细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 的 平 面 内 呈 波 形 振 动 两 个 波 峰 之 间 的 距 离 为 波 长 波 峰 的 大 小 即 为 该 光 波 的 振 幅 不 同 波 长 的 光 具 有 不 同 的 颜 色 即 光 的 波 长 不 同 光 的 颜 色 也 不 同

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1 第 一 章 光 的 基 本 知 识 一 光 的 本 质 光 是 一 种 可 见 的 电 磁 波 是 能 量 的 辐 射 形 式 光 子 的 能 量 频 率 和 波 长 之 间 的 关 系 可 以 由 以 下 方 程 表 示 此 方 程 即 为 普 朗 克 方 程 式 中 为 波 长 为 频 率 为 光 速 其 值 为!"# $ % " 为 普 朗 克 常 数 其 值 为 && &!"# ' 由 上 式 可 以 看 出 光 的 波 长 越 长 光 子 的 能 量 越 小 光 的 波 长 越 短 光 子 的 能 量 越 大 因 此 电 磁 辐 射 可 按 波 长 长 短 划 分 为 几 个 区 域 如 表 " " 所 示 由 表 " " 可 以 看 出 可 见 光 的 波 长 范 围 在 电 磁 波 谱 中 只 是 很 小 的 一 段 表 电 磁 波 谱 区 域 波 长 常 用 表 示 方 法 标 准 % 跃 迁 类 型 射 线 "# "# ' % "# " "# "# 核 反 应 射 线 "# ' #"% "# "# "# $ 内 层 电 子 远 紫 外 "# ##% "# $!"# 中 层 电 子 紫 外 ## ##%!"#!"# 外 层 价 电 子 可 见 ## &#%!"# &!"# 外 层 价 电 子 红 外 #& #% &!"#!"# 分 子 的 振 动 与 转 动 远 红 外 #"###%!"# "# ' 分 子 的 振 动 与 转 动 微 波 #""##% "# ' " 分 子 的 转 动 无 线 电 波 ""###% ""# ' 核 自 旋 二 光 的 性 质 光 具 有 粒 子 性 与 波 动 性 或 称 为 波 粒 二 象 性 光 的 波 动 性 表 现 为 光 有 反 射 折 射 绕 射 和 干 涉 等 现 象 光 的 粒 子 性 量 子 性 表 现 为 原 子 和 分 子 辐 射 能 量 时 是 以 一 连 串 微 粒 子 形 式 进 行 的 这 种 微 粒 子 称 为 光 子 光 量 子 在 均 匀 透 明 的 介 质 中 光 沿 直 线 传 播 光 在 传 播 时 它 是 在 与 它 前 进 方 向 相 垂 直

2 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 的 平 面 内 呈 波 形 振 动 两 个 波 峰 之 间 的 距 离 为 波 长 波 峰 的 大 小 即 为 该 光 波 的 振 幅 不 同 波 长 的 光 具 有 不 同 的 颜 色 即 光 的 波 长 不 同 光 的 颜 色 也 不 同 而 光 的 振 幅 决 定 光 的 强 度 振 幅 越 大 光 的 亮 度 越 强 振 幅 越 小 光 的 亮 度 越 弱 此 外 不 同 波 长 或 不 同 频 率 的 光 具 有 不 同 的 能 量 波 长 短 频 率 高 的 光 其 光 量 子 的 能 量 大 波 长 长 频 率 低 的 光 其 光 量 子 的 能 量 小 光 的 波 长 不 同 其 折 射 率 亦 不 同 波 长 越 长 折 射 率 越 小 波 长 越 短 折 射 率 越 大 因 此 当 一 束 平 行 白 光 通 过 棱 镜 后 由 于 组 成 白 光 的 七 色 光 的 波 长 不 同 它 们 的 折 射 率 各 异 而 被 分 散 为 红 橙 黄 绿 青 蓝 紫 七 色 光 如 图 " " 所 示 图 光 的 色 散 其 中 红 光 的 波 长 范 围 为 &'# &#% 紫 光 的 波 长 范 围 为 '# '#% 比 紫 光 波 长 更 短 的 光 叫 紫 外 线 比 红 光 波 长 更 长 的 光 叫 红 外 线 人 的 肉 眼 是 看 不 到 红 外 线 和 紫 外 线 的 在 荧 光 显 微 镜 和 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 技 术 中 常 涉 及 到 的 是 紫 外 光 至 可 见 光 的 光 谱 区 域 在 这 两 个 区 域 内 光 的 波 长 与 光 的 颜 色 关 系 如 表 " 所 示 表 常 用 的 光 的 波 长 与 光 的 颜 色 关 系 光 谱 区 域 波 长 范 围 光 谱 颜 色 紫 外 光 区 可 见 光 区 "# ##% 远 紫 外 区 ##'#% 近 紫 外 区 '# '#% '# #% # ##% ## #% #&##% &##&'#% &'# &#% 肉 眼 不 可 见 波 长 小 于 '#% 的 光 紫 蓝 青 绿 黄 橙 红 注 不 同 资 料 上 的 数 据 略 有 差 异

3 第 一 章 光 的 基 本 知 识 三 光 的 吸 收 光 进 入 某 物 质 后 部 分 或 全 部 的 光 能 可 被 物 质 的 分 子 或 原 子 所 吸 收 物 质 从 外 部 吸 收 能 量 后 进 入 激 发 态 当 物 质 从 激 发 态 回 到 基 态 时 是 以 电 磁 辐 射 的 形 式 放 出 所 吸 收 的 能 量 这 时 便 会 发 射 出 光 当 有 些 物 质 由 激 发 态 回 到 基 态 时 不 是 以 电 磁 辐 射 的 形 式 而 是 以 其 他 形 式 如 以 热 能 的 形 式 放 出 所 吸 收 的 能 量 这 时 就 不 会 发 射 出 光 必 须 强 调 指 出 光 的 吸 收 具 有 高 度 选 择 性 即 一 定 能 量 的 光 量 子 辐 射 只 能 被 一 定 结 构 的 物 质 分 子 或 原 子 所 吸 收 例 如 石 英 玻 璃 对 可 见 光 几 乎 不 吸 收 而 对 红 外 光 有 强 烈 的 吸 收 作 用 利 用 物 质 对 光 吸 收 的 高 度 选 择 性 制 成 的 各 种 滤 片 可 以 吸 收 一 定 波 长 范 围 的 光 允 许 特 定 波 长 的 光 通 过 因 此 可 作 为 荧 光 显 微 镜 中 的 激 发 滤 片 和 阻 断 滤 片

4 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 第 一 节 荧 光 的 发 光 原 理 一 荧 光 在 光 的 照 射 下 物 质 的 电 子 吸 收 能 量 后 可 由 低 能 级 的 电 子 层 内 层 电 子 跳 到 高 能 级 的 电 子 层 此 时 电 子 由 低 能 态 进 入 高 能 态 高 能 态 的 电 子 是 不 稳 定 的 它 会 在 极 短 的 时 间 "# $ 内 以 辐 射 光 量 子 的 形 式 释 放 能 量 后 再 回 到 原 来 的 能 态 这 时 发 射 出 的 波 长 比 激 发 光 的 波 长 要 长 在 可 见 光 波 长 的 范 围 内 为 人 眼 所 能 看 见 的 光 这 种 光 称 为 荧 光 如 图 " 所 示 图 紫 外 光 激 发 荧 光 物 质 发 射 荧 光 示 意 图 荧 光 是 发 光 体 分 子 中 处 于 激 发 态 的 原 子 核 外 电 子 由 高 能 级 回 到 低 能 级 所 产 生 的 辐 射 因 此 是 冷 光 荧 光 的 颜 色 多 为 蓝 色 绿 色 红 色 和 黄 色 等

5 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 二 荧 光 的 发 光 原 理 众 所 周 知 物 质 的 原 子 是 由 原 子 核 和 电 子 层 所 构 成 的 不 同 的 原 子 含 有 不 同 数 量 的 电 子 电 子 层 电 子 是 在 不 停 地 运 动 着 的 根 据 量 子 理 论 运 动 着 的 电 子 可 以 处 于 一 系 列 不 连 续 的 能 量 状 态 即 能 级 中 电 子 遵 守 一 定 的 规 则 可 以 从 一 个 能 级 向 另 一 个 能 级 跃 迁 并 伴 随 着 与 能 级 差 相 对 应 的 特 定 能 量 的 吸 收 或 释 放 一 般 情 况 下 电 子 总 是 处 于 能 量 最 低 的 能 级 即 基 态 在 一 定 条 件 下 电 子 可 吸 收 能 量 如 光 能 热 能 电 能 机 械 能 等 跃 迁 到 较 高 能 级 即 激 发 态 这 个 过 程 叫 激 发 处 于 激 发 态 的 电 子 是 不 稳 定 的 它 总 是 要 跃 迁 回 到 基 态 将 多 余 的 能 量 释 放 出 去 跃 迁 方 式 可 能 是 辐 射 跃 迁 也 可 能 是 非 辐 射 跃 迁 以 非 辐 射 跃 迁 方 式 跃 迁 时 能 量 大 多 转 化 成 热 能 而 以 辐 射 方 式 跃 迁 时 能 量 转 化 成 相 应 波 长 的 光 这 个 过 程 叫 发 射 如 图 所 示 # 基 态 " 较 高 的 能 级 " 激 发 能 量 发 射 能 量 图 光 能 的 吸 收 转 移 和 发 射 示 意 图 跃 迁 到 激 发 态 的 电 子 大 多 处 于 单 重 激 发 态 由 于 单 重 激 发 态 很 不 稳 定 半 衰 期 很 短 电 子 直 接 由 单 重 激 发 态 的 最 低 振 动 能 级 下 降 到 基 态 的 任 何 振 动 能 级 并 以 光 的 形 式 放 出 它 们 所 吸 收 的 能 量 发 射 持 续 的 时 间 也 很 短 这 种 发 射 光 寿 命 较 短 即 为 荧 光 "$'$ 年 () ( 首 先 描 述 了 这 一 荧 光 现 象 但 荧 光 一 词 是 由 * 在 "$ 年 提 出 的 处 于 激 发 态 的 分 子 量 是 不 稳 定 的 它 可 能 通 过 去 活 化 过 程 丧 失 多 余 的 能 量 而 返 回 基 态 丧 失 多 余 的 能 量 的 方 式 有 分 子 内 的 辐 射 跃 迁 和 非 辐 射 跃 迁 分 子 间 的 相 互 作 用 由 于 只 有 一 部 分 物 质 的 分 子 能 够 发 荧 光 所 以 只 有 能 产 生 荧 光 的 物 质 才 被 称 为

6 $ 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 荧 光 物 质 荧 光 物 质 分 子 去 活 化 回 到 基 态 的 过 程 除 了 发 荧 光 之 外 还 可 能 包 括 热 能 及 磷 光 等 释 放 能 量 的 形 式 因 处 于 激 发 态 的 电 子 还 可 能 先 驰 豫 到 三 重 激 发 态 再 以 辐 射 方 式 跃 迁 到 基 态 由 于 三 重 态 的 半 衰 期 较 长 发 射 持 续 时 间 也 较 长 这 种 发 射 光 寿 命 较 长 产 生 的 是 磷 光 磷 光 也 是 一 种 辐 射 跃 迁 释 放 能 量 的 形 式 其 通 常 要 在 低 温 或 刚 性 介 质 中 才 能 被 观 察 到 由 光 激 发 所 引 的 荧 光 称 为 光 致 荧 光 由 化 学 反 应 所 引 起 的 荧 光 称 为 化 学 荧 光 由 射 线 或 阴 极 射 线 引 起 的 荧 光 分 别 称 为 射 线 荧 光 或 阴 极 射 线 荧 光 由 激 光 引 起 的 荧 光 称 为 激 光 荧 光 如 果 化 学 发 光 在 有 生 命 的 生 物 体 中 产 出 例 如 萤 火 虫 萤 火 虫 的 发 光 机 制 是 体 内 的 萤 光 素 +( 萤 光 酵 素 +(,- 及 氧 的 化 学 反 应 而 发 光 和 含 磷 的 真 菌 称 为 生 物 发 光 无 论 哪 一 种 荧 光 其 发 光 机 制 都 是 相 同 的 三 荧 光 色 素 及 其 大 分 子 结 构 一 荧 光 色 素 荧 光 色 素 又 称 作 荧 光 物 质 也 可 被 称 作 荧 光 染 料 或 荧 光 探 针 能 够 产 生 荧 光 并 能 作 为 染 料 的 化 合 物 称 为 荧 光 色 素 荧 光 色 素 对 光 的 吸 收 和 荧 光 的 发 射 具 有 高 度 的 选 择 性 这 和 它 的 分 子 结 构 有 密 切 关 系 产 生 荧 光 的 最 重 要 的 条 件 是 物 质 的 分 子 必 须 具 有 吸 收 一 定 频 率 光 能 的 基 团 生 色 团 发 射 团 和 能 产 生 一 定 光 量 子 的 助 色 团 荧 光 团 二 荧 光 色 素 的 分 子 结 构 荧 光 色 素 和 非 荧 光 色 素 在 结 构 上 都 含 有 发 色 团 和 助 色 团 在 单 色 光 照 射 下 都 能 吸 收 能 量 但 为 什 么 只 有 荧 光 色 素 才 发 射 荧 光 呢 这 主 要 是 与 荧 光 色 素 的 分 子 结 构 特 征 有 关 同 时 也 不 是 所 有 单 色 光 都 能 激 发 荧 光 色 素 发 射 出 荧 光 荧 光 色 素 要 发 生 荧 光 物 质 分 子 必 须 具 备 合 适 的 能 量 此 外 这 些 物 质 还 必 须 具 有 高 荧 光 效 率 荧 光 效 率 即 荧 光 量 子 产 率./ 它 可 被 定 义 为 荧 光 物 质 吸 收 光 后 所 发 射 出 的 荧 光 光 量 子 数 与 所 吸 收 激 发 光 光 量 子 数 之 比 发 射 荧 光 的 光 量 子 数 荧 光 效 率 吸 收 光 的 光 量 子 数 荧 光 效 率 反 映 了 物 质 将 吸 收 的 光 能 转 化 成 为 荧 光 的 效 率 荧 光 量 子 产 率 的 数 值 越 大 物 质 的 荧 光 越 强 用 于 荧 光 分 析 的 荧 光 物 质 的 量 子 产 率 要 在 #' 以 上 那 些 不 发 光 的 物 质 其 荧 光 量 子 产 率 的 数 值 为 零 由 于 处 于 激 发 态 物 质 的 分 子 可 以 由 很 多 形 式 把 激 发 光 的 光 能 释 放 出 去 而 发 射 光 只 是 其 中 的 一 种 形 式 大 部 分 物 质 没 有 发 射 荧 光 的 性 质 即 使 是 荧 光 色 素 也 不 是

7 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 将 吸 收 的 全 部 光 都 转 变 为 荧 光 而 是 在 发 射 荧 光 的 同 时 亦 或 多 或 少 地 以 其 他 的 形 式 释 放 其 所 吸 收 的 光 能 因 此 在 通 常 情 况 下./ 的 数 值 总 是 小 于 " 如 罗 丹 明 在 乙 醇 中 的 荧 光 量 子 产 率 为 # 荧 光 黄 在 水 中 的 荧 光 量 子 产 率 为 #& 许 多 吸 光 物 质 的 荧 光 量 子 产 率 很 低 不 能 产 生 荧 光 因 为 这 些 物 质 吸 收 了 激 发 光 的 能 量 后 再 把 这 部 分 能 量 释 放 出 来 大 多 用 于 同 类 分 子 或 其 他 分 子 碰 撞 时 的 消 耗 以 热 能 的 形 式 释 放 因 此 无 荧 光 发 射 有 机 化 合 物 分 子 中 具 有 电 子 共 轭 结 构 者 其 荧 光 效 率 随 着 电 子 共 轭 程 度 的 增 加 而 增 大 所 发 生 的 荧 光 光 谱 也 将 向 长 波 长 方 向 移 动 任 何 有 利 于 提 高 电 子 共 轭 程 度 的 结 构 改 变 都 能 提 高 荧 光 效 率 或 使 荧 光 波 长 长 移 荧 光 物 质 的 分 子 结 构 具 有 刚 性 结 构 和 平 面 结 构 的 共 轭 体 系 分 子 不 会 以 0 0 单 键 自 由 旋 转 刚 性 共 轭 体 系 必 须 是 共 平 面 的 否 则 无 法 形 成 大 的 共 轭 体 系 在 共 轭 体 系 中 使 处 于 激 发 态 的 电 子 有 宽 广 的 离 域 电 子 的 活 动 度 范 围 使 其 在 激 发 态 时 具 有 一 定 的 稳 定 性 能 够 维 持 "# $ 左 右 为 使 能 量 向 荧 光 转 化 提 供 必 要 的 时 间 非 荧 光 色 素 虽 然 也 有 共 轭 体 系 但 不 具 备 刚 性 结 构 和 共 平 面 的 共 轭 体 系 因 此 不 发 光 第 二 节 荧 光 色 素 的 性 质 一 激 发 光 波 长 和 发 射 光 波 长 通 常 使 用 荧 光 色 素 的 激 发 光 波 长 大 多 处 于 近 紫 外 区 域 或 可 见 光 区 域 发 射 光 波 长 多 处 于 可 见 光 区 域 物 质 发 生 电 子 从 基 态 向 激 发 态 跃 迁 过 程 中 吸 收 的 能 量 要 高 于 荧 光 发 射 的 能 量 因 此 荧 光 色 素 的 发 射 波 长 总 是 大 于 其 激 发 波 长 两 者 的 差 值 叫 斯 托 克 斯 位 移 * 1 + 斯 托 克 斯 位 移 说 明 了 在 激 发 与 发 射 之 间 存 在 着 能 量 损 失 在 荧 光 分 析 中 就 是 利 用 斯 托 克 斯 位 移 现 象 将 激 发 光 与 荧 光 物 质 的 发 射 光 分 离 出 来 只 检 测 发 射 光 从 而 可 提 高 检 测 的 灵 敏 度 和 选 择 性 例 / -0+ ( 1 异 硫 氰 酸 荧 光 素 它 的 激 发 光 波 长 为 #% 发 射 光 波 长 为 % 斯 托 克 斯 位 移 是 #' % 如 图 ' 所 示 有 些 荧 光 色 素 的 斯 托 克 斯 位 移 较 大 而 有 些 荧 光 色 素 的 斯 托 克 斯 位 移 较 小 斯 托 克 斯 位 移 较 大 其 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 的 重 叠 就 越 少 有 利 于 提 高 其 分 辨 率 根 据 荧 光 色 素 的 激 发 光 波 长 和 发 射 光 波 长 可 选 择 光 源 和 滤 光 片 例 如 如 果 荧 光 色 素 的 激 发 波 长 处 于 紫 外 区 则 必 须 使 用 紫 外 光 源

8 "# 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 图 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 二 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 一 般 荧 光 物 质 都 具 有 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 这 两 种 光 谱 可 以 描 绘 出 该 物 质 的 部 分 光 学 性 质 一 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 的 基 本 概 念 " 激 发 光 谱 激 发 光 谱 又 称 荧 光 激 发 光 谱 是 通 过 测 量 荧 光 物 质 的 荧 光 发 射 强 度 随 激 发 波 长 变 化 而 获 得 的 光 谱 激 发 光 谱 是 将 发 射 荧 光 单 色 器 固 定 在 某 一 波 长 的 情 况 下 扫 描 激 发 单 色 器 所 测 得 的 光 谱 其 具 体 测 绘 办 法 是 将 发 射 荧 光 单 色 器 的 波 长 固 定 在 待 测 荧 光 物 质 的 最 大 荧 光 发 射 波 长 处 不 断 地 改 变 激 发 光 波 长 以 使 不 同 波 长 的 入 射 光 激 发 荧 光 物 质 所 产 生 的 荧 光 到 达 检 测 器 便 可 以 测 得 该 荧 光 的 强 度 以 激 发 光 的 波 长 为 横 坐 标 荧 光 强 度 为 纵 坐 标 作 图 得 到 荧 光 强 度 与 激 发 光 波 长 的 关 系 曲 线 即 为 该 荧 光 物 质 的 激 发 光 谱 激 发 光 谱 显 示 出 能 量 的 有 效 吸 收 波 长 范 围 并 显 示 出 荧 光 强 度 对 激 发 光 波 长 的 依 赖 关 系 所 以 激 发 光 谱 的 实 质 是 反 映 了 不 同 波 长 激 发 光 所 激 发 出 的 荧 光 的 相 对 效 率 激 发 光 谱 经 过 校 正 后 在 形 态 上 与 吸 收 光 谱 相 同 这 种 情 况 下 可 以 用 测 定 的 吸 收 光 谱 代 替 激 发 光 谱 一 些 荧 光 色 素 产 品 介 绍 中 就 只 给 出 了 荧 光 物 质 的 吸 收 光 谱 用 户 在 选 择 激 发 光 时 从 该 谱 线 上 可 以 查 得 其 吸 收 峰 值 的 波 长 范 围 作 为 参 考 图 中, 为 吸 收 光 谱 激 发 光 谱 示 意 图 横 坐 标 表 示 激 发 光 的 波 长 纵 坐 标 表 示 每 一 个 激 发 波 长 所 对 应 的 相 对 激 发 光 强 度

9 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 "" 图 吸 收 光 谱 和 荧 光 发 射 光 谱 示 意 图 发 射 光 谱 发 射 光 谱 又 称 荧 光 光 谱 它 是 反 映 荧 光 物 质 的 荧 光 发 射 强 度 与 发 射 光 波 长 之 间 相 互 关 系 的 光 谱 谱 线 荧 光 光 谱 是 在 固 定 激 发 光 波 长 下 扫 描 发 射 单 色 器 所 测 得 的 光 谱 其 具 体 测 绘 办 法 是 保 持 激 发 光 的 波 长 和 强 度 不 变 而 使 荧 光 物 质 所 产 生 的 荧 光 通 过 不 同 波 长 的 发 射 单 色 器 后 照 射 于 检 测 器 上 记 录 各 种 发 射 波 长 下 相 应 的 荧 光 强 度 以 荧 光 发 射 波 长 为 横 坐 标 相 应 的 荧 光 强 度 为 纵 坐 标 作 图 便 得 到 荧 光 发 射 光 谱 如 图 中 所 示 荧 光 光 谱 表 示 在 所 发 射 的 荧 光 中 各 种 波 长 组 分 的 相 对 强 度 由 于 荧 光 发 射 发 生 于 第 一 电 子 激 发 态 的 最 低 振 动 能 级 而 与 荧 光 物 质 分 子 被 激 发 至 哪 一 个 电 子 态 无 关 所 以 荧 光 光 谱 的 形 状 通 常 与 激 发 波 长 无 关 只 有 极 少 数 例 外 二 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 的 用 途 发 光 物 质 的 光 谱 反 映 了 分 子 原 子 或 离 子 的 基 态 和 激 发 态 之 间 能 量 的 跃 迁 从 基 态 到 激 发 态 的 跃 迁 是 由 吸 收 光 谱 激 发 光 谱 所 表 征 的 而 激 发 态 回 到 基 态 的 反 向

10 " 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 跃 迁 是 由 发 射 荧 光 光 谱 和 发 射 磷 光 光 谱 所 表 征 荧 光 分 析 中 利 用 激 发 光 谱 选 择 灵 敏 的 激 发 光 波 长 利 用 荧 光 光 谱 选 择 灵 敏 的 检 测 波 长 通 常 情 况 下 要 选 择 能 够 激 发 出 最 大 荧 光 强 度 的 激 发 光 波 长 在 激 发 光 谱 图 中, 上 可 以 看 到 某 一 激 发 波 长 下 具 有 最 大 发 射 荧 光 强 度 则 该 激 发 光 波 长 称 为 最 大 激 发 波 长 在 两 侧 激 发 波 长 范 围 " 所 对 应 的 是 强 发 射 荧 光 区 域 即 激 发 灵 敏 的 区 域 在 荧 光 光 谱 图 中 上 最 大 发 射 荧 光 强 度 所 对 应 的 波 长 % 称 为 最 大 发 射 荧 光 波 长 而 且 在 % 两 侧 的 波 长 范 围 内 荧 光 发 射 强 度 较 高 测 定 荧 光 时 激 发 波 长 在 发 射 波 长 在 % 时 测 定 灵 敏 度 最 高 因 此 激 发 光 谱 可 以 用 来 确 定 荧 光 探 针 适 宜 的 激 发 波 长 而 荧 光 光 谱 则 是 确 定 荧 光 波 长 检 测 范 围 的 依 据 激 发 光 谱 或 吸 收 光 谱 及 荧 光 光 谱 还 可 以 用 来 鉴 别 荧 光 物 质 这 是 因 为 在 一 定 条 件 下 每 一 种 荧 光 物 质 都 有 其 特 定 的 激 发 光 谱 及 荧 光 光 谱 形 状 一 般 在 相 同 的 测 定 条 件 下 荧 光 物 质 不 同 其 光 谱 也 不 相 同 在 鉴 别 荧 光 样 品 时 需 要 同 时 测 定 未 知 样 品 的 光 谱 和 已 知 物 质 或 标 准 物 质 的 光 谱 并 将 二 者 的 光 谱 相 比 较 总 之 在 荧 光 分 析 中 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 是 选 择 和 使 用 荧 光 色 素 荧 光 探 针 鉴 别 不 同 荧 光 物 质 的 依 据 每 种 荧 光 色 素 所 吸 收 的 光 不 仅 有 一 定 的 波 长 而 且 在 各 波 长 上 的 吸 收 量 也 不 均 匀 从 而 构 成 特 殊 的 吸 收 光 谱 曲 线 相 应 地 其 发 射 荧 光 的 情 况 也 是 如 此 因 此 一 定 的 荧 光 染 料 在 一 定 的 条 件 下 有 一 定 的 吸 收 光 谱 激 发 光 谱 和 荧 光 光 谱 发 射 光 谱 图 中 0 荧 光 色 素 的 吸 收 光 谱 和 荧 光 光 谱 是 符 合 * 定 律 的 例 如 吖 啶 橙 的 吸 收 光 谱 最 大 吸 收 波 长 是 % 其 发 射 的 荧 光 光 谱 是 # ##% 因 此 吖 啶 橙 和 细 胞 的 不 同 成 分 结 合 后 可 以 发 射 蓝 绿 黄 橙 红 各 色 荧 光 也 有 部 分 荧 光 色 素 在 紫 外 区 带 有 " 个 吸 收 带 例 如 硫 代 黄 素 - 的 最 大 吸 收 波 长 是 '$#% 它 发 射 的 荧 光 光 谱 在 # ##% 它 与 细 胞 的 不 同 成 分 结 合 后 可 发 生 蓝 绿 黄 橙 色 等 荧 光 了 解 各 种 荧 光 色 素 的 吸 收 光 谱 和 发 射 光 谱 后 有 利 于 我 们 在 观 察 荧 光 样 品 时 有 效 地 选 择 合 适 的 滤 片 以 获 取 最 好 的 荧 光 效 果 三 荧 光 强 度 荧 光 强 度 即 发 射 荧 光 的 光 量 子 数 荧 光 强 度 决 定 了 荧 光 色 素 检 测 的 灵 敏 度 它 本 身 又 取 决 于 荧 光 色 素 的 摩 尔 消 光 系 数 和 荧 光 的 量 子 产 率 在 确 定 的 条 件 下 二 者 为 定 值 摩 尔 消 光 系 数 反 映 了 荧 光 色 素 吸 收 激 发 光 的 能 力 而 量 子 产 率 反 映 了 荧 光 色 素 将 吸 收 的 辐 射 能 转 化 成 荧 光 的 效 率 当 荧 光 色 素 与 细 胞 结 构 或 生 物 分 子 结 合 时 其 量 子 产 率 应 接 近 或 大 于 # 否 则 没 有 实 用 价 值 四 荧 光 寿 命 荧 光 寿 命 即 激 发 态 寿 命 是 指 电 子 在 激 发 态 的 平 均 停 留 时 间 若 电 子 受 激 后

11 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 "' 迅 速 驰 豫 则 可 实 现 多 次 激 发 所 以 荧 光 寿 命 短 时 可 提 高 灵 敏 度 大 多 数 荧 光 色 素 的 荧 光 寿 命 在 纳 秒 级 特 别 长 的 荧 光 寿 命 对 于 高 灵 敏 度 检 测 也 很 有 意 义 例 如 利 用 稀 土 离 子 配 合 物 的 长 寿 命 荧 光 而 建 立 的 时 间 分 辨 荧 光 测 量 技 术 可 极 大 地 提 高 检 测 的 灵 敏 度 所 谓 时 间 分 辨 荧 光 测 量 技 术 就 是 采 用 时 间 延 迟 技 术 在 激 发 后 延 迟 一 段 时 间 等 短 寿 命 的 散 射 光 和 自 身 本 底 荧 光 干 扰 信 号 衰 减 后 再 测 量 荧 光 探 针 特 异 的 荧 光 信 号 这 样 可 大 大 排 除 干 扰 信 号 提 高 检 测 的 特 异 性 和 灵 敏 度 五 荧 光 稳 定 性 提 高 激 发 光 的 强 度 固 然 可 以 提 高 荧 光 的 强 度 但 激 发 光 的 强 度 不 是 可 以 无 限 提 高 的 因 为 激 发 光 的 强 度 超 过 一 定 限 度 时 光 吸 收 就 趋 于 饱 和 并 不 可 逆 地 破 坏 激 发 态 分 子 这 就 是 光 漂 白 的 现 象 对 于 流 式 细 胞 术 而 言 光 漂 白 的 问 题 并 不 严 重 因 为 光 源 照 射 细 胞 的 时 间 很 短 但 对 于 荧 光 显 微 镜 和 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 而 言 光 源 需 长 时 间 照 射 样 品 光 漂 白 现 象 就 会 严 重 影 响 测 量 解 决 光 漂 白 问 题 最 直 接 方 法 是 降 低 光 照 的 强 度 或 者 是 使 用 防 淬 灭 剂 六 荧 光 色 素 分 子 间 的 相 互 作 用 大 多 数 荧 光 色 素 都 有 浓 度 依 赖 式 的 自 身 荧 光 淬 灭 现 象 即 浓 度 高 时 荧 光 反 而 减 弱 荧 光 淬 灭 是 指 由 于 分 子 间 的 相 互 作 用 降 低 了 荧 光 量 子 产 率 而 不 改 变 荧 光 发 射 光 谱 的 一 种 双 分 子 作 用 过 程 其 机 理 可 能 是 激 发 态 分 子 以 非 辐 射 方 式 将 能 量 传 递 给 邻 近 分 子 而 不 能 发 射 荧 光 有 些 激 发 态 分 子 还 可 相 互 作 用 形 成 激 发 态 二 聚 体 %( 使 发 射 光 谱 发 生 位 移 这 种 性 质 可 以 运 用 于 双 波 长 发 射 比 例 测 量 七 荧 光 色 素 分 子 对 环 境 的 敏 感 性 荧 光 色 素 的 荧 光 光 谱 和 量 子 产 率 是 受 环 境 影 响 的 这 也 是 许 多 荧 光 色 素 具 有 探 针 作 用 的 基 础 影 响 荧 光 色 素 的 荧 光 性 质 的 环 境 因 素 主 要 有 一 荧 光 色 素 染 液 的 2 值 荧 光 色 素 是 否 发 射 荧 光 辐 射 何 种 荧 光 与 它 们 在 溶 液 中 的 存 在 状 态 有 关 如 " 萘 酚 & 磺 酸 呈 负 一 价 离 子 时 无 荧 光 呈 负 二 价 离 子 时 才 能 发 射 蓝 色 荧 光 萘 胺 呈 分 子 状 态 时 发 射 蓝 色 荧 光 而 呈 一 价 离 子 时 荧 光 消 失 荧 光 色 素 中 都 含 有 酸 性 或 碱 性 助 色 团 溶 液 的 酸 碱 性 对 它 们 的 电 离 有 影 响 如 " 萘 酚 & 磺 酸 在 2& 的 溶 液 中 会 发 射 蓝 色 荧 光 当 2 低 于 & 时 就 不 发 射 荧 光 不 电 离 的 荧 光 色 素 在 各 种 2 溶 液 中 都 可 发 射 荧 光 2 值 可 影 响 有 机 试 剂 的 电 离 也 影 响 金 属 络 合 物 的 组

12 " 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 成 因 此 2 值 对 金 属 络 合 物 的 荧 光 影 响 大 二 温 度 荧 光 色 素 的 荧 光 量 子 产 率 和 荧 光 强 度 通 常 随 溶 液 温 度 的 降 低 而 增 加 如 荧 光 黄 的 乙 醇 溶 液 在 #3 以 下 每 降 低 "#3 荧 光 量 子 产 率 增 加 '4 降 至 $#3 时 荧 光 量 子 产 率 接 近 "##4 反 之 则 减 弱 温 度 升 高 分 子 热 运 动 加 大 分 子 碰 撞 几 率 增 加 使 处 于 激 发 态 的 电 子 难 以 维 持 稳 定 导 致 荧 光 的 淬 灭 一 般 在 #3 时 温 度 引 起 的 荧 光 淬 灭 作 用 就 有 表 现 随 着 温 度 的 升 高 淬 灭 作 用 加 剧 在 #3 以 下 荧 光 量 子 产 率 随 温 度 变 化 不 太 明 显 因 此 进 行 荧 光 染 色 过 程 中 为 获 取 良 好 的 染 色 效 果 要 注 意 温 度 的 控 制 三 光 分 解 作 用 当 激 发 光 源 能 量 过 大 时 可 使 荧 光 色 素 分 子 中 的 共 价 键 发 生 断 裂 分 子 结 构 破 坏 将 使 激 发 能 大 部 分 消 耗 因 此 无 荧 光 发 射 故 在 实 际 应 用 中 在 满 足 镜 下 观 察 的 最 高 灵 敏 度 条 件 下 应 选 择 适 当 的 激 发 光 强 度 功 率 四 溶 剂 性 质 对 荧 光 色 素 的 影 响 溶 剂 的 性 质 对 荧 光 色 素 的 荧 光 强 度 有 明 显 影 响 同 种 荧 光 色 素 在 不 同 的 溶 剂 中 其 荧 光 光 谱 的 位 置 和 强 度 都 有 差 别 一 般 是 荧 光 峰 的 波 长 随 着 溶 剂 的 介 电 常 数 增 大 而 增 大 如 $ 羟 基 喹 啉 在 乙 腈 丙 酮 氯 仿 中 的 荧 光 量 子 产 率 随 着 溶 剂 极 性 的 降 低 介 电 常 数 降 低 而 依 次 递 减 如 果 溶 剂 和 荧 光 色 素 形 成 了 化 合 物 或 溶 剂 使 荧 光 色 素 的 电 离 状 态 改 变 则 荧 光 峰 的 波 长 和 强 度 都 会 发 生 很 大 变 化 如 在 苯 胺 或 萘 胺 的 稀 溶 液 中 加 入 少 许 盐 酸 由 于 形 成 盐 酸 盐 其 荧 光 将 会 消 失 五 荧 光 色 素 浓 度 的 影 响 浓 度 对 荧 光 强 度 的 影 响 更 明 显 在 稀 溶 液 中 的 荧 光 强 度 与 荧 光 色 素 的 浓 度 呈 线 性 关 系 浓 度 增 加 到 一 定 程 度 时 荧 光 强 度 保 持 恒 定 即 使 再 增 加 浓 度 荧 光 强 度 也 不 发 生 变 化 若 浓 度 继 续 增 加 超 过 一 定 限 度 后 荧 光 强 度 将 随 着 浓 度 的 增 加 而 减 弱 荧 光 色 素 染 色 的 应 用 浓 度 一 般 为 "# ' "# % 5 六 荧 光 色 素 和 其 他 生 物 分 子 结 合 的 影 响 有 些 荧 光 色 素 结 合 到 生 物 分 子 上 后 荧 光 比 原 来 在 水 溶 液 中 明 显 增 强 八 荧 光 色 素 的 分 类 荧 光 色 素 可 被 紫 外 光 或 蓝 紫 光 短 波 长 光 激 发 而 发 射 荧 光 现 在 应 用 的 一 些 荧 光 色 素 也 可 被 长 波 长 光 线 激 发 这 类 荧 光 色 素 大 多 数 属 于 吖 啶 类 如 吖 啶 橙 吖 啶 黄 罗 丹 明 荧 光 黄 钠 等 按 其 化 学 反 应 性 可 将 荧 光 色 素 分 为 三 类 碱 性 荧 光 色 素 含 碱 性 助 色 团 在 酸 性 溶 液 中 电 离 荧 光 色 素 离 子 为 阳 离 子 吖 啶 类 荧 光 色 素 如 吖 啶 黄 能 与 67, 和 87, 结 合 而 染 色 主 要 是 通 过 嵌 入 67, 的

13 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 " 双 螺 旋 结 构 实 现 的 溴 化 乙 啶 也 是 通 过 嵌 入 67, 而 染 色 在 紫 外 光 照 射 下 发 红 色 荧 光 酸 性 荧 光 色 素 含 酸 性 助 色 团 在 碱 性 溶 液 中 电 离 荧 光 色 素 离 子 为 阴 离 子 中 性 荧 光 色 素 由 酸 性 荧 光 色 素 和 碱 性 荧 光 色 素 混 合 而 成 的 一 种 复 合 染 料 第 三 节 组 织 细 胞 的 自 发 荧 光 与 继 发 荧 光 组 织 细 胞 的 荧 光 有 两 种 一 种 是 自 发 荧 光 一 种 是 继 发 荧 光 一 组 织 细 胞 的 自 发 荧 光 组 织 不 经 荧 光 色 素 染 色 在 紫 外 光 或 短 光 波 的 照 射 下 所 呈 现 的 荧 光 叫 自 发 性 荧 光 自 发 荧 光 的 生 物 体 存 在 于 地 球 上 的 主 要 生 存 环 境 中 如 土 壤 细 菌 洞 穴 新 西 兰 萤 火 虫 空 气 萤 火 虫 植 物 真 菌 岩 石 穿 石 贝 海 洋 水 母 等 在 生 物 分 类 中 有 "& 个 门 的 ## 余 种 生 物 具 有 自 然 发 光 现 象 其 中 包 括 众 所 周 知 的 种 类 如 蘑 菇 水 母 鱿 鱼 海 星 软 体 虫 鱼 和 甲 虫 但 其 他 一 些 熟 悉 的 种 类 如 蜘 蛛 蟹 两 栖 动 物 以 及 哺 乳 动 物 等 则 不 具 发 光 特 性 生 物 发 光 在 海 洋 中 尤 为 普 遍 在 弱 光 地 带 海 平 面 ## 米 以 下 几 乎 所 有 动 物 都 能 发 光 其 发 光 颜 色 各 异 从 *9 : 鱼 的 深 蓝 光 水 母 的 蓝 绿 光 某 些 真 菌 的 绿 光 到 萤 火 虫 的 黄 光 和 橘 黄 光 发 红 光 的 生 物 非 常 罕 见 但 深 海 鱼 ; + 却 有 两 对 发 射 红 光 的 器 官 和 两 个 发 射 蓝 光 的 器 官 同 样 南 美 花 科 雌 甲 虫 1( 1 ( 的 头 上 也 有 一 对 红 色 器 官 其 身 体 上 还 有 "" 个 黄 绿 色 器 官 哺 乳 动 物 不 发 光 但 其 体 内 存 在 着 能 产 生 超 微 弱 化 学 发 光 的 细 胞 这 种 光 肉 眼 不 可 见 但 可 用 光 电 倍 增 管 检 测 到 在 肺 脏 肝 脏 离 体 的 细 胞 如 吞 噬 细 胞 血 小 板 受 精 卵 真 菌 酵 母 和 植 物 中 甚 至 在 人 的 呼 吸 气 流 中 均 可 见 到 这 种 超 微 弱 化 学 发 光 其 原 因 是 氧 代 谢 物 的 生 成 和 内 源 性 物 质 如 不 饱 和 脂 肪 酸 的 氧 化 还 可 能 是 具 有 自 身 化 学 发 光 的 单 态 氧 的 形 成 这 样 从 化 学 发 光 的 四 种 类 型 合 成 发 光 生 物 发 光 超 微 弱 发 光 以 及 能 量 传 递 发 光 中 建 立 了 生 物 反 应 和 生 物 物 质 的 检 测 方 法 "& 年 ; ( 主 教 曾 报 道 在 北 极 当 人 们 急 需 在 夜 间 行 路 时 就 用 一 种 简 便 的 方 法 放 置 一 些 腐 烂 的 橡 树 枝 以 照 亮 森 林 中 的 道 路 可 以 推 断 这 是 腐 烂 橡 树 枝 上 真 菌 所 发 的 光 那 时 人 们 就 已 发 现 不 需 燃 烧 明 火 就 能 照 明 的 方 法 近 年 来 人 们 又 发 现 化 学 发 光 与 生 物 发 光 最 为 有 用 的 应 用 之 一 就 是 既 能 使 活 细 胞 内 的 分 子 信 号 和 基 因 表 达 发 光 又 不 损 伤 细 胞

14 "& 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 化 学 和 生 物 发 光 是 有 趣 的 自 然 现 象 它 使 人 们 的 研 究 从 深 海 和 岩 石 的 生 态 学 和 生 物 学 领 域 通 过 生 物 化 学 化 学 达 到 了 自 然 光 本 身 或 许 能 将 它 们 更 好 的 应 用 于 人 类 生 命 一 动 物 组 织 细 胞 的 自 发 性 荧 光 一 般 组 织 细 胞 中 的 蛋 白 质 和 脂 类 在 紫 外 光 照 射 下 能 发 出 微 弱 的 淡 蓝 色 的 荧 光 其 中 弹 性 纤 维 的 荧 光 很 强 呈 亮 蓝 色 6% " ' 观 察 了 甲 醛 固 定 的 卵 巢 切 片 证 明 结 缔 组 织 和 黄 体 细 胞 为 淡 蓝 色 荧 光 而 卵 泡 的 荧 光 较 暗 成 熟 卵 泡 膜 细 胞 呈 黄 绿 色 荧 光 这 种 黄 绿 色 荧 光 可 能 与 卵 巢 激 素 有 关 ( " 观 察 了 经 甲 醛 固 定 的 田 鼠 猫 大 白 鼠 小 白 鼠 的 肾 上 腺 证 明 肾 上 腺 髓 质 内 有 两 种 不 同 的 嗜 铬 细 胞 一 种 细 胞 经 紫 外 光 照 射 后 呈 现 很 强 的 自 发 性 荧 光 这 种 细 胞 成 群 分 布 另 一 种 细 胞 的 荧 光 很 弱 用 碘 化 钾 处 理 标 本 时 强 荧 光 的 细 胞 群 选 择 性 地 浸 染 成 棕 色 而 弱 荧 光 的 细 胞 无 色 ( 认 为 发 强 荧 光 的 细 胞 群 含 有 并 分 泌 去 甲 肾 上 腺 素 而 其 他 细 胞 含 有 并 分 泌 肾 上 腺 素 细 胞 内 的 脂 褐 素 呈 棕 黄 色 的 自 发 荧 光 例 如 心 肌 细 胞 核 两 侧 的 肌 浆 内 随 着 年 龄 的 增 加 或 在 某 些 疾 病 的 情 况 下 可 见 较 大 量 的 棕 黄 色 的 脂 褐 素 荧 光 颗 粒 细 胞 内 脂 褐 素 各 界 值 是 细 胞 老 化 的 一 个 公 认 指 标 对 于 用 神 经 母 细 胞 瘤 细 胞 在 无 血 清 培 养 下 建 立 的 神 经 细 胞 老 化 模 型 利 用 紫 外 光 激 发 脂 褐 素 能 产 生 自 发 荧 光 并 且 其 荧 光 值 与 脂 褐 素 值 具 有 相 对 应 的 特 点 可 测 定 体 外 培 养 一 定 时 期 的 细 胞 内 脂 褐 素 的 自 发 荧 光 值 从 而 观 察 测 试 对 象 对 脂 褐 素 积 累 的 影 响 维 生 素, 呈 绿 色 自 发 性 荧 光 ( 观 察 了 大 白 鼠 器 官 内 维 生 素, 的 分 布 " #" " 大 白 鼠 食 入 维 生 素, 以 后 在 很 多 器 官 的 细 胞 内 如 肝 细 胞 库 普 弗 细 胞 肾 上 腺 束 状 带 细 胞 肺 和 肾 的 间 质 细 胞 卵 巢 间 质 细 胞 和 黄 体 细 胞 眼 球 视 网 膜 细 胞 脂 肪 细 胞 及 小 肠 细 胞 内 均 可 见 到 维 生 素, 的 绿 色 荧 光 并 证 明 缺 乏 维 生 素, 的 动 物 的 绿 色 荧 光 将 会 消 失 患 维 生 素, 过 多 症 的 大 白 鼠 肝 细 胞 内 呈 现 明 显 的 绿 色 荧 光 库 普 弗 细 胞 增 大 并 含 有 大 量 维 生 素, 此 外 某 些 药 物 可 呈 现 一 定 的 荧 光 四 环 素 为 黄 色 荧 光 四 环 素 能 和 骨 基 质 中 的 钙 结 合 利 用 这 一 特 性 可 以 用 四 环 素 饲 养 动 物 以 观 察 新 骨 质 的 形 成 这 在 活 体 内 骨 组 织 计 量 学 研 究 和 临 床 检 验 中 得 到 了 广 泛 应 用 ( 等 "&# 证 明 四 环 素 和 癌 细 胞 有 较 大 的 亲 和 力 能 在 恶 性 肿 瘤 内 形 成 亮 黄 色 的 荧 光 灶 阿 的 平 和 奎 纳 克 林 发 黄 绿 色 荧 光 它 曾 被 用 于 研 究 药 物 在 蠕 虫 体 内 的 分 布 阐 明 药 物 对 蠕 虫 的 作 用 / 和 2 ( 等 "& 报 道 了 多 聚 甲 醛 可 以 诱 发 组 织 细 胞 内 的 内 源 性 生 物 胺 61 ( % 等 "& 用 这 种 方 法 证 明 了 哺 乳 动 物 脑 干 中 存 在 两 种 单 胺 神 经 元 儿 茶 酚 胺 型 1 % 神 经 元 和 羟 色 胺 型 1 :( ( % 神 经 元 前 者 含 有 去 甲 肾 上 腺 素 或 多 巴 6 用 多 聚 甲 醛 处 理 后 前 者 呈 现 黄 绿 色 荧 光 羟 色 胺 呈 黄 色 荧 光 并 且 他 们 对 两 种 单 胺 神 经 元 在 脑 干 中 的 分 布 进 行 了 详

15 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 " 细 观 察 同 时 很 多 学 者 证 明 了 血 小 板 松 果 体 中 的 神 经 元 消 化 道 黏 膜 内 的 嗜 铬 细 胞 以 及 某 些 动 物 结 缔 组 织 中 的 肥 大 细 胞 内 均 含 有 黄 色 荧 光 的 羟 色 胺 显 示 脑 干 单 胺 神 经 元 的 荧 光 方 法 + "& 报 道 用 #"% 磷 酸 缓 冲 液 2 # 配 制 的 4 多 聚 甲 醛 冷 溶 液 灌 流 动 物 恒 冷 箱 冰 冻 切 片 真 空 干 燥 后 在 $#3 与 多 聚 甲 醛 蒸 气 作 用 "1 可 显 示 中 枢 神 经 系 统 细 胞 内 的 单 胺 成 分 整 个 过 程 只 需 1 二 植 物 细 胞 的 自 发 荧 光 植 物 在 紫 外 光 照 射 下 能 发 出 弱 的 淡 蓝 色 淡 绿 色 和 红 色 的 荧 光 " 细 胞 壁 的 自 发 荧 光 植 物 的 细 胞 壁 可 自 发 出 淡 绿 色 荧 光 约 为 #% 产 生 荧 光 的 原 因 还 不 是 很 清 楚 但 其 自 发 绿 色 荧 光 的 物 质 基 础 是 与 细 胞 壁 多 糖 结 合 的 酚 酸 叶 绿 体 的 自 发 荧 光 叶 绿 体 在 光 合 作 用 中 吸 收 可 见 光 叶 绿 素 在 '# 和 & '% 处 有 吸 收 峰 已 是 人 所 共 知 的 但 叶 绿 体 能 自 发 荧 光 却 并 不 完 全 为 人 所 知 当 激 发 光 波 长 为 '' "% 时 叶 绿 体 的 发 射 波 长 为 # % 呈 蓝 色 当 激 发 光 波 长 在 " #% 时 叶 绿 体 的 发 射 波 长 为 # %&#% 呈 橙 红 色 因 此 在 实 验 中 应 注 意 选 择 合 适 的 激 发 光 波 长 叶 绿 体 分 子 含 有 一 个 卟 啉 环 的 头 部 和 一 个 叶 绿 醇 植 醇 1 的 尾 巴 卟 啉 环 由 四 个 吡 咯 环 以 四 个 甲 烯 基 02 连 接 而 成 镁 原 子 居 于 卟 啉 环 的 中 央 偏 向 于 带 正 电 荷 与 其 相 连 的 氮 原 子 则 偏 向 于 带 负 电 荷 因 而 卟 啉 具 有 极 性 是 亲 水 的 可 以 与 蛋 白 质 结 合 另 外 还 有 一 个 含 羰 基 和 羧 基 的 同 素 环 羧 基 以 酯 键 和 甲 醇 结 合 环 上 的 丙 酸 基 侧 链 以 酯 键 与 叶 醇 相 结 合 叶 醇 是 由 四 个 异 戊 二 烯 单 位 组 成 的 双 萜 是 一 个 亲 脂 的 脂 肪 链 它 决 定 了 叶 绿 体 的 脂 溶 性 卟 啉 环 上 的 共 轭 双 键 和 中 央 镁 原 子 易 被 光 激 发 而 引 起 电 子 得 失 从 而 使 叶 绿 体 具 有 特 殊 的 光 化 学 性 质 以 氢 的 同 位 素 氘 或 氚 试 验 证 明 叶 绿 体 不 参 与 氢 的 传 递 或 氢 的 氧 化 还 原 而 仅 以 电 子 传 递 即 电 子 得 失 引 起 的 氧 化 还 原 及 共 轭 传 递 直 接 能 量 传 递 的 方 式 参 与 能 量 的 传 递 ' 植 物 的 抑 菌 物 质 抵 御 病 虫 害 多 是 芳 香 化 合 物 在 紫 外 光 激 发 下 发 射 荧 光 二 组 织 细 胞 的 继 发 荧 光 组 织 细 胞 经 荧 光 色 素 染 色 后 细 胞 内 某 些 成 分 和 荧 光 色 素 结 合 后 而 呈 现 的 荧 光 称 为 继 发 性 荧 光 荧 光 色 素 和 细 胞 内 的 某 种 特 定 成 分 结 合 后 可 以 呈 现 出 不 同 颜 色 的 专 一 性 荧 光 利 用 某 些 成 分 的 继 发 性 荧 光 可 对 各 种 组 织 进 行 细 胞 化 学 的 观 察 和 研 究 组 织 细 胞 的 继 发 荧 光 在 生 命 科 学 研 究 中 的 应 用 十 分 广 泛 详 细 内 容 见 本 书 第 二 部 分 的 第 七 章 第 八 章 第 九 章 第 十 章 和 第 十 二 章

16 " $ 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 第 四 节 荧 光 的 淬 灭 及 抗 淬 灭 一 荧 光 的 淬 灭 荧 光 物 质 的 分 子 从 第 一 激 发 单 重 态 向 基 态 跃 迁 是 一 种 释 放 能 量 的 过 程 其 能 量 的 释 放 有 荧 光 发 射 辐 射 跃 迁 和 非 荧 光 两 种 形 式 前 者 是 进 行 荧 光 分 析 所 必 需 的 后 者 与 荧 光 发 射 形 式 竞 争 能 量 会 导 致 原 来 能 够 发 荧 光 的 物 质 分 子 不 能 发 出 荧 光 这 种 现 象 即 为 荧 光 淬 灭 现 象 荧 光 分 子 的 荧 光 淬 灭 是 由 内 部 因 素 和 外 部 因 素 同 时 作 用 造 成 的 内 部 因 素 主 要 是 分 子 从 激 发 态 回 到 基 态 以 非 辐 射 跃 迁 形 式 释 放 能 量 而 外 部 因 素 则 包 含 有 多 方 面 常 见 的 作 用 因 素 有 " 光 照 射 它 是 导 致 荧 光 淬 灭 的 最 常 见 的 因 素 荧 光 的 产 生 需 要 光 照 射 但 同 时 光 照 射 也 会 促 进 激 发 态 分 子 与 其 他 分 子 相 互 作 用 而 引 起 碰 撞 淬 灭 荧 光 物 质 的 分 子 与 外 部 分 子 或 离 子 形 成 非 荧 光 的 络 合 物 ' 共 振 能 量 的 转 移 溶 剂 种 类 2 值 温 度 能 够 引 起 荧 光 淬 灭 的 物 质 称 淬 灭 剂 如 卤 素 离 子 重 金 属 离 子 配 位 数 较 大 的 金 属 离 子 具 有 氧 化 性 的 有 机 化 合 物 硝 基 化 合 物 重 氮 化 合 物 羰 基 化 合 物 羟 基 化 合 物 和 氧 分 子 外 源 性 的 淬 灭 剂 如 氧 分 子 以 浓 度 依 赖 的 方 式 淬 灭 染 料 的 荧 光 通 常 情 况 下 淬 灭 是 由 于 碰 撞 引 起 的 这 时 通 过 研 究 淬 灭 剂 对 染 料 荧 光 的 淬 灭 作 用 可 获 得 淬 灭 剂 与 荧 光 基 团 的 亲 和 性 及 其 扩 散 速 率 的 信 息 蛋 白 质 也 可 淬 灭 许 多 荧 光 团 的 荧 光 例 如 荧 光 素 或 7 6 的 抗 体 是 各 自 有 效 而 特 异 的 荧 光 淬 灭 剂 荧 光 探 针 的 浓 度 大 于 " 5 时 常 发 生 荧 光 的 自 灭 现 象 这 是 由 于 被 激 发 的 分 子 在 发 生 荧 光 前 和 未 激 发 的 分 子 碰 撞 或 由 于 荧 光 探 针 分 子 间 缔 合 而 形 成 二 聚 体 或 多 聚 体 的 关 系 氢 离 子 探 针 如 0 0/ 和 *7,/5 等 其 激 发 或 发 射 光 谱 对 2 值 很 敏 感 可 用 于 监 测 2 值 但 有 时 又 要 求 染 料 对 2 值 不 敏 感 则 可 选 用 对 2 值 不 敏 感 的 染 料 如 6. 类 染 料 考 虑 到 以 上 因 素 在 进 行 荧 光 探 针 实 验 时 除 注 意 合 适 的 2 值 溶 剂 温 度 等 条 件 外 染 色 溶 液 最 好 新 鲜 配 制 配 高 浓 度 的 储 存 液 在 临 用 前 稀 释 避 免 因 储 存 时 间 过 长 而 失 效 另 外 利 用 染 料 对 环 境 的 敏 感 性 可 以 设 计 所 需 要 的 探 针 例 如 在 对 2 敏 感 的 荧 光 素 的 & 羟 基 上 连 上 半 乳 糖 得 到 的 二 半 乳 糖 苷 荧 光 素 /6< 就 是 检 测

17 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 " 半 乳 糖 苷 酶 活 性 的 特 异 性 探 针 因 为 /6< 的 荧 光 很 弱 而 经 过 半 乳 糖 苷 酶 的 作 用 后 生 成 的 荧 光 素 具 有 很 强 的 荧 光 图 是 激 光 照 射 下 荧 光 淬 灭 曲 线 从 图 中 可 以 看 出 随 着 激 光 照 射 时 间 的 增 加 荧 光 淬 灭 的 速 度 是 非 常 快 的 在 最 初 的 # 内 几 乎 呈 直 线 下 降 图 激 光 照 射 下 荧 光 淬 灭 曲 线 二 荧 光 的 抗 淬 灭 在 进 行 荧 光 探 针 的 荧 光 标 记 后 常 存 在 各 种 因 素 导 致 荧 光 淬 灭 或 衰 减 标 记 样 品 的 荧 光 褪 色 漂 白 是 在 荧 光 显 微 镜 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 时 遇 到 的 主 要 问 题 激 光 扫 描 共 聚 集 显 微 镜 由 于 具 有 更 强 的 功 率 和 聚 焦 更 准 确 的 光 束 与 普 通 荧 光 显 微 镜 相 比 标 本 的 光 漂 白 作 用 更 为 明 显 荧 光 团 的 荧 光 可 在 连 续 的 观 察 过 程 中 逐 渐 减 弱 或 消 失 因 此 应 考 虑 使 用 抗 荧 光 淬 灭 剂 抗 荧 光 衰 减 剂 抗 荧 光 淬 灭 剂 的 应 用 可 减 慢 荧 光 衰 减 的 过 程 获 得 更 长 的 观 察 时 间 进 行 荧 光 测 定 术 或 荧 光 定 量 分 析 和 模 式 识 别 (( 许 多 因 素 对 荧 光 强 度 和 荧 光 团 的 光 漂 白 有 影 响 如 激 发 光 的 强 度 功 率 2 值 溶 液 的 性 质 以 及 存 在 其 他 使 荧 光 淬 灭 的 物 质 等 根 据 已 经 提 出 的 几 种 光 漂 白 的 假 说 包 括 氧 自 由 基 的 损 伤 作 用 和 蛋 白 变 性 在 进 行 荧 光 探 针 的 荧 光 标 记 后 常 存 在 各 种 因 素 导 致 荧 光 淬 灭 或 衰 减 因 此 在 许 多 情 况 下 应 考 虑 使 用 抗 荧 光 衰 减 剂 现 已 有 不 少 公 司 推 出 了 一 些 有 效 的 荧 光 保 护 剂 可 以 延 缓 荧 光 淬 灭 的 时 间 一 些 常 用 的 和 最 有 效 的 抗 荧 光 衰 减 剂 的 优 缺 点 比 较 如 下

18 # 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 一 常 用 的 抗 荧 光 淬 灭 剂 " 苯 二 胺 1 : % 6 6 虽 然 是 最 有 效 的 抗 淬 灭 剂 之 一 但 对 光 和 热 都 有 较 强 的 敏 感 性 而 且 具 有 毒 性 因 此 限 制 了 其 在 体 内 研 究 中 的 应 用 较 理 想 的 6 抗 淬 灭 剂 混 合 液 配 方 是 #4 甘 油 "#4 * 其 中 6 浓 度 在 %% 5 之 间 最 终 2 值 为 $ # 丙 基 没 食 子 酸 盐 ( 7< 7< 无 毒 性 对 光 和 热 稳 定 但 抗 荧 光 漂 白 的 效 果 不 如 6 可 用 于 体 内 研 究 推 荐 浓 度 在 '%% 5 用 甘 油 配 制 效 果 也 不 错 '" 二 偶 氮 双 环 辛 烷 " : = 6, 0 6, 0 是 一 种 非 离 子 性 稳 定 性 的 抗 淬 灭 剂 价 格 便 宜 而 且 容 易 使 用 可 用 于 体 内 研 究 另 外 维 生 素 0 也 有 一 定 的 抗 荧 光 漂 白 作 用 二 抗 荧 光 淬 灭 试 剂 盒 经 过 不 可 逆 的 光 漂 白 过 程 可 导 致 荧 光 强 度 的 显 著 降 低 或 消 失 将 明 显 降 低 检 测 的 灵 敏 度 尤 其 在 目 标 分 子 的 含 量 相 对 较 低 激 发 光 较 强 或 持 续 检 测 时 间 较 长 的 情 况 下 更 为 明 显 为 减 少 荧 光 样 本 的 光 漂 白 作 用 分 子 探 针 公 司 专 门 生 产 了 几 种 抗 荧 光 淬 灭 试 剂 盒 ( 5 * )/: 和 * )/:5 1 已 经 证 明 它 们 可 增 强 许 多 用 于 固 定 细 胞 和 组 织 以 及 游 离 细 胞 标 本 的 荧 光 探 针 的 光 稳 定 性 抗 淬 灭 剂 的 主 要 功 能 是 保 持 荧 光 探 针 的 荧 光 强 度 通 常 是 通 过 抑 制 活 性 氧 基 的 产 生 和 释 放 而 发 挥 作 用 的 常 用 试 剂 盒 简 介 如 下 "( 5 抗 淬 灭 试 剂 盒 ( 5 抗 淬 灭 试 剂 盒 的 组 成 部 分 包 括 "( 5 抗 淬 灭 剂 粉 末 ( 5 封 片 剂 ' 标 本 封 片 过 程 的 实 验 步 骤 使 用 该 试 剂 封 片 可 使 大 多 数 荧 光 探 针 的 荧 光 淬 灭 减 弱 或 不 发 生 荧 光 淬 灭 牛 肺 动 脉 内 皮 细 胞, 用 荧 光 黄 次 毒 覃 环 肽 标 记 用 * 作 为 封 片 剂 '# 后 光 漂 白 使 荧 光 强 度 下 降 约 为 初 始 荧 光 强 度 的 " 4 而 使 用 该 试 剂 盒 封 片 在 同 样 条 件 下 则 保 持 不 变 在 用 荧 光 黄 标 记 2 细 胞 时 采 用 该 试 剂 封 片 比 采 用 含 有 苯 二 胺 的 试 剂 封 片 得 到 的 荧 光 强 度 更 强 在 - 8: 染 色 时 采 用 该 试 剂 可 显 著 增 强 其 荧 光 强 度 该 试 剂 也 可 有 效 抑 制 以 下 荧 光 探 针 的 淬 灭 四 甲 基 罗 丹 明 (% 1 (1 :% 67, 结 合 的 核 酸 探 针 如 6, 及 碘 化 丙 锭 ( : % : : 和.. " 由 于 其 适 用 范 围 较 广 而 且 对 多 数 荧 光 探 针 都 具 有 抗 光 漂 白 作 用 因 此 是 进 行 荧 光 多 标 记 的 常 用 试 剂 常 应 用 于 多 种 标 记 的 荧 光 原 位 杂 交 + ( 1 ( : = / *2

19 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 " * )/: 和 * )/:5 1 抗 淬 灭 试 剂 盒 该 试 剂 原 始 配 方 可 将 荧 光 黄 的 荧 光 淬 灭 速 率 减 小 到 零 尤 其 适 用 于 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 的 定 量 测 定 因 为 其 在 进 行 测 定 时 往 往 要 求 激 发 强 度 相 对 较 强 而 且 采 集 时 间 也 较 长 容 易 造 成 荧 光 淬 灭 * )/: 试 剂 可 使 荧 光 黄 的 有 效 荧 光 发 射 扩 大 # 倍 以 上 用 该 试 剂 封 片 后 细 胞 和 组 织 中 的 荧 光 信 号 可 保 持 两 年 之 久 原 始 的 * )/: 配 方 实 际 上 可 使 荧 光 黄 的 荧 光 完 全 淬 灭 几 乎 也 可 使 小 瀑 布 蓝 0: 和, / (' # 荧 光 团 的 荧 光 几 乎 完 全 淬 灭 为 克 服 这 种 局 限 分 子 探 针 公 司 的 研 究 人 员 又 研 制 了 * )/:5 1 抗 淬 灭 试 剂 盒 该 衰 减 剂 的 配 方 使 荧 光 黄 的 荧 光 衰 减 速 率 降 低 倍 而 荧 光 黄 的 初 始 荧 光 强 度 没 有 显 著 降 低 因 此 使 光 学 显 微 镜 的 信 噪 比 显 著 提 高 此 外 小 瀑 布 蓝, / (' #- 8: 的 淬 灭 也 达 到 最 小 实 际 上 * )/:5 1 抗 淬 灭 试 剂 盒 可 将 小 瀑 布 蓝 的 衰 减 速 率 几 乎 降 到 零 而 其 发 射 强 度 仅 降 低 约 '#4 每 一 种 * )/: 或 * )/:5 1 抗 淬 灭 剂 试 盒 的 组 成 包 括 "* )/: 或 * )/:5 1 抗 淬 灭 剂 储 存 于 甘 油 中 即 用 型 足 够 封 片 ## 张! 浓 缩 的 * )/: 或 * )/:5 1 抗 淬 灭 剂 溶 液 用 于 那 些 不 适 合 用 甘 油 作 为 封 片 液 的 实 验 中 ' 平 衡 缓 冲 液 可 提 高 样 品 的 2 值 增 加 两 种 抗 淬 灭 剂 配 方 的 保 护 作 用 详 细 的 标 本 封 片 步 骤 说 明 另 外 还 有 用 于 蓝 色 核 衬 染 荧 光 探 针 6, 的 * )/: 和 * )/:5 1 抗 衰 减 试 剂 盒 加 入 该 试 剂 有 防 止 光 漂 白 的 作 用 * )/: 试 剂 盒 与 ( 5 试 剂 盒 不 同 使 用 时 不 需 要 混 合 将 荧 光 标 记 的 标 本 用 该 试 剂 盒 提 供 的 平 衡 缓 冲 液 简 单 洗 涤 后 即 可 将 封 片 剂 直 接 加 在 玻 片 上 封 片 分 子 探 针 公 司 提 供 的 抗 淬 灭 剂 对 各 种 荧 光 探 针 的 抗 淬 灭 作 用 如 表 " 所 示 表 抗 淬 灭 剂 对 不 同 荧 光 探 针 的 抗 淬 灭 作 用 无 抗 淬 灭 剂 * )/: 抗 淬 灭 剂 * )/:5 1 抗 淬 灭 剂 荧 光 团 抗 光 漂 白 抗 光 漂 白 初 始 荧 光 抗 光 漂 白 初 始 荧 光 作 用 作 用 强 度 作 用 强 度 ( 5 抗 淬 灭 剂 抗 光 漂 白 初 始 荧 光 作 用 强 度, / ( $$ >> >> >> >> >>> >>> >>>, / ( ' >> > >>> > >> >>> >>>, / ( & >>> >> >>> > >>> >> >>, / ( &$ >> > >>> > > >>> >>>, / ( >> >> >>> >> >>> >>> >>>, / (&'' >>> >>> > >>> >>> >>> >>, / (& >>> >>> >>> >>> >>> >>> >>>, / (&&# > > >>> > >>> >>> >>>, / (&$# > > >> > >> >>> >>

20 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 续 表 荧 光 团 无 抗 淬 灭 剂 抗 光 漂 白 作 用 * )/: 抗 淬 灭 剂 * )/:5 1 抗 淬 灭 剂 抗 光 漂 白 初 始 荧 光 抗 光 漂 白 初 始 荧 光 作 用 强 度 作 用 强 度 ( 5 抗 淬 灭 剂 抗 光 漂 白 初 始 荧 光 作 用 强 度,;0, >> >>> >> >> >>> /5 > >>> > > >> > >> 0: > >>> >> >>> >>> ' >> >>> >>> >> >>> >>> >>> 6, >> >> > >> > >>> >> / ( > >>> >> > >> >>> >>> ;( > >>> >>> ( <( $$ > >>> > >> >> >>> >>> ( <( " >> >>> > >> >> >> >> ( : % : : > >> >> >> > >>> >>> *.- <( > >> >> > > >>> >>> - (% 1 (1 :% >> >> >> >> >> >>> >>> - 8: > > >> > >> >>> >>>.. " >> >> >>> >>> > >>> >>> 注 >>> 荧 光 团 对 光 漂 白 有 很 好 的 抵 抗 作 用 > > 荧 光 团 对 光 漂 白 有 一 定 程 度 的 抵 抗 作 用 > 荧 光 团 对 光 漂 白 没 有 或 仅 有 极 弱 的 抵 抗 作 用 > > > 抗 淬 灭 剂 引 起 初 始 荧 光 强 度 极 少 或 没 有 降 低 >> 抗 淬 灭 剂 导 致 初 始 荧 光 强 度 一 定 程 度 的 降 低 > 抗 淬 灭 剂 导 致 初 始 荧 光 强 度 显 著 降 低 76 未 确 定 数 据 是 根 据 毛 细 管 中 的 荧 光 探 针 溶 液 测 得 三 其 他 抗 荧 光 淬 灭 方 法 采 取 以 下 措 施 可 使 活 性 细 胞 或 非 活 性 标 本 的 荧 光 强 度 得 到 增 强 " 使 用 中 密 度 滤 片 采 用 高 数 值 孔 径 的 物 镜 ' 相 对 较 低 的 放 大 倍 数 高 质 量 光 学 滤 片 和 高 速 胶 片 高 效 能 检 测 器 第 五 节 荧 光 光 谱 交 叉 干 扰 及 消 除 在 使 用 两 种 以 上 荧 光 探 针 时 如 果 两 个 荧 光 发 射 峰 很 近 荧 光 光 谱 彼 此 会 有 部 分 重 叠 这 种 现 象 称 为 荧 光 光 谱 交 叉 ( 当 这 种 荧 光 光 谱 交 叉 严 重 时 便 会 出

21 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 ' 现 一 种 荧 光 探 针 的 荧 光 信 号 扩 散 到 另 一 荧 光 探 针 的 检 测 通 道 的 情 况 造 成 光 谱 交 叉 干 扰 图 & 是 2 1 '' $2 '' $/ -0 和 (% 1 (1 :% -;8 的 荧 光 发 射 光 谱 其 中 2 '' $ 蓝 与 / -0 绿 之 间 的 光 谱 谱 线 有 部 分 重 叠 当 同 时 用 '& % 和 $$% 激 光 扫 描 两 荧 光 物 质 时 在 / -0 的 发 射 荧 光 峰 值 波 长 % 处 就 会 检 测 到 2 '' $ 的 发 射 荧 光 当 在 大 于 "#% 波 长 范 围 内 检 测 / -0 的 荧 光 时 2 '' $ 在 该 部 分 的 荧 光 图 & 中 阴 影 部 分 会 干 扰 / -0 的 荧 光 测 定 图 和 的 荧 光 发 射 光 谱 发 生 光 谱 交 叉 示 意 图 光 谱 交 叉 现 象 经 常 存 在 于 多 重 标 记 的 样 品 之 间 这 一 点 可 以 从 发 射 光 谱 上 看 出 图 & 显 示 的 不 仅 是 在 2 '' $ 与 / -0 之 间 在 / -0 与 -;8 之 间 的 荧 光 发 射 光 谱 也 存 在 着 光 谱 交 叉 当 测 定 用 这 些 荧 光 探 针 标 记 的 样 品 时 要 注 意 消 除 光 谱 交 叉 干 扰 虽 然 几 种 荧 光 化 合 物 共 存 于 同 一 样 品 中 但 是 每 一 种 荧 光 化 合 物 都 有 其 自 身 的 激 发 光 谱 和 发 射 光 谱 而 且 不 同 的 荧 光 物 质 的 这 两 种 光 谱 往 往 会 存 在 差 异 表 现 在 光 谱 的 形 状 不 同 激 发 峰 和 发 射 峰 的 峰 宽 范 围 最 大 峰 值 波 长 和 强 度 不 同 所 以 在 测 定 时 可 以 根 据 仪 器 条 件 选 择 激 发 波 长 发 射 波 长 和 其 他 参 数 差 异 比 较 大 的 荧 光 探 针 标 记 样 品 可 以 减 少 或 避 免 荧 光 物 质 间 的 干 扰 即 在 选 择 同 时 使 用 的 几 种 荧 光 探 针 时 一 般 选 择 发 射 光 谱 没 有 交 叉 或 交 叉 小 发 射 峰 值 波 长 不 同 荧 光 发 射 强 度 相 当 在 仪 器 上 各 荧 光 信 号 彼 此 能 够 分 开 的 荧 光 探 针 标 记 样 品 当 用 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 系 统 检 测 来 自 样 品 的 光 信 号 时 利 用 滤 片 狭 缝 或 光 栅 将 不 同 的 几 种 荧 光 物 质 发 射 波 长 分 开 到 不 同 的 通 道 中 到 达 各 自 的 监 测 器 这 些 不 同 通 道 的 荧 光 往 往 被 设 定 为 不 同 的 伪 颜 色 在 显 示 器 上 分 别 显 示 出 相 应 颜 色 的 共 焦 图 像 以 易 于 观 察 当 几 种 荧 光 物 质 的 荧 光 发 射 峰 相 距 很 远 彼 此 干 扰 很 小 时 可 将 不 同 的 发 射 波 长

22 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 分 为 不 同 的 荧 光 通 道 检 测 以 测 定 各 个 组 分 的 荧 光 强 度 此 时 这 几 种 物 质 的 激 发 波 长 可 以 相 同 也 可 以 不 同 只 要 激 光 光 源 有 相 应 的 激 发 谱 线 即 可 例 如 标 记 67, 的 2 '' $ 的 蓝 色 荧 光 与 标 记 蛋 白 质 的 0 的 红 色 荧 光 如 果 标 记 条 件 适 宜 一 般 能 够 完 全 分 开 因 此 可 以 同 时 检 测 通 常 避 免 或 排 除 光 谱 交 叉 干 扰 的 方 法 有 以 下 几 种 一 使 用 几 种 荧 光 探 针 时 尽 量 选 择 相 互 之 间 无 光 谱 交 叉 的 荧 光 探 针 要 根 据 仪 器 条 件 和 荧 光 探 针 的 特 性 选 择 那 些 发 射 光 谱 没 有 交 叉 荧 光 发 射 强 度 匹 配 的 荧 光 探 针 标 记 样 品 二 低 标 记 荧 光 强 度 样 品 的 一 种 或 几 种 荧 光 的 强 度 太 高 有 时 会 导 致 光 谱 交 叉 的 出 现 采 用 降 低 标 记 物 浓 度 缩 短 标 记 时 间 调 整 探 针 介 质 等 方 法 可 降 低 样 品 的 荧 光 强 度 三 采 用 顺 序 扫 描 方 法 克 服 光 谱 交 叉 所 谓 顺 序 扫 描 主 要 是 指 用 不 同 波 长 激 光 轮 流 照 射 样 品 同 时 在 相 应 的 荧 光 检 测 通 道 轮 流 采 集 并 显 示 每 种 荧 光 的 共 聚 焦 图 像 其 原 理 是 对 于 荧 光 物 质 如 果 没 有 激 发 光 就 不 会 有 荧 光 产 生 因 此 虽 然 两 种 荧 光 探 针 同 时 存 在 但 是 如 果 没 有 受 到 同 时 激 发 则 会 减 少 光 谱 交 叉 现 象 的 影 响 据 此 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 设 计 了 顺 序 扫 描 方 法 用 不 同 波 长 的 激 光 分 别 激 发 荧 光 样 品 分 别 采 集 相 应 的 共 焦 图 像 同 时 分 通 道 显 示 每 种 荧 光 的 共 焦 图 像 例 如 对 于 双 重 荧 光 样 品 其 具 体 操 作 过 程 是 首 先 只 用 一 种 激 光 激 发 相 应 的 第 一 种 荧 光 物 质 在 第 一 通 道 显 示 其 荧 光 图 像 再 用 另 一 种 激 光 激 发 另 一 种 荧 光 物 质 在 第 二 通 道 显 示 其 荧 光 图 像 相 应 的 顺 序 扫 描 软 件 能 够 将 两 通 道 的 不 同 荧 光 图 像 同 时 分 通 道 显 示 并 叠 加 合 成 展 示 出 两 荧 光 间 空 间 定 位 关 系 依 次 类 推 用 顺 序 扫 描 方 法 还 可 以 采 集 三 重 或 更 多 重 荧 光 样 品 的 图 像 目 前 很 多 型 号 的 共 聚 焦 显 微 镜 系 统 具 有 顺 序 扫 描 功 能 对 于 用 易 淬 灭 探 针 标 记 的 多 荧 光 样 品 要 尽 量 使 用 低 强 度 激 光 照 射 并 缩 短 照 射 时 间 在 顺 序 扫 描 过 程 中 先 采 集 易 淬 灭 的 荧 光 信 号 可 以 减 少 光 刺 激 作 用 例 如 / -0 与 2 '' $ 标 记 的 样 品 前 者 用 $$% 激 光 激 发 后 者 用 '& % 紫 外 激 光 激 发 / -0 在 紫 外 光 的 照 射 下 容 易 淬 灭 为 此 使 用 顺 序 扫 描 法 取 图 时 要 先 采 集 / -0 的 荧 光 信 号 后 采 集 2 '' $ 的 信 号 另 外 光 敏 样 品 不 宜 进 行 长 时 间 反 复 样 品 采 集 四 修 改 检 测 仪 器 的 检 测 条 件 对 于 图 像 上 出 现 比 较 弱 的 荧 光 交 叉 信 号 有 时 能 够 通 过 改 变 仪 器 的 检 测 条 件 来 克 服 常 用 的 措 施 有 降 低 干 扰 荧 光 的 激 发 光 强 度 以 降 低 其 发 射 荧 光 强 度 减 小 被 干 扰 通 道 的 检 测 灵 敏 度 改 变 激 发 波 长 和 检 测 波 长 范 围 等 例 如 荧 光 通 道 的 图 像 上 看 到 了 来 自 通 道 " 的 较 弱 的 荧 光 交 叉 信 号 这 时 在 保 证 采 集 到 各 通 道 清 晰 图 像 的 情 况 下 降 低 通 道 " 的 激 发 强 度 减 小 通 道 的 光 电 倍 增 管 1 % (

23 第 二 章 荧 光 的 基 本 知 识 ;- 以 降 低 其 采 集 的 灵 敏 度 小 范 围 内 改 变 各 通 道 的 检 测 波 长 有 时 可 以 消 除 来 自 通 道 " 的 荧 光 交 叉 信 号 五 荧 光 光 谱 鉴 别 法 通 常 情 况 下 不 同 的 荧 光 物 质 的 荧 光 光 谱 不 会 完 全 重 合 利 用 不 同 的 荧 光 光 谱 之 间 的 差 异 可 以 将 来 自 于 两 种 荧 光 物 质 的 荧 光 信 号 鉴 别 开 来 得 到 各 自 的 荧 光 图 像

24 第 三 章 荧 光 染 料 色 素 的 早 期 应 用 和 发 展 史 "$'$ 年 () ( 首 先 描 述 了 荧 光 现 象 "$ 年 * 发 现 有 些 物 质 在 短 波 光 的 照 射 下 物 质 本 身 能 放 射 出 一 种 比 激 发 光 光 波 波 长 长 的 光 波 他 把 这 种 光 称 为 荧 光 并 提 出 荧 光 一 词 这 些 能 够 产 生 荧 光 并 能 作 为 染 料 的 化 合 物 即 为 荧 光 色 素 此 后 多 种 荧 光 物 质 被 陆 续 发 现 : 在 "#' 年 设 计 出 了 能 吸 收 可 见 光 并 允 许 紫 外 光 透 过 的 滤 片 在 此 基 础 上 8 1( 于 """ 年 发 明 了 首 台 荧 光 显 微 镜 荧 光 显 微 镜 制 成 后 由 于 人 和 动 物 组 织 的 自 发 荧 光 很 弱 当 时 荧 光 技 术 在 生 物 学 中 的 应 用 并 不 令 人 满 意 直 到 "'# 年 荧 光 物 质 才 真 正 被 用 于 固 定 细 胞 和 组 织 的 染 色 2 ( 于 "' 年 发 现 用 非 常 稀 薄 的 有 机 色 素 溶 液 处 理 组 织 后 可 使 标 本 的 荧 光 强 度 增 强 从 而 可 以 观 察 组 织 的 继 发 荧 光 同 普 通 染 色 剂 相 比 荧 光 染 色 的 灵 敏 度 要 高 出 "##"### 倍 以 后 由 于 荧 光 染 色 方 法 和 荧 光 观 测 装 置 的 改 进 特 别 是 荧 光 抗 体 技 术 的 建 立 及 激 发 光 源 和 滤 片 系 统 的 发 展 使 荧 光 显 微 镜 技 术 在 细 胞 学 微 生 物 学 免 疫 学 等 方 面 得 到 了 广 泛 的 应 用 近 年 来 随 着 科 学 技 术 的 飞 速 发 展 各 种 先 进 的 检 测 手 段 如 流 式 细 胞 仪 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 等 相 继 出 现 同 时 荧 光 染 色 技 术 不 断 改 进 各 种 商 品 化 的 新 型 荧 光 探 针 也 陆 续 推 出 荧 光 染 色 早 已 超 出 了 组 织 细 胞 的 概 念 被 用 于 观 察 分 子 水 平 上 的 各 种 生 命 现 象 目 前 荧 光 技 术 广 泛 应 用 于 生 命 科 学 研 究 的 各 个 领 域 一 染 料 的 早 期 应 用 和 发 展 染 料 最 早 是 应 用 在 丝 麻 棉 等 纺 织 品 的 印 染 上 我 国 周 朝 初 期 的 印 染 工 艺 已 相 当 发 达 此 时 人 类 在 染 色 剂 和 染 色 方 面 已 经 积 累 了 一 些 知 识 在 "" 年 5 )1 首 先 应 用 天 然 染 色 剂 研 究 肌 肉 组 织 用 番 红 花 浸 染 切 片 得 到 了 较 好 的 结 果 当 时 人 们 使 用 的 全 是 从 动 植 物 和 矿 物 中 提 炼 的 天 然 染 料 如 靛 青 朱 砂 胭 脂 红 等 "$ & 年 %( 偶 然 制 得 了 第 一 个 人 工 合 成 的 煤 焦 油 染 料 苯 胺 紫 % 9 ( 从 此 开 始 了 人 工 合 成 染 料 的 时 代 此 后 一 些 化 学 家 采 用 ( 的 方 法 以 氟 化 苯 胺 作 原 料 相 继 合 成 了 其 他 很 多 染 料 为 首 的 就 是 "$ 年 合 成 的 蔷 薇 苯 胺 品 红 ( 也 称 为 复 红 + 1 后 来 又 合 成 了 副 品 红 (( 甲 基 紫 % 1 9 龙 胆 紫 9 结 晶 紫 ( 9

25 第 三 章 荧 光 染 料 色 素 的 早 期 应 用 和 发 展 史 甲 基 绿 % 1 ( 孔 雀 绿 %1 ( 亮 绿 ( ( 藏 红 +( 亚 甲 基 蓝 % 1 碳 花 青 和 各 种 偶 氮 染 料 如 碱 性 棕 %( ( ) 随 后 这 些 染 料 逐 渐 商 品 化 并 应 用 于 组 织 标 本 血 液 标 本 细 菌 标 本 的 染 色 新 的 染 色 方 法 随 之 建 立 二 荧 光 染 料 色 素 的 早 期 应 用 和 发 展 在 人 工 合 成 染 料 的 时 期 也 出 现 了 具 有 荧 光 性 的 染 料 其 中 氧 杂 蒽 和 吖 啶 氧 杂 蒽 的 衍 生 物 派 若 宁. (. 罗 丹 明 (1 :% 荧 光 黄 + ( 曙 红.. 赤 藓 红 ( 1( 等 都 是 很 有 名 的 吖 啶 类 染 料 早 期 的 吖 啶 类 染 料 主 要 有 碱 性 染 革 黄 棕 1 1 吖 啶 黄 ( : ) 吖 啶 橙 ( : ( 吖 啶 黄 素 ( +9 等 有 些 染 料 如 金 胺 (% 亮 磺 黄 素 ( 1 +9 中 性 红 ((: 副 品 红 (( 等 来 源 于 其 他 试 剂? 描 写 了 组 织 学 和 组 织 化 学 中 常 用 的 一 些 吖 啶 类 染 料 尽 管 # 世 纪 初 就 有 很 多 荧 光 探 针 可 供 使 用 但 人 们 真 正 用 过 的 却 很 少 组 织 学 家 细 胞 学 家 和 细 菌 学 家 喜 欢 染 色 能 力 很 强 的 红 色 蓝 色 和 绿 色 染 料 而 这 些 染 料 在 溶 液 中 大 多 没 有 荧 光 或 荧 光 很 弱 只 有 派 若 宁. 和 曙 红. 等 红 色 染 料 是 例 外 吖 啶 类 染 料 通 常 把 细 胞 染 成 黄 色 因 而 不 大 常 用 碱 性 品 红 含 有 副 品 红 和 品 红 碱 的 混 合 物 在 "$&' 年 被 : ( 引 进 组 织 学 研 究 以 后 就 成 为 一 种 重 要 的 细 胞 核 染 料 它 对 于 细 菌 学 特 别 是 对 于 用 以 研 究 结 核 杆 菌 这 类 耐 酸 微 生 物 体 1 7 法 的 发 展 起 过 重 要 影 响 龙 胆 紫 是 ( 和 1( 1 分 别 在 "$$" 年 和 "$$ 年 引 入 微 生 物 技 术 中 的 它 在 "$$ 年 就 成 了 <(% 染 色 液 的 主 要 成 分 "$$ 年 1( 1 用 亚 甲 基 蓝 作 为 第 一 个 重 要 的 活 体 染 料 并 阐 明 了 它 对 神 经 组 织 的 亲 和 性 他 还 把 许 多 其 他 染 料 引 进 该 领 域 比 如 他 的 著 名 的 三 酸 混 合 物 甲 基 绿 酸 性 品 红 橙 < 直 到 # 世 纪 '# 年 代 初 期 即 在 荧 光 显 微 镜 研 制 成 功 # 多 年 后 吖 啶 类 和 其 他 荧 光 染 料 才 被 用 于 固 定 细 胞 和 组 织 的 荧 光 显 微 术?( 的 显 微 技 术 大 全 收 录 了 很 多 染 料 但 对 吖 啶 类 染 料 却 只 字 未 提 在 其 他 方 面 都 很 有 参 考 价 值 的 这 部 著 作 中 关 于 荧 光 显 微 镜 的 章 节 也 只 提 到 了 其 在 观 测 组 织 切 片 自 身 荧 光 中 的 应 用 当 时 的 显 微 镜 学 家 还 没 有 认 识 到 这 样 一 个 事 实 即 用 荧 光 显 微 镜 观 察 时 荧 光 染 料 能 提 高 染 色 组 织 的 观 察 灵 敏 度 和 清 晰 度 人 们 错 误 地 以 为 由 荧 光 染 料 诱 导 荧 光 的 显 微 镜 观 察 会 产 生 赝 像 而 导 致 曲 解 虽 然 荧 光 染 料 很 多 年 来 未 被 用 于 固 定 组 织 细 胞 的 染 色 但 在 其 他 方 面 却 得 到 了 应 用 人 们 知 道 在 水 溶 液 中 荧 光 素 会 产 生 很 强 的 黄 绿 色 荧 光 即 使 用 水 稀 释 "&!"# 倍 其 钠 盐 仍 可 产 生 浅 绿 色 的 荧 光 1( 1 用 它 来 显 示 眼 内 液 体 的 流 动 "#& 年 荧 光 素 在 美 国 成 为 第 一 个 用 于 地 下 水 示 踪 的 荧 光 探 针 随 着 一 战 中 治 疗 伤 员 的 需 要 吖 啶 黄 素 被 确 认 为 有 效 的 抗 菌 剂 这 种 染 料 被 英 国 科 学 家 称 为 黄 素

26 $ 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 和 吖 啶 黄 素 很 接 近 的 原 黄 素 是 另 一 种 有 用 的 抗 菌 剂 后 来 证 明 这 两 种 染 料 都 是 有 用 的 核 酸 荧 光 染 料 三 荧 光 染 料 探 针 在 活 细 胞 中 的 早 期 应 用 和 发 展 在 " 世 纪 末 药 物 学 家 和 实 验 治 疗 学 家 就 对 荧 光 染 料 能 导 致 微 生 物 发 光 的 性 质 表 现 出 了 浓 厚 的 兴 趣 人 们 认 识 到 这 种 增 强 的 发 光 是 光 致 发 光 - ( 和 : ( 的 一 部 重 要 著 作 讲 述 了 这 方 面 的 研 究 吖 啶 染 料 是 治 疗 锥 虫 的 有 效 药 物 1( 1 用 吖 啶 黄 素 对 付 老 鼠 体 内 的 这 种 原 生 动 物 并 取 得 了 显 著 效 果 这 种 染 料 因 其 能 影 响 锥 虫 而 被 称 为 锥 黄 素 显 微 镜 学 家 用 明 视 野 显 微 镜 观 察 了 这 类 染 料 和 微 生 物 体 的 结 合 原 生 动 物 学 家 ( 9= 显 然 是 用 荧 光 显 微 镜 研 究 染 料 和 活 细 胞 结 合 的 第 一 人 他 把 各 种 荧 光 探 针 和 药 物 如 荧 光 素 曙 红 中 性 红 奎 宁 等 加 到 纤 毛 豆 形 虫 的 培 养 液 中 并 用 荧 光 显 微 镜 观 察 了 细 胞 的 染 色 荧 光 他 掌 握 了 这 种 实 验 方 法 的 基 本 特 点 其 目 的 是 把 各 种 类 型 的 物 质 不 管 是 染 料 还 是 无 色 药 物 引 入 细 胞 假 定 它 们 服 从 一 定 的 分 布 规 律 并 在 一 定 的 条 件 下 富 集 在 细 胞 的 特 定 成 分 中 那 么 它 们 在 荧 光 显 微 镜 的 暗 视 野 中 就 可 以 突 出 显 示 细 胞 的 部 分 结 构 "" 年 荧 光 染 料 探 针 被 引 入 荧 光 显 微 术 中 标 志 着 实 验 细 胞 学 向 前 迈 了 一 大 步 ( 9= 的 报 告 首 次 描 述 了 活 体 荧 光 探 针 以 后 有 人 用 活 体 染 料 包 括 荧 光 探 针 进 行 原 生 动 物 试 验 但 只 限 于 用 明 视 野 显 微 镜 观 察 "' 年 匈 牙 利 药 物 学 家 把 几 种 不 同 的 荧 光 探 针 注 入 预 先 感 染 了 锥 虫 的 啮 齿 动 物 体 内 从 而 创 立 了 活 体 荧 光 探 针 技 术 荧 光 显 微 镜 下 的 血 涂 片 观 察 表 明 荧 光 染 料 和 核 酸 及 带 血 锥 虫 的 基 本 部 分 有 特 异 结 合 # 世 纪 '# 年 代 由 于 对 化 疗 特 别 感 兴 趣 人 们 做 了 各 种 努 力 试 图 确 定 染 料 在 什 么 位 置 和 动 物 及 人 体 内 的 疟 原 虫 结 合 人 们 在 荧 光 显 微 镜 下 发 现 在 所 试 验 的 各 种 荧 光 探 针 中 喹 吖 因 即 阿 的 平 在 注 射 后 的 "# 内 能 被 循 环 淋 巴 液 选 择 吸 收 将 吖 啶 黄 素 加 到 成 纤 维 细 胞 培 养 液 中 在 显 微 镜 下 可 看 到 试 验 浓 度 下 它 能 阻 止 细 胞 的 分 裂 用 荧 光 吲 哚 碳 花 青 染 料 标 记 脂 蛋 白 可 在 体 外 研 究 动 脉 粥 样 化 形 成 过 程 中 脂 蛋 白 的 代 谢 通 过 这 些 研 究 人 们 明 白 对 于 某 些 氨 基 吖 啶 能 优 先 和 细 胞 核 成 分 结 合 对 这 种 结 合 机 理 的 研 究 弄 清 了 染 料 对 核 酸 的 结 合 这 种 强 相 互 作 用 已 被 体 外 及 低 2 区 固 定 细 胞 中 的 纯 化 核 酸 所 阐 明 在 1( 1 阐 明 荧 光 素 能 示 踪 眼 内 液 体 的 流 动 之 后 -1 + 将 裂 隙 灯 显 微 镜 加 以 改 进 试 图 观 察 眼 内 染 料 的 荧 光 但 当 时 荧 光 显 微 镜 用 的 光 源 是 经 聚 光 镜 会 聚 的 透 射 光 对 大 多 数 不 透 明 的 活 器 官 标 本 无 法 观 察 " 年 海 德 堡 2 : ( 大 学 的 药 物 学 家 1 ( 和 年 轻 的 解 剖 学

27 第 三 章 荧 光 染 料 色 素 的 早 期 应 用 和 发 展 史 家, 2 ( 合 作 对 荧 光 显 微 镜 做 了 重 大 改 进 在 这 种 荧 光 显 微 镜 中 光 源 的 垂 直 入 射 光 直 接 通 过 侧 边 的 透 光 管 经 物 镜 会 聚 于 样 品 上 发 射 的 荧 光 沿 透 光 管 返 回 到 观 察 者 眼 中 别 的 基 本 部 件 还 有 相 应 的 滤 光 片 和 一 个 浸 在 水 中 的 物 镜 这 台 被 称 作 体 内 活 体 显 微 镜 的 仪 器 可 以 认 为 是 第 一 台 落 射 荧 光 显 微 镜 他 们 用 这 种 显 微 镜 观 察 了 动 物 体 内 注 入 荧 光 探 针 后 的 肾 脏 的 微 循 环 荧 光 素 和 吖 啶 黄 素 的 稀 释 溶 液 被 用 于 研 究 尿 液 形 成 的 生 理 学 很 多 科 学 家 对 体 内 活 体 荧 光 显 微 镜 产 生 了 兴 趣 并 试 验 了 各 种 荧 光 探 针 如 亮 碱 性 染 革 黄 棕 < 1 1 < 吉 耳 曼 宁 * (% * 樱 草 灵 黄 ( % )(1, 噻 唑 黄 1 = ) 硫 磺 素 1 +9 等 在 # 世 纪 '# 年 代 人 们 用 这 种 荧 光 新 技 术 观 察 了 活 体 皮 肤 肝 脏 肾 脏 结 膜 和 肾 上 腺 在 第 二 次 世 界 大 战 期 间, 2 ( 竟 然 进 行 了 非 人 道 的 活 体 试 验 用 体 内 活 体 荧 光 显 微 镜 观 察 人 体 内 的 组 织 为 满 足 生 物 学 研 究 的 需 要 活 体 荧 光 探 针 必 须 在 等 渗 无 毒 和 无 淬 灭 剂 的 条 件 下 使 用 (( *1)( = 和? 等 人 对 这 方 面 早 期 的 研 究 做 过 综 述 近 年 来 由 于 现 代 落 射 荧 光 显 微 镜 显 微 荧 光 扫 描 仪 数 码 成 像 采 集 系 统 等 先 进 设 备 和 方 法 的 应 用 微 循 环 的 体 内 活 体 显 微 术 又 重 新 受 到 欢 迎 <(9= 等 人 将 低 密 度 脂 蛋 白 进 行 酰 化 然 后 与 一 种 荧 光 探 针 : : : ( 结 合 当 肝 窦 内 皮 细 胞 摄 取 这 种 标 记 的 低 密 度 脂 蛋 白 后 便 可 用 荧 光 显 微 镜 进 行 鉴 定 研 究 人 员 将 "##5 荧 光 标 记 的 低 密 度 脂 蛋 白 经 门 静 脉 注 入 6 大 鼠 体 内 两 天 后 再 从 门 脉 内 注 入 "# 个 626?" 细 胞 这 是 一 种 化 学 诱 导 生 成 的 6 大 鼠 结 肠 癌 细 胞 系 一 周 后 处 死 大 鼠 取 出 肝 脏 标 本 进 行 常 规 组 织 学 检 查 并 用 大 鼠 内 皮 细 胞 单 克 隆 抗 体 进 行 免 疫 组 织 化 学 染 色 结 果 发 现 在 正 常 肝 实 质 组 织 中 肝 窦 内 皮 细 胞 出 现 荧 光 而 大 血 管 内 皮 未 出 现 荧 光 染 色 说 明 仅 肝 窦 内 皮 细 胞 能 摄 取 乙 酰 化 的 低 密 度 脂 蛋 白 在 发 生 肿 瘤 转 移 的 肝 脏 内 出 现 荧 光 的 空 间 梯 度 标 记 的 内 皮 细 胞 聚 集 在 转 移 灶 的 周 围 当 转 移 灶 超 过 ##% 后 便 出 现 新 生 血 管 的 形 成 同 时 荧 光 标 记 的 细 胞 从 周 围 侵 入 转 移 灶 内 并 在 肿 瘤 体 内 排 列 成 管 状 还 有 人 用 该 显 微 镜 和 吖 啶 橙 对 啮 齿 动 物 的 肝 脏 微 循 环 进 行 了 定 量 研 究 四 荧 光 染 料 探 针 在 植 物 研 究 中 的 早 期 应 用 和 发 展 当 荧 光 探 针 用 于 植 物 标 本 时 会 产 生 一 些 异 常 的 颜 色 组 合 自 身 荧 光 常 和 染 色 荧 光 共 存 例 如 用 荧 光 显 微 镜 观 察 萘 红 % :(: 染 色 的 树 叶 切 片 时 可 看 到 红 色 的 角 质 层 橘 红 色 的 初 级 韧 皮 部 和 次 级 韧 皮 部 蓝 色 的 木 栓 形 成 层 和 亮 红 色 的 木 质 部 有 些 荧 光 色 素 可 在 同 一 细 胞 中 诱 导 产 生 两 种 颜 色 的 荧 光 如 用 ( 1 1 时 可 看 到 橙 色 的 细 胞 质 和 黄 色 的 核 酸 当 用 吖 啶 橙 处 理 含 有 死 细 胞 的 混 合 液 时 也 可 观 察 到 这 种 多 色 荧 光 现 象 比 如 在 2 为 $# 时 植 物 表 皮 的 活 细 胞 发

28 '# 细 胞 生 物 学 荧 光 技 术 原 理 和 应 用 绿 光 而 死 细 胞 发 红 光 ; : ( 大 学 的 植 物 细 胞 生 理 学 家 * +( :* ( ( 发 现 吖 啶 橙, 有 将 活 细 胞 和 死 细 胞 染 成 不 同 颜 色 的 独 特 性 能 他 用 明 视 野 显 微 镜 研 究 了 其 他 很 多 染 料 对 细 胞 的 活 体 染 色 并 在 "'"" # 年 间 发 表 了 一 系 列 论 文 为 他 的 这 一 发 现 奠 定 了 基 础 在 观 察 组 织 或 细 胞 荧 光 时 大 多 数 科 学 家 都 没 有 考 虑 到 染 色 液 2 值 的 影 响 而 只 是 简 单 地 将 染 料 配 成 稀 溶 液 但 2( 报 道 说 在 2 为 " 时 用 荧 光 素 对 洋 葱 表 皮 细 胞 进 行 体 内 活 体 染 色 后 死 细 胞 和 活 细 胞 会 产 生 不 同 的 荧 光 图 像 作 为 一 个 细 胞 生 理 学 家 他 敏 感 地 意 识 到 了 2 值 对 带 电 荷 的 荧 光 探 针 和 胞 内 组 分 之 间 的 结 合 的 重 要 性 他 还 认 识 到 染 料 浓 度 可 能 会 影 响 其 在 溶 液 中 的 存 在 形 态 他 在 战 争 年 代 完 成 并 报 道 了 这 些 研 究 成 果 他 用, 和 其 他 几 种 荧 光 染 料 进 行 了 荧 光 显 微 研 究 并 基 于 这 些 研 究 在 " #" 年 发 表 了 近 # 篇 研 究 论 文 第 二 次 世 界 大 战 后 不 久 他 着 手 总 结 战 时 德 国 在 细 胞 生 理 学 和 植 物 细 胞 原 生 质 方 面 的 研 究 成 果 回 到 德 国 后 他 撰 写 了 两 部 著 作 其 中 的 一 部 就 是 关 于 荧 光 显 微 镜 的 * ( ( 的 富 于 创 见 的 工 作 直 接 导 致 了, 作 为 核 酸 荧 光 探 针 在 荧 光 显 微 术 流 式 细 胞 术 中 的 现 代 应 用 * ( ( 在 荧 光 显 微 术 方 面 的 工 作 是 开 创 性 的 具 有 重 大 意 义 在 这 些 工 作 中 他 系 统 地 研 究 了 植 物 活 细 胞 对, 的 吸 收 和 存 储 他 发 现 细 胞 内 的 荧 光 颜 色 在 一 定 程 度 上 依 赖 于 染 料 的 浓 度 这 就 是 浓 度 效 应 后 人 又 称 之 为 * ( ( 效 应 当, 浓 度 低 "A ###"A"#### 时 发 绿 光 浓 度 高 "A"## 时 发 红 光 中 等 浓 度 时 发 黄 光 * ( ( 还 指 出 通 过 荧 光 显 微 术, 能 辨 认 植 物 细 胞 是 死 的 还 是 活 的 因 为 2 为 $# 时 活 细 胞 显 绿 色 而 死 细 胞 显 红 色 在 2 大 于 时, 能 使 死 细 胞 的 细 胞 质 显 红 色 在 低 2 时 细 胞 核 显 红 色 当 2 升 到 &$ 时 开 始 变 成 黄 绿 色 后 来 有 人 证 实 死 细 胞 和 活 细 胞 确 实 可 以 产 生 不 同 颜 色 的 荧 光 * ( ( 和 他 的 同 事 们 又 对 酵 母 菌 霉 菌 细 菌 和 精 子 进 行 了 活 体 实 验, 染 色 产 生 的 双 色 荧 光 引 起 了 人 们 对 这 种 荧 光 异 色 现 象 的 注 意 在 荧 光 2 指 示 剂 的 细 胞 生 理 学 应 用 方 面 * ( ( 遥 遥 领 先 * ( ( 认 为 活 体 染 色 后 之 所 以 会 产 生 不 同 颜 色 的 荧 光 是 由 于 细 胞 蛋 白 和, 阳 离 子 的 结 合 程 度 不 同 在 活 细 胞 中 蛋 白 上 大 概 不 存 在 负 电 荷 对, 阳 离 子 的 吸 附 很 弱 结 合 态 染 料 的 浓 度 很 低 产 生 绿 色 荧 光 而 在 受 损 细 胞 和 死 细 胞 中 由 于 静 电 作 用 蛋 白 对, 的 吸 附 逐 渐 增 强 因 而 分 别 产 生 黄 色 和 红 色 的 荧 光 * ( ( 假 定 随 着 细 胞 的 损 伤 和 死 亡 蛋 白 的 亚 显 微 结 构 受 到 破 坏 带 上 更 多 的 负 电 荷 对, 的 吸 附 也 相 应 增 强 死 细 胞 质 中 铜 红 色 荧 光 的 出 现 为 研 究 精 细 结 构 的 变 化 提 供 了 看 得 见 的 证 据 * ( ( 还 发 现, 可 用 于 测 定 细 胞 蛋 白 质 的 等 电 点 在 乙 醇 固 定 的 标 本 中 含 蛋 白 的 组 织 在 等 电 点 以 下 发 绿 光 在 等 电 点 以 上 发 铜 红 色 荧 光 后 来 又 有 很 多 科 学 家 对, 和 活 细 胞 的 相 互 作 用 进 行 了 深 入 研 究 并 对 * (

29 第 三 章 荧 光 染 料 色 素 的 早 期 应 用 和 发 展 史 '" ( 的 解 释 提 出 了 质 疑 他 们 认 为 双 色 荧 光 与 细 胞 的 代 谢 活 性 以 及 染 料 和 67, 单 核 苷 酸 多 糖 溶 酶 体 及 核 蛋 白 复 合 物 等 的 结 合 有 关, 的 荧 光 异 色 现 象 主 要 是 由 于 染 料 单 体 二 聚 体 和 多 聚 体 等 的 形 成 而 导 致 的, 和 核 酸 可 以 形 成 各 种 复 合 物 包 括 染 料 分 子 插 入 67, 碱 基 之 间 发 绿 光 以 及 染 料 和 核 酸 表 面 的 磷 酸 根 作 用 称 为 堆 集 *1 %%+:( 详 细 研 究 了, 和 固 定 细 胞 的 结 合 他 强 调 2 值 对 于, 和 细 胞 内 组 分 结 合 之 动 力 学 的 重 要 性 用 2 法 测 量 组 织 蛋 白 等 电 点 的 方 法 也 得 以 证 实 很 多 研 究 者 提 出 在 酸 性 染 色 条 件 下, 阳 离 子 易 于 和 酸 性 组 分 结 合 如 软 骨 和 柱 细 胞 颗 粒 中 的 酸 性 粘 多 糖 和 核 酸 有 ' 个 研 究 小 组 各 自 独 立 地 发 现 在 完 全 相 同 的 条 件 下 用, 染 色 固 定 中 间 相 的 核 酸 和 染 色 体 67, 发 黄 绿 色 到 绿 色 荧 光 而 富 含 87, 的 区 域 发 橙 色 到 红 色 荧 光 有 人 指 出 引 起 颜 色 差 异 的 是 67, 和 87, 分 子 大 小 和 构 型 的 不 同 而 不 是 67, 和 87, 之 间 的 固 有 的 化 学 差 异 8 ( 用 显 微 荧 光 分 光 光 度 法 研 究 了, 与 纯 化 核 及 胞 内 核 酸 的 结 合 机 理 他 证 实 67, 二 级 结 构 的 有 序 程 度 对, 的 结 合 有 重 要 影 响 由 于 癌 细 胞 中 核 染 色 质 及 87, 的 含 量 增 多 用, 染 色 法 可 以 很 明 显 地 看 到 癌 细 胞 和 正 常 细 胞 的 颜 色 差 异 在 检 测 和 鉴 定 纯 化 的 或 病 毒 感 染 细 胞 核 酸 时, 被 证 明 是 一 种 灵 敏 的 细 胞 化 学 荧 光 探 针 有 人 用 极 化 荧 光 显 微 术 研 究 了 染 色 体 中 67, 的 构 造 作 为 检 测 染 色 体 中 67, 的 荧 光 探 针, 可 在 染 色 臂 上 产 生 均 一 的 荧 光 为 得 到 单 细 胞 中 87, 和 67, 含 量 以 及 67, 分 子 变 异 的 定 量 信 息 也 有 人 采 用 微 荧 光 术