實驗一 蛋白質定量

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1 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 目 錄 實 驗 室 保 命 守 則 II 實 驗 課 課 程 進 度 表 IV 序 言 1 實 驗 暖 身 賽 微 量 分 注 器 的 使 用 與 連 續 稀 釋 3 實 驗 一 實 驗 二 實 驗 三 實 驗 四 實 驗 五 蛋 白 質 定 量 7 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 23 重 組 蛋 白 之 純 化 35 重 組 蛋 白 之 濃 縮 43 蛋 白 質 染 色 51 附 錄 63 附 錄 一 Bradford assay 偵 測 極 限 63 附 錄 二 BCA assay 偵 測 極 限 64 附 錄 三 pet-20 (b) map 65 附 錄 四 IPTG 誘 導 卡 通 圖 66 附 錄 五 溶 液 成 份 表 67 I

2 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 室 保 命 守 則 實 驗 進 行 之 餘 夕 ㄇ 一 ㄚ 也 要 顧, 若 不 留 意, 經 常 會 造 成 永 久 的 遺 憾, 因 此, 請 遵 守 以 下 各 項 規 定 : 1. 請 事 先 勘 查 緊 急 沖 洗 站 洗 眼 站 滅 火 器 與 逃 生 門 的 位 置 2. 為 了 避 免 有 異 味, 請 勿 穿 著 涼 鞋 或 拖 鞋 ( 腳 趾 不 要 裸 露 ) 3. 為 了 看 起 來 更 專 業, 同 時, 避 免 染 劑 摧 毀 你 的 衣 服, 請 穿 著 實 驗 衣 4. 請 不 要 披 頭 散 髮, 有 礙 觀 瞻 5. 在 實 驗 室 請 勿 吸 煙 化 妝 嚼 口 香 糖 吃 東 西 如 果 食 物 是 要 自 己 ( 或 給 我 ) 吃 的 話, 請 勿 存 放 於 實 驗 室 的 冰 箱 中 6. 在 案 發 現 場 請 勿 留 下 任 何 痕 跡, 所 以 實 驗 後 請 將 殘 局 收 拾 乾 淨 7. 實 驗 中 打 翻 任 何 藥 品 試 劑 時, 請 勿 逃 跑, 而 是 趕 快 清 理 離 開 實 驗 室 前 請 記 得 洗 手 8. 眼 睛 是 靈 魂 之 窗, 配 製 酸 鹼 溶 液 有 毒 的 溶 液 或 進 行 危 險 實 驗 時, 請 戴 上 眼 鏡, 但 請 使 用 安 全 眼 鏡 而 不 是 太 陽 眼 鏡 近 視 的 同 學, 就 乖 乖 的 戴 眼 鏡 來 上 課 吧! 9. 使 用 任 何 藥 品, 請 先 看 清 楚 標 示 或 翻 閱 Merck index, 查 明 是 否 會 對 人 體 造 成 傷 害 如 果 看 不 懂 英 文 請 詢 問 助 教 1) 揮 發 性 的 溶 劑 ( 就 是 有 臭 味 的 ): 務 必 在 通 風 櫥 中 量 取 配 製 2) 有 毒 致 癌 藥 劑 : 例 如 acrylamide( 神 經 毒 ),ethidium bromide( 突 變 劑 ) 請 戴 手 套 取 用 中 毒 時 請 就 醫, 而 不 是 到 處 和 同 學 握 手 3) 在 地 球 報 廢 前, 請 勿 隨 意 傾 倒 藥 品 廢 液 請 依 指 示 集 中 處 理 10. 為 了 延 長 儀 器 的 壽 命, 同 時 保 護 你 我 安 全, 請 發 揮 愛 心 至 少 做 到 下 列 幾 點 : 1) 離 心 機 : 離 心 管 務 必 平 衡 2) 供 電 器 : 會 產 生 極 高 的 電 壓, 電 源 開 啟 時 請 勿 觸 摸 電 極 3) 微 波 爐 : 加 熱 時 必 須 把 瓶 蓋 或 管 蓋 鬆 開, 以 免 發 生 爆 炸 II

3 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 4) UV 燈 之 使 用 : 使 用 UV transilluminatior 觀 察 膠 片 時, 務 必 使 用 UV 光 不 能 穿 透 之 防 護 板 或 眼 鏡 5) 酒 精 燈 之 使 用 : 請 遠 離 講 義 紙 張 及 有 機 溶 劑 等 易 燃 物, 起 火 時 請 記 得 滅 火 並 撥 打 菌 液 的 處 理 : 本 實 驗 使 用 之 細 菌 雖 然 不 是 病 原 菌, 但 在 某 些 情 況 下 任 何 細 菌 皆 可 造 成 感 染 此 外, 實 驗 中 部 分 菌 種 帶 有 來 自 質 體 的 抗 藥 性, 隨 意 丟 棄 容 易 造 成 環 境 中 抗 藥 性 細 菌 的 繁 衍, 為 了 不 要 成 為 2012 的 幫 兇, 故 請 注 意 : 1) 與 細 菌 接 觸 過 的 任 何 容 器 或 培 養 基, 使 用 後 必 須 經 過 滅 菌 才 可 丟 棄 2) 實 驗 中 若 不 小 心 被 菌 液 濺 到, 請 用 大 量 清 水 沖 洗, 並 以 70% 酒 精 消 毒 3) 桌 面 或 地 面 有 菌 液 翻 覆 時, 請 以 10% 漂 白 水 擦 拭 清 洗 12. 請 睡 飽 吃 飽 後 再 來 進 行 實 驗 ( 請 勿 以 此 當 作 翹 課 的 藉 口!) III

4 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 課 課 程 進 度 表 11/19 廠 商 課 程 : 純 水 系 統 微 量 分 注 器 操 作 說 明 實 驗 暖 身 賽 微 量 分 注 器 的 使 用 與 連 續 稀 釋 11/26 廠 商 課 程 : 蛋 白 酵 素 免 疫 分 析 儀 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 (Bradford assay) 12/03 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 (BCA assay 分 光 光 度 計 之 操 作 ) 12/10 筆 試 實 驗 二 重 組 蛋 白 的 表 現 與 粗 萃 取 ( 流 程 說 明 ) 蛋 白 質 純 化 管 柱 的 清 洗 12/17 實 驗 三 蛋 白 質 之 純 化 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 12/24 蛋 白 質 定 量 (Bradford assay) 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 12/31 筆 試 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 01/07 操 作 考 IV

5 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 序 言 開 始 實 驗 前 請 先 問 問 自 己, 修 生 化 實 驗 的 原 因, 除 了 必 修 外, 還 可 以 想 到 什 麼 理 由? 學 生 : 老 天 爺 啊 ~ 我 需 要 花 多 久 時 間 做 實 驗 呢? 老 天 爺 : 一 輩 子 學 生 : 這 是 老 天 爺 您 的 笑 話 嗎? 老 天 爺 : 這 不 是 笑 話, 而 是 人 生 你 一 睜 開 眼, 就 在 想, 如 果 我 今 天 再 翹 課 會 不 會 被 教 授 當? 如 果 我 課 堂 夢 周 公, 考 試 還 會 不 會 寫? 如 果 我 在 facebook 破 口 大 罵, 老 師 會 不 會 看 到? 如 果 我 晚 上 on line 到 清 晨, 室 友 會 不 會 叫 我 起 床? 如 果 生 活 中 有 太 多 想 問 的 問 題, 所 以 你 需 要 做 實 驗 找 出 答 案 學 生 : 老 天 爺 啊 ~ 如 果 我 每 天 跟 您 祈 禱, 您 能 告 訴 我 答 案 嗎? 老 天 爺 : 我 現 在 就 能 告 訴 你 答 案! 你 會 : 被 當! 不 會 寫! 被 同 學 打 小 報 告! 室 友 其 實 還 指 望 你 會 叫 醒 他! 不 過, 這 些 你 不 想 聽 到 的 答 案 就 真 的 是 唯 一 的 答 案 嗎? 學 生 : 也 許 老 天 爺 : 就 是 有 太 多 可 能 性, 所 以 你 才 需 要 動 手 做 實 驗 其 實 實 驗 常 會 讓 人 摸 不 著 頭 緒 的 一 個 原 因, 是 因 為 它 實 在 太 抽 象 你 想 想, 魔 獸 能 夠 真 實 的 呈 現 在 你 的 螢 幕 前 所 以 你 很 容 易 投 入 這 個 遊 戲, 但 當 你 電 腦 突 然 中 毒 時, 如 果 你 沒 有 充 分 的 電 腦 知 識, 那 你 可 能 還 想 不 透 是 哪 個 下 載 的 檔 案 帶 來 的 病 毒 我 們 再 以 學 習 欣 賞 畫 作 來 舉 例, 你 看 一 幅 素 描 畫, 一 看 就 知 道 它 的 內 容, 1

6 序 言 但 請 你 解 說 一 幅 抽 象 畫 時, 你 可 能 都 會 覺 得 : 好 像 是 這 也 許 就 是 你 還 沒 學 習 生 化 實 驗 前 的 寫 照 由 於 這 些 生 化 分 子 都 很 小, 小 到 你 無 法 用 肉 眼 看 見, 如 果 你 不 是 用 心 去 觀 察 它 們, 那 你 可 能 整 堂 實 驗 課 下 來, 只 是 按 照 實 驗 步 驟 在 對 一 些 水 溶 液 吸 吸 吐 吐 面 對 這 些 看 不 到 的 東 西, 你 還 是 要 小 心 照 顧 它 們, 所 以 你 最 好 能 成 為 國 王 的 新 衣 中 的 聰 明 人, 對 自 己 催 眠 : Yes! We can! (See what?) 生 化 的 領 域 非 常 廣, 無 法 像 日 劇 一 樣, 十 集 就 能 結 束, 所 以 本 學 期 的 實 驗 安 排 從 蛋 白 質 開 始, 而 這 只 是 入 門 的 基 礎 欲 練 神 功 請 先 自 功 ( 自 行 用 功 )! 玩 遊 戲 需 要 練 功, 做 實 驗 當 然 也 需 要 這 些 基 礎 操 作 這 本 上 學 期 的 生 化 實 驗 講 義 我 們 稱 它 為 破 之 卷! 不 是 要 打 破 你 對 生 化 科 技 的 美 夢, 而 是 要 打 破 你 目 前 對 生 化 只 停 留 在 紙 上 談 兵 的 印 象 你 願 意 花 時 間 與 滑 鼠 溫 存, 請 容 我 利 用 上 課 的 時 間 介 紹 你 與 pipetman 認 識 吧! 它 沒 有 優 美 的 流 線 設 計 但 它 很 好 用! 電 腦 沒 有 滑 鼠 很 難 操 作, 實 驗 沒 有 pipetman 很 難 進 行 常 有 人 在 實 驗 課 上 完 後, 還 搞 不 清 楚 這 幾 個 小 時 到 底 在 做 什 麼, 可 能 的 原 因 除 了 助 教 說 得 不 夠 清 楚 外, 也 可 能 是 你 預 報 做 得 不 夠 徹 底 本 學 期 的 講 義 留 有 一 些 空 洞 處, 除 了 是 因 為 助 教 懶 得 寫 外, 滿 足 它! 也 是 本 學 期 寫 預 報 的 方 式, 在 查 資 料 的 同 時, 你 也 可 以 在 其 它 空 白 處 塗 塗 抹 抹,as much as possible! The more fillings you put in, the more scores you can get! 而 下 學 期 的 生 化 實 驗 講 義, 我 們 稱 之 為 解 之 卷 這 本 解 將 揭 開 重 組 工 程 的 秘 密, 從 基 因 的 層 次 帶 你 往 更 上 游 的 生 化 領 域 進 行 探 索! ( 同 樣 的, 你 啥 也 看 不 到 ) 當 然, 其 實 老 師 與 助 教 們 最 期 盼 的 是 : 希 望 在 實 驗 課 過 後, 能 讓 你 找 到, 學 習 實 驗 除 了 必 修 之 外 的 其 他 理 由 2

7 實 驗 暖 身 賽 微 量 分 注 器 的 使 用 與 連 續 稀 釋 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 課 前 提 示 連 續 稀 釋 指 的 是 將 一 開 始 的 高 濃 度 樣 品, 依 一 定 的 比 例, 逐 一 稀 釋 到 一 定 的 低 濃 度 連 續 稀 釋 的 這 個 實 驗 技 巧, 可 以 應 用 在 許 多 不 同 領 域 的 實 驗 當 中, 像 是 微 生 物 實 驗 的 菌 落 稀 釋 生 化 實 驗 標 準 樣 品 的 連 續 稀 釋 等 連 續 稀 釋 要 做 得 好 並 不 容 易, 從 一 開 始 應 該 稀 釋 的 倍 數 選 擇, 到 如 何 計 算 與 設 計 實 驗, 最 後, 在 微 量 分 注 器 實 際 操 作 時 的 人 為 誤 差 等, 其 實 每 一 步 都 是 學 問 如 果 你 能 將 連 續 稀 釋 的 技 巧 學 下 來, 並 且 盡 量 將 誤 差 降 低, 對 於 將 來 操 作 實 驗 的 靈 巧 度 上 會 有 很 大 的 幫 助! 實 驗 原 理 我 們 先 來 練 習 設 計 連 續 稀 釋 的 實 驗 : (A) 助 教 show show 目 前 我 們 的 手 邊 有 一 管 濃 度 為 4mg/ml 的 蛋 白 質, 現 在 我 們 要 將 其 以 二 倍 稀 釋 的 方 式, 連 續 稀 釋 到 終 濃 度 為 0.5mg/ml, 且 每 一 管 的 最 終 體 積 都 保 持 在 100μl 請 問 該 如 何 進 行? (B) 同 學 try try 3

8 實 驗 暖 身 賽 微 量 分 注 器 的 使 用 與 連 續 稀 釋 目 前 我 們 的 手 邊 有 一 管 濃 度 為 9 mg/ml 的 蛋 白 質, 現 在 我 們 要 將 其 以 三 倍 稀 釋 的 方 式, 連 續 稀 釋 到 終 濃 度 為 0.1 mg/ml, 且 每 一 管 的 稀 釋 體 積 都 保 持 在 180 μl 請 問 該 如 何 進 行? 實 驗 器 材 微 量 分 注 器 離 心 管 Tip 實 驗 藥 品 Trypan Blue 染 劑 ( 有 毒! 操 作 請 小 心 ) 實 驗 步 驟 1. 準 備 三 支 離 心 管, 分 別 寫 上 S1 S2 S3 2. S1 S2 S3 先 加 入 220 μl H 2 O 3. 拿 起 桌 上 標 示 S4 的 染 劑, 吸 取 110 μl 到 S3 吸 吐 10 次 4. 從 S3 再 吸 取 110 μl 到 S2 後, 吸 吐 10 次 5. 從 S2 再 吸 取 110 μl 到 S1 後, 吸 吐 10 次 6. 依 照 助 教 指 示, 將 sample (S1~S4) 逐 次 加 到 微 量 盤 中 4

9 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 7. 利 用 ELISA reader 偵 測 吸 光 值 5

10 實 驗 暖 身 賽 微 量 分 注 器 的 使 用 與 連 續 稀 釋 實 驗 暖 身 賽 微 量 分 注 器 的 使 用 與 連 續 稀 釋 一 實 驗 紀 錄 及 結 果 1. 請 問 你 進 行 的 是 幾 倍 稀 釋 呢? 2. R 2 = 3. 請 貼 上 圖 表 6

11 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 課 前 提 示 本 學 期 生 化 實 驗 的 主 角 是 蛋 白 質, 就 像 是 剛 出 身 的 寶 寶 要 先 秤 重 一 般, 在 了 解 蛋 白 質 之 前, 我 們 要 先 學 會 玷 玷 蛋 白 質 究 竟 有 幾 兩 重 所 以 我 們 會 花 上 幾 堂 課 的 時 間 學 習 與 使 用 蛋 白 質 定 量 的 實 驗, 但 是 你 知 道 我 們 為 什 麼 要 把 青 春 花 在 學 習 蛋 白 質 的 定 量 嗎? 事 實 上, 定 量 是 我 們 日 常 生 活 非 常 重 要 的 問 題, 假 設 你 上 市 場 買 一 斤 豬 肉, 除 了 擔 心 病 死 豬 的 問 題 外, 你 又 要 如 何 確 認 肉 販 給 你 的 份 量 沒 有 灌 水 呢? 更 神 奇 的 是, 同 樣 的 一 斤 豬 肉, 利 用 超 級 市 場 的 電 子 磅 秤 和 一 般 市 場 用 的 彈 簧 秤, 秤 出 來 的 重 量 會 是 一 樣 重 的 嗎? 像 這 種 有 關 定 量 問 題 的 小 事, 其 實 是 大 大 影 響 我 們 日 常 生 活 的 如 果 在 定 量 上 沒 有 一 定 的 標 準, 人 與 人 之 間 的 溝 通 可 能 會 出 現 大 問 題 除 了 跟 肉 販 大 打 出 手 外, 你 也 很 難 依 照 一 份 食 譜 的 指 示, 做 出 一 道 美 味 的 佳 餚 同 樣 地, 科 學 界 也 是 如 此, 在 全 世 界 不 同 角 落 的 實 驗 室, 同 時 有 許 多 生 化 實 驗 正 在 進 行, 為 了 讓 各 國 的 科 學 家 能 夠 交 流 與 重 複 重 要 的 實 驗, 相 關 的 實 驗 條 件 必 須 詳 細 說 明 記 載 尤 其 是 在 實 驗 中 所 使 用 的 蛋 白 質 含 量 必 須 以 科 學 界 公 認 的 方 法 來 測 定, 這 樣 其 他 科 學 家 才 能 有 所 依 循 所 以, 現 在 你 應 該 了 解, 除 了 日 常 生 活 外, 在 生 化 的 世 界 裡, 定 量 更 是 一 件 看 似 容 易 但 卻 非 常 重 要 的 工 作 如 果 定 量 工 作 沒 有 確 實 完 成, 很 可 能 導 致 後 續 的 實 驗 完 全 的 失 敗, 因 此 在 各 位 開 始 學 習 生 化 實 驗 的 時 候, 一 定 要 把 這 個 基 礎 建 立 好 另 外 一 個 在 課 前 所 必 須 注 意 的 重 點 是, 在 生 化 實 驗 中 所 處 理 的 樣 品 通 常 是 非 常 微 量 的, 打 個 噴 嚏 你 的 蛋 白 質 就 會 消 失 在 空 氣 中 公 斤 是 我 們 秤 體 重 的 單 位, 而 微 克 (microgram,μg,10-6 g), 則 是 我 們 最 常 使 用 的 蛋 白 質 計 量 單 位, 這 個 單 位 甚 至 比 實 驗 室 常 見 的 四 位 天 平 還 要 小 100 倍 因 此 各 位 先 前 所 熟 知 秤 7

12 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 豬 肉 體 重 等 的 方 式, 並 不 適 合 在 生 化 實 驗 中 使 用 實 際 上 生 化 實 驗 中 不 光 是 蛋 白 質, 甚 至 醣 類 脂 質 以 及 核 酸 等 生 化 物 質 的 定 量 都 面 臨 到 相 同 的 問 題 而 解 決 問 題 的 關 鍵 就 在 這 些 生 化 物 質 本 身 的 化 學 特 性 上 本 學 期 的 實 驗 將 介 紹 眾 多 蛋 白 質 定 量 方 法 中 的 其 中 三 種, 屬 於 科 學 界 常 用 的 定 量 方 法, 但 請 注 意, 目 前 並 沒 有 一 種 定 量 方 法 是 毫 無 破 綻 的 各 種 方 法 都 有 其 偵 測 極 限, 干 擾 因 素 以 及 反 應 偏 好 誤 差 等 等 問 題, 請 同 學 先 上 網 查 查 這 些 方 法 的 底 細, 在 上 課 時 也 要 注 意 聽 助 教 所 補 充 的 部 分 原 理, 從 而 了 解 在 實 驗 中 該 視 情 況 使 用 何 種 最 適 合 的 定 量 方 法 在 本 實 驗 操 作 中, 微 量 分 注 器 (pipetman) 的 操 作 能 力 是 決 定 勝 負 的 關 鍵, 更 是 造 成 實 驗 誤 差 的 重 要 因 素, 在 實 際 操 作 實 驗 前 請 複 習 相 關 操 作 的 注 意 事 項 此 外, 本 實 驗 也 將 使 用 分 光 光 度 計 (Spectrophotometer), 以 及 原 理 類 似 但 較 進 階 的 ELISA reader 這 兩 種 生 化 實 驗 常 用 的 儀 器, 請 仔 細 學 習 如 何 正 確 使 用 這 些 儀 器 並 充 分 了 解 儀 器 的 相 關 原 理 實 驗 原 理 假 設 你 的 實 驗 目 的 是 從 一 盤 動 物 細 胞 中 取 得 想 要 進 行 研 究 的 蛋 白 質, 首 先 你 必 須 將 細 胞 打 破, 讓 蛋 白 質 跑 出 來 但 是 在 得 到 我 們 的 目 標 蛋 白 質 之 前, 我 們 會 需 要 加 入 各 種 的 詴 劑, 幫 助 我 們 清 除 一 些 樣 品 中 非 蛋 白 質 的 異 物, 像 是 脂 質 醣 類 和 核 酸 等 分 子, 這 些 詴 劑 通 常 包 括 以 下 四 類 : 1. 界 面 活 性 劑 (detergent): 協 助 將 蛋 白 質 與 脂 質 分 開, 利 於 膜 蛋 白 的 分 離 如 : 2. 還 原 劑 (reductants): 可 以 防 止 蛋 白 質 被 氧 化 或 用 於 還 原 蛋 白 質 雙 硫 鍵 如 : 3. 變 性 劑 (denaturing agents): 運 用 離 子 強 度 和 極 端 的 ph 值, 阻 礙 蛋 白 質 二 級 8

13 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 與 三 級 結 構 的 產 生, 可 以 防 止 蛋 白 質 之 間 的 交 互 作 用 (protein-protein interaction) 如 : 4. 酵 素 (enzymes): 用 以 去 除 核 酸 醣 類 或 脂 質 並 同 時 防 止 蛋 白 質 在 萃 取 過 程 被 水 解 如 : 雖 然 經 過 了 上 述 詴 劑 的 處 理 之 後, 可 以 留 下 比 較 純 的 蛋 白 質, 但 是 這 些 詴 劑 也 常 會 干 擾 到 蛋 白 質 的 定 量 另 一 方 面, 這 些 純 化 出 的 蛋 白 質 濃 度 其 實 很 低, 即 使 把 水 份 抽 乾 而 剩 下 粉 末, 我 們 也 無 法 像 秤 豬 肉 般, 以 幾 斤 幾 兩 來 定 量 所 以 生 化 學 家 們 發 明 了 很 多 種 方 法 來 解 決 蛋 白 質 定 量 的 問 題 但 即 使 如 此, 到 目 前 為 止 沒 有 一 種 方 法 會 是 十 全 十 美 的, 所 以 在 面 對 不 同 狀 況 之 下 的 蛋 白 質 樣 品, 我 們 要 善 用 每 種 定 量 法 的 優 點 與 避 免 其 缺 點 所 以 接 下 來 要 介 紹 三 種 目 前 科 學 界 最 常 用 的 蛋 白 質 定 量 方 法, 不 過 它 們 的 優 缺 點 一 定 要 特 別 注 意 喔! (A) Bradford assay 在 酸 性 的 環 境 下, 染 劑 會 與 蛋 白 質 中 的 鹼 性 氨 基 酸 和 芳 香 族 氨 基 酸 上 的 殘 基 相 結 合, 此 時, 最 大 的 吸 收 峰 位 置, 會 由 465 nm 變 為 595 nm, 溶 液 的 顏 色 也 由 棕 色 變 為 藍 色, 因 此 樣 品 的 595 nm 吸 收 會 與 樣 品 中 的 蛋 白 質 含 量 成 正 比, 藉 此 可 以 偵 測 蛋 白 質 含 量 優 點 : 較 不 受 K + Na + Mg 2+ 等 離 子 Tris 緩 衝 液 糖 甘 油 巰 基 乙 醇 EDTA 干 擾 缺 點 : 9

14 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 1. 各 種 蛋 白 質 中 的 鹼 性 氨 基 酸 和 芳 香 族 氨 基 酸 的 含 量 不 同, 因 此 不 同 蛋 白 質 在 測 定 時 可 能 產 生 偏 差 2. 易 受 以 下 詴 劑 干 擾 : (B) Bicinchoninic Acid (BCA) Assays 在 鹼 性 的 環 境 下, 蛋 白 質 與 二 價 離 子 先 反 應 生 成 雙 縮 脲 錯 合 物, 然 後 這 些 二 價 離 子 再 被 蛋 白 質 中 的 芳 香 族 氨 基 酸 還 原 成 一 價 的 離 子 每 一 個 被 還 原 的 離 子 會 進 一 步 與 兩 分 子 的 Bicinchoninic Acid 形 成 紫 色 錯 合 物, 而 在 波 長 562 nm 出 現 最 大 的 吸 收 峯, 我 們 可 以 由 樣 品 的 562 nm 吸 光 質 推 算 蛋 白 質 含 量 優 點 : 快 速 形 成 的 複 合 物 穩 定 且 不 受 detergent 的 影 響 缺 點 : 1. 各 種 蛋 白 質 所 帶 有 的 芳 香 族 胺 基 酸 含 量 不 同, 因 此 也 影 響 到 每 種 蛋 白 質 的 呈 色 量 2. 易 受 以 下 詴 劑 干 擾 : (C) UV Spectrophotometric Assay 蛋 白 質 中 的 和 藉 由 苯 環 的 共 振 性, 會 分 別 吸 收 275 nm 和 280 nm 的 紫 外 光 能 量 而 在 分 光 光 度 計 產 生 吸 收 訊 號 利 用 訊 號 的 強 度 可 以 用 來 偵 測 樣 品 中 的 蛋 白 質 含 量 10

15 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 優 點 : 快 速 且 偵 測 後 之 蛋 白 質 可 完 全 回 收 使 用 缺 點 : 每 種 蛋 白 質 和 的 量 有 差 異 之 外, 在 天 然 的 物 質 中 亦 存 在 有 許 能 於 280 nm 吸 光 的 化 合 物 舉 例 來 說, 像 是 核 酸, 除 了 在 260 nm 有 最 大 的 吸 收 峰 外, 在 280 nm 亦 有 相 當 大 的 吸 光 (D) 光 度 計 之 簡 介 1. 光 度 計 之 光 源 主 要 是 作 為 吸 光 度 測 量 用, 可 由 高 壓 氫 ( 氘 ) 氣 燈 提 供 波 長 200 到 340 nm 的 紫 外 光, 或 由 鹵 素 燈 提 供 340 nm 到 800 nm 的 可 見 光 2. 比 色 管 (Cuvettes) 比 色 管 依 材 質 不 同 而 有 不 同 的 適 應 範 圍, 其 中 玻 璃 比 色 管 最 便 宜, 但 由 於 玻 璃 本 身 就 會 對 紫 外 光 產 生 吸 收, 所 以 只 適 用 於 波 長 340 nm 以 上 的 實 驗 實 用 至 於 使 用 Quartz silica 或 fused silica 等 石 英 等 級 的 比 色 管 則 可 用 於 波 長 200 到 800 nm, 從 紫 外 光 到 可 見 光 都 可 適 用 此 外, 市 面 上 也 有 許 多 拋 棄 式 比 色 管, 其 中 polymethacrylate 適 用 280~800 nm,polystyrene 適 用 350~800 nm 3. 光 度 計 的 定 量 原 理 : 分 光 光 度 計 最 常 用 來 測 量 樣 品 的 透 光 度 及 吸 光 度 當 光 通 過 物 質 時 的 光 學 現 象 包 括 反 射 折 射 散 射 繞 射 放 出 螢 光 或 是 吸 收 等 等 而 吸 收 的 現 象 是 指 特 定 波 長 的 光 能 量 可 以 被 物 質 內 部 的 電 子 利 用, 因 此 光 穿 透 後 的 能 量 強 度 將 隨 著 樣 品 內 物 質 的 濃 度 增 加 而 減 弱 而 分 光 光 度 計 的 儀 器 是 設 計 成 可 以 依 照 實 驗 的 需 求 改 變 入 射 光 的 波 長, 並 偵 測 入 射 光 與 射 出 光 的 能 量 差 異, 將 實 驗 數 值 以 透 光 度 或 11

16 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 是 吸 收 度 呈 現 光 度 計 定 量 的 理 論 基 礎 是 來 自 比 爾 定 律 (Lambert-Beer law), 定 義 了 透 光 度 與 物 質 吸 光 係 數 物 質 濃 度 光 線 通 過 路 徑 長 度 的 關 係 如 下 : I t /I 0 = 10 ε.c.l = t [ 公 式 1] t 表 示 溶 液 的 透 光 強 度 (transmittance), 常 以 百 分 比 表 示 (%T), 例 t x 100 =T I o 表 示 入 射 光 的 強 度 I t 表 示 穿 透 光 的 強 度 l 表 示 光 線 通 過 受 測 物 質 的 溶 液 的 路 徑 長 度 (path length), 通 常 以 比 色 管 (cuvette) 的 寬 度 代 表 c 表 示 物 質 的 濃 度 ( 常 以 莫 耳 濃 度 M 表 示 ) ε 表 示 該 物 質 的 吸 光 係 數 (absorbtion coefficient or absorptivity or extinction coefficient), 其 數 值 隨 物 質 種 類 與 光 波 長 而 異 但 測 量 物 質 濃 度 時 通 常 不 用 透 光 度 而 是 常 以 吸 光 度 表 示, 溶 液 的 吸 光 度 (absorbance, 簡 稱 A 或 abs 或 E), 又 名 吸 光 密 度 (Optical density, 簡 稱 O.D.) 就 同 一 波 長 的 單 色 光 而 言, 某 一 液 體 物 質 的 吸 光 度 與 該 液 體 物 質 的 厚 度 及 濃 度 成 正 比 關 係 式 如 下 : A = ε c l [ 公 式 2] 由 [ 公 式 1] 與 [ 公 式 2] 得 吸 光 度 與 透 光 度 關 係 為 T = I t /I o = 10 ε.c.l = 10 A A = -logt = -log(i t /I o ) = log(1/t) = O.D. 請 注 意, 因 為 A 由 比 例 (-log(i t /I o )) 推 導 而 來, 所 以 吸 光 度 不 具 單 位 此 外,ε 12

17 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 代 表 莫 耳 吸 光 係 數 (molar absorbance coefficient), 定 義 為 濃 度 1 M 的 某 純 物 質 於 特 定 溶 液 中, 對 特 定 波 長 光 線 ( 單 色 光 ) 於 1 cm 光 路 徑 下 的 吸 收, 故 其 單 位 為 M -1 cm -1, 而 不 同 的 樣 品 會 有 不 同 的 莫 耳 吸 光 係 數 4. 光 度 計 的 應 用 為 了 分 析 某 種 化 學 物 質 的 濃 度, 往 往 單 獨 或 藉 著 與 其 他 反 應 物 ( 如 染 料 ) 作 用, 形 成 吸 光 團 (chromophore), 選 擇 可 與 其 吸 光 團 相 對 應 的 特 定 波 長 之 光 線 照 射 樣 品, 然 後 測 定 其 吸 光 度, 進 而 依 照 比 爾 定 律 由 吸 光 度 和 標 準 品 濃 度 的 相 對 關 係 推 求 出 此 種 待 測 化 學 物 質 的 濃 度 在 這 裡 要 注 意 的 是, 吸 光 度 和 溶 液 濃 度 的 關 係 是 推 衍 出 來 的, 會 隨 著 受 測 物 本 身 溶 劑 染 料 與 光 波 長 的 不 同 而 異, 故 須 有 已 知 濃 度 之 標 準 物, 在 相 同 的 環 境 下 同 時 進 行 測 量 以 做 為 參 考 實 驗 器 材 96 well plate pipetman Ultrospec 2100 分 光 光 度 計 酵 素 免 疫 分 析 儀 實 驗 藥 品 Bradford assay reagent (Bio-Rad) Bicinchoninic Acid (BCA) Assays reagent A reagent B 牛 血 清 白 蛋 白 標 準 液 還 原 劑 2-ME 1 M 13

18 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 SDS PBS 未 知 濃 度 蛋 白 質 樣 品 實 驗 步 驟 (A) 以 Bradford 法 進 行 蛋 白 質 定 量 (a) 序 列 稀 釋 標 準 蛋 白 質 樣 品 1. 助 教 發 給 每 組 一 管 標 準 蛋 白 質 樣 品 為 標 準 品 1 號 ( 以 下 簡 稱 S1), 其 蛋 白 質 濃 度 為 1.5 mg/ml 2. 準 備 5 支 新 的 微 量 離 心 管, 分 別 標 上 S2 S3 S4 S5 S6 並 加 入 15 μl 的 H 2 O 到 每 個 離 心 管 的 管 底 3. 由 S1 取 出 15 μl 樣 品, 加 入 S2, 並 用 pipet 吸 吐 約 十 次 由 S2 取 出 15 μl 樣 品, 加 入 S3, 同 樣 用 pipet 吸 吐 約 十 次 以 此 連 續 稀 釋 的 方 式, 分 別 準 備 好 S4 S5 S6 的 標 準 樣 品 4. 將 S1~S6 的 蛋 白 質 標 準 品 各 吸 取 10 μl 分 別 加 入 標 示 好 s1~s6 新 的 微 量 離 心 管 中 (b) 準 備 蛋 白 質 測 詴 樣 品 1. 準 備 五 個 新 的 微 量 離 心 管, 將 之 分 別 標 示 E0~E4, 然 後 依 照 以 下 表 格 在 各 離 心 管 內 添 加 相 關 詴 藥, 混 合 均 勻 備 用 樣 品 編 號 E0 E1 E2 E3 E4 詴 藥 成 份 1 % SDS

19 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 16 mm 2-ME BSA S H 2 O 再 準 備 四 個 新 的 微 量 離 心 管, 將 之 分 別 標 示 e0~e4, 然 後 分 別 對 應 E0~E 各 管, 取 10 μl 樣 品 到 e0~e4 中 (c) 蛋 白 質 呈 色 反 應 在 s1~s6 與 e0~e4 的 每 一 個 微 量 離 心 管 中 加 入 200 μl 的 Bradford 詴 劑 另 外 準 備 一 隻 新 的 微 量 離 心 管, 將 之 標 示 為 B, 並 單 獨 添 加 10μL H 2 O 與 200 μl 的 Bradford 詴 劑, 我 們 稱 此 樣 品 為 空 白 對 照 組 (Blank) 將 以 上 各 管 使 用 vortex 將 管 內 的 溶 液 均 勻 混 合, 然 後 在 室 溫 下 至 放 置 10 分 鐘 (d) 偵 測 吸 光 值 將 每 一 個 微 量 離 心 管 內 的 所 有 樣 品 轉 移 至 96 孔 盤, 依 照 助 教 的 指 示 加 入 指 定 的 位 置, 然 後 由 助 教 送 至 ELISA reader 中 偵 測 595 nm 的 吸 光 值 (B) 以 Bicinchoninic Acid (BCA) 法 進 行 蛋 白 質 定 量 1. 助 教 發 給 每 組 一 管 標 準 蛋 白 質 樣 品 為 標 準 品 1 號 ( 以 下 簡 稱 S1), 其 蛋 白 質 濃 度 為 3 mg/ml 2. 準 備 5 支 新 的 微 量 離 心 管, 分 別 標 上 S2 S3 S4 S5 S6 並 加 入 30 μl 的 H 2 O 到 每 個 離 心 管 的 管 底 3. 由 S1 取 出 15 μl 樣 品, 加 入 S2, 並 用 pipet 吸 吐 約 十 次 由 S2 取 出 15 μl 樣 品, 加 入 S3, 同 樣 用 pipet 吸 吐 約 十 次 以 此 連 續 稀 釋 的 方 式, 分 別 準 備 好 S4 S5 S6 的 標 準 樣 品 4. 將 S1~S6 的 蛋 白 質 標 準 品 各 吸 取 20 μl 分 別 加 入 標 示 好 s1~s6 新 的 微 量 15

20 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 離 心 管 中 (b) 準 備 蛋 白 質 測 詴 樣 品 1. 準 備 五 個 新 的 微 量 離 心 管, 將 之 分 別 標 示 E0~E4, 然 後 依 照 以 下 表 格 在 各 離 心 管 內 添 加 相 關 詴 藥, 混 合 均 勻 備 用 樣 品 編 號 E0 E1 E2 E3 E4 詴 藥 成 份 1 % SDS mm 2-ME BSA S H 2 O (c) 蛋 白 質 呈 色 反 應 在 s1~s6 與 E0~E4 的 每 一 個 微 量 離 心 管 中 加 入 200 μl 的 BCA 詴 劑 另 外 準 備 一 隻 新 的 微 量 離 心 管, 將 之 標 示 為 B, 並 單 獨 添 加 20μL H 2 O 與 200 μl 的 BCA 詴 劑, 我 們 稱 此 樣 品 為 空 白 對 照 組 (Blank) 將 以 上 各 管 使 用 vortex 將 管 內 的 溶 液 均 勻 混 合, 然 後 在 37 C 下 放 置 30 分 鐘 (d) 偵 測 吸 光 值 將 每 一 個 微 量 離 心 管 內 的 所 有 樣 品 轉 移 至 96 孔 盤, 依 照 助 教 的 指 示 加 入 指 定 的 位 置, 然 後 由 助 教 送 至 ELISA reader 中 偵 測 562 nm 的 吸 光 值 (C) 以 UV Spectrophotometric 法 進 行 蛋 白 質 定 量 1. 助 教 發 給 每 組 一 管 標 準 蛋 白 質 樣 品 為 標 準 品 1 號 ( 以 下 簡 稱 S1), 其 蛋 白 質 16

21 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 濃 度 為 3 mg/ml 2. 配 一 管 含 有 濃 度 1μg/mL 的 蛋 白 標 準 品 (S2), 總 體 積 為 0.85mL 吸 取 當 中 的 0.8 ml 到 cuvette 中 How to do? 3. 另 外 準 備 一 隻 新 的 微 量 離 心 管, 將 之 標 示 為 B, 並 單 獨 添 加 0.8 ml H 2 O, 我 們 稱 此 樣 品 為 空 白 對 照 組 (Blank) (d) 偵 測 吸 光 值 依 照 助 教 的 指 示 使 用 Ultrospec 2100 分 光 光 度 計 偵 測 280 nm 的 吸 光 值 (e) 請 記 錄 下 機 器 使 用 流 程 參 考 資 料 : 1. < 生 化 實 驗 / 基 礎 操 作 原 理 與 方 法, 第 三 版 > 偉 明 圖 書 2. Bio-Rad Bradford assay kit protocol 3. Thermo BCA assay kit protocol 4. 台 大 生 化 科 技 研 究 所, 生 化 實 驗 手 冊 17

22 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 一 實 驗 紀 錄 及 結 果 1. Bradford assay (a) 蛋 白 標 準 品 樣 品 編 號 s1 s2 s3 s4 s5 s6 BSA(mg/ml) OD595 (b) 蛋 白 標 準 品 曲 線 圖 : 全 部 的 點 : 濃 度 極 限 內 的 點 : R 2 = R 2 = (c) 蛋 白 質 測 詴 樣 品 樣 品 編 號 e0 e1 e2 e3 e4 SDS ( 最 終 濃 度 ) 2-ME ( 最 終 濃 度 ) 18

23 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 BSA(mg/ml) ( 最 終 濃 度 ) OD Bicinchoninic Acid (BCA) Assays (a) 蛋 白 標 準 品 樣 品 編 號 s1 s2 s3 s4 s5 s6 BSA(mg/ml) OD562 (b) 蛋 白 標 準 品 曲 線 圖 : 全 部 的 點 : 濃 度 極 限 內 的 點 : R 2 = R 2 = (c) 蛋 白 質 測 詴 樣 品 19

24 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 樣 品 編 號 E0 E1 E2 E3 E4 SDS ( 最 終 濃 度 ) 2-ME ( 最 終 濃 度 ) BSA(mg/ml) ( 最 終 濃 度 ) OD UV Spectrophotometric (a) 蛋 白 標 準 品 樣 品 編 號 S2 BSA(μg/ml) OD280 二 自 我 學 習 評 量 上 完 課 後 你 是 否 能 回 答 下 列 問 題 : 1. Bradford ford BCA 與 UV 光 定 量 的 原 理 分 別 為 何? 2. 當 蛋 白 質 中 有 0.5% SDS 時, 你 會 選 擇 何 種 定 量 法? 3. 本 次 的 實 驗 的 樣 品 稀 釋 是 1/3 稀 釋, 若 改 成 1/4 稀 釋, 在 每 管 樣 品 最 後 含 量 為 100 μl 時, 你 會 如 何 設 計 實 驗? 4. SDS 是 屬 於 還 原 劑 還 是 清 潔 劑? 哪 種 蛋 白 定 量 方 式 較 易 受 SDS 影 響? 5. 利 用 UV Spectrophotometric 時, 你 是 否 注 意 到 其 中 的 一 個 數 值 : OD 260 /OD 280 呢? 你 能 說 明 這 個 數 值 的 意 義 嗎? 20

25 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 三 問 題 與 討 論 1. Bradford assay 與 Bicinchoninic Acid (BCA) Assays 的 偵 測 極 限 分 別 為 何? 2. Bicinchoninic Acid (BCA) Assays 所 用 到 的 reagent A 和 reagent B 主 要 會 含 有 哪 些 物 質? 3. 透 過 這 次 實 驗, 你 學 到 了 蛋 白 質 的 定 量 方 法 那 你 知 道 脂 質 與 糖 類 要 如 何 定 量 嗎? 4. 前 陣 子 紅 極 一 時 的 毒 奶 粉 事 件 ( 三 聚 氰 胺 ), 奸 商 究 竟 用 了 什 麼 手 法, 影 響 了 蛋 白 質 濃 度 的 定 量? 21

26 實 驗 一 蛋 白 質 定 量 22

27 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 課 前 提 示 我 要 活 下 去!, 所 以 我 們 一 定 需 要 營 養 素 三 劍 客 之 一 的 蛋 白 質 來 關 照 蛋 白 質 是 由 胺 基 酸 (Amino Acid) 所 組 成, 是 構 成 人 體 很 重 要 的 成 份 從 飲 食 得 到 的 蛋 白 質 在 吸 收 之 後, 經 過 怎 麼 背 也 背 不 熟 的 生 化 機 轉 後, 可 以 轉 化 成 為 構 成 我 們 身 體 的 皮 膚 肌 肉 毛 髮 臟 器 等 的 主 要 結 構, 同 時, 也 參 與 在 構 成 酵 素 免 疫 抗 體 等 生 理 調 節 分 子 除 了 是 維 持 生 命 所 不 可 缺 少 的 營 養 素 外, 甚 至 在 危 急 時 可 以 充 當 緊 急 的 能 量 來 源 在 生 長 發 育 中 的 胎 兒 幼 兒 及 青 少 年, 由 於 身 體 快 速 成 長, 需 要 大 量 的 蛋 白 質, 如 果 蛋 白 質 缺 乏 則 會 影 響 正 常 的 生 長 發 育 ; 成 年 人 蛋 白 質 不 足 時, 會 發 生 抵 抗 力 下 降 易 疲 勞 工 作 效 率 低 提 早 衰 退 等 問 題 ; 老 年 人 缺 乏 蛋 白 質 則 易 出 現 貧 血, 易 感 染 心 臟 受 損 等 問 題 蛋 白 質 既 然 如 此 重 要, 如 果 我 們 能 由 體 外 大 量 表 現 出 蛋 白 質, 並 且 將 這 些 蛋 白 質 商 品 化, 提 供 給 有 需 求 的 大 眾, 那 我 們 可 真 是 錢 途 無 量 呀! 換 句 話 說, 你 在 上 完 接 下 來 的 實 驗 課 後, 你 就 是 生 化 界 的 比 爾 蓋 茲 了! 商 品 化 的 目 標 有 點 遠 大, 那 我 再 舉 幾 個 更 切 實 際 的 誘 因 給 你 聽 聽 : 你 知 道 市 面 上 買 得 到 的 蛋 白 質 價 格 是 多 少 嗎? 去 問 問 實 驗 室 的 學 長 姐 吧! 另 一 方 面, 有 許 多 實 驗 室 要 研 究 的 蛋 白, 其 實 在 市 面 上 根 本 買 不 到 喔! 也 許 你 會 想 : 既 然 沒 有 賣 就 表 示 沒 有 商 機 嘛!, 那 你 就 大 錯 特 錯 囉! 當 你 證 明 你 自 己 所 製 備 的 蛋 白 具 有 獨 特 的 生 理 功 能, 這 根 本 就 是 商 機 無 限 了! 你 看 看, 學 會 重 組 蛋 白 的 表 達 有 多 麼 重 要! 那 人 類 又 為 何 會 想 出 體 外 製 備 重 組 蛋 白 的 點 子 呢? 身 為 特 務 的 蛋 白 質, 掌 管 著 不 同 的 化 學 反 應, 但 特 務 也 有 受 傷 老 化 退 休 的 時 候, 如 果 人 體 的 某 個 蛋 白 發 生 問 題, 可 以 藉 由 補 充 年 輕 的 特 務, 來 接 管 部 份 的 23

28 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 功 能, 而 且 不 會 直 接 影 響 到 人 體 的 其 他 反 應 舉 個 最 常 見 的 例 子, 當 胰 島 素 表 現 不 足 時 會 引 起 糖 尿 病, 為 了 控 制 醣 類 的 代 謝, 這 些 患 者 每 天 都 要 額 外 增 加 胰 島 素 的 攝 取 這 時 候 問 題 就 來 了, 你 知 道 古 早 時 代, 我 們 是 如 何 取 得 大 量 胰 島 素 的 嗎? 在 重 組 蛋 白 技 術 發 明 前, 主 要 是 從 豬 的 胰 臟 蒐 集 ( 素 食 者 與 回 教 徒 怎 麼 辦 呢?), 但 這 個 方 法 既 昂 貴 又 費 時, 聰 明 的 科 學 家 為 了 不 再 讓 無 辜 的 動 物 莫 名 其 妙 的 被 犧 牲, 同 時, 也 想 要 提 高 蛋 白 質 的 生 產 效 率, 於 是 一 步 步 的 建 立 出 了 重 組 蛋 白 的 表 現 系 統 藉 由 基 因 選 殖 的 技 術, 科 學 家 可 以 把 人 類 的 胰 島 素 基 因 放 進 生 物 裡, 藉 由 大 量 複 製 的 過 程, 再 從 這 些 生 物 工 廠 提 取 胰 島 素 蛋 白 體 外 製 備 的 胰 島 素 不 但 比 胰 臟 細 胞 的 純 化 容 易 得 多, 由 於 不 是 由 不 同 物 種 ( 豬 ) 來 的 胰 島 素, 就 可 避 免 掉 部 份 會 對 豬 胰 島 素 過 敏 的 病 人 產 生 發 炎 反 應 的 疑 慮 說 了 那 麼 多, 你 現 在 準 備 好 學 習 如 何 在 體 外 大 量 製 造 出 重 組 蛋 白 了 嗎? 實 驗 開 始 前, 請 先 找 出 下 列 問 題 的 答 案 : 1. 為 何 甘 油 能 當 作 抗 凍 劑 呢? 2. 抗 凍 劑 保 護 細 胞 的 原 理 為 何 呢? 3. 保 存 細 胞 的 抗 凍 劑 可 以 用 甘 油 嗎? 還 有 哪 些 抗 凍 劑 的 選 擇 呢? 4. 細 菌 培 養 愈 久 細 菌 就 愈 多 也 愈 好 嗎? 理 由 是 什 麼 呢? 5. 較 具 有 殺 菌 效 果 的 酒 精, 濃 度 約 為 多 少 最 理 想 呢? 6. 酒 精 殺 菌 的 原 理 為 何? 7. 準 備 凍 起 來 的 細 菌, 保 存 在 -20 或 -80 有 差 別 嗎? 8. 培 養 液 中 通 常 含 有 抗 生 素, 原 因 為 何? 9. 培 養 液 中 的 抗 生 素, 為 何 無 法 通 殺 細 菌? 10. 從 -80 拿 出 來 的 冷 凍 菌, 要 等 到 溶 化 後 才 能 勾 菌 培 養 嗎? 11. 細 胞 冷 凍 的 速 度 要 慢 慢 來, 所 以 解 凍 時 也 是 慢 慢 來 嗎? 12. 裝 在 離 心 管 的 培 養 液 愈 多 愈 好 嗎? 13. 在 培 養 箱 的 離 心 管 直 直 放 比 較 理 想, 還 是 放 斜 斜 呢? 14. 轉 成 大 量 培 養 後, 要 等 到 菌 液 的 OD 600 吸 光 值 介 於 0.6~0.8 的 原 因 為 何 呢? 15. 為 何 是 偵 測 OD 600 呢? 16. 加 入 IPTG 之 後 細 菌 還 會 快 速 生 長 嗎? 17. 打 破 細 胞 壁 的 方 法 有 哪 些 呢? 24

29 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 原 理 大 量 的 蛋 白 質 製 備 就 像 影 印 一 般, 首 先 要 準 備 好 我 們 所 欲 複 製 的 文 件 ( 重 組 蛋 白 的 基 因 片 段 ), 再 來 就 是 要 選 一 台 功 能 良 好 的 影 印 機 ( 蛋 白 質 表 現 系 統 ), 才 能 大 量 且 穩 定 的 表 現 我 們 的 重 組 蛋 白 (A) 文 件 的 準 備 : 重 組 蛋 白 基 因 的 選 殖 蛋 白 質 是 由 DNA 來 的, 所 以 首 先 要 先 將 有 興 趣 的 DNA 片 段 接 合 到 表 現 載 體 上, 進 一 步 的, 才 能 利 用 表 現 系 統 大 量 表 達 所 要 的 蛋 白 質 何 謂 表 現 載 體 (Expression plasmid), 簡 單 來 說, 它 是 一 種 環 狀 且 經 過 人 工 修 飾 的 DNA, 其 上 具 有 不 同 的 啟 動 子 (promoter), 這 些 載 體 在 進 入 不 同 的 物 種 後, 可 以 利 用 這 些 生 物 ( 細 菌 酵 母 菌 等 ), 先 轉 錄 (transcription) 出 我 們 所 感 興 趣 的 mrna, 再 藉 著 轉 譯 (translation), 最 後 製 造 出 我 們 所 要 的 目 標 蛋 白, 這 就 是 重 組 蛋 白 請 更 詳 細 解 釋 載 體 : 這 些 重 組 蛋 白 藉 由 各 種 方 式 純 化 出 來 後, 用 途 多 多 : 可 以 用 來 研 究 其 蛋 白 質 的 立 體 結 構, 或 是 打 入 動 物 體 內 來 產 生 抗 體, 再 藉 由 純 化 血 清 來 得 到 抗 體, 最 後 可 以 作 為 醫 療 用 途 或 實 驗 用 途 等 (B) 機 型 的 選 擇 : 蛋 白 質 表 現 系 統 1. 大 腸 桿 菌 系 統 (Escherichia coli) 25

30 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 大 腸 桿 菌 是 目 前 使 用 最 廣 泛 的 系 統, 具 有 生 長 快 速 產 量 高 及 低 成 本 的 優 點, 但 由 於 是 原 核 生 物 (prokaryote), 無 法 進 行 醣 化 作 用 (glycosylation) 等 轉 譯 後 修 飾 的 動 作, 而 且 常 常 會 形 成 不 溶 性 的 包 涵 體 包 涵 體? 包 涵 體 是 蛋 白 質 的 聚 焦 體 (protein aggregate), 以 顆 粒 狀 存 在 於 細 胞 質 (cytoplasm), 而 且 蛋 白 質 本 身 不 具 生 物 活 性, 或 只 有 很 低 的 生 物 活 性 因 此 醱 酵 生 產 之 後, 必 須 要 在 回 收 時 進 行 蛋 白 質 的 再 折 疊 (refolding), 恢 復 其 三 度 空 間 結 構, 才 能 具 有 生 物 活 性 2. 酵 母 菌 系 統 (Saccharomyces cerevisiae) 酵 母 菌 為 真 核 生 物 (eukaryote), 同 時 具 有 大 腸 桿 菌 的 優 點, 目 前 大 規 模 的 醱 酵 技 術 已 經 建 立 完 成 優 點 是 其 分 泌 系 統 較 大 腸 桿 菌 為 完 備 ; 具 有 部 分 醣 化 的 功 能 (N-linked mannose glycosylation 及 O-linked glycosylation), 但 不 具 有 N-linked complex glycosylation 功 能, 包 涵 體 較 不 易 產 生, 使 用 的 廣 泛 性 僅 次 於 大 腸 桿 菌 系 統 但 相 較 於 大 腸 桿 菌 系 統, 酵 母 菌 相 對 的 產 量 比 較 低, 生 長 也 較 慢, 而 且 仍 然 無 法 完 成 complex glycosylation 及 完 整 的 轉 譯 後 修 飾 3. 昆 蟲 細 胞 系 統 (Insect Cell System) 此 一 系 統 為 近 年 來 新 興 的 技 術, 其 產 量 與 酵 母 菌 系 統 類 似, 昆 蟲 細 胞 可 以 利 用 懸 浮 培 養 (suspension culture), 因 此 也 可 以 使 用 醱 酵 槽 大 量 培 養, 甚 少 產 生 包 涵 體 其 缺 點 為 不 能 做 complex glycosylation, 且 醣 基 化 的 組 成 與 哺 乳 動 物 細 胞 培 養 所 製 備 的 不 盡 相 同, 此 外, 由 於 是 利 用 病 毒 感 染, 因 此 不 能 進 行 長 時 間 連 續 培 養 4. 哺 乳 動 物 細 胞 系 統 (Mammalian Cell System) 主 要 是 利 用 人 類 的 細 胞 株 所 建 立 的 表 現 系 統, 由 於 是 人 類 的 細 胞, 優 點 當 然 是 它 能 進 行 所 有 複 雜 的 醣 化 作 用 及 完 整 的 轉 譯 後 修 飾, 且 製 造 出 來 的 蛋 白 質 不 會 形 成 26

31 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 包 涵 體, 與 天 然 蛋 白 質 的 特 性 最 為 相 似 ( 具 有 生 物 活 性 ) 同 時, 大 部 分 蛋 白 質 會 分 泌 到 培 養 液 中, 容 易 回 收 其 缺 點 為 開 發 時 間 較 長 產 量 不 高 培 養 基 較 昂 貴 大 規 模 細 胞 培 養 技 術 較 為 困 難 (C) 影 印 開 始 : 重 組 蛋 白 之 誘 導 本 次 實 驗 選 擇 了 大 腸 桿 菌 表 現 系 統 大 腸 桿 菌 在 送 入 我 們 的 載 體 (plasmid) 後, 就 會 乖 乖 的 複 製 出 我 們 的 蛋 白 嗎? 古 語 說 : 有 錢 能 使 鬼 推 磨, 聰 明 的 科 學 家, 當 然 也 想 出 一 套 方 法, 讓 大 腸 桿 菌 心 甘 情 願 的 穩 定 且 大 量 表 現 出 我 們 的 蛋 白 其 中, 最 廣 為 人 知 的 方 法 之 一 就 是 乳 糖 操 作 組 你 能 解 釋 圖 中 乳 糖 (lactose) 如 何 調 控 基 因 表 現 嗎? 27

32 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 為 了 適 應 環 境 的 快 速 變 動, 基 因 的 啟 動 與 關 閉, 須 要 精 巧 的 控 制, 以 免 成 本 的 浪 費 而 控 制 基 因 表 現 的 方 式 主 要 有 三 種 : 抑 制 作 用 減 弱 作 用 活 化 作 用 乳 糖 操 作 組 是 抑 制 作 用 的 典 型 例 子 抑 制 物 專 門 和 目 標 基 因 上 游 的 操 作 子 結 合 只 要 抑 制 物 (repressor) 擋 在 DNA 上 面,RNA polymerase 就 無 法 轉 錄 出 mrna 對 細 菌 來 說, 環 境 中 如 果 沒 有 乳 糖 分 子, 又 何 必 要 浪 費 能 量, 製 造 分 解 乳 糖 的 酵 素 呢? 因 此 等 到 環 境 中 缺 乏 葡 萄 糖 而 又 出 現 了 乳 糖 分 子 時 乳 糖 會 進 入 細 胞 與 抑 制 物 結 合, 此 時 抑 制 物 無 法 再 與 DNA 結 合, 於 是 解 除 了 轉 錄 的 封 鎖 本 實 驗 是 以 Escherichia coli BL21 的 E. coli Rosetta (DE3) plyss 作 為 宿 主 細 胞 ( 影 印 機 ) 此 宿 主 細 胞 的 genome 具 有 lac I gene 與 潛 溶 性 的 噬 菌 體 λde3,lac I gene 可 以 表 現 產 生 lac repressor λde3 的 核 苷 酸 序 列 則 包 含 lac promoter 與 可 以 做 出 T7 RNA polymerase 的 T7 gene 1, 細 菌 本 身 的 plyss 則 具 有 T7 lysozyme 的 T7 lysozyme gene λde3 所 表 現 出 來 的 T7 RNA polymerase, 會 受 到 plyss 所 產 生 的 T7 lysozyme 抑 制 在 宿 主 細 胞 中, 除 了 本 身 即 表 現 的 plyss 質 體 外, 我 們 也 利 用 轉 形 (transformation) 的 方 式, 將 pet-20b(+) 質 體 送 到 了 細 菌 體 內 pet-20b(+) 除 了 28

33 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 帶 有 我 們 外 插 上 去 的 DNA 序 列 外 ( 我 們 欲 表 現 的 蛋 白 質 基 因 序 列 ), 本 身 還 具 有 lac I gene 與 plyss 不 同 源 的 Ori Multiple cloning site (MCS) 以 及 Selection marker Ori: Multiple cloning site (MCS): Selection marker: 在 無 IPTG 存 在 的 情 況 下,lac repressor 與 lac promoter 的 lac operator 結 合, 此 時 E. coli RNA polymerase 與 lac promoter 的 結 合 能 力 大 幅 降 低, 使 T7 gene 1 表 現 出 T7 RNA polymerase 的 產 量 少 但 由 於 T7 RNA polymerase 仍 有 基 本 表 現 量, 使 得 重 組 蛋 白 還 是 可 以 有 小 量 的 合 成 這 些 對 細 菌 來 說 是 外 來 的 蛋 白 質, 可 能 會 影 響 細 菌 的 增 殖 或 導 致 重 組 質 體 的 不 穩 定, 故 藉 由 plyss 表 現 少 量 的 T7 lysozyme 可 以 抑 制 T7 RNA polymerase 的 活 性, 避 免 在 細 菌 增 生 的 過 程 中 產 生 不 良 的 影 響 ( 我 們 要 先 大 量 增 殖 細 菌, 才 有 在 短 時 間 內 複 製 出 大 量 重 組 蛋 白 的 本 錢 ) 此 外,lac repressor 也 會 與 pet-20b (+) 上 的 T7 promoter 的 lac O 結 合, 使 少 量 但 仍 有 活 性 的 T7 RNA polymerase 無 法 轉 錄 出 下 游 重 組 蛋 白 的 基 因 在 加 入 IPTG 誘 導 後 時,IPTG 會 與 lac repressor 結 合, 使 lac repressor 不 能 與 lac operator 結 合,λDE3 上 T7 gene 1 開 始 轉 譯 出 RNA polymerase, 並 且 誘 導 更 大 量 的 T7 RNA polymerase 產 生, 此 時 原 本 少 量 表 現 的 T7 lysozyme 對 大 量 產 生 的 T7 RNA polymerase 的 活 性 無 法 產 生 顯 著 的 抑 制 作 用, 使 T7 RNA polymerase 能 成 功 轉 錄 出 目 標 蛋 白 的 基 因, 最 後 轉 譯 出 重 組 蛋 白 詳 細 作 用 機 制 與 pet-20b (+) 的 圖 譜 請 參 考 附 錄 29

34 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 我 們 這 次 要 表 現 的 重 組 蛋 白, 基 因 序 列 的 來 源 是 bacillus licheniformis 的 幾 丁 質 酶, 在 經 過 碳 端 定 位 修 剪 後 的 分 子 蛋 白 分 子 量 約 為 47 kd 實 驗 器 材 Pipetman Tip 15 ml 養 菌 管 50 ml 離 心 管 250 ml 錐 形 瓶 1.5 ml sterile eppendorf 恆 溫 培 養 箱 桌 上 型 離 心 機 實 驗 藥 品 TB 培 養 液 Ampicillin Chloramphenical IPTG B-PER (Bacterial Protein Extration Reagnet, Pierce, USA) 實 驗 步 驟 (A) 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 1. 將 帶 有 重 組 蛋 白 基 因 質 體 的 菌 落, 培 養 於 約 3 ml TB 培 養 液 當 中, 另 外 再 加 30

35 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 入 : 抗 生 素 Ampicillin ( 最 終 濃 度 100 μg/ml ) 及 Chloramphenicol ( 最 終 濃 度 34 μg/ml ), 於 37,200 rpm 震 盪 培 養 過 夜 Ampicillin 抑 菌 的 作 用 機 制 Chloramphenicol 抑 菌 的 作 用 機 制 2. 將 培 養 過 夜 的 菌 液 全 倒 入 25 ml 新 鮮 的 TB ( 含 抗 生 素 Ampicillin 及 Chloramphenicol), 最 終 體 積 約 28 ml 37,200 rpm 震 盪 培 養 至 OD ~0.8, 約 一 小 時 為 何 要 偵 測 OD 600? 為 何 OD 600 要 在 0.6~0.8 時 才 能 加 入 IPTG 呢? 31

36 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 3. 將 IPTG ( 終 濃 度 為 0.4 mm ) 加 入 28 ml 的 菌 液 後, 於 25 下, 繼 續 培 養 約 4 小 時, 誘 導 重 組 蛋 白 質 的 表 現 4. 以 10,000 rpm 離 心 10 分 鐘, 去 除 上 清 液 而 留 下 菌 體 加 入 適 量 ( 約 100 μl ) 之 B-PER (Bacterial Protein Extration Reagnet, Pierce, USA) 打 破 菌 體, 於 25 下, 以 200 rpm 震 盪 至 菌 液 略 為 澄 清 5. 若 破 碎 之 菌 液 呈 黏 稠 狀, 則 再 加 入 適 量 (0.5 μl) Benzonase Nuclease (Novagen, USA), 在 200 rpm 下 震 盪 30 分 鐘 至 菌 液 變 為 澄 清 6. 以 10,000 rpm 離 心 10 分 鐘, 收 取 上 清 液, 此 為 粗 酵 素 液 參 考 資 料 1. J.F.Sambrook and D.W. Russell. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 rd ed, Vols 1.2. and pet System Manual,11 rd ed, 頁 周 業 仁 譯,Karl Drlica 原 著,(2003) <DNA 的 14 堂 課 > 台 北 : 天 下 遠 見 32

37 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 一 自 我 學 習 評 量 上 完 課 後 你 是 否 能 回 答 下 列 問 題 : 1. 乳 糖 操 作 組 的 運 作 原 理? 2. IPTG 是 什 麼 呢? 為 何 它 能 誘 導 蛋 白 表 現? 3. 何 謂 transformation? 與 另 一 個 專 有 名 詞 transfection 有 何 差 別? 4. Ori 的 作 用 為 何? 人 類 與 細 菌 的 Ori 數 量 有 不 同 嗎? 5. 破 碎 之 菌 液 為 何 會 呈 黏 稠 狀? 此 時 加 入 nuclease 的 用 義 為 何? 二 問 題 與 討 論 1. RNA polymerase 如 何 結 合 上 DNA? 其 與 DNA 的 複 製 有 怎 樣 的 關 係? 2. 在 原 理 中, 我 們 有 提 到 三 種 控 制 基 因 表 現 的 方 式 ( 抑 制 作 用 減 弱 作 用 活 化 作 用 ) 乳 糖 操 作 組 是 屬 於 抑 制 作 用, 那 你 能 再 舉 出 減 弱 作 用 與 活 化 作 用 的 例 子 嗎? 重 組 蛋 白 的 表 現 機 制 有 風 險 嗎? 4. 在 原 理 的 介 紹 當 中, 我 們 提 到 了 潛 溶 性 的 噬 菌 體 λ, 你 知 道 這 個 噬 菌 體 的 特 性 有 哪 些 嗎? 它 為 何 能 拿 來 進 行 基 因 工 程 呢? 5. 為 何 說 : 由 豬 所 取 得 的 胰 島 素 對 人 類 來 說 為 不 同 物 種 來 源, 而 來 自 微 生 物 表 現 而 來 的 蛋 白 卻 跟 人 類 為 同 物 種 來 源 呢? 33

38 實 驗 二 重 組 蛋 白 之 誘 導 與 粗 蛋 白 的 萃 取 34

39 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 三 重 組 蛋 白 之 純 化 課 前 提 示 為 了 完 成 我 們 重 組 蛋 白 商 品 化 的 春 秋 大 夢, 我 們 當 然 不 能 直 接 將 粗 萃 取 得 到 的 蛋 白 質 直 接 上 架, 除 了 成 份 不 明 外, 消 費 者 會 感 覺 像 是 服 用 了 大 腸 桿 菌 的 體 液 ( 因 為 粗 萃 取 的 結 果, 就 是 打 破 細 菌 ), 所 以 我 們 在 這 邊 要 教 你 如 何 在 一 堆 蛋 白 中, 進 一 步 的 得 到 我 們 所 要 的 特 殊 蛋 白, 而 這 就 是 蛋 白 純 化 我 們 既 然 要 的 是 蛋 白 質, 我 們 可 以 選 擇 在 粗 酵 素 液 中 加 入 DNase RNase 等 非 降 解 蛋 白 質 的 酵 素, 減 少 非 蛋 白 質 的 干 擾, 但 問 題 是, 細 菌 本 身 還 是 會 表 現 很 多 的 蛋 白 質, 我 們 要 如 何 從 中 取 得 我 們 真 正 想 要 的 重 組 蛋 白 呢? 純 化 蛋 白, 就 像 找 尋 走 失 的 小 孩 一 般, 我 們 先 把 老 人 大 人 阿 狗 阿 貓 等 排 除 後, 再 利 用 小 孩 身 上 所 穿 的 衣 服 鞋 子 等, 當 作 尋 人 的 特 徵 所 以 我 們 在 表 現 蛋 白 質 時, 就 讓 重 組 蛋 白 戴 了 個 帽 子, 利 用 這 個 特 殊 的 帽 子, 我 們 就 可 以 很 快 的 得 到 我 們 要 的 蛋 白, 至 於 這 個 帽 子 是 什 麼 呢? 請 你 繼 續 看 下 去 實 驗 原 理 (A) 小 量 重 組 蛋 白 之 純 化 經 過 多 年 的 改 良, 目 前 純 化 蛋 白 質 的 方 法 大 致 上 可 分 為 : 1. 鹽 溶 與 鹽 析 沉 澱 : 利 用 分 子 表 面 極 性 不 同 2. 離 子 交 換 : 利 用 分 子 靜 電 荷 不 同 3. 親 和 層 析 : 利 用 分 子 親 和 力 大 小 不 同 4. 分 子 篩 膠 體 層 析 : 利 用 分 子 量 大 小 不 同 生 物 科 技 發 展 之 初, 利 用 層 析 法 純 化 特 定 蛋 白 的 過 程, 一 般 需 要 結 合 三 四 35

40 實 驗 三 重 組 蛋 白 之 純 化 種 不 同 管 柱 的 層 析 法, 例 如 分 子 篩 離 子 交 換 疏 水 作 用 力 與 逆 相 層 析 管 柱 等 等 如 此 純 化, 最 大 的 缺 點 是 耗 時 產 量 低 且 品 質 沒 有 保 證 但 是 科 技 始 終 來 自 於 人 性, 近 年 來 隨 著 分 子 生 物 學 的 大 紅 大 紫, 利 用 一 些 特 殊 技 巧, 就 發 展 出 了 許 多 特 殊 性 的 親 和 力 層 析 管 柱 只 要 一 種 管 柱, 便 可 從 粗 酵 素 液 中 分 離 出 目 標 的 蛋 白 質 其 中, 親 和 層 析 法 的 純 化 效 果 很 好, 但 需 要 先 找 到 有 親 和 性 配 對 的 分 子, 就 像 你 要 找 到 生 命 中, 跟 你 有 很 強 吸 引 力 的 Mr. or Ms. Right 一 樣 親 和 層 析 法 的 概 念, 簡 單 來 說 : 我 們 已 知 A 與 B 兩 分 子 之 間, 有 專 一 性 的 親 和 力, 欲 由 樣 本 混 合 物 中, 將 所 含 的 B 分 子 分 離 出 來, 最 方 便 的 方 法, 是 先 把 A 固 定 在 一 固 定 相 (solid phase) 上, 當 樣 本 混 合 物 通 過 此 固 定 相 時, 其 中 的 B 分 子 即 被 A 吸 附 到 固 定 相 ( 親 和 性 ) 待 洗 去 混 合 物 中 其 它 雜 質 後, 進 一 步 破 壞 A-B 之 間 的 吸 引 力, 再 藉 由 沖 洗 即 可 得 到 B 親 和 層 析 法 是 很 有 效 的 純 化 方 法, 但 並 非 任 何 物 質 均 可 應 用 此 法, 因 為 不 一 定 能 找 到 適 合 它 的 另 一 半 ( 對 它 有 親 和 力 的 分 子 ) 因 此, 進 行 親 和 層 析 法 之 第 一 要 件, 就 是 要 進 行 比 武 招 親 ( 尋 找 與 目 標 分 子, 例 子 中 的 B, 有 親 和 力 的 分 子 A), 看 看 誰 有 資 格 成 為 理 想 ( 耐 打 耐 摔?) 的 駙 馬 列 舉 一 些 已 結 為 連 理 的 例 子 來 瞧 瞧 : 1. 酵 素 (enzyme) 和 它 的 受 質 (substrate) 2. 抗 體 (antibody) 和 抗 原 (antigen) 3. 激 素 (hormone) 和 受 體 (receptor) 4. RNA 和 其 互 補 的 DNA 欲 進 行 親 和 層 析,ligand (A) 的 選 擇 相 當 重 要, 擇 偶 ( 篩 選 ) 條 件 如 下 : 1. 專 一 性 的 結 合, 親 和 力 越 大 越 好 ( 有 空 就 要 黏 在 一 起!) 2. Ligand (A) 與 分 子 (B) 結 合 後, 在 一 定 的 條 件 下 又 能 解 離, 而 且 不 會 因 解 離 破 壞 原 本 的 生 物 活 性 ( 有 的 時 候 還 是 需 要 彼 此 冷 靜 一 下!) 36

41 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 3. Ligand 上 具 有 能 連 結 到 固 定 支 持 物 上 的 基 團, 結 合 後 不 影 響 它 與 欲 分 離 物 質 的 結 合 專 一 性 ( 知 道 另 一 半 的 藏 身 之 處 ) 而 親 和 層 析 中 與 ligand 連 接 的 支 持 物 多 為 凝 膠 (resin), 與 管 柱 中 凝 膠 結 合 的 ligand 才 能 留 在 管 柱 裡 面, 等 待 伊 人 歸 來 凝 膠 則 應 具 有 下 列 特 性 : 1. 不 溶 於 水, 但 具 有 親 水 性 2. 化 學 惰 性, 沒 有 ( 或 極 少 ) 離 子 能 交 換 這 一 類 非 專 一 性 的 結 合 3. 足 夠 的 化 學 基 團, 經 活 化 後 能 與 大 量 的 ligand 結 合 4. 均 一 的 球 狀 顆 粒 5. 具 有 多 孔 網 狀 結 構, 方 便 大 分 子 自 由 通 過 6. 物 理 及 化 學 性 質 穩 定, 能 忍 受 一 定 程 度 內 的 ph 值 離 子 濃 度 溫 度 或 介 面 活 性 劑 等 的 變 化 親 和 層 析 法 最 怕 遇 到 的 問 題, 就 是 找 不 到 與 目 標 分 子 有 親 合 性 結 合 能 力 的 ligand, 為 了 解 決 找 不 到 另 一 半 的 問 題, 現 在 遺 傳 工 程 的 技 術 可 以 在 蛋 白 質 序 列 上 加 一 個 tag ( 也 就 是 一 開 始 和 你 提 到 的 帽 子 ), 然 後 就 會 有 一 個 相 對 的 物 質 和 此 tag 有 親 和 力 可 以 結 合 目 前 最 常 用 的 tag 為 His-tag, 主 要 是 在 我 們 要 純 化 的 蛋 白 基 因 前 端 和 ( 或 ) 後 端 再 接 上 六 個 Histidine 的 序 列, 在 目 標 蛋 白 表 達 出 來 後, 蛋 白 上 即 帶 有 六 個 連 續 的 Histidine 帶 有 His-tag 的 蛋 白, 主 要 會 和 什 麼 物 質 結 合 呢?, 而 能 進 一 步 的 留 在 管 柱 當 中 本 次 實 驗, 是 要 利 用 帶 有 的 金 屬 離 子 管 柱 與 帶 有 His-tag 的 蛋 白 進 行 配 位 結 合, 使 重 組 蛋 白 質 停 留 在 管 柱 中 先 以 含 較 低 濃 度 的 (20 mm) 洗 去 非 親 和 性 結 合 的 雜 蛋 白, 最 後 再 加 入 具 較 高 濃 度 的 (150 mm), 以 競 爭 結 合 的 方 式 使 重 組 蛋 白 質 被 沖 提 出 來, 藉 以 達 到 純 化 蛋 白 質 的 目 的 37

42 實 驗 三 重 組 蛋 白 之 純 化 本 次 所 使 用 的 純 化 管 柱 為 TALON Resin TALON Resin 本 身 的 結 構 為 3D 立 體 式, 具 有 四 個 如 齒 狀 之 結 構 可 以 緊 緊 咬 住 金 屬 鈷 離 子 (Co 2+ ), 使 估 離 子 整 天 宅 在 家 裡 當 帶 有 His-Tag 的 蛋 白 回 來 時 能 彼 此 結 合, 在 需 要 分 開 時 ( 使 蛋 白 質 離 開 管 柱, 為 沖 提 純 化 的 過 程 ), 這 些 金 屬 離 子 還 能 乖 乖 待 在 家, 不 會 有 金 屬 離 子 滲 透 現 象 若 金 屬 離 子 與 管 柱 resin 的 結 合 不 夠 緊 密, 將 會 導 致 金 屬 離 子 伴 隨 著 欲 純 化 之 蛋 白 一 起 被 沖 洗 下 來, 將 會 影 響 蛋 白 質 之 純 度 功 能 及 活 性 與 鎳 離 子 (Ni 2+ ) 比 較 起 來,TALON Resin 使 用 的 鈷 離 子 與 His-tagged proteins 結 合 之 專 一 性 更 高 另 一 方 面, 不 論 在 2-ME 或 各 種 變 性 環 境 中, TALON 皆 相 當 穩 定 TALON Resin 的 3D 立 體 式 與 金 屬 鈷 離 子 (Co 2+ ) 的 結 合 方 式 實 驗 器 材 Pipetman Tip TALON spin Columns 離 心 機 微 量 離 心 管 38

43 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 藥 品 phosphate buffe Extraction/Wash buffer Elution buffe 實 驗 步 驟 (A) 小 量 重 組 蛋 白 之 純 化 小 叮 嚀 1. 純 化 管 柱 有 上 下 蓋 的 部 分, 每 次 離 心 前, 下 蓋 務 必 拆 除 2. 將 溶 液 加 入 純 化 管 柱 前, 下 蓋 務 必 先 蓋 緊 3. 離 心 後 resin 會 集 結 於 管 底 手 動 式 的 混 合 動 作, 務 必 要 讓 resin 與 溶 液 均 勻 混 合 a. 親 合 性 管 柱 純 化 請 先 取 出 5 支 微 量 離 心 管 (eppendorf), 分 別 標 示 為 F1 W1 W2 E1 E2, 並 在 每 次 完 成 液 體 收 集 後 將 離 心 管 插 在 冰 上 1. 加 入 1 ml ddh 2 O 到 TALON spin Columns, 手 動 混 合 均 勻 5 min 以 1800 rpm 離 心 2 min, 以 洗 除 殘 留 的 保 存 液 2. 加 入 1 ml 1x Equilibration buffer 到 TALON spin Columns 以 平 衡 管 柱, 手 動 混 合 均 勻 5 min 以 1800 rpm 離 心 2 min 此 步 驟 重 覆 2 次 3. 置 入 0.6 ml 粗 酵 素 液, 手 動 混 合 均 勻 5 min ( 使 粗 酵 素 液 與 TALON 樹 脂 充 分 接 觸 ), 再 靜 置 30 sec 以 1800 rpm 離 心 2 min 將 離 心 過 後 的 過 濾 液 吸 起 保 留 於 F1 4. 加 入 1 ml Wash buffer 到 TALON spin Columns, 手 動 混 合 均 勻 5 min ( 使 不 帶 39

44 實 驗 三 重 組 蛋 白 之 純 化 有 His-tag 的 雜 蛋 白 能 充 分 洗 去 ) 以 1800 rpm 離 心 2 min 將 離 心 過 後 的 過 濾 液 吸 起 保 留 於 W1 此 步 驟 再 重 複 1 次, 將 離 心 過 後 的 過 濾 液 吸 起 保 留 於 W2 5. 將 500 μl Elution buffer 加 到 管 柱 中, 手 動 混 合 均 勻 5 min ( 使 重 組 蛋 白 能 與 imidazole 充 分 置 換 ), 再 靜 置 30 sec 以 2000 rpm 離 心 2 min 將 離 心 下 來 的 重 組 蛋 白 收 集 到 E1 中 此 步 驟 再 重 複 一 次, 並 收 集 沖 提 液 到 E2 中 TALON spin Columns 的 回 收 與 保 存 : 1. 加 入 1mL 20 mm MES 到 TALON spin Columns 的 管 柱, 手 動 混 合 均 勻 5 min, 以 1800 rpm 離 心 2 min 此 步 驟 再 重 複 一 次 2. 加 入 1mL ddh 2 O 到 TALON spin Columns 的 管 柱, 手 動 混 合 均 勻 5 min, 以 1800 rpm 離 心 2 min 此 步 驟 再 重 複 一 次 3. 加 入 1mL 20% EtOH, 保 存 於 4 參 考 資 料 1. 國 立 陽 明 大 學 生 命 科 學 系 < 生 命 科 學 實 驗 之 實 驗 原 理 及 步 驟 講 義 > 頁 莊 榮 輝 老 師 主 編 < 台 大 生 物 化 學 實 驗 > 頁 騰 達 行 季 刊 APRIL-JUNE Q2 40

45 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 三 重 組 蛋 白 之 純 化 一 自 我 學 習 評 量 上 完 課 後 你 是 否 能 回 答 下 列 問 題 : 1. 重 組 蛋 白 所 帶 的 Histidine (His-tag) 作 用 是 什 麼? 2. 為 何 高 濃 度 的 Imidazole 能 將 重 組 蛋 白 從 column 中 沖 下 來? 3. Co 2+ 與 Ni 2+ 為 何 能 與 Histidine 結 合 呢? 4. Histidine 序 列 位 於 蛋 白 質 的 前 端 或 後 端, 會 影 響 到 重 組 蛋 白 的 表 現 或 功 能 嗎? 二 問 題 與 討 論 1. 除 了 用 酵 素 將 非 蛋 白 質 的 雜 質 降 解 之 外, 有 沒 有 直 接 將 蛋 白 質 與 其 他 干 擾 物 分 離 的 方 法 呢? 2. Wash buffer 與 Elution buffer 的 成 份 幾 乎 一 樣, 唯 一 的 差 別 是 什 麼 呢? 3. 在 實 驗 原 理 的 部 份, 我 們 有 提 到 其 他 利 用 親 和 性 結 合 的 例 子, 抗 體 抗 原 是 如 何 結 合 的 呢? 4. 除 了 His-tag 外, 你 知 道 還 有 哪 些 帽 子 可 以 選 擇 嗎? 5. 今 天 學 到 的 是 蛋 白 質 的 純 化 方 式, 那 你 知 道 DNA 有 哪 些 純 化 方 式 嗎? 41

46 實 驗 三 重 組 蛋 白 之 純 化 42

47 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 課 前 提 示 完 成 了 蛋 白 質 的 純 化 後, 如 果 直 接 將 純 化 的 成 品 上 架, 就 像 是 奸 商 在 牛 奶 中 加 入 許 多 水 一 樣, 雖 然 量 很 大, 但 消 費 者 真 正 需 要 的 成 份 卻 很 少 為 了 維 護 商 譽 與 提 昇 我 們 的 商 品 價 值, 我 們 需 要 再 多 一 步 濃 縮 的 動 作 就 像 是 現 在 市 面 上 很 多 火 紅 的 產 品, 像 是 雞 精 青 木 瓜 四 X 飲 精 華 乳 液 等, 小 小 的 一 罐, 價 錢 卻 高 得 嚇 人, 可 見 濃 縮 的 確 是 成 為 一 個 精 明 的 商 人 一 定 要 學 會 的 重 要 撇 步 那 遠 古 時 代 是 如 何 進 行 濃 縮 的 呢? 還 記 得 太 上 老 君 的 仙 丹 嗎? 孫 悟 空 因 為 偷 吃 了 太 上 老 君 的 仙 丹, 彼 此 結 下 了 不 解 之 仇 我 們 先 來 看 看 太 上 老 君 說 過 的 一 句 話 : 這 玉 瓶 中 裝 有 二 十 顆 仙 丹, 六 千 年 的 仙 丹 有 五 顆, 三 千 年 的 仙 丹 有 十 五 顆 這 樣 看 起 來, 古 早 時 濃 縮 出 精 華 產 品 要 花 上 千 年 的 時 間, 只 有 仙 人 或 千 年 老 妖 才 辦 得 到, 而 且 粒 粒 皆 辛 苦 現 代 人 汲 汲 營 營 分 秒 必 爭, 在 發 明 長 生 藥 丸 前, 為 了 節 省 時 間 與 在 有 生 之 年 得 到 精 華, 目 前 已 經 發 展 出 許 多 濃 縮 的 方 式, 你 知 道 有 哪 些 嗎? 不 同 於 市 面 上 雞 精 等 產 品, 是 在 宰 殺 無 辜 生 命 後 取 得 蛋 白 質 在 之 前 的 實 驗, 我 們 以 人 道 的 方 式 大 量 取 得 了 重 組 蛋 白, 並 且 也 完 成 了 純 化 所 以 接 下 來, 我 們 要 告 訴 你, 如 何 讓 我 們 自 己 純 化 的 蛋 白, 在 短 時 間 內 也 能 變 成 精 在 實 驗 開 始 前, 你 能 想 到 幾 種 濃 縮 的 方 式 呢? 43

48 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 實 驗 原 理 (A) 重 組 蛋 白 之 濃 縮 濃 縮 的 其 中 一 個 方 法, 是 將 目 標 分 子 與 干 擾 物 分 離, 就 像 肉 塊 脫 水 變 成 肉 乾 一 般 在 各 種 分 離 方 法 當 中, 沈 澱 法 是 最 常 使 用 的 方 法 之 ㄧ, 利 用 沈 澱 的 方 法, 可 以 有 效 的 把 蛋 白 質 從 粗 抽 取 液 中 沉 降 分 離 出 來 當 面 對 壓 力 時, 人 的 性 情 會 大 變, 蛋 白 質 也 一 樣, 在 水 溶 液 中, 蛋 白 質 膠 體 顆 粒 的 穩 定 性 是 需 要 一 定 條 件 的 透 過 不 同 的 物 理 化 學 因 素 的 影 響, 微 調 了 蛋 白 質 的 存 在 環 境, 此 時 的 蛋 白 質 顆 粒 將 會 失 去 電 荷 脫 水 甚 至 變 性, 這 些 結 塊 的 蛋 白 質 最 後 則 會 從 溶 液 中 析 出, 這 個 過 程 就 稱 為 蛋 白 質 的 沉 澱 反 應 沉 澱 反 應 可 粗 略 的 分 為 兩 種 類 型 : 1. 可 逆 沉 澱 反 應 在 發 生 沉 澱 反 應 時, 蛋 白 質 雖 已 沉 澱 析 出, 但 它 的 分 子 內 部 結 構 並 未 發 生 顯 著 變 化, 基 本 上 還 保 持 原 有 的 性 質, 當 促 進 沉 澱 的 因 素 去 除 後, 能 再 溶 於 原 來 的 溶 劑 中 這 個 過 程, 稱 為 可 逆 沉 澱 反 應, 又 叫 作 不 變 性 沉 澱 反 應 屬 於 這 一 類 的 反 應 有? 2. 不 可 逆 沉 澱 反 應 在 發 生 沉 澱 反 應 時, 蛋 白 質 分 子 的 內 部 結 構 空 間 的 構 型 遭 到 破 壞, 失 去 原 來 的 天 然 性 質, 這 時 候 蛋 白 質 已 發 生 變 性 這 種 變 性 蛋 白 質 的 沉 澱 不 能 再 溶 解 於 原 來 溶 劑 中 的 作 用 叫 作 不 可 逆 沉 澱 反 應 屬 於 這 一 類 的 反 應 有? 44

49 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 以 下 再 針 對 幾 個 作 用 原 理 進 行 更 詳 細 的 說 明 : 1. 硫 酸 銨 沈 澱 法 每 個 蛋 白 質 的 分 子 表 面 上, 都 分 布 有 若 干 比 例 的 非 極 性 區 域, 會 凝 集 許 多 水 分 子 以 便 溶 入 水 溶 液 中 ; 若 在 此 水 溶 液 中 加 入 大 量 硫 酸 銨, 會 因 為 硫 酸 銨 的 高 度 水 合 能 力, 搶 走 聚 集 在 蛋 白 質 表 面 的, 使 得 蛋 白 質 表 面 的 非 極 性 區 域 暴 露 出 來, 這 些 疏 水 性 的 區 域 便 會 互 相 聚 集 結 合, 進 一 步 成 為 聚 合 體 而 沈 澱 下 來 2. 有 機 溶 劑 沈 澱 法 當 蛋 白 質 水 溶 液 中 加 入 大 量 有 機 溶 劑, 水 分 子 濃 度 被 稀 釋, 蛋 白 質 的 溶 解 度 便 迅 速 下 降, 因 而 得 以 沈 澱 下 來 但 因 為 有 機 溶 劑 與 水 混 合 後 會 產 生 熱, 容 易 造 成 蛋 白 質 的 變 性, 因 此 要 在 極 低 溫 下 操 作 常 用 的 有 機 溶 劑 像 是 丙 酮, 在 沈 澱 後 也 常 用 乙 醚 來 帶 走 丙 酮, 以 加 速 乾 燥 3. 三 氯 醋 酸 (trichloroacetic acid, TCA) 是 一 種 很 強 的 蛋 白 質 變 性 劑, 許 多 蛋 白 質 遇 到 TCA 都 會 變 性 沈 澱, 無 法 再 恢 復 原 態 因 此,TCA 對 皮 膚 有 很 強 的 腐 蝕 性, 不 小 心 接 觸 後 要 馬 上 沖 水 通 常 TCA 並 不 被 用 在 純 化 蛋 白 質 的 步 驟 中, 而 是 用 來 沈 澱 或 移 除 大 部 分 的 蛋 白 質 除 了 利 用 沉 澱 的 方 式 得 到 我 們 的 蛋 白 質 外, 還 有 許 多 方 法 可 以 選 擇 : 1. 透 析 法 : 簡 單 來 說, 是 分 子 通 過 一 選 擇 性 通 透 膜 的 過 程 透 析 是 利 用 不 同 孔 徑 的 膜 對 不 同 分 子 量 的 物 質 具 有 選 擇 性 的 通 透 性 像 是 低 分 子 量 或 離 子 的, 例 如 : 通 透 性 較 高, 穿 透 自 如 ; 而 巨 大 的 分 子 ( 如 蛋 白 質, 多 醣 類 澱 粉 等 ) 則 無 衝 破 膜 45

50 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 的 封 鎖, 只 好 乖 乖 待 在 膜 中 2. 免 疫 沉 澱 法 : 需 要 特 異 性 的 抗 體, 才 能 與 我 們 的 目 標 蛋 白 結 合, 不 過 買 抗 體 的 成 本 非 常 貴 3. 離 子 交 換 層 析 : 可 用 陰 離 子 或 陽 離 子 的 交 換 樹 脂 進 行 濃 縮 4. 冷 凍 乾 燥 法 : 在 冷 凍 狀 態 下 讓 樣 品 中 的 液 體 昇 華, 最 後 留 下 蛋 白 質 結 晶 本 次 實 驗 用 的 是 超 濾 法, 主 要 是 針 對 小 體 積 蛋 白 質 溶 液 ( 幾 ml) 此 法 不 易 引 起 變 性, 且 速 度 快 只 要 濾 膜 沒 有 破 損, 濃 縮 器 就 可 以 重 複 使 用 濃 縮 器 的 主 要 原 理, 是 依 據 我 們 所 要 純 化 的 蛋 白 質 大 小, 選 擇 適 合 的 分 子 篩 孔 洞 大 小 藉 由 離 心 的 方 式, 只 有 小 於 孔 洞 大 小 的 分 子 會 穿 過 孔 洞, 而 大 於 孔 洞 大 小 的 蛋 白 就 自 然 留 在 濃 縮 器 裡 頭 囉! 本 次 實 驗 用 的 濃 縮 器 為 分 子 量 大 小 限 制 為 的 分 子 篩 膜, 大 於 的 蛋 白 質 經 離 心 後, 仍 留 存 於 上 管, 小 於 此 分 子 量 的 蛋 白 質 與 些 許 溶 液 在 離 心 後 則 會 進 入 下 管, 最 後 留 在 上 層 管 柱 的 溶 液 就 是 濃 縮 完 成 的 蛋 白 質 實 驗 器 材 Pipetman Tip Amicon Ultra 高 速 離 心 機 46

51 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 步 驟 (A) 重 組 蛋 白 之 濃 縮 a. 蛋 白 質 之 濃 縮 1. 先 拿 出 兩 支 乾 淨 的 離 心 管, 分 別 標 示 be1 be2 將 經 過 管 柱 純 化 的 E1 E2 分 別 保 留 20 ul 於 be1 be2, 藉 以 比 較 濃 縮 前 後 蛋 白 質 濃 度 的 改 變 2. 先 將 0.3 ml E1 E2 的 溶 液 加 到 濃 縮 管 當 中, 以 13000rpm 離 心 5min 3. 再 將 E1 E2 中 剩 下 的 溶 液 全 部 加 到 濃 縮 管 當 中, 以 13000rpm 離 心 5min 4. 重 覆 離 心 的 步 驟, 直 到 濃 縮 體 積 約 至 100 μl 為 止 ( 每 次 離 心 後, 須 開 蓋 一 次 再 蓋 好, 才 能 再 次 離 心 ) 3. 將 濃 縮 器 上 管 倒 置, 以 6500rpm 離 心 2 min 拿 出 二 支 新 的 離 心 管, 標 示 為 ae1 ae2 將 蛋 白 質 濃 縮 液 分 別 收 取 於 ae1 ae2 b. 濃 縮 器 之 清 洗 1. 加 入 300 μl ddh 2 O 到 濃 縮 器 中, 以 rpm 離 心 2 min 2. 將 濃 縮 管 倒 置, 以 6500 rpm 離 心 2 min, 藉 以 離 下 上 管 殘 留 液 甩 乾 下 管 內 殘 留 的 ddh 2 O 3. 加 入 300 μl ddh 2 O, 保 存 在 4 參 考 資 料 莊 榮 輝 老 師 主 編 < 台 大 生 物 化 學 實 驗 > 頁 1 47

52 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 一 實 驗 紀 錄 及 結 果 1. Protein 定 量 : C F1 W1 W2 Total volume (μl) sample loading volume (μl) concentration be1 be2 ae1 ae2 Total volume (μl) sample loading volume (μl) concentration 2. be1 原 本 體 積 : 濃 縮 後 的 ae1 體 積 : 濃 縮 倍 3. be2 原 本 體 積 : 濃 縮 後 的 ae2 體 積 : 濃 縮 倍 48

53 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 二 自 我 學 習 評 量 上 完 課 後 你 是 否 能 回 答 下 列 問 題 : 1. 何 謂 可 逆 沉 澱 反 應? 何 謂 不 可 逆 沉 澱 反 應? 2. 免 疫 沉 澱 法 的 原 理 是 什 麼 呢? 如 果 找 不 到 蛋 白 質 的 專 一 抗 體, 我 們 要 如 何 自 製 抗 體 呢? 3. 何 謂 離 子 交 換 樹 脂? 4. 硫 酸 銨 沈 澱 法 的 原 理 為 何? 三 問 題 與 討 論 1. 在 沉 澱 法 的 介 紹 當 中, 我 們 有 提 到 等 電 點 的 沉 澱 方 式 你 知 道 蛋 白 質 與 等 電 點 的 關 係 嗎? 它 的 沉 澱 原 理 為 何 呢? 2. 當 蛋 白 質 純 化 完 成 之 後, 濃 縮 蛋 白 質 樣 品 除 了 可 以 減 少 體 積 之 外, 還 有 什 麼 意 義 呢? 蛋 白 質 濃 縮 後 的 濃 度 要 在 什 麼 範 圍 內 才 算 合 適 呢? 3. 你 在 這 次 實 驗 課 所 純 化 完 成 的 蛋 白 質 是 保 存 在 什 麼 緩 衝 液 中 呢? 如 果 之 後 的 實 驗 需 要 在 其 他 緩 衝 液 條 件 之 下 進 行, 那 你 應 該 怎 麼 做 呢? 蛋 白 純 化 完 成 之 後 應 該 怎 樣 保 存 才 能 維 持 它 的 活 性 呢? 4. 除 了 利 用 硫 酸 銨 來 進 行 沉 澱 外, 利 用 同 樣 的 原 理, 你 還 能 找 出 幾 種 能 夠 取 代 硫 酸 銨 的 化 學 物 質 呢? 5. 在 了 解 蛋 白 質 的 沉 澱 原 理 後, 你 知 道 DNA 要 用 什 麼 方 法 來 沉 澱 嗎? 49

54 實 驗 四 重 組 蛋 白 之 濃 縮 50

55 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 課 前 提 示 在 經 過 艱 難 的 蛋 白 質 表 現 純 化 與 濃 縮 之 後, 終 於 得 到 了 我 們 的 重 組 蛋 白 但 問 題 又 來 了 : 我 們 怎 麼 知 道 大 腸 桿 菌 真 的 忠 實 地 轉 譯 出 我 們 要 的 重 組 蛋 白 呢? 而 第 一 次 學 蛋 白 質 製 備 的 你, 是 否 在 純 化 的 過 程 當 中, 不 小 心 讓 蛋 白 質 變 性 了 呢? 也 或 許 純 化 出 來 的 蛋 白 質 根 本 不 是 我 們 所 想 要 的 呢? 為 了 解 決 這 些 困 擾, 在 這 一 章 我 們 要 傳 授 你 幾 個 簡 單 的 確 認 方 法 另 外 要 提 醒 你 的 是, 就 像 是 市 面 所 販 售 的 食 品 一 般, 在 上 架 前, 一 定 要 經 過 品 質 檢 測, 以 免 到 後 來 發 生 像 毒 奶 粉 的 事 件, 可 是 會 上 頭 版 新 聞 的 實 驗 的 進 行 也 是 一 樣, 過 程 當 中 有 許 多 時 候 須 要 先 停 一 停 ( 適 當 的 休 息?), 為 目 前 的 實 驗 結 果 進 行 確 認 的 步 驟 這 個 確 認 的 步 驟 之 所 以 重 要, 就 是 要 避 免, 在 你 一 股 腦 地 將 整 個 實 驗 流 程 完 成, 卻 在 最 後 的 實 驗 結 果 上 看 不 到 任 何 的 反 應 於 是 你 發 了 狂 的 往 回 一 步 步 的 追 蹤, 最 悲 慘 的 結 論, 可 能 是 你 發 現, 在 一 開 始 你 就 搞 錯 了 一 個 實 驗 步 驟, 青 春 小 鳥 可 是 一 去 不 回 來 呀! 所 以 停 一 停 的 確 認 步 驟 是 很 重 要 的! 要 確 認 實 驗 結 果 是 否 正 確 的 方 法, 通 常 是 針 對 分 子 的 特 性 來 進 行 檢 驗 在 蛋 白 質 方 面, 我 們 知 道 每 種 蛋 白 質 都 有 自 己 的 分 子 量 帶 電 量 分 子 構 型 親 水 或 疏 水 性 酵 素 活 性 等 等 在 這 次 的 課 程 中, 我 們 選 擇 針 對 蛋 白 質 的 分 子 量 與 酵 素 活 性 來 進 行 檢 測 告 訴 你 如 何 快 速 的 從 蛋 白 質 的 體 重 與 能 力, 確 認 你 所 純 化 的 蛋 白 的 確 是 你 所 需 要 的, 而 不 單 單 只 是 一 團 胡 亂 摺 疊 的 胺 基 酸 鏈 實 驗 原 理 (A) 蛋 白 質 的 游 泳 池 : 電 泳 51

56 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 在 分 離 不 同 分 子 量 蛋 白 質 的 方 法 中, 電 泳 是 目 前 使 用 最 廣 的 方 法 之 一 顧 名 思 義, 電 泳, 就 是 讓 蛋 白 質 在 電 場 中 游 泳 就 像 游 泳 池 需 要 水 一 樣, 電 泳 也 需 有 一 介 質, 幫 助 蛋 白 質 的 泳 動 最 早 是 在 溶 液 中 進 行, 但 在 溶 液 中 會 有 嚴 重 擴 散 的 現 象, 故 又 改 成 用 固 相 的 濾 紙 但 又 因 濾 紙 與 分 子 間 摩 擦 力 太 大, 後 來 多 改 用 說 軟 不 軟 說 硬 不 硬 的 半 固 態 膠 體, 如 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 (polyacrylamide gel) 洋 菜 醣 (agarose) 或 澱 粉 (starch) 分 子 在 電 場 中 的 移 動, 稱 作 泳 動, 泳 動 的 程 度 稱 為 泳 動 率 (mobility).. ( 所 外 加 電 壓 mv) ( 分 子 之 淨 電 荷 ) 泳 動 率 ~ 分 子 與 介 質 間 之 摩 擦 力 上 述 之 摩 擦 力, 決 定 於 此 分 子 之 大 小 形 狀 分 子 量 大 者 摩 擦 力 大, 泳 動 率 小 ; 球 形 分 子 摩 擦 力 較 小, 泳 動 率 大 分 子 在 不 同 環 境 ph 的 影 響 下, 可 能 帶 不 同 淨 電 荷 : 當 環 境 ph = 分 子 之 pi 時, 此 分 子 之 淨 電 荷 為 零 (pi 為 等 電 點 ); 當 環 境 ph < 分 子 之 pi 時, 此 分 子 之 淨 電 荷 為 正 ; 當 環 境 ph > 分 子 之 pi 時, 此 分 子 之 淨 電 荷 為 負 pi? 電 泳 系 統 中, 電 子 由 負 極 流 向 正 極 ( 負 負 相 斥 ); 帶 負 電 的 分 子 往 正 極 跑, 帶 正 電 的 分 子 往 負 極 跑, 不 帶 電 者 則 不 動 大 部 分 電 泳 系 統 的 ph 定 在 8.3, 在 此 ph 值 下, 凡 是 pi (> or <) 8.3 的 分 子 均 帶 負 電 荷, 都 可 以 往 正 極 跑 (B) 打 造 游 泳 池 : SDS-PAGE 的 原 理 與 製 備 蛋 白 質 電 泳 以 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 應 用 最 廣, 其 中 又 以 膠 體 有 無 加 入 SDS (Sodium 52

57 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 Dodecyl Sulfate), 分 為 SDS-PAGE 及 non-denaturing PAGE ( 原 態 電 泳 ) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate): SDS 為 一 種 陰 離 子 界 面 活 性 劑, 其 非 極 性 的 部 分 會 與 蛋 白 質 結 合, 極 性 部 分 的 硫 酸 根 則 朝 外 使 蛋 白 質 分 子 外 部 帶 ( 正 or 負 ) 電 荷 大 致 而 言, 二 個 peptide bond 會 結 合 一 個 SDS 分 子 此 種 結 合 導 致 蛋 白 質 分 子 立 體 結 構 崩 解 使 結 構 中 的 非 共 價 鍵 完 全 破 壞, 形 成 鏈 狀 分 子 結 合 SDS 的 蛋 白 質, 不 論 原 來 帶 正 或 負 電, 結 合 了 SDS 後 皆 會 帶 ( 正 or 負 ) 電, 而 可 往 ( 正 or 負 ) 極 跑, 泳 動 率 與 分 子 量 成 反 比 因 此 SDS-PAGE 可 用 來 測 定 蛋 白 質 的 分 子 量, 但 所 測 得 的 是 變 性 狀 態 (denatured) 之 分 子 量, 與 原 態 (native) 分 子 量 可 能 不 同 不 加 SDS 之 non-denaturing PAGE, 其 泳 動 率 與 本 身 分 子 之 電 荷 分 子 大 小 分 子 形 狀 等 均 有 關 係, 較 難 預 測 聚 丙 烯 醯 胺 膠 體 的 形 成, 是 由 單 體 分 子 經 聚 合 反 應, 成 為 高 分 子 聚 合 物, 並 以 架 橋 分 子, 交 錯 連 結 成 三 次 元 的 半 固 態 膠 體 所 謂 的 單 分 子, 指 得 是 丙 烯 醯 胺 (acrylamide) CH2=CH-CO-CH2 架 橋 則 是 Bis, [N, N'-methylene-bis(acrylamide)] 可 看 作 兩 個 丙 烯 醯 胺 單 體 分 子 連 結 在 一 起, 可 形 成 分 叉 點, 以 構 成 立 體 結 構 發 動 聚 合 反 應 的 是 自 由 基 (free radical), 產 生 自 由 基 的 來 源 有 過 硫 酸 銨 (ammonium persulfate, APS) 或 riboflavin ( 維 生 素 B2) 幫 助 自 由 基 電 子 傳 遞 的 催 化 劑 則 是 TEMED (tetramethylenediamine) 有 了 建 構 游 泳 池 的 建 材 後, 接 著 則 是 進 行 組 裝, 也 就 是 鑄 膠 (gel casting) 的 步 驟 這 是 一 種 自 由 基 的 聚 合 反 應, 大 致 有 下 列 幾 個 過 程 : 53

58 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 1. 自 由 基 形 成 : 靠 APS TEMED 產 生 自 由 基 的 碰 撞, 再 引 發 連 鎖 反 應 2. 聚 合 反 應 : 單 體 分 子 首 尾 相 接, 以 連 鎖 反 應 形 成 大 分 子 的 長 鏈 3. 交 錯 連 結 : 若 架 橋 分 子 Bis, [N, N'-methylene-bis(acrylamide)] 加 入 聚 合 反 應, 則 可 形 成 網 狀 三 次 元 結 構 凝 膠 後 會 產 生 孔 洞, 這 些 孔 洞 猶 如 一 個 篩 子, 可 將 大 小 不 同 的 分 子 予 以 分 離 上 層 膠, 又 稱 焦 集 膠 體 (stacking gel),ph 6.8 下 層 膠 又 稱 分 離 膠 體 (separating gel),ph 8.8 游 泳 池 準 備 好 後, 就 要 開 始 進 行 電 泳 了! 注 意 下 面 三 種 分 子, 在 電 泳 時 的 表 現 : 1. Glycine (pi=6.8): 存 在 於 緩 衝 液 ( 請 參 考 附 錄, 緩 衝 液 的 成 份 ) 中 圖 中 以 深 色 圓 點 ( 當 環 境 ph >6.8 時 Gly 帶 負 電 ) 或 白 色 圓 點 ( 當 環 境 ph = 6.8 時 為 不 帶 電 之 zwitterion) 表 示 2. 蛋 白 分 子 : 在 圖 中 以 愛 心 ( 我 們 純 化 的 心 血 ) 表 示 3. 氯 離 子 : 存 在 於 膠 體 中, 以 斜 線 部 分 代 表 54 鳴 槍 起 跑 ( 通 電 ) 後, 所 有 分 子 拼 命 往 前 ( 或 下 ) 衝 Glycine 進 入 膠 体 後,

59 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 立 刻 變 成 不 帶 電 的 的 分 子 ( 白 點 ), 泳 動 率 變 小 ; 同 時 氯 離 子 則 很 快 的 往 正 極 泳 動, 因 此 在 氯 離 子 與 Glycine 之 間 有 一 段 缺 乏 離 子 的 空 間, 電 壓 很 高 然 而 兩 電 極 之 間, 一 定 要 有 負 離 子 來 帶 動 電 流, 此 時 蛋 白 質 就 被 推 上 火 線, 拿 來 當 作 傳 導 的 補 給 兵, 由 於 上 層 膠 中 的 孔 隙 較 疏 (4 %), 於 是 蛋 白 質 分 子 在 此 離 子 缺 乏 空 間, 快 速 往 正 極 泳 動, 一 直 碰 到 氯 離 子 的 尾 端, 而 聚 集 成 一 薄 層, 這 才 是 蛋 白 質 真 正 的 起 跑 線 當 Glycine 分 子 慢 慢 通 過 焦 集 膠 體, 又 變 回 負 離 子, 離 子 缺 乏 空 間 瓦 解 ; 蛋 白 質 泳 動 到 分 離 膠 体, 此 時 的 泳 動 各 憑 本 事, 泳 動 結 果 的 決 定 因 素 在 於 蛋 白 質 本 身 的 分 子 量 電 荷 等 一 開 始 製 備 分 離 膠 体 時 濃 度 (%) 的 選 擇 則 是 隨 蛋 白 質 大 小 調 整 (C) 重 組 蛋 白 之 分 子 量 確 認 Coomassie Brilliant Blue G-250 在 與 蛋 白 質 結 合 後 會 呈 現 藍 色 藉 由 分 子 量 的 比 對 即 可 初 步 判 定 是 否 為 我 們 所 要 的 蛋 白 呈 色 原 理 : (D) 重 組 蛋 白 之 活 性 確 認 本 次 實 驗 純 化 的 是 幾 丁 質 酶 (Chitinase), 所 以 我 們 利 用 這 個 酵 素 所 能 作 用 的 受 質 4-methylumbelliferyl-β-D-N, N -diacetylchitobioside (4MU-(GlcNAc) 2 ) 來 進 行 檢 驗 如 果 我 們 純 化 出 的 蛋 白 是 有 活 性 的 話, 當 酵 素 剪 切 這 個 受 質 後, 即 55

60 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 可 以 激 發 波 長 355 nm 與 發 射 波 長 460 nm 檢 測 螢 光 的 有 無 ( 受 質 ) 發 光 原 理 : 實 驗 器 材 鑄 膠 套 件 ( 含 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 ) 間 隔 條 (spacer, 0.75 mm) 及 樣 本 梳 (comb, 10 well) 垂 直 迷 你 電 泳 槽 電 源 供 應 器 染 色 脫 色 方 盒 Shaker UV 燈 照 相 系 統 / 照 膠 系 統 實 驗 藥 品 40% acrylamide/ Bis-Acrylamide Tris buffer (ph 8.8) Tris buffer (ph 6.8) 10% SDS TEMED 10% APS 4MU-(GlcNAc) 2 56

61 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 Coomassie Brilliant Blue G-250 異 丙 醇 實 驗 步 驟 (A) SDS-PAGE 的 製 備 1. 將 電 泳 玻 片 及 氧 化 鋁 片 以 酒 精 清 洗 乾 淨 後 擦 乾, 將 厚 度 0.75 mm 的 間 隔 條 (spacer) 組 裝 於 鑄 膠 套 件 2. 組 裝 完 成, 先 利 用 完 全 酒 精 確 認 是 否 確 實 鎖 緊 3. 依 下 表 體 積, 先 配 置 separating gel 將 液 體 依 序 加 入 15 ml 離 心 管 本 次 實 驗 使 用 10 % 膠 體 配 置 膠 體 溶 液 時,APS 溶 液 必 須 最 後 加 入 4. 小 心 混 合 均 勻, 並 避 免 氣 泡 產 生, 然 後 以 微 量 吸 管 小 心 注 入 鑄 膠 套 件 Stacking Separating 4% 10% 40% acrylamide/ Bis-Acrylamide 0.37 ml ml 0.5 M Tris-HCl ph ml M Tris-HCl ph ml 10 % SDS 25 μl 50 μl dd H 2 O 1.48 ml 1.788ml TEMED 2.5 μl 2.5 μl 10 % Ammonium persulfate (APS) 12.5 μl 25 μl Total volume 2.5 ml 5 ml * 此 為 一 片 膠 的 量 5. 膠 體 約 佔 玻 片 的 2/3 至 3/4 高 度, 加 完 後 儘 快 在 膠 體 液 面 上 方 小 心 加 入

62 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 μl 異 丙 醇, 以 壓 平 膠 體 液 面 6. 待 凝 膠 完 成 ( 約 20 min), 倒 出 上 層 的 異 丙 醇 7. 配 製 stacking gel 將 液 體 依 序 加 入 15 ml 離 心 管 加 入 混 合 好 的 溶 液 後 立 刻 插 入 樣 本 梳 (comb), 待 凝 膠 完 成 ( 約 10 min) 鑄 好 的 膠 片 可 置 於 封 口 袋 中 於 4 保 存, 但 要 加 入 少 量 蒸 餾 水 防 止 膠 片 乾 裂, 使 用 期 限 約 兩 週 (B) 蛋 白 質 電 泳 若 膠 片 是 在 4 中 保 存, 須 先 取 出 回 復 室 溫 1. 將 膠 片 架 到 電 泳 槽 上, 並 利 用 電 泳 夾 夾 妥 後, 在 槽 內 加 入 SDS-PAGE running buffer 膠 片 一 定 要 等 回 復 室 溫 後 才 能 架 到 電 泳 槽, 否 則 玻 片 會 因 熱 漲 而 撐 破 2. 將 樣 品 12μl 與 3μl 的 樣 品 追 蹤 染 劑 (5x SDS sample treatment buffer) 加 到 離 心 管 中 並 混 勻 3. 以 100 加 熱 10 分 鐘, 於 室 溫 冷 卻 後 離 心 4. 將 15μl 樣 品 注 入 樣 品 槽, 第 一 個 孔 洞 加 入 5 μl protein marker 5. 蓋 上 電 泳 槽 的 蓋 子, 確 認 正 負 電 極 裝 置 正 確, 連 接 上 電 源 供 應 器 6. 先 以 90 伏 特 進 行 電 泳, 待 追 蹤 染 劑 集 焦 後, 改 以 120 伏 特 繼 續 電 泳, 直 到 追 蹤 染 劑 泳 動 到 膠 底 線 時, 中 止 電 泳 (C) 重 組 蛋 白 之 分 子 量 確 認 1. 將 SDS-PAGE 膠 片 用 去 離 子 水 沖 洗 二 次 2. 倒 掉 清 洗 液, 再 加 入 Coomassie Blue 蛋 白 染 劑 (Gelcode TM Blue Stain Reagent, PIERCE), 蓋 過 膠 體 搖 晃 約 40 分 鐘 3. 以 10 ml 去 離 子 水 褪 染 數 次, 每 次 10 min, 直 到 膠 體 呈 透 明 狀, 拍 照 膠 片 與 存 檔 58

63 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 (D) 重 組 蛋 白 之 活 性 確 認 1. SDS-PAGE 膠 片 清 理 a. 將 SDS-PAGE 膠 片 用 去 離 子 水 沖 洗 一 次 b. 用 25% isopropanol 浸 泡 15min 目 的 : c. 用 去 離 子 水 沖 洗 兩 次 ( 每 次 至 少 15 min), 洗 去 isopropanol 2. 將 膠 體 浸 泡 於 含 有 100 μm 4MU-(NAG) 2 的 螢 光 受 質 染 液 中, 置 於 紫 外 燈 (UV-312) 下 觀 察 螢 光 反 應 參 考 文 獻 1. 莊 榮 輝 老 師 主 編 台 大 生 物 化 學 實 驗 頁 14~20 59

64 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 一 實 驗 紀 錄 及 結 果 本 次 純 化 的 蛋 白 為 : 分 子 量 約 為 : 活 染 電 泳 所 使 用 的 蛋 白 濃 度 為 : 活 性 染 色 結 果 : 蛋 白 染 色 結 果 : 二 自 我 學 習 評 量 上 完 課 後 你 是 否 能 回 答 下 列 問 題 : 1. 決 定 蛋 白 質 分 子 的 淨 電 荷 為 正 電 或 負 電, 受 那 些 因 素 影 響? 2. 那 些 因 素 會 影 響 蛋 白 質 分 子, 在 電 場 中 的 泳 動 速 率? 3. 膠 體 溶 液 的 成 分 有 那 些? 各 有 什 麼 作 用? 那 一 種 有 毒 性? 4. 焦 集 膠 體 如 何 使 樣 品 蛋 白 質 焦 聚 成 一 薄 層? 5. 製 備 膠 體 時, 為 何 APS 要 最 後 加 入? 60

65 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 三 問 題 與 討 論 1. 凝 膠 的 孔 洞 大 小 是 如 何 決 定 的 呢? 2. acrylamide 與 bisacrylamide 的 比 值 越 大, 孔 洞 越 大 還 越 小? 3. SDS-PAGE 與 non-denaturing PAGE 在 原 理 與 應 用 上, 有 何 異 同? 4. 是 否 所 有 蛋 白 質 分 子 均 由 負 極 向 正 極 泳 動? 在 什 麼 情 況 下 會 有 例 外? 5. 在 原 理 介 紹 中 提 到, 變 性 狀 態 的 蛋 白 質 分 子 量, 與 原 態 分 子 量 可 能 不 同 原 因 何 在? 61

66 實 驗 五 蛋 白 質 染 色 62

67 附 錄 一 Bradford assay 偵 測 極 限 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 63

68 附 錄 附 錄 二 BCA assay 偵 測 極 限 Tween -20, 5% Triton X-114, 1% Triton X-100, 5% Zwittergent 3-14, 1% CHAPS, 5% SDS, 5% OTG, 5% Reducing Agents Dithiothreitol (DTT), 1 mm 2-Mercaptoethanol, 1 mm TCEP, n/c Chelating Agents EDTA, 10 mm Sodium citrate, 200 mm Buffers/Salts Tris, 100 mm HEPES, ph 7.5, 100 mm MES, ph 6.1, 100 mm Imidazole, ph 7.0, 50 mm Guanidine-HCl, 4 M Urea, 3 M Sucrose, 40% 64

69 附 錄 三 pet-20 (b) map 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 65

70 附 錄 附 錄 四 IPTG 誘 導 卡 通 圖 66

71 附 錄 五 溶 液 成 份 表 海 洋 大 學 生 科 系 生 化 實 驗 手 冊 Equilibration/wash buffer (ph 7.0) sodium phosphate NaCl 50 mm 300 mm Wash buffer (ph 7.0) sodium phosphate NaCl imidazole 50 mm 300 mm 10 mm Elution buffer (ph 7.0) sodium phosphate NaCl imidazole 50 mm 300 mm 150 mm 10% SDS solution SDS H2O 10 g to 1 ml 10% APS solution APS H2O 0.1 g to 1 ml Resolving gel buffer (1.5M Tris-HCl, ph 8.8) Tris H2O 36.3 g to 200 ml Stacking (1.5M Tris-HCl, ph 6.8) 67

72 附 錄 Tris H2O 3.0 g to 50 ml SDS-PAGE running buffer (ph 8.3) Tris, 0.025M 12 g Glycine, M 57.6 g 10% SDS, 0.1% 40 ml H2O to 4 L 68