 对脂质过氧化的抑制 4 图 1 苦丁茶多酚对脂质过氧化的抑制作用 Fig.1 Inhibition rate of polyphenols from Kuming tea on lipid peroxidation 由图 1 回归方程计算可得, 苦丁茶多酚对脂质过氧化的半抑制质量浓度 IC5=11.48mg/L 3 结论 y=3.6743x R 2 = 通过单因素试验, 确定了苦丁茶多酚提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数 5% 料液比 1:(g/mL) 提取时间 s 微波功率 291W 3.2 通过 Box-Behnken 响应曲面法优化, 确定苦丁茶多酚提取的最佳试验条件为乙醇体积分数 52% 料液比 1:24(g/mL) 提取时间 62s 以该优化条件在微波功率参考文献 : [1] 刘宗岸. 冬青属苦丁茶的保健功效及利 [J]. 热带农业科技,9, 32 (2): [2] LV Ping, HUANG Qiang. Study on in vitro bacteriostasis of the different extract from Ilex Kudingcha C.J.Tseng[J]. Agricultural Science & Technlogy, 9, 1(6): [3] 王新, 陆慧宁, 林少琨. 苦丁茶冬青叶化学成分及药理作用研究进展 [J]. 天然产物研究与开发, 5, 17(3): [4] 程春萍. 苦丁茶的化学成分 [J]. 内蒙古石油化工, 9, (2): [5] AN Ming, WANG Ouqing, CHEN Zili, et al. Triterpenoid glycosides from Ilex Kudingcha[J]. Phytochemistry, 1996, 43(2): [6] 刘丽香, LAURA T, 梁兴飞, 等. Folin-Ciocalteu- 比色法测定苦丁茶中多酚含量 [J]. 茶叶科学, 8, 28(2): [7] 张文芹, 许文清, 孙怡, 等. 苦丁茶冬青与大叶冬青苦丁茶提取物体外抗氧化活性比较研究 [J]. 食品科学, 1, 31(23): [8] 唐远谋, 李明元, 徐坤, 等. 啤酒花多酚的提取及对 DPPH 自由基的清除作用 [J]. 西华大学学报 : 自然科学版, 1, 29(4): [9] LIU Lixiang, SUN Yi, LAURA T, et al. Determination of polyphenolic content and antioxidant activity of Kudingcha made from Ilex Kudingcha C.J.Tseng[J]. Food Chemistry, 9, 112(1): [1] SHARIFIFAR F, MOSHAFI M H, MANSOURI S H, et al. In vitro valuation of antibacterial and antioxidant activities of the essential oil and ethanol extract of endemic Zataria multiflora Boiss[J]. Food Control, 7, 18(7): -5. [11] 金鸣, 蔡亚欣, 李金荣, 等. 邻二氮菲 -Fe 2+ 氧化法检测 H2O2/Fe 2+ 产生的羟自由基 [J]. 生物化学与生物物理学进展, 1996, 23(6): [12] 刘丽香, 梁兴飞, 孙怡, 等. 苦丁茶提取物多酚含量与抗氧化活性的测定 [J]. 茶叶科学, 8, 28(4): [13] 何冰, 陈小夏. 茶多酚清楚氧自由基及抑制脑脂质过氧化反应的体外试验 [J]. 中国药理学通报, 1998, 14(3): [14] SUN Yi, WU Wenqing, ZHANG Wenqin et al. Optimizing the extraction of phenolic antiodants from Kudingcha made from Ilex Kudingcha C.J.Tseng by using response surface methodology[j]. Separation and Purification Technology, 11, 78(3): [15] 沈汪洋, 金征宇. 微波辅助提取咖啡豆残渣中多酚 [J]. 食品科学, 1, 31():

3mg/L, 对脂质过氧化的半抑制质量浓度为 11.48mg/L 图 9 苦丁茶多酚对 O 2 的清除作用 Fig.

第期马海燕等臭氧水和超声波协同作用在速冻西兰花中的应用研究材料与方法臭氧水的制取臭氧水处理超声波处理超声波和臭氧水协同处理对照处理邻苯二胺分光光度法测

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