178 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 215,Vol.31,No.1 类包括糖脂类脂肽类磷脂类和脂肪酸类等其中, 细菌生产的表面活性剂一般都是糖脂类 [2] 鼠李糖脂是糖脂类

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峙仰
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1 研究报告生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 215, 31(1): 铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选张翠坤常冬妹杨洪江 ( 天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室, 天津 3457) 摘要 : 从多种来源筛选高产鼠李糖脂的菌株, 并研究菌种发酵特性和鼠李糖脂产物的理化性质采用 CTAB 平板初步筛选鼠李糖脂合成菌株, 通过分析菌株的 16S rrna 基因序列确定细菌种属, 采用薄层色谱红外光谱分析产物性质结果显示, 利用 CTAB 平板初筛获得 163 株阳性菌株, 初步发酵确定 1 株高产细菌鼠李糖脂的产量为 g/l,1 株细菌均鉴定为铜绿假单胞菌挑选产量最高的菌株 B12, 分别以甘油菜籽油花生饼粉或葵花籽饼粉为碳源进行发酵, 发现菜籽油为合成鼠李糖脂的最佳碳源进一步对比在和 4 的发酵水平, 发现 37 条件下鼠李糖脂产量最高, 为 26.8 g/l 最后, 对鼠李糖脂发酵产物进行了初步纯化, 并进行了薄层色谱和红外光谱分析菌株 B12 能够合成较高水平的鼠李糖脂, 可能成为工业生产的候选菌株关键词 : 生物表面活性剂 ; 铜绿假单胞菌 ; 鼠李糖脂 ; 条件优化 DOI :1.1356/j.cnki.biotech.bull Screening of Pseudomonas aeruginosa Strains Highly Producing Rhamnolipid Zhang Cuikun Chang Dongmei Yang Hongjiang (Key Laboratory of Industrial Microbiology of Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 3457) Abstract: This work aims to screen strains highly producing rhamnolipid from multiple sources, analyze the characterization of fermentation and physicochemical characteristics of rhamnolipid. CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide)methylene blue plate was used for primary screening the strains synthesizing the rhamnolipid. Then the strains were identified by analyzing 16S rrna sequences, and the property of rhamnolipid was analyzed by TLC(thin layer chromatography)and FTIR(Fourier transform infrared spectroscopy). Total 163 strains with a dark blue halo around the colony were selected for further analysis of producing rhamnolipid. Among them, 1 strains producing g/l rhamnolipid were identified as Pseudomonas aeruginosa. Moreover, strain B12 yielding highest rhamnolipid was selected and used for the optimization of carbon resource, including glycerol, rapeseed oil, peanut cake or sunflower seed cake, and rapeseed oil was recognized as the optimal carbon source for the synthesis of rhamnolipid. Fermentation temperature was also evaluated at 35, 37 and 4, so the production of rhamnolipid was the highest of 26.8 g/l at 37. In addition, rhamnolipid produced by strain B12 was purified and analyzed by TLC and FTIR. In conclusion, strain B12 could synthesize a relatively high level of rhamnolipid and could be a candidate strain for industrial production. Key words: bio-surfactant ;Pseudomonas aeruginosa ;rhamnolipid ;optimization 生物表面活性剂是微生物在特定培养条件下分泌的具有表面活性的代谢产物, 与化学合成表面活性剂相比, 具有结构多样性高效和生物可降解性等优点, 有潜力替代化学合成表面活性剂的地位 [1] 许多种类的微生物都可分泌生物表面活性剂, 包括细菌酵母菌和丝状真菌生物表面活性剂种收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 (313725) 作者简介 : 张翠坤, 女, 硕士, 研究方向 : 微生物学发酵及其应用 ; zhangcuikun@126.com 通讯作者 : 杨洪江, 男, 博士, 研究方向 : 微生物及分子生物学相关研究 ; hongjiangyang@tust.edu.cn

质结果显示, 利用 CTAB 平板初筛获得 163 株阳性菌株, 初步发酵确定 1 株高产细菌鼠李糖脂的产量为 12.2-17.

2 178 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 215,Vol.31,No.1 类包括糖脂类脂肽类磷脂类和脂肪酸类等其中, 细菌生产的表面活性剂一般都是糖脂类 [2] 鼠李糖脂是糖脂类表面活性剂中一种重要类型, 一般由鼠李糖基和长链脂肪酸组成合成鼠李糖脂的微生物主要是铜绿假单胞菌, 通常可以合成含一个鼠李糖基的单鼠李糖脂和含两个鼠李糖基的双鼠李糖脂, 且以双鼠李糖脂为主 [3] 鼠李糖脂可以利用可再生及经济的底物生产, 例如餐饮废油油厂废水和油饼粉等 [4] 目前的文献多以排油圈直径或表面张力等指标来评价生物表面活性剂的性能, 较少文献以产量为出发点评价细菌生产鼠李糖脂的能力 [5] 本研究采用 CTAB 亚甲基蓝平板法从实验室保存菌株和环境样品中筛选能够生产鼠李糖脂的菌株, 并通过蒽酮硫酸法定量检测每株菌的鼠李糖脂产量利用分子生物学方法鉴定分离菌株的种类, 研究不同碳源发酵温度对菌株高产鼠李糖脂的作用, 并对鼠李糖脂进行薄层色谱分析和红外光谱分析 1 材料与方法 1.1 材料菌株实验室保存假单胞菌属菌株来源于天津科技大学校园内不同环境分离菌株, 样品包括草地土壤污泥河水以及餐余富油垃圾等共计 4 份培养基与溶液 CTAB 固体培养基 :KH 2 PO 4.7 g/l Na 2 HPO 4.9 g/l NaNO 3 2 g/l MgSO 4.4 g/l CaCl 2.1 g/l 甘油 2 g/l CTAB.2 g/l 亚甲基蓝.5 g/l 微量元素溶液 1 ml/l 琼脂粉 15 g/l [6], 用于产鼠李糖脂菌株的筛选 LB 培养基 : 蛋白胨 1 g/l NaCl 1 g/l 酵母浸粉 5 g/l 用于一般细菌培养及发酵中种子培养基无机盐培养基 :NaCl 1 g/l KCl 1 g/l NaNO 3 6 g/l KH 2 PO 4 3 g/l Na 2 HPO 4.3 g/l MgSO g/l CaCl 2 1 g/l 微量元素溶液 1 ml/l 微量元素溶液 :FeCl 3.16 g/l ZnSO g/l CuSO 4.15 g/l MnSO g/l H 3 BO g/l 发酵培养基是在无机盐培养基中添加不同的碳源制成, 本研究所用碳源包括甘油菜籽油花生饼粉和葵花籽饼粉蒽酮硫酸溶液 : 称取.2 g 蒽酮, 加入到 ml 98% 硫酸中, 用于定量测定鼠李糖脂的浓度 1.2 方法 CTAB 平板法筛选鼠李糖脂生产菌株鼠李糖脂是一种阴离子型表面活性剂, 它能与培养基中的阳离子溴化盐形成不溶的复合物, 然后通过亚甲基蓝的显色作用使产鼠李糖脂的菌落周围出现深蓝色的晕圈晕圈的大小在一定程度上反映了鼠李糖脂的分泌水平因此,CTAB 平板法可区分产鼠李糖脂与不产鼠李糖脂的菌株 [7] 向环境样品加入无菌生理盐水稀释, 振荡后静止 1 min, 取上清液涂布在 CTAB 平板上, 挑选其上生长的菌株三区划线纯化保存将获得的分离菌株与实验室保藏的假单胞菌属菌株单菌落点种在 CTAB 平板培养基上,37 培养 72 h 观察菌落周围是否出现深蓝色晕圈, 并测量菌落直径与晕圈直径, 晕圈直径与菌落直径的比值大致与鼠李糖脂的产量呈正比 [8] 鼠李糖脂产量的测定鼠李糖基团在强酸下被水解生成甲基糠醛, 然后与蒽酮生成蓝绿色化合物, 它在 625 nm 波长处有最大吸收, 其吸光度与浓度呈线性关系根据鼠李糖与鼠李糖脂分子量的关系, 鼠李糖脂浓度 =3.4 鼠李糖浓度 [9] 配制和 mg/l 的鼠李糖标准溶液, 每个浓度 3 个平行分别取 1.25 ml 标准溶液与 2.5 ml 蒽酮硫酸溶液冰浴中混合, 沸水浴中反应 15 min 待反应液温度下降到室温, 测定 625 nm 波长下的吸光度值, 绘制吸光度值与鼠李糖浓度的标准曲线得到吸光度值与鼠李糖浓度之间的关系 :y=.123x+.818,y 为吸光度值,x 为 L- 鼠李糖 (mg/l), 线性相关系数为.999 1, 线性关系很强, 可以用来计算鼠李糖浓度 ( 图 1) 将单菌落接种到 LB 培养基中振荡培养过夜, 转接 3% 种子液到发酵培养基中,35 2 r/min 培养 72 h 将发酵液 12 r/min 离心 1 min, 上清液用蒸馏水稀释合适倍数, 取 1.25 ml 稀释液于冰浴中缓缓加入 2.5 ml 蒽酮硫酸溶液, 沸水浴 15 min 冷却至室温后测定 625 nm 波长处的吸光度值根据标准曲线的函数关系及其他相关系数计算鼠李

合成含一个鼠李糖基的单鼠李糖脂和含两个鼠李糖基的双鼠李糖脂, 且以双鼠李糖脂为主 [3] 鼠李糖脂可以利用可再生及经济的底物生产, 例如餐饮废油油厂废水和油饼粉等 [4] 目前的文献多以排油圈直径或表面张力等指标来评价

3 1.6 养 72 h 测定生物量 OD6 和鼠李糖脂产量 y=.123x 对高产菌株进行发酵温度的优化将高产菌 R2= OD 张翠坤等铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选 215,31(1) 株接种到种子培养基中过夜培养后以 3% 接种量 1. 转接到 3 g/l 发酵培养基中分别在和 4 2 r/min 振荡培养 72 h 分别测定生物量 OD6 和鼠李糖脂产量 r/min 的转速离心 3 min 上清液用 6. mol/l HCl 调 L-rhamnose/ mg L-1 图1 =2 1 V/V 萃取 2 次后合并有机相于 45 旋转蒸发得到棕黄色固体或黏稠液体用.5 mol/l L-鼠李糖标准曲线 NaHCO3 溶液溶解后即得鼠李糖脂溶液 14 实验层析板为青岛化工硅胶 G 板将纯化的鼠糖脂产量鼠李糖脂乳化活性将发酵液 12 r/min 离心 1 min 上清液用蒸馏水稀释 5 倍后取 2 ml 与等体积的液体石蜡加入透明玻璃试管 1 mm 1 cm 中于涡旋振荡器上准确振荡 1 min 混匀室温静置 3 d 后测量乳化层高度和发酵液稀释液层高度并计算乳化指数乳化指数 % = 乳化层高度乳 / 化层高度 + 发酵液稀释液高度 % 将发酵液以 4 节至 2. 用等体积的有机溶剂氯仿甲醇鼠李糖脂纯化及性质分析菌株鉴定及系统发育树构建挑取单菌落接种到 LB 培养基中振荡培养过夜按照文献 1 中的方法提取细菌的基因组 DNA 以细菌的基因组 DNA 为模板使用通用引物 27F 和 1 492R 11 对 16S rrna 基因进行扩增 PCR 扩增程序 94 预变性 5 min 95 变性 1 min 53 退火 1 min 72 延伸 1.5 min 3 个循环李糖脂溶液用毛细管滴加在距层析板一端约 1 cm 处的起点线上风干后将薄层板置于盛有展开剂氯仿甲醇醋酸 = V/V/V 的展开槽中待展开剂上升到距离顶端 1 cm 左右时取出层析板干燥后喷洒显色剂苯酚硫酸酒精 =3 g 1 ml 25 ml 烘烤显色迁移率 = 待测物质迁移距离 / 溶剂展开距离红外光谱 Fourier Transform Infrared Spectrometer FTIR 可以通过鉴定化学键和功能基团从而确定混合物中的某种组分将冷冻干燥的表面活性剂粉末与 KBr 样品 KBr=1-3 1 MPa 压片 1 min 形成半透明薄片进行红外吸收光谱扫描结果 CTAB平板法筛选产鼠李糖脂菌株将经过处理的样品在 CTAB 平板上涂布并培 72 终延伸 1 min 采用引物 27F 和 1 492R 对扩增产物进行测序养共得到 38 个菌落大于 2 mm 且菌落周围具有深使用 NCBI 网站上的 BLAST 工具进行序列同源性比蓝色晕圈的菌株另外将实验室保存 173 株微生对确定菌株的种属 12 利用 MEGA5. 软件中的物点接在 CTAB 平板上发现有 125 株细菌的菌落邻接法 Neighbor Joining NJ 进行系统发育分析周围具有深蓝色晕圈其余 42 株菌可以在 CTAB 平构建系统发育树板上生长但不产生深蓝色晕圈还有 6 株菌不能在 13 产鼠李糖脂的碳源及发酵温度的优化对高 CTAB 平板上生长共计有 163 株细菌菌落周围形产菌株进行碳源种类的优化将高产菌株接种到种成了深蓝色晕圈显示这些菌株能够合成鼠李糖脂子培养基 LB 培养基中振荡培养过夜转接到发 2.2 酵培养基中 3% 接种量碳源分别为甘油菜籽定量筛选高产鼠李糖脂菌株将初筛阳性的 163 株细菌分别接种到 5 ml 发油花生饼粉葵花籽饼粉榨油副产物打磨成的酵培养基 2 g/l 甘油为碳源中振荡培养 72 h 粉末碳源含量为 3 g/l 35 2 r/min 振荡培测定鼠李糖脂产量结果表 1 显示有 1 株细

5 mol/l L-鼠李糖标准曲线 NaHCO3 溶液溶解后即得鼠李糖脂溶液 14 实验层析板为青岛化工硅胶 G 板将纯化的鼠糖脂产量鼠李糖脂乳化活性将发酵液 12 r/min 离心 1 min 上清液用蒸馏水稀释 5 倍后取 2 ml 与等体积的液体石蜡加入透明玻璃试管 1 mm 1 cm 中于涡旋振荡器上准确振荡 1 min 混匀室温静置 3 d

4 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 18 表1 215,Vol.31,No.1 鼠李糖脂高产菌株的特性分析菌株晕圈直径 / 菌落直径生物量 OD6 鼠李糖脂 / g L-1 A A A A A A A B B B 乳化率 /% 菌鼠李糖脂产量在 g/l 其中来源于土菌将序列上传至 GenBank 数据库各菌株序列接壤样品的菌株 B12 鼠李糖脂产量最高为 17.7 g/l 收号见系统进化树图 2 1 株分离菌株同源性很 2.3 分离菌株的分子鉴定与系统发育树的构建高位于同一个进化枝 clade 与他们最相似的参分别提取上述 1 株细菌基因组 DNA 扩增比菌株中 P. aeruginosa FR2 是从泰国南部温泉中分 16S rrna 基因并进行序列测定使用 NCBI 网站上离的能够分泌表面活性剂且具有耐热的性质 BLASTN 工具进行序列比对 1 株细菌与铜绿假单 P. aeruginosa GF 是从印度被污染土壤中分离的菌株胞菌 Pseudomonas aeruginosa GF KM25992 的同可以降解氯酚等有毒化合物 P. aeruginosa JS-11 最源性均为 % 确定分离菌株都属于铜绿假单胞初分离于小麦根际土壤能够降解苯脲类除草剂异 Pseudomonas aeruginosa A37 KM Pseudomonas aeruginosa A192 KM Pseudomonas aeruginosa GF KM25992 Pseudomonas aeruginosa B9 KM Pseudomonas aeruginosa B12 KM Pseudomonas aeruginosa A487 KJ Pseudomonas aeruginosa A141 KP Pseudomonas aeruginosa A184 KM Pseudomonas aeruginosa A148 KM Pseudomonas aeruginosa B13 KM58837 Pseudomonas aeruginosa A199 KP Pseudomonas aeruginosa FR2 HG Pseudomonas aeruginosa ATCC AF94719 Pseudomonas aeruginosa JS-11 EF Pseudomonas aeruginosa 93 HG Pseudomonas aeruginosa ATCC AJ611 Pseudomonas fulva 67 FJ Pseudomonas reactans NO8 FJ 图2. 分离菌株的系统发育树丙隆 15 产量 OD6 和结果表 2 显示分别以甘 2.4 碳源种类对鼠李糖脂合成的影响油菜籽油花生饼粉和葵花籽饼粉为碳源的培养基分别以甘油菜籽油花生饼粉和葵花籽饼粉鼠李糖脂产量依此为和 6.4 g/l 菜为碳源分析菌株 B12 在不同培养基中的鼠李糖脂籽油是菌株 B12 合成鼠李糖脂最适宜的碳源

3 分离菌株的分子鉴定与系统发育树的构建高位于同一个进化枝 clade 与他们最相似的参分别提取上述 1 株细菌基因组 DNA 扩增比菌株中 P. aeruginosa FR2 是从泰国南部温泉中分 16S rrna 基因并进行序列测定使用 NCBI 网站上离的能够分泌表面活性剂且具有耐热的性质 BLASTN 工具进行序列比对 1 株细菌与铜绿假单 P.

5 3 碳源种类对鼠李糖脂合成的影响碳源甘油菜籽油花生籽饼粉葵花籽饼粉 18.7± ± ± ±.8 g L-1 OD6 2.6±.1 7.4± ±.1 7.8±.1 9.9±.2 9.7±.2 㧼 ᓖ OD6 啐ᵾ 㜲/ g L-1 鼠李糖脂 / 啐ᵾ 㜲㧼 ᓖ 注 - 表示未检出由于饼粉培养基不可溶因此 OD6 不能准确表示生物量 2.5 定量筛选高产鼠李糖脂菌株 12 图3 以 3 g/l 菜籽油为碳源分别测定䰤/h 6 表2 性质 181 张翠坤等铜绿假单胞菌高产鼠李糖脂菌株的筛选 215,31(1) 菌株 P. aeruginosa B12 摇瓶发酵和 4 条件下菌株 B12 鼠李糖脂的产量结果表 3 显示 37 发酵后获得的鼠李糖脂产量最高为分析结果图 4 显示硅胶板上出现两个棕黄 26.8 g/l 色的斑点斑点的颜色证明了样品的糖脂类特性表3 斑点 RL1 Rhamnolipid 和 RL2 的迁移率 Rf 分别发酵温度对鼠李糖脂合成的影响为.71 和发酵温度 37 4 鼠李糖脂 / g L 21.7± ± ±1.1 分的吸附能力不同展开剂对各成分的吸附能力也 OD6 7.4±.3 7.8±.1 7.6±.1 8.±.1 7.4±.5 8.1±.2 不同从而使混合物品得以分离铜绿假单胞菌生性质 -1 通过碳源种类和发酵温度的优化菌株 B12 发酵的条件确定为以菜籽油为碳源发酵温度为菌株B12发酵产鼠李糖脂分析将种子液以 3% 的接种量接种到含 3 g/l 菜籽在薄层色谱分析中硅胶吸附剂对样品中各成产的鼠李糖脂可能含有一个或两个鼠李糖分子 16 其中含有一个鼠李糖分子的糖脂极性较小 Rf 值较大含有两个鼠李糖分子的糖脂极性较大其 Rf 值较小可以看出菌株 B12 合成的鼠李糖脂是混合物包括单鼠李糖脂和双鼠李糖脂且主要成分是双鼠李糖脂油的发酵培养基中 37 2 r/min 振荡培养每 12 h 取样 1 ml 分别测定样品的值 OD6 和鼠 RL1 RL2 李糖脂产量时间曲线图 3 显示发酵液的值从初始的 6.8 上升到 8. 左右 OD6 值一般能够代表细菌的浓度在本次发酵中 OD6 值在 h 之间迅速从 1.8 攀升到了 19.3 之后一直保持下䎧㓯降的趋势到 72 h 发酵终点 OD6 值下降到了 13.2 图4 但是从摇瓶表观来看一开始形成菜籽油的乳浊液在之后的发酵中菜籽油逐渐被消耗乳浊液逐渐变清因此在本实验中 OD6 值并不能代表细菌的生长 2.8 㓯薄层色谱分析菌株 B12 的鼠李糖脂产物发酵产物鼠李糖脂的红外光谱分析溶液冷冻干燥成粉末状与 KBr 混匀研磨后鼠李糖脂的产量开始增长缓慢后来开始大量合成测定 4-4 cm-1 波长处的吸收峰菌株 B12 所到发酵终点 72 h 时鼠李糖脂产量为 26.8 g/l 合成的鼠李糖脂的红外吸收光谱图图 5 显示发酵产物鼠李糖脂的薄层色谱分析 cm-1 处有很宽的吸收峰为大量的 -OH 对菌株 B12 发酵合成的鼠李糖脂进行萃取纯化和 -CHX 不对称伸缩振动 cm-1 处的峰然后将鼠李糖脂溶液点在硅胶 G 板上进行薄层色谱是 C-O-C 键伸缩振动形成 cm-1 的峰可能是酰

aeruginosa B12 摇瓶发酵和 4 条件下菌株 B12 鼠李糖脂的产量结果表 3 显示 37 发酵后获得的鼠李糖脂产量最高为分析结果图 4 显示硅胶板上出现两个棕黄 26.8 g/l 色的斑点斑点的颜色证明了样品的糖脂类特性表3 斑点 RL1 Rhamnolipid 和 RL2 的迁移率 Rf 分别发酵温度对鼠李糖脂合成的影响为.71 和.

6 182 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 215,Vol.31,No.1 胺 Ⅰ 带, 即 C=O 伸缩振动吸收峰, 也可能是酰胺 N-H 面内弯曲振动吸收带即酰胺 Ⅱ 带缔合态, 或二者重叠从以上的各个峰的波数可以确定肽链和烷基链, 与鼠李糖脂分子式能够相对应 /% /cm 图 5 P. aeruginosa B12 合成的鼠李糖脂的红外光谱 3 讨论生产成本是生物表面活性剂产品工业化的限制性因素, 降低生产成本的方法包括筛选高产鼠李糖脂的菌株, 或者选择价格低廉的底物进行生产 [17] Thavasi 等以花生油饼为底物, 将库彻氏棒状杆菌 (Corynebacterium kutscheri) 在 3 L 发酵罐中发酵 [18] 132 h, 得到了 6.4 g/l 鼠李糖脂 George 等菌株 P. aeruginosa D 以煎炸椰子油为底物, 合成了 3.6 g/l 鼠李糖脂菌株 P. aeruginosa GIM32 利用糖蜜酒厂废水为原料, 发酵 64 h, 得到 2.6 g/l 鼠李糖脂 [19] 从矿物切削油中筛选到菌株 P. aeruginosa NCAIM, 能够利用煎炸废油葵花籽油和油厂废水为原料进行发酵, 鼠李糖脂产量分别达到和.4 g/l [2] 菌株 P. aeruginosa 67 分离于原油污染土壤, 该菌株利用葵花籽油能够生产 3.4 g/l 鼠李糖脂 [2] [21] Wadekar 等报道, 铜绿假单胞菌在葡萄糖甘油石蜡和菜籽油为碳源的不同培养基中, 鼠李糖脂的产量分别为和 13.5 g/l, 从经济性考虑, 菜籽油是大规模生产生物表面活性剂鼠李糖脂的首选碳源菜籽油富含油酸, 是适宜生物表面活性剂生产的碳源, 与本研究的结果相同铜绿假单胞菌合成的鼠李糖脂, 其鼠李糖环数量为 1 个或 2 个, 由于疏水性差异, 可以采用薄层色谱法分离, 得到迁移率不同的两个斑点且两种鼠李糖脂的红外吸收图谱相似, 具有相同的化学基团 [5] 大部分由铜绿假单胞菌生产的都是双鼠李糖脂, 很少一部分单鼠李糖脂占主要部分 4 结论本研究通过 CTAB 平板法初步筛选和定量测定, 获得高产鼠李糖脂菌株 P. aeruginosa B12 以菜籽油为碳源条件下, 菌株 B12 的鼠李糖脂产量为 26.8 g/l, 是工业生产鼠李糖脂的候选菌株参考文献 [1]Thavasi R, Nambaru VR, Jayalakshmi S. Biosurfactant production by Pseudomonas aeruginosa from renewable resources[j]. Indian Journal of Microbiology, 211, 51(1):3-36. [2]Markus MM, Barbara H, Michaela K, et al. Evaluation of rhamnolipid production capacity of Pseudomonas aeruginosa PAO1 in comparison to the rhamnolipid over-producer strains DSM 718 and DSM 2874[J]. Applied Microbiology Biotechnology, 211, 89 (7): [3]Rahman KS, Rahman TJ, McClean S, et al. Rhamnolipid biosurfactant production by strains of Pseudomonas aeruginosa using low-cost raw materials[j]. Biotechnology Progress, 22, 18 : [4]Makkar RS, Cameotra SS. Biosurfactant production by microorganisms on unconventional carbon sources-a review[j]. J Surf Det, 1999, 2 : [5] 包木太, 张金秋, 张娟, 等. 产糖脂类生物表面活性剂菌株鉴定及发酵条件优化 [J]. 环境工程学报, 213, 7(1): [6]Nur AM, Amirul AA, Mohamad NM. Rhamnolipid produced by Pseudomonas aeruginosa USM-AR2 facilitates crude oil distillation[j]. The Journal of General and Applied Microbiology, 212, 58 : [7]Siegmund I, Wagner F. New method for detecting rhamnolipids excreted by Pseudomonas species during growth on mineral agar[j]. Biotechnology Technology, 1991, 5 : [8]Pinzon N, Ju LK. Improved detection of rhamnolipid production using agar plates containing methylene blue and cetyl trimethylammonium bromide[j]. Biotechnology Letter, 29, 31 : [9]Benincasa M, Accorsini FR. Pseudomonas aeruginosa LBI

66 35 3 25 2 15 5 /cm -1 1634.27 1284 1174.4 1114.52 168.93 885.74 85.61 85.12 675.13 614.29 577.72 457.45 图 5 P.

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