602 原菌严重影响禽畜及人类卫生健康而痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae 造成的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势志贺氏菌株血清型分布的多样性表明在亚洲需要有多效或有交叉保护性的志贺氏菌疫苗 [7] 禽畜养殖场为防治家禽的疾病发生一般将在饲料和水体中常规投入抗生素或消毒剂本

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绢耐伍
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1 第 37 卷第 3 期 2016 年 5 月 RESEARCH OF AGRICULTURAL MODERNIZATION Vol. 37 No. 3 May 2016 DOI: /j 孙宇杰, 柳佳志, 王智柔, 雷琎, 林连兵. 噬菌体 SYJ4 及其对肉鸡痢疾治疗效果的初步探究 [J]., 2016, 37(3): Sun Y J, Liu J Z, Wang Z R, Lei J, Lin L B. The therapeutic effect of bacteriophage SYJ4 on diarrhea in broiler chickens[j]. Research of Agricultural Modernization, 2016, 37(3): 噬菌体 SYJ4 及其对肉鸡痢疾治疗效果的初步探究柳佳志王智柔雷琎林连兵 * 孙宇杰昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明摘要为了分离以致病性痢疾志贺菌 Shigella dysenteriae CMCC (B) 为宿主菌的烈性噬菌体并分析其生物学特性及其对患痢疾肉鸡的治疗效果采用双层平板法从水样中分离纯化获得烈性噬菌体 SYJ4 其最佳感染复数 MOI 为 0.1 最适感染温度为 37 最适感染 ph 范围在 6 一步生长曲线表明噬菌体 SYJ4 裂解量约为 50 潜伏期约为 20 min 裂解期约为 120 min 将无菌噬菌体富集液通过灌喂方式作用于由 S. dysenteriae CMCC (B) 导致的出现明显白痢症状的病鸡中并与链霉素治疗效果进行比较结果表明噬菌体 SYJ4 对痢疾志贺菌 S. dysenteriae CMCC (B) 引起的鸡痢疾具有一定治疗效果其治疗效果与链霉素相仿并在控制鸡肠道志贺氏菌群数量上优于链霉素研究表明对于将噬菌体应用于肉禽细菌性肠道疾病治疗研究具有一定的参考价值关键词噬菌体痢疾志贺菌噬菌体治疗肉禽痢疾中图分类号 TS201.3 Q939.4 文献标识码Ａ文章编号 The therapeutic effect of bacteriophage SYJ4 on diarrhea in broiler chickens SUN Yujie, LIU Jiazhi, WANG Zhirou, LEI Jin, LIN Lianbing Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, Yunnan , China To isolate bacteriophages with the capacity of infecting Shigella dysenteriae CMCC (B) 51105, bacteriophage Abstract named SYJ4 was separated and purified from sewage sample using doubleplate method, then its preliminary biological characteristics and therapeutic effect on diarrhea in chickens were further analyzed. Results showed that SYJ4 had an optimal MOI (multiplicity of infection) as 0.1, the optimal infection temperature was 37, and its optimal infection ph ranged from 6 to. Onestep growth curve also showed that SYJ4 was a variety of virulent phage, its burst size was 50, and the incubation period and the burst time were about 20 min and 120 min, respectively. Compared with the therapeutic effect of streptomycin, the chickens fed phage SYJ4 by gavage suffered from diarrhea caused by S. dysenteriae CMCC (B) 51105, which indicated that to some degree, bacteriophage SYJ4 had the same therapeutic effect on diarrhea caused by S. dysenteriae, however, its function on controlling the number of S. dysenteriae in intestine of chickens was better than the streptomycin. Therefore, the study will provide a certain valuable method for treating the meat and poultry bacterial intestinal disease with the phage therapy. bacteriophage; Shigella dysenteriae; phage therapy; meat animals; dysentery Key words 随着对抗生素滥用所产生后果的深入认识如何减少化学药物和制剂的应用已成为养殖业生存和发展的严峻问题 [1] 噬菌体的侵染具有高度的专一性当噬菌体感染细菌时可在细菌中繁殖并杀死细菌但其对动植物或人体本身没有毒性 [1] 在自然界中凡是有细菌分布的地方均可发现特异噬菌体的存在 [2] 因此噬菌体以其特有的自然特征有望成为理想的抗菌药和新型生物杀菌制剂 [3] 美国 FDA 已批准噬菌体作为食品添加剂用于杀灭食品中的李斯特菌 Listeria monocytogenes [4] Miller 等 [5] 证明了将噬菌体应用于控制肉禽坏死性肠炎的有效性 Huff 等 [6] 证明了使用噬菌体饲喂 1 日龄肉禽可以预防气管内大肠杆菌导致的疾病志贺氏菌 Shigella 是胃肠疾病感染的主要病基金项目国家自然科学基金项目大学生创新创业计划项目作者简介孙宇杰 1992 男山西阳泉人本科在读 id @hotmail.com 通讯作者林连兵 1969 男湖南通道人教授硕士生导师现主要从事微生物在农业和环保领域的应用研究 linlb@kmust.edu.cn 收稿日期接受日期 Foundation item: National Natural Science Foundation of China ( ); National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship ( ). Corresponding author: LIN Lianbing, linlb@kmust.edu.cn. Received 11 February, 2015; Accepted 23 September, 2015

噬菌体 SYJ4 及其对肉鸡痢疾治疗效果的初步探究柳佳志王智柔雷琎林连兵 * 孙宇杰昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明 650500 摘要为了分离以致病性痢疾志贺菌 Shigella dysenteriae CMCC (B) 51105 为宿主菌的烈性噬菌体并分析其生物学特性及其对患痢疾肉鸡的治疗效果采用双层平板法从水样中分离纯化获得烈性噬菌体 SYJ4 其最佳感染复

2 602 原菌严重影响禽畜及人类卫生健康而痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae 造成的细菌性痢疾已发展为世界性流行趋势志贺氏菌株血清型分布的多样性表明在亚洲需要有多效或有交叉保护性的志贺氏菌疫苗 [7] 禽畜养殖场为防治家禽的疾病发生一般将在饲料和水体中常规投入抗生素或消毒剂本试验旨在通过分离鸡致病性痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae CMCC (B) 敏感的烈性噬菌体并利用分离到的噬菌体对患痢疾肉鸡进行治疗试验并与链霉素治疗效果进行比较探究噬菌体在禽类肠道细菌感染的应用价值 1 材料与方法 1.1 试验材料采样样品的富集培养采用 GN 增菌培养基 GN BROTH HAJNA 宿主细胞的培养和后续的噬菌体分离采用 LB LuriaBertani 培养基痢疾志贺菌 S. dysenteriae CMCC (B) 为昆明理工大学邓先余博士惠赠以 1% 接种量将活化后的痢疾志贺菌接入 GN 增菌液中 rpm 震荡培养至生长对数期 OD 后 4 冷藏备用 GN 增菌液胰蛋白胨 20 g 葡萄糖 1 g 甘露醇 2 g 柠檬酸钠 5 g 去氧胆酸钠 0.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 ml ph = 7.0±0.2 半固体培养基加入终浓度为 0.4% 琼脂固体培养基加入终浓度为 2% 琼脂经 115 高压蒸汽灭菌 15 min 后使用 1.2 噬菌体的富集分离及其生物学特征采集校园污水厂的泥水混合物 50 ml 充分震荡后静置沉降 10 min 后取上清 5 ml 接入 200 ml 由 GN 增菌液配置成的宿主细菌菌液 OD 中 rpm 恒温摇床中培养 24 h 之后 000 g 离心 20 min 取上清用 0.22 μm 滤膜过滤除菌后 4 冷藏备用采用双层琼脂平板法分离噬菌体 [] 取 100 μl 噬菌体富集液与 100 μl 宿主菌液混合静置吸附 1520 min 后向其中倾入 4.0 ml 于 40 预热的 LB 半固体琼脂培养基颠倒混匀后平铺于事先准备好的下层 LB 固体琼脂培养基待半固体培养基完全凝固后胶带封口在 37 恒温培养箱中倒置隔夜培养若出现透明圆圈则说明筛选到以痢疾志贺氏菌为宿主菌的噬菌体挑取噬菌斑进行四次纯化获得单株噬菌体 [9] 培养宿主菌痢疾志贺菌至对数期前期 OD546= 菌体浓度约为 cfu/ml 按照感染复第 36 卷数为加入噬菌体纯培养液和宿主菌菌液添加 LB 液体培养基使每管液体体积相同设置 3 个重复同时加设不加噬菌体的宿主菌和不加宿主菌的噬菌体作为为空白对照于 rpm 恒温摇床中培养 3.5 h 用双层平板法测定噬菌体滴度以产生最高噬菌体滴度所对应的 MOI 作为最佳感染复数 [10] 取宿主细菌菌液 5 ml 加入噬菌体液使 MOI= 静置吸附 15 min 后 g 离心 30 s 弃上清使用 LB 液体培养基洗涤 2 次加入同体积 37 预热的 LB 液体培养基并充分混匀迅速置于恒温摇床培养 rpm 每隔 10 min 测定培养液中噬菌体滴度以感染时间为横坐标噬菌体滴度为纵坐标绘制一步生长曲线 [11] 将一定滴度的噬菌体液分别置于下存放 1 h 后分别测定其噬菌体滴度 [12] 分析温度对噬菌体活性的影响配制 ph 值分别为的缓冲液体系柠檬酸缓冲液磷酸盐缓冲液 TrisHCl 缓冲液 Na2CO3 缓冲液各取 990 μl 加入 1.5 ml 的无菌 Eppendorf 管中再向各管中加入 10 μl 滴度为 1 10 pfu/ml 的噬菌体纯培养液 37 静置 1 h 后进行滴度测定 [13] 分析 ph 对噬菌体活性的影响 1.3 噬菌体治疗试验选用 120 日龄的健康 AA 肉鸡 15 羽平均体重为 1.65 kg 随机分配为 3 组每组 5 个重复每个重复 1 羽均饲喂基础日粮基础日粮参照美国 NRC 1994 肉鸡营养需要充分混合成颗粒状全价饲料饲喂水源为 0.9% NaCl 溶液, 所有试验组均为自由摄食 [13] 试验组分为 3 组命名为 A B C 试验前先停止水源供给 4 h 后人工灌喂痢疾志贺菌菌液处于生长稳定期 40 ml 4 h 后进行如下分组处理 A 组人工灌喂 20 ml 噬菌体纯培养液滴度为 pfu/ml B 组人工灌喂 20 ml 链霉素溶液浓度为 0.2% C 组人工灌喂 20 ml 经过灭活处理湿热灭菌锅中 min 的噬菌体培养液在收集粪样时同时观察粪样形态及肉鸡的活动状态样品收集时使用 50 ml 灭菌处理的离心管收集每个试验组的粪便称量粪样重量后加入 20 ml 灭菌处理的 4 0.9% NaCl 溶液充分震荡使粪样完全分散静置 510 min 后取上清供分析采用 SS 培养基分析以上样品中志贺菌的含量

dysenteriae CMCC (B) 51105 为昆明理工大学邓先余博士惠赠以 1% 接种量将活化后的痢疾志贺菌接入 GN 增菌液中 37 150 rpm 震荡培养至生长对数期 OD600 0.2 后 4 冷藏备用 GN 增菌液胰蛋白胨 20 g 葡萄糖 1 g 甘露醇 2 g 柠檬酸钠 5 g 去氧胆酸钠 0.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.

3 第3期孙宇杰等噬菌体 SYJ4 及其对肉鸡痢疾治疗效果的初步探究以时间为横坐标单位重量样品细菌含量为纵坐标绘制出志贺菌数量变化曲线 2 结果与分析 2.1 噬菌体分离及其生物学特征 603 高噬菌体的存活率开始下降 50 和 60 处理 60 min 后滴度分别降至 67% 和 19% 0 处理 60 min 后噬菌体失活说明噬菌体 SYJ4 热稳定性较差在 37 有很好的稳定性同样有助于其在肠道中的生存使用双层平板法分离获得噬菌体的噬菌斑形态图 1 噬菌斑透明边缘清晰直径为 mm 可见此噬菌体为烈性噬菌体对宿主菌有很强的裂解作用命名为 SYJ4 图 2 噬菌体 SYJ4 的一步生长曲线 Fig. 2 Onestep growth curve of bacteriophage SYJ4 图 1 噬菌斑形态 Fig. 1 Bacteriophage plaques on the doublelayer plate 按照感染复数 MOI 为加入噬菌体纯培养液和宿主细菌菌液培养 3.5 h 后所测定的滴度结果见表 1 当 MOI=0.1 时测得滴度为 pfu/ml 为 5 个试验组中的最大值因此最佳感染复数为 0.1 说明噬菌体 SYJ4 具有较强的侵染能力表 1 噬菌体 SYJ4 最佳感染复数测定 Table 1 The determination of bacteriophage SYJ4 on optimal multiplicity of infection (MOI) 试验组宿主菌数量噬菌体数量 MOI h 后噬菌体效价 pfu/ml 通过噬菌体 SYJ4 的一步生长曲线图 2 可知噬菌体潜伏期约为 20 min 裂解期约为 120 min 经计算噬菌体感染宿主菌的裂解量约为 50 噬菌体 SYJ4 的潜伏期裂解期和裂解量和大肠杆菌噬菌体类似裂解量高更有利于提高侵染的速率使用不同温度处理噬菌体 SYJ4 后进行感染实验表明图 3 37 处理后噬菌体滴度剩余最大而低温下噬菌体滴度减少不大随着温度的升图 3 温度对噬菌体活性的影响 Fig. 3 Effect of temperature on bacteriophage activity 噬菌体 SYJ4 的最适 ph 范围为 6 图 4 在 7.3 左右剩余滴度最高在 ph 10 和 ph 6 时噬菌体滴度下降较快当 ph=10.2 时噬菌体的滴度剩余 6 10 pfu/ml 仅为起始噬菌体活性的 % ph 为 47 时噬菌体的滴度下降较 ph 为 710 时更加快表明 SYJ4 噬菌体对碱性环境的耐受性较酸性环境更强一些噬菌体 SYJ4 的 ph 值适应性有助于其在肠道 ph 环境中生存图 4 ph 对噬菌体活性的影响 Fig. 4 Effect of ph value on bacteriophage activity

2 Onestep growth curve of bacteriophage SYJ4 图 1 噬菌斑形态 Fig. 1 Bacteriophage plaques on the doublelayer plate 按照感染复数 MOI 为 0.001 0.01 0.1 1 10 加入噬菌体纯培养液和宿主细菌菌液培养 3.5 h 后所测定的滴度结果见表 1 当 MOI=0.

4 噬菌体治疗试验对所有试验组在饲喂菌液 4 h 后的症状观察表明表 2 它们均出现下痢症状同时开始减少进食量直至停止进食活动量减少至几乎不再运动饲喂菌液 12 h 后 A B 组均开始逐步增加进食量活动量逐步恢复至饲喂菌液前水平粪便逐步由水样转变为绿便最终转变为黄色大颗粒状而 C 组则恢复缓慢粪样均为水样或绿便可见噬菌体和链霉素均具有明显的治疗表 2 不同试验组症状变化比较 Table 2 The comparison of symptom changes in the different treatment groups 处理组噬菌体治疗组链霉素治疗组空白对照组时间段 h 进食量运动量粪样形态水样白便后为绿色颗粒状固体黄色颗粒状水样白便绿色颗粒状固体第 36 卷志贺氏活菌量开始下降在 10 h 时间段内平均下降速度约为 cfu/(g.min) 16 h 后基本稳定至 103 cfu/g 为喂菌前水平 C 组空白对照组饲喂菌液约 2 h 后单位重量粪样的志贺氏活菌量开始显著上升于约 6 h 后达到最高值达到 2 10 cfu/g 鲜重之后志贺氏活菌量开始缓慢下降在 20 h 时间段内平均下降速度约为 cfu/(g.min) 饲喂菌液后在 16 h 内未能恢复至喂菌前水平对 A 组噬菌体治疗组中噬菌体数量变化分析表明图 6 噬菌体呈阶梯上升于约 11 h 达到峰值最高时滴度达到 6 10 pfu/g 鲜重左右随后开始下降随着志贺氏菌量的急剧减少噬菌体数量随后也显著下降并维持在较低的水平这有利于进一步控制志贺氏菌的增殖水样白便后为绿色颗粒状固体注表示正常水平 + 表示亚正常水平表示不正常进一步对不同试验组粪便样品中志贺氏细菌数量变化研究表明 A 组噬菌体治疗组饲喂菌液约 2 h 后单位重量粪样的志贺氏活菌量开始显著上升于约 h 后达到最高值达到 cfu/g 鲜重之后志贺氏活菌量开始下降在 1012 h 时间段内平均下降速度约为 cfu/(g.min) 15 h 后基本稳定至 103 cfu/g 图 5 为喂菌前水平图 5 试验组志贺氏细菌变化 Fig. 5 The concentration change of Shigella during the treatment time B 组链霉素治疗组饲喂菌液约 3 h 后单位重量粪样的志贺氏活菌量开始显著上升于约 h 后达到最高值达到 cfu/g 鲜重之后图 6 A 组噬菌体和志贺氏细菌变化 Fig. 6 The concentration changes of Shigella and phages in group A 3 讨论志贺氏菌是重要的食源性病原菌之一目前临床主要以抗生素治疗痢疾但耐药菌株的出现和增加局限了抗生素治疗方式 [14] 而噬菌体与传统的抗生素比较具有特异杀菌特点且可随宿主菌共同进化因此不易产生抗性菌株 Gohary 等 [15] 将噬菌体喷洒在鸡舍中来阻止肉鸡的大肠杆菌病使肉鸡死亡率显著下降 P 0.05 Kim 等 [16] 研究了将噬菌体作为肉鸡日粮添加剂后对不同饲养环境中肉鸡生长状况和盲肠菌群变化的影响情况表明噬菌体可以促进肉鸡生长并可以降低宿主病原菌的数量 Kim 等 [17] 评价了肠炎沙门氏菌噬菌体作为肉鸡饲料来抑制肠炎沙门氏菌的效果表明除了可以降低肠炎沙门氏菌造成的死亡率外将噬菌体以 0.2% 的浓度加入饲料中对肉鸡生长不会造成消极影响本试验测定了 SYJ4 的生理特性当以感染复数 MOI 为 0.1 时接种滴度较高为 pfu/ml 在一步生长曲线中可以看出噬菌体 SYJ4

不同试验组症状变化比较 Table 2 The comparison of symptom changes in the different treatment groups 处理组噬菌体治疗组链霉素治疗组空白对照组时间段 h 进食量运动量粪样形态 02 220 2072 水样白便后为绿色颗粒状固体黄色颗粒状 02 220 2072 02 220 水样白便 2072 +

5 第3期 605 孙宇杰等噬菌体 SYJ4 及其对肉鸡痢疾治疗效果的初步探究的潜伏期较短为 20 min 长于张辉等报道的痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae 噬菌体潜伏期为 10 min 但短于 Turner 等 [19] 介绍的沙门氏噬菌体 vb_ SenSEnt1 潜伏期为 20 min 与大肠杆菌噬菌体平均潜伏期 2527 min 相似 [1] 本试验表明痢疾志贺氏菌 S. dysenteriae CMCC B 可导致肉鸡出现明显下痢症状而链霉素和噬菌体 SYJ4 均对其有类似的治疗效果且噬菌体 SYJ4 在控制鸡肠道志贺氏菌群数量上有一定的优势综上所述本实验所分离到的噬菌体能为取代抗生素用于控制禽畜肠道致病菌提供可行的办法 [1] 参考文献 [1] Ugorakova J, Bukovska G. Lysins and holins: Tools of phageinduced lysis[j]. Biologia, 2003, 5(3): [2] 高成秀, 严亚贤. 噬菌体治疗制剂的研究进展 [J]. 中国兽医科学, 2007, 37(7): Gao C X, Yan Y X. Advance in bacteriophages as therapeutic agents[j]. Veterinary Science in China. 2007, 37(7): [3] Tiwari R, Chakraborty S, Dhama K, et al. Wonder world of phages: potential biocontrol agents safeguarding biosphere and health of animals and humans current scenario and perspectives[j]. Pakistan Journal of Biological Sciences, 2014, 17(3): [4] Daniells S. FDA approves viruses as food additive for meat[z]. [5] Miller R W, Skinner J, Sulakvelidze A, et al. Bacteriophage therapy for control of necrotic enteritis of broiler chickens experimentally infected with clostridium perfringens[j]. Avian Diseases, 2010, 54(1): [6] Huff W E, Huff G R, Rath N C, et al. Method of administration affects the ability of bacteriophage to prevent colibacillosis in 1dayold broiler chickens[j]. Poultry Science, 2013, 92(4): [7] von Seidlein L, Kim D R, Ali M, et al. A multicentre study of Shigella diarrheain in six Asian countries: Disease burden, clinical manifestations, and microbiology[j]. PLoS Medicine, 2006, 3(e3539): [] Adams M H. Bacteriophages[M]. New York: Interscience, Li L P, Zhang Z Y. Isolate virulent phage of staphylococcus aureus and the study of the approach to optimal condition for preservation[j]. Chinese Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2011, 3(6): [10] Gill J J, Hyman P. Phage choice, isolation, and preparation for phage therapy[j]. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2010, 11(1): 214. [11] Khan Mirzaei M, Nilsson A S. Isolation of phages for phage therapy: A comparison of spot tests and efficiency of plating analyses for determination of host range and efficacy[j]. PLoS One, 2015, 10(3): e DOI: /journal.pone [12] Lau G L, Sieo C C, Tan W S, et al. Characteristics of a phage effective for colibacillosis control in poultry[j]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2012, 92(13): [13] Trevisan R B, Nakagi V S, Bravo P T, et al. Feeding programs and their effects on broiler performance and economic indexes[j]. Journal of Applied Poultry Research, 2014, 23(4): [14] 赵庆友, 朱瑞良. 噬菌体制剂的研究现状及发展前景 [J]. 中国兽药杂志, 2010, 44(7): Zhao Q Y, Zhu R L. Recent advances and prospects in bacteriophage therapy[j]. China Journal of Veterinary Medicine, 2010, 44(7): [15] ElGohary F A, Huff W E, Huff G R, et al. Environmental augmentation with bacteriophage prevents colibacillosis in broiler chickens[j]. Poultry Science, 2014, 93(11): [16] Kim J H, Kim J W, Lee B B, et al. Effect of dietary supplementation of bacteriophage on growth performance and cecal bacterial populations in broiler chickens raised in different housing systems[j]. Livestock Science, 2014, 170: [17] Kim K H, Lee G Y, Jang J C, et al. Evaluation of antise bacteriophage as feed additives to prevent Salmonella enteritidis (se) in broiler[j]. AsianAustralasian Journal of Animal Sciences, 2013, 26(3): [1] 张辉, 王冉, 包红朵. 裂解性福氏志贺氏菌噬菌体 SFA2 的生物学特性及其在巴氏杀菌牛奶中的灭菌效果 [J]. 食品科学, 2010, 31(23): Zhang H, Wang R, Bao H D. Biological characteristics of lytic SFA2 phage and its sterilization effect in milk[j]. Food Science, 2010, 31(23): [19] Turner D, Hezwani M, Nelson S, et al. Characterization of the salmonella bacteriophage vb_sensent1[j]. Journal of General Virology, 2012, 93(9): [9] 李陇平, 张智英. 金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的分离鉴定和最佳保存方法研究 [J]. 中国畜牧兽医, 2011, 3(6): 责任编辑童成立

dysenteriae CMCC B 51105 可导致肉鸡出现明显下痢症状而链霉素和噬菌体 SYJ4 均对其有类似的治疗效果且噬菌体 SYJ4 在控制鸡肠道志贺氏菌群数量上有一定的优势综上所述本实验所分离到的噬菌体能为取代抗生素用于控制禽畜肠道致病菌提供可行的办法 [1] 参考文献 [1] Ugorakova J, Bukovska G.

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Microsoft Word - 793-797 tb20150504赵宏宇s-高校教改纵横.doc 微生物学通报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Apr. 20, 2016, 43(4): 793 797 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150504 高校教改纵横生物工程专业发酵课程群建设探索 * 赵宏宇