44 天津工业大学学报第 34 卷 [6] 裂, 内溶物渗出而死. 本文为进一步提高 G 的抗菌性能, 通过改进的 Hummers 法制备了氧化程度较高的 G, 并对其进行季铵盐功能化改性. 替代

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励尹
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1 第 34 卷第 2 期 2015 年 4 月天津工业大学学报 JURAL F TIAJI PLYTEHI UIVERSITY Vol.34 o.2 April 2015 石墨烯基季铵盐的制备及其抗菌性能张华, 孙庆德, 王瑞芳, 张雯, 张凤 ( 天津工业大学改性与功能纤维天津市重点实验室, 天津 ) 摘要 : 为提高氧化石墨烯的抗菌性能, 对其进行功能化改性, 包括羧基化改性 (G-H) 和氨基化改性 (), 最终得到石墨烯基季铵盐 (). 通过透射电镜红外光谱分析 X 衍射 X 光电子能谱对中间产物和终产物进行了表征, 并通过紫外 - 可见光光谱仪和扫描电镜等测试表征了 G G-H 和对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的抗菌性能. 结果表明 : 对大肠杆菌的抑菌率达到 86.1%, 对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到 95.3%, 是一种有潜力的生物医用材料. 关键词 : 石墨烯 ; 季铵盐 ; 抗菌性能 ; 功能化中图分类号 :613.71;TQ455 文献标志码 : A 文章编号 : X(2015) Fabrication and antibacterial activity of graphene based quaternary ammonium salt ZH Hua, SU Qing-de, W Rui-fang, ZH Wen, ZH Feng (Tianjin Municipal Key Laboratory of Fiber Modification and Functional Fiber, Tianjin Polytechnic University, Tianjin , hina) Abstract: Graphene based quaternary ammonium salt ()has been fabricated through a series of derivative of graphene such as carboxylated graphene oxide(g-h), amino-functionalization graphene oxide () in the aim of enhancing the antibacterial properties of graphene oxide. The different functionalized G were characterized by transmission electron microscope (TEM), Fourier-transform infrared (FT-IR) spectroscopy, X-ray diffraction (XRD) and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). The antibacterial activity to Gram-negative Escherichia coli (E. coli) and Gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus) of G, G-H and were com 鄄 pared by UV-Vis spectrometer and scanning electron microscope (SEM). The results indicated that the antibac 鄄 terial rates of are 86.1% and 95.3% to E. coli and S. aureus, respectively. So is a promising new material for biological and medical applications. Key words: graphene; quaternary ammonium salt; antibacterial activity; functionalization 石墨烯 (G) 是一种由单层碳原子紧密堆积而成的 2-D 蜂窝状材料, 被认为是富勒烯碳纳米管石墨 [1] (Gt) 的基本结构单元. 石墨烯可用于高速场效应管 (FET) 包括隧道效应三极管的器件材料触摸屏低成本 ID 卡以及 LED PV 等光电器件, 也可作为添加剂用于超级电容器和锂离子电池电极材料, 或作为增强 [2] 剂用于复合材料. 近期, 上海应用物理所物理生物学 [3] 实验室胡文兵等报道了 G 的抗菌特性, 发现 G 的抗菌性源自于它对大肠杆菌细胞膜的破坏, 更重要的是 G 对哺乳动物产生的细胞毒性很小. 随后, 伊朗谢 [4] 里夫理工大学 Akhavan 等进一步研究了 G 和还原石墨烯 (rg) 对革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌的毒性作用. 新加坡南洋理工大学的陈元教授报道了 Gt 氧化石墨 (Gt) G rg 的抗菌性能和抗菌机理, 并探讨了膜压和氧压对其抗菌活性的 [5] 影响. 以上研究表明, 石墨烯可以作为有效的新型抗菌材料. 季铵盐类抗菌剂也是一种高效抗菌剂, 其阳离子吸引带负电荷的细菌细胞壁, 长链烷基接触到细菌细胞壁的另一侧, 作用于细菌细胞表层, 破坏细胞的细胞壁和细胞膜. 其作用方式有两种 : 一种是长链烷基破坏细菌的细胞壁而杀死细菌 ; 另一种是由于受抗菌剂阳离子的吸引, 细菌负电荷减少, 继而细胞壁破收稿日期 : 基金项目 : 天津市应用基础与前沿计划重点项目 (13JZDJ32100) 第一作者 : 张华 (1961 ), 女, 博士, 教授, 研究方向为抗菌纳米材料. hua1210@126.com

2 44 天津工业大学学报第 34 卷 [6] 裂, 内溶物渗出而死. 本文为进一步提高 G 的抗菌性能, 通过改进的 Hummers 法制备了氧化程度较高的 G, 并对其进行季铵盐功能化改性. 替代石墨烯片层 ): H a la H a Hl H 1 实验部分 H a H 1.1 实验药品与仪器所用药品包括 : 石墨 (Gt),8 000 目, 化学纯, 天津市光复精细化工研究所产品 ;2-(7- 偶氮苯并三氮唑 )-,,,- 四甲基脲六氟磷酸酯 (HATU), 分析纯, 天津市光复精细化工研究所产品 ;,- 二甲基 1,3- 丙二胺, 分析纯, 天津市化学试剂研究所产品 ; 五氧化二磷, 过硫酸钾, 浓硫酸 (98%), 高锰酸钾, 硝酸钠, 双氧水 (30%), 盐酸 (36%~38%) 等, 上海试剂一厂产品 ; 次氯酸,3- 氯 -1,2- 丙二醇, 盐酸, 蛋白胨, 酵母浸粉等, 天津市科密欧化学试剂有限公司产品. 所用仪器包括 :UEIR22 型傅里叶变换红外光谱仪, 德国 BRUKER 公司产品 ;K-alpha X 型 X 射线光电子能谱仪, 英国 Thermo Scientific 公司产品 ;JEM- 2010FEF 型透射电子显微镜,HitachiS-4800 型场发射扫描电子显微镜, 日本 ikon 公司产品 ;D/MAX 2500 型 X 射线衍射仪, 日本 Rigaku 公司产品 ;TU-1901 型紫外可见分光光度计, 北京普析通用仪器公司产品. 1.2 氧化石墨烯的制备将 40 ml 浓硫酸加热至 90, 在机械搅拌的同时加入 8.4 g 过硫酸钾和 8.4 g 五氧化二磷, 混合均匀后降温至 80, 加入 10 g Gt, 恒温水浴反应 4.5 h. 将反应物过滤, 并用蒸馏水洗涤残留的酸, 置于真空烘箱 [7] 于 60 烘干, 得到预氧化石墨. 将 5 g 预氧化石墨加至 130 ml 浓硫酸 ( 冰水浴 ) 中, 机械搅拌反应 30 min; 然后加入 2 g a 3, 待固体完全溶解后缓慢加入 25 g 高锰酸钾, 并将温度升高至 35, 反应 90 min; 用注射器加入 230 ml 蒸馏水, 立即转移到 95 油浴中反应 5 min, 把混合物倒至 ml 的烧杯中滴加 12.5 ml 30% 双氧水趁热过滤, 得到枯黄色固体 ; 加入 10% 稀盐酸 10 ml, 洗涤离心 3 遍, 用蒸馏水洗涤至中性 ; 将离心后固体放置于冷冻干燥 [8-10] 机中干燥 3 d, 置于干燥器中保存. 1.3 羧基化石墨烯的制备将 100 mg G 分散于 100 ml 蒸馏水中, 超声处理 1 h, 得到均匀溶液. 在 G 悬浮液中加入 1.2 g ah 和 1.0 g 氯乙酸, 水浴超声 2 h, 加入适量的稀盐酸得到 [11] 均匀分散的水溶液. 再经过滤水洗干燥后得到 G-H. 其化学反应示意如下 ( 其中用 3 个六圆环 1.4 氨基化石墨烯 () 的制备将 100 mg G-H 分散于 100 ml DMF 中, 于 30 机械搅拌下超声 1 h, 加入 10 ml 的, - 二甲基 1,3- 丙二胺反应 1 h, 加入 10 mg 的偶联剂 HATU, 转入 60 的水浴, 冷却回流 6 h, 用 ml 乙醇稀释产物, 过滤后得到 [12-13]. 化学反应示意如下 : 1.5 石墨烯基季铵盐 () 的制备将 100 mg 分散于 100 ml 蒸馏水中, 加入 1 ml 质量分数为 36.5 % 的浓盐酸. 加入 11 g3- 氯 -1,2- 丙二醇, 冷凝回流 6~7 h. 将得到的产物用水和乙醇交替洗涤 3 次, 离心后得到产物 [14]. 化学反应示意如下 : H3 + H H H 1.6 结构表征针对干燥至恒重的 Gt G G-H 和 : 在室温下采用 UEIR22 型傅里叶变换红外光谱仪 (FT-IR) 测试其 400~4 000 cm -1 吸收光谱 ; 采用 K- alpha X 型 X 射线光电子能谱仪 (XPS) 分析其表面元素和含量 ; 采用 JEM-2010FEF 型透射电子显微镜 (TEM) 观察石墨烯形貌, 加速电压 100 kv; 采用 D/ MAX-2500 型 X 射线衍射仪对其进行 X 射线衍射 (XRD) 分析,u 靶 Kα1 线, 波长为 nm, 扫描速率为 2 /min, 扫描范围 (2θ) 为 3 ~ 抗菌实验 H + l H H H l H + H H H + H H (1) 细菌生长曲线的测定. 在固体琼脂板上取单菌落, 接种到预先添加有灭菌过的液体培养基的三角瓶中, 然后放置在 37 恒温振荡仪中以 140 r/min 孵育 24 h. 取 5 ml 过夜培养的菌液, 以 r/min 离 H3 H H H

纯, 天津市化学试剂研究所产品 ; 五氧化二磷, 过硫酸钾, 浓硫酸 (98%), 高锰酸钾, 硝酸钠, 双氧水 (30%), 盐酸 (36%~38%) 等, 上海试剂一厂产品 ; 次氯酸,3- 氯 -1,2- 丙二醇, 盐酸, 蛋白胨, 酵母浸粉等, 天津市科密欧化学试剂有限公

3 第 2 期张华, 等 : 石墨烯基季铵盐的制备及其抗菌性能 45 心 5 min, 再用灭菌的生理盐水清洗 3 次, 重悬. 将 200 μl 的悬浊液加入到新鲜的 LB 培养基中, 使得菌液最终体积为 100 ml, 放置到 37 的恒温摇床中以 140 r/ min 培养, 每隔 2 h 从三角瓶中取样 3 ml 放入灭菌离心管中, 放在 4 的冰箱中储存. 直至 26 h 后, 采用 TU 型紫外可见分光光度计测出所得到溶液的.D. 600 nm 值 ( 波长为 600 nm 的光密度值 ) [15-16]. 以培养时间为横坐标,.D.600 nm 值为纵坐标绘制生长曲线. (2) 抑菌率的测定. 按照测生长曲线的办法培养细菌, 取 1 ml.d.600 = 0.1 的菌悬液分别和 100 μl 的无菌水 ( 空白对照组 ) 抗菌剂混合后, 接着转移至 15 ml 的灭菌试管中, 之后加入 10 ml 的液体培养基. 在 r/min 条件下震荡 2 h. 用 200 μl 稀释 10 万倍处理后的菌悬液铺平板, 放置在 37.5 恒温培养箱中培养 24 h. 采用 HitachiS-4800 型场发射扫描电子显微镜 (SEM) 观察处理前后细菌的细胞形态. 本实验中的抗菌剂有 G( μg/ml) G-H(100 μg/ml) (100 μg/ml) 的水溶液. [17] 空白对照实验为加入 100 μl 的无菌水. 抑菌率 =( 空白样的菌落数 - 抗菌剂处理后的菌落数 )/ 空白样的菌落数 100% [18]. 2 结果与讨论 2.1 结构分析图 1 所示为各种功能化石墨烯的红外光谱图. 透过率 G G-H 波数 /cm -1 图 1 各种功能化石墨烯的红外光谱图 Fig.4 FT-IR spectra of G, G-H, and 由图 1 可知,G 在 cm -1 处分别为 H () 伸缩振动峰. 与 G 相比,G H 的 H 峰强度减弱, 峰增强, 且向高波数移动, 峰位置在 cm -1 处, 说明 G 上的羟基向羧基转变. 在 cm -1 处出现 H 的伸缩振动峰,2 924 cm -1 处为甲基的 H 伸缩振动峰,1 710 cm -1 处为键的伸缩振动峰,1 350 cm -1 处为新增的伸缩振动峰, 说明氨基化过程中形成了共价键. 在 cm -1 处出现 H 的伸缩振动峰, cm -1 处出现 H 3 和 H 2 的 H 伸缩振动峰,1 710 cm -1 处为的伸缩振动峰,1 350 cm -1 为的伸缩振动峰, 由此可知石墨烯基季铵盐具有 H H 3 H 2 等官能团. 图 2 所示为各种功能化石墨烯的 X 光电子能谱图. 光电子数 Gt G G-H 结合能 /ev 图 2 Gt 和各种功能化石墨烯的 X 光电子能谱图 Fig.2 XPS spectra of Gt,G,G-H, and 由图 2 可知, 在和 ev 处的峰分别归属于碳氮氧的特征峰. Gt 中氧碳质量比为 3.19/ 96.81,G 中氧碳质量比为 56.48/43.52, 相比 Gt 而言其氧含量大幅度提高, 这主要是因为 G 上具有丰富的羟基羧基环氧基等. G-H 中氧碳质量比为 61.05/38.42, 其氧含量相对于 G 中的氧含量有所增加, 主要是由于 G 上的羟基和环氧基部分转化成了羧基. 和相对于 G-H 在 ev 处出现了氮的特征峰, 氮含量分别为 5.81% 和 4.34%, 这主要是因为上形成了共价键, 引入了元素导致的. 相对碳质量分数减少, 氧质量分数增加, 主要是由于 3- 氯 -1,2- 丙二醇被成功地接枝, 引入了羟基. 2.2 尺寸大小和晶体结构图 3 所示为的透射电镜图片. 500 nm 图 3 的透射电镜图 Fig.3 TEM micrograph of

直至 26 h 后, 采用 TU- 1901 型紫外可见分光光度计测出所得到溶液的.D. 600 nm 值 ( 波长为 600 nm 的光密度值 ) [15-16]. 以培养时间为横坐标,.D.600 nm 值为纵坐标绘制生长曲线. (2) 抑菌率的测定.

4 天 46 津工业由图 3 可以看出层数较少且透明卷曲褶大学学第 34 卷报 G 无菌水 G-H 皱仅有几个微米大小. 图 4 所示为 Gt 和各种功能化石墨烯的 XRD 图. 2θ = 26.5 d = 0.34 nm Gt 强度 2θ = θ = 8.4 d = 0.81 nm d = 1.05 nm a 处理大肠杆菌 G G-H θ/ 图 4 Gt 以及功能化石墨烯的 XRD 曲线图 Fig.4 XRD patterns of Gt G G-H and 由图 4 可知天然 Gt 在 2θ = 26.5 有个很强的特征衍射峰是 002 晶面的特征衍射峰其层间距为 d = 0.34 nm. G 的特征衍射峰出现在 2θ = 10.9 其晶面间距明显增大为 0.81 nm. 这是由于浓硫酸的插层作用和高锰酸钾的强氧化作用使得其面上增加了大量羟基和环氧基等官能团面间距增大. G-H 的特征衍射峰出现在 2θ = 8.4 晶面间距进一步增大为 1.05 nm. 和无特征衍射峰主要是由于随着链长的进一步增长石墨烯片层剥离得到寡层层间呈无序排列. 2.3 抗菌性能图 5 所示为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长 b 处理金黄色葡萄球菌图6 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌平板计数图 Fig.6 Plate count photographs of E. coil and S. aureus 由图 6 可知处理前大肠杆菌的数目为 166 个经过 G G-H 处理后菌数分别为和 23 个得出 G G-H 的抑菌率分别为 36.7% 69.3%和 86.1% 处理前金黄色葡萄球菌的数目为 212 个经过 G G-H 处理后菌数分别为和 10 个得出 G G-H 的抑菌率分别为 52.8% 78.3% 95.3%. 由此可知羧基化石墨烯的抗菌性能大于 G 可能是因为其活性氧的含量高于 G 更能抑制细菌生长而石墨烯基季铵盐的抗菌性能高于 G 和羧基化石墨烯是因为石墨烯基季铵盐具有可破坏细菌壁的季铵盐支链. 图 7 所示为用处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌前后的扫描电镜图. 曲线图. 2.5 大肠杆菌金黄色葡萄球菌.D.600 nm μm 1.0 b 处理前金黄色葡萄球菌 a 处理前大肠杆菌 μm 生长时间/h 图 5 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长曲线图 Fig.5 Growth curve of E. coli and S. aureus 由图 5 可知,大肠杆菌 4 h 后进入对数生长期 14 h 后进入稳定期对数生长区间为 4~14 h. 与之相对应的金黄色葡萄球菌进入对数期的时间是 6 h 16 h 进入稳定期其对数生长区间为 6~16 h. 图 6 所示为经过无菌水 G G -H 等试剂处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的平板计数图. 1 μm c 处理后大肠杆菌 1 μm d 处理后金黄色葡萄球菌图 7 处理前后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扫描电镜图 Fig.7 SEM images of E. coli and S. aureus before and after having been treated with 由图 7 可以看出处理前大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞结构完整处理后细菌的细胞形态遭到破

9 其晶面间距明显增大为 0.81 nm. 这是由于浓硫酸的插层作用和高锰酸钾的强氧化作用使得其面上增加了大量羟基和环氧基等官能团面间距增大. G-H 的特征衍射峰出现在 2θ = 8.4 晶面间距进一步增大为 1.05 nm. 和无特征衍射峰主要是由于随着链长的进一步增长石墨烯片层剥离得到寡层层间呈无序排列. 2.3 抗菌性能图 5 所示为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长 b 处理金黄色葡萄球菌图6 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌平板计数图 Fig.

5 第 2 期张华, 等 : 石墨烯基季铵盐的制备及其抗菌性能 47 坏, 特别是金黄色葡萄球菌, 几乎全部细胞都遭到破坏. 这主要是因为石墨烯片层尖锐的边缘破坏细胞膜, 季铵盐的阳离子吸引带负电荷的细菌细胞壁, 破坏细菌的细胞壁从而杀死细菌. 3 结论本文以水溶性 HATU 为偶联剂成功制备了, 同时, 制备了高效的碳纳米抗菌剂, 并对其进行结构表征和抗菌性能分析, 研究结果表明 : (1) 随着接枝的官能团越多越长, 功能化石墨烯的层间距也逐渐增大, 氨基化石墨烯和石墨烯季铵盐片层之间是无序堆叠的. (2) 无论是对大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌, 抑菌率大小排序为 : 石墨烯季铵盐 > 羧基化石墨烯 >G. (3) 石墨烯基季铵盐对大肠杆菌的抑菌率达到 86.1%, 对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到 95.3%, 其抗菌性能远高于 G 和羧基化石墨烯. 参考文献 : [1] GEIM A K, VSELV K S. The rise of graphene[j]. ature Materials,2007,6(3): [2] 陈永胜, 黄毅. 石墨烯新型二维碳纳米材料 [M]. 北京 : 科学出版社,2013: [3] HU W B, PEG, LU W J, et al. Graphene-based antibacterial paper[j]. Acs ano,2010,4(7): [4] AKHAVA, GHADERI E. Toxicity of graphene and graphene oxide nanowalls against bacteria[j]. Acs ano,2010,4(10): [5] LIU S, ZEG T H, HFMA M, et al. Antibacterial activity of graphite, graphite oxide, graphene oxide, and reduced graphene oxide:membrane and oxidative stress[j]. Acs ano,2011, 5(9): [6] 李娜, 罗虎. 抗菌剂的应用及发展现状 [J]. 化工技术与开发,2012,10(5): [7] LIU H, HU L, PEG W, et al. Fabrication and characterization of polyamide 6-functionalized graphene nanocomposite fiber[j]. Journal of Materials Science,2012,47(23): [8] HUMMERS W S, FFEMA R E. Preparation of graphitic oxide[j]. Journal of the American hemical Society,1958,4(4): [9] 任小孟, 王源升, 何特. Hummers 法合成石墨烯的关键工艺及反应机理 [J]. 材料工程,2013,10(1):1-5. [10] MARA D, KSYKI D V, BERLI J M, et al. Improved synthesis of graphene oxide[j]. Acs ano,2010,4(8): [11] DU D, W L, SHA Y, et al. Functionalized graphene oxide as a nanocarrier in a multienzyme labeling amplification strategy for ultrasensitive electrochemical immunoassay of phosphorylated[j]. Analytical hemistry,2011,83(3): [12] RAMAATHA T, FISHER F T, RUFF R S, et al. Aminofunctionalized carbon nanotubes for binding to polymers and biological systems [J]. hemistry of Materials,2005,17(6): [13] YA J L, HE G J, A J, et al. Functionalized graphene oxide with ethylenediamineand 1,6-hexanediamine [J]. ew arbon Materials,2012,27(5): [14] 徐浩, 许虎君, 陈玲, 等. 脂肪酰胺丙基, 二甲基 2,3- 二羟丙基氯化铵的合成及性能 [J]. 精细化工石油,2012,3 (1):1-4. [15] LI J, W G, ZHU H, et al. Antibacterial activity of largearea monolayer graphene film manipulated by charge transfer [J]. Scientific Reports,2014,4(1):1-8. [16] SHI Q, VITHULI, WAK J H, et al. Durable antibacterial Ag/polyacrylonitrile (Ag/PA)hybrid nanofibers prepared by atmospheric plasma treatment and electrospinning[j]. European Polymer Journal,2011,47(7): [17] W Y W, A A, JI Y, et al. Superior antibacterial activity of zinc oxide/graphene oxide composites originating from high zinc concentration localized around bacteria[j]. AS Applied Materials & Interfaces,2014,6(4): [18] HE J, PEG H, W X, et al. Graphene oxide exhibits broad -spectrum antimicrobial activity against bacterial phytopathogens and fungal conidia by intertwining and membrane perturbation[j]. anoscale,2014,6(3):

3 结论本文以水溶性 HATU 为偶联剂成功制备了, 同时, 制备了高效的碳纳米抗菌剂, 并对其进行结构表征和抗菌性能分析, 研究结果表明 : (1) 随着接枝的官能团越多越长, 功能化石墨烯的层间距也逐渐增大, 氨基化石墨烯和石墨烯

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