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1 九 十 五 學 年 度 國 立 嘉 義 大 學 - 教 育 部 教 學 卓 越 計 畫 子 計 畫 A 研 發 跨 領 域 多 元 適 性 課 程 與 教 材 -4( 創 意 教 材 之 研 發 ) 微 生 物 學 實 驗 Laboratory Experiments in Microbiology 國 立 嘉 義 大 學 微 生 物 與 免 疫 學 系 編 中 華 民 國 九 十 六 年 五 月

2 微 生 物 學 實 驗 目 錄 週 次 題 目 撰 寫 老 師 頁 次 目 錄 蔡 竹 固 1 編 輯 說 明 蔡 竹 固 2 實 驗 一 實 驗 環 境 與 儀 器 設 施 的 認 識 與 操 作 及 實 驗 室 安 全 規 則 蔡 竹 固 3 實 驗 二 微 生 物 觀 察 蔡 竹 固 16 實 驗 三 細 菌 染 色 蔡 竹 固 24 實 驗 四 細 菌 的 純 系 培 養 朱 紀 實 31 實 驗 五 細 菌 的 生 長 曲 線 朱 紀 實 39 實 驗 六 影 響 微 生 物 生 長 的 環 境 因 子 翁 博 群 46 實 驗 七 微 生 物 的 代 謝 ( 一 ) 謝 佳 雯 55 實 驗 八 微 生 物 的 代 謝 ( 二 ) 謝 佳 雯 60 實 驗 九 細 菌 生 長 的 控 制 翁 博 群 69 實 驗 十 細 菌 的 遺 傳 特 性 ( 一 ) 翁 炳 孫 78 實 驗 十 一 細 菌 的 遺 傳 特 性 ( 二 ) 翁 炳 孫 81 實 驗 十 二 噬 菌 體 的 培 養 黃 襟 錦 86 實 驗 十 三 真 菌 的 培 養 與 觀 察 蔡 竹 固 89 實 驗 十 四 環 境 中 的 微 生 物 蔡 竹 固 94 實 驗 十 五 免 疫 學 基 本 技 術 莊 晶 晶 99 實 驗 十 六 人 類 皮 膚 細 菌 的 分 離 與 鑑 定 黃 襟 錦 102 1

3 編 輯 說 明 本 校 生 命 科 學 院 為 強 化 大 學 部 同 學 之 基 礎 科 目 教 學, 自 95 學 年 度 起, 於 生 命 科 學 院 各 學 系 大 一 下 學 期 開 授 必 修 微 生 物 學 3 學 分 與 微 生 物 學 實 驗 1 學 分, 讓 同 學 對 基 礎 微 生 物 學 知 識 微 生 物 種 類 有 初 步 的 認 識, 做 為 修 習 各 專 業 微 生 物 學 生 物 技 術 學 程 的 先 修 課 程 本 校 之 農 學 院 農 業 生 物 科 技 學 系 動 物 科 學 系 生 命 科 學 院 之 食 品 科 學 系 ( 所 ) 生 物 資 源 學 系 水 生 生 物 學 系 分 子 與 生 物 化 學 系 等, 均 需 開 設 必 修 或 選 修 之 微 生 物 學 及 實 驗 課 程, 自 93 學 年 度 起, 微 生 物 與 免 疫 學 系 ( 以 下 簡 稱 本 系 ) 著 手 規 劃 適 合 各 學 系 所 要 求 之 微 生 物 學 與 實 驗 課 程, 以 收 統 籌 及 充 實 教 學 實 驗 之 儀 器 設 備, 避 免 教 材 深 淺 不 一, 不 利 學 習 儀 器 設 備 閒 置, 浪 費 空 間 之 弊 由 本 系 及 相 關 系 所 師 資 加 以 討 論 整 合 後, 訂 有 課 程 大 綱 指 定 教 科 書 考 古 題 實 習 講 義 意 見 反 應 與 答 覆 等 互 動 機 制, 再 召 開 系 所 課 程 規 劃 委 員 會 系 所 務 會 議 討 論 為 配 合 本 校 95 年 教 學 卓 越 計 畫 子 計 畫 A(A-4-1 創 意 教 材 之 研 發 ) 計 畫 之 執 行, 乃 有 編 訂 適 合 生 命 科 學 領 域 學 生 一 學 期 使 用 之 微 生 物 學 整 合 教 學 實 驗 課 程 教 材 的 構 想, 於 95 年 9 月 29 日, 經 本 系 所 務 會 議 討 論 通 過 後, 擇 定 實 驗 環 境 與 儀 器 設 施 的 認 識 與 操 作 及 實 驗 室 安 全 規 則 微 生 物 觀 察 細 菌 染 色 細 菌 的 純 系 培 養 細 菌 的 生 長 曲 線 影 響 微 生 物 生 長 的 環 境 因 子 微 生 物 的 代 謝 細 菌 生 長 的 控 制 細 菌 的 遺 傳 特 性 噬 菌 體 的 培 養 真 菌 的 培 養 與 觀 察 環 境 中 的 微 生 物 免 疫 學 基 本 技 術 人 類 皮 膚 細 菌 的 分 離 與 鑑 定 等 實 驗 課 程 內 容 由 各 負 責 老 師 著 手 撰 寫, 初 稿 完 成 之 後, 並 送 請 學 者 專 家 進 行 審 訂, 再 由 各 撰 寫 老 師 加 以 修 正 自 96 年 開 始, 本 校 為 提 昇 教 學 品 質, 配 合 教 學 卓 越 計 畫 之 實 施, 推 出 教 學 助 理 制 度, 由 本 校 在 學 學 生 協 助 教 師 進 行 教 學 活 動, 配 合 實 驗 課 之 需 要, 在 授 課 老 師 指 導 監 督 下, 帶 領 修 課 同 學 進 行 分 組 實 驗 其 具 體 工 作 內 容 包 括 : 協 助 教 師 準 備 上 課 資 料 準 備 試 劑 預 作 課 程 實 驗 協 助 學 生 操 作 實 驗 督 導 實 驗 室 安 全 課 後 清 理 實 驗 室 進 行 實 驗 相 關 之 討 論 協 助 批 改 實 驗 報 告 及 評 分 設 計 並 維 護 課 程 網 頁, 以 及 其 他 相 關 教 學 輔 助 工 作 有 了 微 生 物 學 整 合 教 學 實 驗 課 程 教 材, 並 於 本 課 程 網 頁 張 貼, 搭 配 教 學 助 理 制 度, 必 可 使 微 生 物 學 實 驗 操 作 印 證 正 課 教 學 內 容, 為 大 一 同 學 札 下 深 厚 的 基 礎 微 生 物 學 整 合 教 學 實 驗 課 程 教 材 容 或 有 不 周 延 之 處, 尚 請 各 位 師 生 不 吝 指 教, 以 利 逐 年 教 材 之 增 訂, 使 其 更 臻 完 備 蔡 竹 固 謹 識 國 立 嘉 義 大 學 微 生 物 與 免 疫 學 系 2

4 實 驗 一 微 生 物 學 實 驗 簡 介 一 目 的 介 紹 進 行 微 生 物 學 實 驗 時 必 須 注 意 的 事 項, 包 括 實 驗 室 安 全 守 則, 常 用 實 驗 設 備 的 操 作 原 理 以 及 使 用 方 法 的 說 明 二 材 料 與 設 備 ( 圖 1-1) 1. 藥 品 2. 試 劑 3. 培 養 皿 4. 玻 璃 器 皿 5. 各 種 微 量 吸 管 6. 微 量 塑 膠 吸 管 7. 微 量 塑 膠 吸 管 8. 微 量 離 心 管 9. 圓 形 轉 盤 10. 玻 璃 棒 與 酒 精 燈 11. 接 種 環 與 移 植 針 12. 玻 璃 試 管 13. 蒸 餾 水 14. 無 菌 手 套 15. 吸 管 洗 淨 器 1. 藥 品 2. 試 劑 3

5 圖 1-1 一 般 性 實 驗 器 材 3. 培 養 皿 4. 玻 璃 器 皿 5. 各 種 微 量 吸 管 6. 微 量 塑 膠 吸 管 尖 7. 微 量 塑 膠 吸 管 尖 8. 微 量 離 心 管 9. 圓 形 轉 盤 10. 玻 璃 棒 與 酒 精 燈 4

6 11. 接 種 環 與 移 植 針 12. 玻 璃 試 管 13. 蒸 餾 水 14. 無 菌 手 套 15. 吸 管 洗 淨 器 圖 1-1 一 般 性 實 驗 器 材 ( 續 ) 三 方 法 與 步 驟 ( 一 ) 微 生 物 實 驗 使 用 之 儀 器 介 紹 微 生 物 學 實 驗 室 之 儀 器 設 備 有 高 壓 滅 菌 釜 ( 桌 上 型 快 速 滅 菌 鍋 ) 無 塵 無 菌 操 作 台 恆 溫 培 養 箱 水 浴 振 盪 器 ( 往 復 式 振 盪 恆 溫 水 槽 ) 迴 轉 振 盪 培 養 箱 電 動 天 平 電 泳 設 備 電 泳 照 相 系 統 桌 上 型 離 心 機 過 濾 裝 置 製 冰 機 熱 風 循 環 烘 箱 蒸 餾 水 製 造 機 酸 鹼 度 測 定 計 恆 溫 水 浴 器 低 溫 冰 櫃 (4 ) 磁 石 加 熱 攪 拌 器 厭 氧 培 養 罐 顯 微 鏡 倒 立 顯 微 鏡 桌 上 型 超 高 速 離 心 機 ( 變 頻 式 高 速 冷 凍 離 心 機 ) 恆 溫 乾 浴 器 紫 外 線 透 視 儀 電 動 吸 管 DNA 雜 交 烘 箱 微 生 物 鑑 定 系 統 菌 落 計 數 器 酵 素 免 疫 分 析 儀 流 式 細 胞 儀 PVC 排 氣 煙 櫃 等 學 生 實 驗 儀 器, 以 配 合 教 學 與 研 究 需 求 1. 高 溫 高 壓 滅 菌 器 (Autoclave)( 圖 1-2): 利 用 高 溫 (121 ) 高 壓 (15 lb/in 2 或 1.1 kg/cm 2 ) 作 用 15 至 20 分 鐘, 以 殺 死 所 有 的 微 生 物, 一 般 可 分 為 全 自 動 與 半 自 動 式 兩 種 5

7 圖 1-2 高 溫 高 壓 滅 菌 器 2. 無 菌 操 作 台 (Laminar Flow)( 圖 1-3): 以 多 孔 之 濾 網 利 用 過 濾 之 原 理, 除 去 空 氣 中 之 微 生 物, 使 用 前 先 以 酒 精 拭 淨 台 面, 打 開 紫 外 燈 並 送 風 10 分 鐘 圖 1-3 無 菌 操 作 台 3. 恆 溫 培 養 箱 (Incubator)( 圖 1-4): 為 具 有 溫 度 控 制 裝 置 之 培 養 箱, 是 各 種 微 生 物 培 養 所 必 備 圖 1-4 恆 溫 培 養 箱 6

8 4. 水 浴 振 盪 器 (Water Bath Shaker)( 圖 1-5): 以 水 浴 保 持 溫 度 恆 定, 再 加 上 振 盪 裝 置, 用 於 需 氧 菌 之 液 體 培 養 圖 1-5 水 浴 振 盪 器 5. 電 動 天 平 ( 圖 1-6): 秤 取 培 養 基 各 成 分 及 緩 衝 液 等 所 需 藥 品 之 用 圖 1-6 電 動 天 平 6. 電 泳 裝 置 (Electrophoresis Apparatus)( 圖 1-7): 包 括 電 源 供 應 與 電 泳 槽 等, 可 用 於 分 析 DNA 及 蛋 白 質 圖 1-7 電 泳 裝 置 7

9 7. 桌 上 型 離 心 機 ( 圖 1-8): 為 一 種 小 型 但 高 速 之 離 心 機, 可 用 於 少 量 菌 液 之 離 心, 以 收 集 菌 體 或 用 於 抽 取 DNA 之 用 圖 1-8 桌 上 型 離 心 機 8. 過 濾 裝 置 ( 圖 1-9): 不 能 以 高 溫 滅 菌 之 實 驗 材 料, 可 利 用 濾 膜 過 濾 法 達 無 菌 之 效 果 圖 1-9 過 濾 裝 置 9. 製 冰 機 ( 圖 1-10): 自 動 製 造 碎 冰 圖 1-10 製 冰 機 8

10 10. 烘 箱 (Oven)( 圖 1-11): 用 來 烘 乾 洗 淨 或 滅 完 菌 的 器 皿 圖 1-11 烘 箱 11. 純 水 製 造 機 ( 圖 1-12): 提 供 純 淨 的 純 水 圖 1-12 純 水 製 造 機 12. 酸 鹼 度 測 定 器 (ph meter)( 圖 1-13): 用 來 測 定 溶 液 的 酸 鹼 值 圖 1-13 酸 鹼 度 測 定 器 9

11 13. 恆 溫 水 浴 器 (Water Bath)( 圖 1-14): 酵 素 作 用 時 之 恆 溫 裝 置 圖 1-14 恆 溫 水 浴 器 14. 低 溫 冰 櫃 ( 圖 1-15): 保 存 菌 種 藥 品 血 清 等 圖 1-15 低 溫 冰 櫃 15. 磁 性 攪 拌 器 (Magnetic Stirrer)( 圖 1-16): 配 製 溶 液 與 培 養 基 時 均 勻 混 和 之 用 圖 1-16 磁 性 攪 拌 器 10

12 16. 厭 氧 培 養 罐 (Anaerobic Jar)( 圖 1-17): 用 於 培 養 厭 氧 性 細 菌 時 所 必 須 圖 1-17 厭 氧 培 養 罐 17. 光 學 顯 微 鏡 ( 圖 1-18): 用 於 觀 察 微 生 物 之 外 形 及 其 染 色 特 性 圖 1-18 光 學 顯 微 鏡 18. 桌 上 型 超 高 速 離 心 機 ( 圖 1-19): 抽 取 DNA 時 離 心 之 用 圖 1-19 桌 上 型 超 高 速 離 心 機 11

13 19. 恆 溫 乾 熱 器 ( 圖 1-20): 微 量 試 管 加 熱 時 使 用 圖 1-20 恆 溫 乾 熱 器 20. 紫 外 線 透 視 儀 ( 圖 1-21): 觀 察 凝 膠 內 之 DNA 圖 1-21 紫 外 線 透 視 儀 21. 電 動 吸 管 ( 圖 1-22): 接 上 玻 璃 吸 管 使 用 圖 1-22 電 動 吸 管 12

14 ( 二 ) 微 生 物 實 驗 其 他 注 意 事 項 1. 分 組 :1-10 組 2. 值 日 組 工 作 : (1) 課 前 協 助 準 備 材 料 : 請 與 助 教 協 調, 安 排 課 餘 時 間 至 實 驗 準 備 室, 學 習 實 驗 材 料 之 準 備 (2) 實 驗 時 之 材 料 與 設 備 分 配 至 各 組, 實 驗 後 之 實 驗 室 整 理 (3) 實 驗 課 後 所 使 用 的 試 管 培 養 皿 及 其 他 器 皿 經 滅 菌 後, 值 日 組 同 學 負 責 洗 滌 烘 乾 與 整 理 等 工 作 3. 實 驗 結 束 後, 各 組 同 學 將 桌 面 清 理 乾 淨, 所 用 的 設 備 和 材 料 歸 還 助 教 4. 實 驗 課 後, 親 自 觀 察, 仔 細 觀 察 病 確 實 記 錄, 不 可 抄 襲 別 人 的 數 據 5. 以 實 事 求 是 的 態 度 認 真 完 成 實 驗 報 告, 一 星 期 後 將 實 驗 報 告 交 給 指 導 教 師 批 閱 四 微 生 物 學 實 驗 室 安 全 守 則 1. 如 非 實 驗 需 要, 不 可 擅 入 實 驗 室 實 驗 室 內 嚴 禁 飲 食 與 吸 菸 2. 進 入 實 驗 室 需 著 實 驗 衣 ; 留 長 髮 者, 在 實 驗 進 行 前 最 好 將 頭 髮 束 好 3. 門 窗 關 上 以 減 少 空 氣 流 動 而 引 起 污 染 4. 實 驗 前 後 請 徹 底 洗 淨 雙 手 5. 實 驗 前 後 需 將 桌 面 清 理 乾 淨, 非 操 作 實 驗 必 要 之 物 品 應 放 置 於 置 物 櫃 中, 不 可 堆 放 於 實 驗 桌 上 6. 實 驗 室 內 嚴 禁 站 立 做 實 驗 或 隨 意 走 動 嘻 鬧 7. 吸 管 (pipette) 使 用 後 應 立 即 泡 在 實 驗 桌 下 之 消 毒 桶 中 8. 接 種 針 及 接 種 環 使 用 後, 需 經 火 焰 燒 到 至 通 紅 滅 菌, 再 豎 立 於 試 管 架 上, 不 可 橫 置 於 桌 上 9. 接 種 細 菌 之 各 種 試 管 應 隨 時 豎 立 於 試 管 架 上, 不 可 橫 置 於 桌 上 10. 培 養 基 於 接 種 細 菌 之 前 應 標 明 組 別 菌 名 與 日 期 11. 酒 精 燈 使 用 時 須 謹 慎 小 心, 勿 置 桌 緣 以 免 打 翻 酒 精 燈 之 使 用 請 遠 離 講 義 紙 張 及 有 機 溶 劑 等 易 燃 物 短 時 間 內 不 需 使 用 或 於 補 充 酒 精 時, 請 熄 滅 火 苗 12. 實 驗 中 若 不 小 心 被 菌 液 濺 到, 請 使 用 大 量 清 水 沖 洗, 並 以 70 酒 精 消 毒 菌 液 不 慎 打 翻 時, 留 在 原 地 勿 動, 請 其 他 同 學 報 告 老 師 前 往 處 理 桌 面 或 地 面 有 菌 液 翻 覆 時, 請 以 10 漂 白 水 擦 拭 清 理 13. 勿 將 菌 液 傾 倒 於 水 槽 中 與 細 菌 接 觸 過 的 任 何 容 器 或 培 養 基, 使 用 後, 必 須 13

15 經 過 滅 菌 才 可 丟 棄 14. 實 驗 產 生 之 廢 棄 物 應 分 類 收 集 : 所 有 使 用 過 之 染 料 有 機 溶 劑 等, 應 倒 於 廢 液 收 集 瓶 內, 不 可 任 意 傾 倒 於 水 槽 中 玻 璃 廢 棄 物 應 收 集 於 指 定 的 紙 箱 內 以 便 集 中 回 收 處 理 15. 實 驗 前 值 日 組 同 學 工 作 : 1) 值 日 組 同 學 由 各 組 同 學 輪 流 擔 任, 需 於 實 驗 前 由 助 教 指 導 準 備 當 次 實 驗 之 公 用 藥 品 及 器 材 裝 取 二 次 去 離 子 水 2) 實 驗 前 配 製 實 驗 所 需 之 溶 液 藥 品 時, 應 清 楚 標 示 其 名 稱 成 份 配 製 日 期 配 製 人 姓 名 組 別 於 容 器 外 16. 操 作 各 項 儀 器 時 應 先 詳 閱 使 用 說 明, 並 遵 守 其 使 用 安 全 清 潔 維 護 等 規 定 1) 操 作 高 壓 滅 菌 釜 : 應 注 意 門 是 否 關 緊 未 降 至 常 壓 勿 打 開 門 2) 離 心 機 : 離 心 管 務 必 平 衡 3) 供 電 器 : 可 產 生 極 高 的 電 壓, 當 電 源 開 啟 時, 請 勿 觸 摸 電 極 4) 微 波 爐 : 加 熱 時, 必 須 把 瓶 蓋 或 管 蓋 鬆 開, 以 免 發 生 爆 炸 5)UV 燈 之 使 用 : 使 用 UV transilluminatior 觀 察 膠 片 時, 不 可 直 視, 務 必 使 用 UV 光 不 能 穿 透 之 防 護 板 或 眼 鏡 17. 實 驗 進 行 前 應 確 實 瞭 解 其 目 的 以 及 進 行 步 驟, 方 能 獨 立 操 作 並 於 實 驗 後 分 析 結 果 有 疑 問 時, 應 在 實 驗 前 請 教 任 課 指 導 老 師 任 何 意 外 事 件 發 生 時, 應 做 相 關 的 應 變 措 施, 並 即 刻 通 知 任 課 老 師 及 助 教 處 理 18. 實 驗 完 畢, 須 將 實 驗 室 及 儀 器 設 備 清 理 妥 當 並 恢 復 原 狀, 離 去 前 請 以 肥 皂 洗 淨 雙 手 19. 值 日 組 同 學 負 責 課 後 之 滅 菌 清 洗 及 打 掃 之 工 作 且 必 須 檢 查 相 關 項 目 是 否 符 合 要 求, 最 後 方 能 離 開 實 驗 室 五 問 題 思 考 與 討 論 1. 何 謂 生 物 安 全 等 級? 針 對 各 生 物 安 全 等 級 基 準 與 試 驗 需 求 為 何? 2. 依 操 作 病 原 微 生 物 時 的 安 全 防 護, 可 將 實 驗 室 具 危 害 性 操 作 概 分 為 哪 兩 級 的 防 護 措 施? 14

16 3. 對 於 高 溫 高 壓 滅 菌 器 的 安 全 管 理, 國 內 鍋 爐 及 壓 力 容 器 安 全 規 則 之 規 範 為 何? 4. 說 明 無 菌 操 作 台 (Laminar Flow) 如 何 以 多 孔 之 濾 網 利 用 過 濾 之 原 理, 確 保 操 作 的 安 全 性 六 參 考 資 料 1. 王 進 琦 編 著 1990 微 生 物 學 實 驗 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 市 546 頁 2. 行 政 院 勞 工 委 員 會, 鍋 爐 及 壓 力 容 器 安 全 規 則, 3. 楊 美 桂 編 著 2004 普 通 微 生 物 學 實 驗 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 市 187 頁 4. 衛 生 署 疾 病 管 制 局, 實 驗 室 生 物 安 全, 15

17 實 驗 二 微 生 物 之 觀 察 一 目 的 存 在 於 自 然 界 中 之 微 生 物, 種 類 與 數 目 非 常 多, 由 於 其 極 為 微 小, 無 法 以 肉 眼 看 見, 需 藉 顯 微 鏡 才 能 觀 察 本 實 驗 主 要 讓 同 學 們 瞭 解 顯 微 鏡 之 構 造 與 原 理, 希 望 每 個 人 都 能 夠 正 確 地 使 用 顯 微 鏡, 學 習 觀 察 微 生 物 的 外 型 同 時 還 介 紹 同 學 們 認 識 電 子 顯 微 鏡, 包 括 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 (Transmission Electron Microscope, 簡 稱 TEM) 與 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (Scanning Electron Microscope, 簡 稱 SEM), 除 了 瞭 解 其 解 像 原 理 之 外, 並 認 識 其 用 途 二 材 料 與 設 備 ( 一 ) 菌 種 1. 球 菌 : 金 黃 色 葡 萄 狀 球 菌 (Staphylococcus aureus) 2. 桿 菌 : 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 3. 真 菌 : 酵 母 菌 (Sacchromyces cerevisiae) 青 黴 菌 (Penicillium notatum) ( 二 ) 設 備 1. 載 玻 片 蓋 玻 片 2. 光 學 顯 微 鏡 拭 鏡 紙 3. 無 菌 蒸 餾 水 4. 接 種 環 接 種 針 三 方 法 與 步 驟 ( 一 ) 光 學 顯 微 鏡 之 構 造 與 使 用 ( 如 圖 2-1) 16

18 1. 構 造 : 接 目 鏡 接 物 鏡 (4X, 10X, 40X 與 100X 四 種 鏡 頭 ) 鏡 臂 鏡 台 粗 調 節 輪 細 調 節 輪 光 源 鏡 座 圖 2-1 光 學 顯 微 鏡 之 構 造 2. 操 作 步 驟 : (1) 將 欲 觀 察 之 含 菌 玻 片 置 於 鏡 台 上, 並 將 玻 片 夾 緊 (2) 打 開 電 源, 以 低 倍 鏡 (4X) 觀 察, 找 到 含 菌 之 區 域 (3) 依 次 提 高 接 物 鏡 倍 數 (10X 與 40X), 以 調 節 輪 對 好 焦 距, 仔 細 觀 察 17

19 (4) 於 玻 片 中 心 滴 上 一 滴 油 鏡 專 用 油, 將 油 鏡 (100X) 慢 慢 轉 正, 使 之 接 觸 到 油, 以 細 調 節 輪 調 好 焦 距, 可 看 到 細 菌 明 顯 的 外 型 ( 二 ) 電 子 顯 微 鏡 (Electron Microscope,EM) 之 介 紹 電 子 顯 微 鏡 是 以 電 子 束 取 代 一 般 光 學 顯 微 鏡 所 使 用 之 可 見 光, 當 光 照 射 於 物 體 上, 可 增 加 解 像 力, 故 放 大 倍 數 因 而 提 高, 如 此 可 以 觀 察 到 更 細 微 的 構 造 病 毒 因 為 顆 粒 太 小, 無 法 以 光 學 顯 微 鏡 觀 察, 必 藉 電 子 顯 微 鏡 才 能 看 到 電 子 顯 微 鏡 依 設 計 之 不 同, 可 分 為 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 ( 圖 2-2), 與 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 ( 圖 2-3) 兩 種, 前 者 用 於 觀 察 細 胞 內 部 的 構 造, 後 者 則 為 細 胞 表 面 的 觀 察 圖 2-2 穿 透 式 電 子 顯 微 鏡 (Hitachi H-7100 型 ) ( 李 明 仁 教 授 提 供 ) 圖 2-3 掃 描 式 電 子 顯 微 鏡 (Hitachi S-3500N 型 ) ( 李 明 仁 教 授 提 供 ) 18

20 ( 三 ) 細 菌 菌 落 與 細 胞 之 觀 察 1. 以 肉 眼 觀 察 金 黃 色 葡 萄 狀 球 菌 (Staphylococcus aureus)( 圖 2-4) 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis)( 圖 2-5) 與 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli)( 圖 2-6) 菌 落 之 形 狀 大 小 顏 色 等 特 性, 仔 細 觀 察 並 描 述 之 圖 2-4 金 黃 色 葡 萄 狀 球 菌 菌 落 圖 2-5 枯 草 桿 菌 菌 落 圖 2-6 大 腸 桿 菌 菌 落 19

21 2. 由 以 上 3 種 不 同 的 微 生 物 之 培 養 液 中, 以 接 種 環 取 出 菌 液, 均 勻 塗 抹 於 一 乾 淨 之 載 玻 片 上, 蓋 上 蓋 玻 片 後, 於 光 學 顯 微 鏡 下 觀 察 細 胞 之 外 形, 詳 細 繪 圖 並 紀 錄 之 ( 四 ) 使 用 顯 微 鏡 測 微 尺 測 定 微 生 物 細 胞 大 小 的 原 理 微 生 物 細 胞 的 大 小 是 微 生 物 分 類 鑑 定 的 重 要 依 據 之 一 微 生 物 個 體 微 小, 必 須 借 助 於 顯 微 鏡 才 能 觀 察, 要 測 量 微 生 物 細 胞 大 小, 也 必 須 借 助 於 特 殊 的 測 微 計 在 顯 微 鏡 下 進 行 測 量 顯 微 測 微 計 由 鏡 臺 測 微 尺 (stage micrometer) 和 目 鏡 測 微 尺 (ocular micrometer) 兩 部 分 組 成 鏡 臺 測 微 尺 是 一 塊 中 央 有 精 確 刻 玻 片 ( 圖 2-7), 刻 度 的 總 長 爲 l mm, 等 分 爲 100 小 格, 每 小 格 長 10μm, 專 用 於 對 目 鏡 測 微 計 進 行 標 定 的 目 鏡 測 微 尺 可 直 接 用 於 測 量 細 胞 大 小, 它 是 一 塊 圓 形 玻 片 ( 圖 2-8), 其 中 央 有 精 確 等 分 到 度, 測 量 時 將 其 放 在 接 目 鏡 中 的 隔 板 上 目 鏡 測 微 尺 刻 度 的 總 長 爲 l cm, 等 分 爲 100 小 格, 每 小 格 長 100μm, 由 於 目 鏡 測 微 尺 所 測 量 的 是 微 生 物 細 胞 經 過 顯 微 鏡 放 大 之 後 所 成 像 的 大 小, 刻 度 實 際 代 表 的 長 度 隨 使 用 的 目 鏡 和 物 鏡 放 大 倍 數 及 鏡 筒 的 長 度 而 改 變, 所 以, 使 用 前 須 先 用 鏡 臺 測 微 計 進 行 標 定, 求 出 某 一 放 大 率 下, 目 鏡 測 微 尺 每 一 小 格 所 代 表 的 長 度, 然 後 用 目 鏡 測 微 計 直 接 測 被 測 物 件 的 大 小 圖 2-7 鏡 臺 測 微 尺 圖 2-8 目 鏡 測 微 尺 一 個 目 鏡 測 微 尺 刻 度 校 正 因 子 (calibration factor) 的 計 算 : 一 個 目 鏡 測 微 尺 刻 度 (μm) = 鏡 臺 測 微 尺 上 二 重 疊 線 間 已 知 的 距 離 / 該 二 重 疊 線 間 目 鏡 測 微 尺 的 刻 度 數 20

22 例 1: 假 如 二 重 疊 線 間 已 知 的 距 離 為 2 個 鏡 臺 測 微 尺 刻 度 (2 X 10μm), 對 應 13 個 目 鏡 測 微 尺 刻 度, 則 每 一 目 鏡 測 微 尺 刻 度 的 校 正 因 子 = 20μm / 13 = 1.54μm. 例 2: 假 如 以 目 鏡 測 微 尺 觀 察 某 一 微 生 物, 長 度 為 5 個 目 鏡 測 微 尺 刻 度, 則 微 生 物 長 度 = 目 鏡 測 微 尺 測 量 的 刻 度 數 X 每 一 目 鏡 測 微 尺 刻 度 的 校 正 因 子 = 5 X 1.54μm. = 7.70μm ( 五 ) 真 菌 菌 絲 之 觀 察 1. 以 肉 眼 觀 察 酵 母 菌 (Sacchromyces cerevisiae) 以 及 青 黴 菌 (Penicillium notatum) 所 形 成 之 菌 落 ( 圖 2-9 圖 2-10), 包 括 其 形 狀 大 小 顏 色 等 特 性, 仔 細 觀 察 並 紀 錄 之 2. 由 培 養 之 酵 母 菌 液 中, 以 接 種 環 取 出 菌 液, 均 勻 塗 於 一 乾 淨 之 載 玻 片 上, 蓋 上 蓋 玻 片 後, 於 光 學 顯 微 鏡 下 觀 察 並 紀 錄 3. 取 一 乾 淨 之 玻 片, 滴 上 一 滴 蒸 餾 水, 以 接 種 針 取 出 青 黴 菌 之 菌 絲 體 和 孢 子, 分 散 均 勻 後, 蓋 上 蓋 玻 片, 於 光 學 顯 微 鏡 下, 觀 察 菌 絲 之 形 狀 大 小 等 特 性 及 孢 子 的 外 形 顏 色 仔 細 觀 察 並 紀 錄 之 圖 2-9 酵 母 菌 菌 落 21

23 圖 2-10 青 黴 菌 菌 落 四 結 果 分 別 描 述 以 上 所 觀 察 之 各 種 不 同 微 生 物 所 形 成 之 菌 落, 以 及 顯 微 鏡 下 細 胞 之 外 形 詳 細 紀 錄 如 下 : 大 小 以 菌 直 徑 (mm) 或 細 胞 直 徑 (μm) 長 (μm) 表 示, 圖 形 以 鉛 筆 畫 出 菌 種 菌 落 細 胞 形 狀 大 小 顏 色 形 狀 大 小 顏 色 金 黃 色 葡 萄 狀 球 菌 枯 草 桿 菌 大 腸 桿 菌 22

24 酵 母 菌 青 黴 菌 五 問 題 思 考 與 討 論 1. 觀 察 細 菌 與 真 菌 外 表 特 徵, 會 有 何 異 同, 應 如 何 加 以 分 辨? 2. 如 何 使 用 光 學 顯 微 鏡? 依 你 的 經 驗, 細 菌 與 真 菌 需 放 大 到 多 少 倍 率 才 能 夠 看 得 到? 如 何 在 顯 微 鏡 下 測 量 其 大 小? 3. 藉 助 顯 微 鏡 可 以 觀 察 細 胞 之 外 形, 你 在 進 行 顯 微 鏡 觀 察 時, 是 否 遭 遇 到 困 難? 要 如 何 加 以 解 決? 4. 如 何 應 用 電 子 顯 微 鏡 技 術 於 微 生 物 學 之 研 究? 六 參 考 資 料 1. 王 進 琦 編 著 1990 微 生 物 學 實 驗 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 市 546 頁 2. 楊 美 桂 編 著 2004 普 通 微 生 物 學 實 驗 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 市 187 頁 23

25 實 驗 三 細 菌 的 染 色 方 法 一 目 的 由 於 細 菌 是 透 明 之 微 小 生 物, 無 法 以 肉 眼 觀 察, 必 在 顯 微 鏡 下 才 可 看 到 事 實 上, 顯 微 鏡 下 的 細 菌 仍 很 微 小, 一 般 多 以 染 料 使 其 著 色, 以 便 觀 察 本 實 驗 主 要 讓 同 學 們 練 習 細 菌 的 各 種 染 色 方 法, 同 時 更 熟 練 顯 微 鏡 下 細 菌 外 形 的 觀 察 二 材 料 與 設 備 1. 金 黃 色 葡 萄 狀 球 菌 (Staphylococcus aureus) 菌 液 2. 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 菌 液 3. 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 菌 液 4. 染 料 ( 圖 3-1): (1) 結 晶 紫 甲 基 藍 染 料 (0.5% Crystal Violet 0.3% Methylene Blue Stain) (2) 革 蘭 氏 染 料 (Gram Stain):2% Crystal Violet,Gram Iodine,95% EtOH, 3.6% Safranin 等 4 種 染 料 與 溶 液 組 成 (3)5% 孔 雀 綠 (Malachite Green) 溶 液,0.5% 沙 黃 (Safranin) 溶 液 (4)2% 尼 羅 辛 染 料 (Nigrosin) 印 地 安 墨 水 (Indian Ink) 5. 酒 精 燈 接 種 環 ( 針 ) 染 色 盤 顯 微 鏡 ( 高 倍 油 鏡 ) 拭 鏡 紙 玻 片 洗 瓶 油 鏡 油 無 菌 蒸 餾 水 圖 3-1 細 菌 染 色 之 染 料 24

26 三 方 法 與 步 驟 ( 一 ) 玻 片 塗 抹 法 1. 玻 片 先 以 清 潔 劑 洗 淨, 再 以 蒸 餾 水 與 95% 酒 精 潤 濕 後 擦 乾 備 用 2. 以 接 種 環 取 出 一 環 菌 液, 塗 抹 於 乾 淨 玻 片 中 央, 再 均 勻 分 散 之 3. 若 由 固 體 培 養 基 取 菌 染 色, 則 先 在 乾 淨 之 玻 片 中 央, 取 一 接 種 環 ( 或 以 滴 管 滴 一 滴 ) 蒸 餾 水 置 於 上, 再 以 接 種 環 輕 沾 培 養 基 上 之 單 一 菌 落 ( 不 要 取 太 多 菌 ), 與 水 充 分 混 合 後, 均 勻 塗 抹 於 玻 片 上 4. 塗 抹 之 玻 片 為 半 透 明 白 色 的 一 層 膜 狀 物, 風 乾 後, 快 速 在 酒 精 燈 上 加 熱 2~3 次, 以 便 將 菌 體 固 定 於 玻 片 上 ( 如 圖 3-2) 1. 以 接 種 環 取 出 菌 液 2. 將 菌 液 塗 在 乾 淨 之 玻 片 上 3. 以 接 種 環 將 菌 液 均 勻 塗 開 4. 自 然 風 乾 後, 於 酒 精 燈 上 過 火 固 定 之 圖 3-2 玻 片 塗 抹 法 25

27 ( 二 ) 簡 單 染 色 法 (Simple Stain) 1. 取 出 染 色 盤, 內 置 少 量 自 來 水 2. 將 依 上 述 方 法 處 理 過 之 載 玻 片, 平 放 在 染 色 架 上, 在 塗 有 菌 處 滴 下 結 晶 紫 ( 或 甲 基 藍 ) 染 料, 作 用 1 分 鐘 後 ( 染 料 蓋 滿 菌 體, 但 不 外 溢 ), 倒 掉 染 料, 用 裝 有 蒸 餾 水 的 洗 瓶 將 剩 餘 的 染 料 沖 掉, 玻 片 乾 後 ( 可 以 濾 紙 吸 乾 ), 置 於 顯 微 鏡 下 觀 察 ( 圖 3-3) 3. 先 以 低 倍 鏡 找 出 含 有 菌 體 的 位 置, 逐 次 增 加 倍 數, 最 後 加 入 一 滴 油 鏡 油, 以 高 倍 油 鏡 觀 察, 並 劃 圖 加 以 紀 錄 1. 在 塗 有 菌 液 處, 滴 上 一 滴 甲 基 藍 2. 一 分 鐘 後, 以 蒸 餾 水 洗 去 染 料 圖 3-3 簡 單 染 色 法 ( 三 ) 革 蘭 氏 染 色 法 (Gram Stain) 1. 依 上 述 同 樣 方 法, 將 欲 觀 察 之 三 種 細 菌 的 隔 夜 培 養 菌 液, 以 接 種 環 均 勻 塗 布 於 玻 片 上 ( 如 圖 3-4), 並 於 旁 邊 以 簽 字 筆 註 明 菌 名 2. 將 此 玻 片 瓶 放 在 染 色 架 上, 先 以 2% 染 液 作 用 1 分 鐘, 再 以 蒸 餾 水 將 剩 餘 染 料 沖 洗 去 除 3. 加 入 Gram Iodine 媒 染 液 (Mordant), 作 用 1 分 鐘, 用 水 沖 洗 26

28 4. 再 以 95% 酒 精 進 行 脫 色 作 用 將 玻 片 斜 置 於 染 色 架 上, 由 上 往 下 滴 入 酒 精 溶 液, 直 到 流 出 的 酒 精 變 成 無 色 後, 再 用 水 沖 洗 5. 加 入 第 二 種 染 液 3.6% 之 Safranin(Counterstain), 繼 續 作 用 1 分 鐘 後, 用 水 沖 掉 多 餘 之 染 料, 以 濾 紙 吸 去 玻 片 上 之 水 分, 於 顯 微 鏡 下 仔 細 觀 察, 並 紀 錄 細 胞 之 外 形 與 顏 色 1. 將 菌 液 塗 抹 於 玻 片 上, 滴 上 結 晶 紫 染 料, 作 用 一 分 鐘 2. 以 水 洗 去 結 晶 紫 染 料 3. 加 入 碘 液 作 用 一 分 鐘, 再 以 水 洗 去 碘 液 4. 以 95% 酒 精 脫 色, 並 以 水 洗 去 酒 精 27

29 5. 加 入 沙 黃 染 料 作 用 一 分 鐘 後, 亦 以 水 洗 去 多 餘 之 染 料 圖 以 濾 紙 吸 乾 水 分, 置 此 玻 片 於 顯 微 鏡 下 觀 察 細 菌 之 革 蘭 氏 染 色 法 ( 四 ) 內 孢 子 染 色 法 (Spore Stain) 1. 依 上 述 同 樣 方 法, 取 一 接 種 環 之 枯 草 桿 菌 菌 液, 均 勻 塗 佈 於 玻 片 上, 並 以 火 固 定 之 2. 滴 上 5% 之 Malachite Green 染 液, 以 蒸 氣 加 熱 作 用 約 5 分 鐘 ( 不 可 讓 染 液 乾 掉 ), 用 水 沖 去 多 餘 染 料 3. 再 以 0.5% 之 Safranin 染 料 作 用 1~2 分 鐘, 用 水 沖 洗 後, 將 玻 片 風 乾, 以 顯 微 鏡 觀 察 並 紀 錄 之 ( 五 ) 負 染 色 法 (Negative Stain) 1. 將 上 述 三 種 細 菌 之 菌 液, 取 一 接 種 環 之 菌 量, 均 勻 塗 布 於 玻 片 上 2. 在 玻 片 之 另 一 端, 加 上 1 滴 2% 之 Nigrosin 染 料 ( 或 Indian Ink) 3. 取 另 一 載 玻 片, 以 30 度 傾 斜 角, 將 染 料 往 菌 體 方 向 推 開 4. 待 染 料 風 乾 後 ( 勿 加 熱 ), 以 顯 微 鏡 觀 察 並 記 錄 之 ( 如 圖 3-5) 28

30 1. 在 塗 有 菌 液 之 玻 片 上, 滴 一 滴 2% Negrosin 染 料 2. 取 另 一 玻 片 以 30 度 斜 角, 將 染 料 塗 開, 使 其 佈 滿 玻 片 3. 取 另 一 玻 片 以 30 度 斜 角, 將 染 料 塗 開, 使 其 佈 滿 玻 片 圖 3-5 細 菌 之 負 染 色 法 4. 將 玻 片 置 於 顯 微 鏡 下 觀 察 四 結 果 細 菌 染 色 之 觀 察 ( 以 鉛 筆 畫 出, 並 用 蠟 筆 塗 上 顏 色 ) Gram (-): 革 蘭 氏 陰 性 菌, 被 染 成 紅 色 Gram (+): 革 蘭 氏 陽 性 菌, 被 染 成 藍 紫 色 染 色 菌 種 金 黃 色 葡 萄 球 狀 菌 大 腸 桿 菌 枯 草 桿 菌 簡 單 染 色 29

31 革 蘭 氏 染 色 內 孢 子 染 色 負 染 色 五 問 題 思 考 與 討 論 1. 請 敘 述 革 蘭 氏 染 色 法 (Gram Stain) 的 原 理 2. 進 行 革 蘭 氏 染 色 時, 為 何 要 採 用 培 養 18 至 24 小 時 的 菌 液? 3. 進 行 內 孢 子 染 色 時, 為 何 最 好 使 用 培 養 3 天 以 上 的 菌 液? 4. 為 何 在 進 行 革 蘭 氏 染 色 時, 要 使 用 Mordant 和 Couterstain? 5. 是 否 還 有 其 他 的 染 色 法, 適 用 於 觀 察 的 細 菌 外 形? 六 參 考 資 料 1. 王 進 琦 編 著 1990 微 生 物 學 實 驗 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 市 546 頁 2. 楊 美 桂 編 著 2004 普 通 微 生 物 學 實 驗 藝 軒 圖 書 出 版 社 台 北 市 187 頁 30

32 實 驗 四 細 菌 的 純 系 培 養 實 驗 目 的 本 章 實 驗 主 要 是 讓 你 能 了 解 1. 無 菌 操 作 技 術 (Sterilization) 及 繼 代 培 養 (Subculture); 2. 細 菌 生 長 所 需 的 無 菌 操 作 設 備 (Equipment) 及 培 養 基 (medium); 3. 觀 察 不 同 細 菌 在 不 同 培 養 基 生 長 情 形 前 言 細 菌 種 類 繁 多, 因 棲 息 環 境 及 寄 主 環 境 不 同, 為 適 應 環 境 中 生 長 成 份 的 限 制, 每 種 細 菌 發 展 出 特 異 的 新 陳 化 謝 途 徑 及 生 化 反 應 在 柯 爾 病 源 菌 假 說 : 要 知 道 動 物 身 上 傳 染 疾 病 是 否 由 特 定 細 菌 感 染 所 引 起, 必 須 先 分 離 純 系 特 定 細 菌, 在 將 特 定 細 菌 接 種 在 健 康 動 物 身 上, 觀 察 動 物 是 否 呈 現 相 同 的 傳 染 疾 病 而 在 不 同 環 境 中 都 有 可 能 有 細 菌 生 長, 因 此 要 知 道 如 何 在 無 菌 狀 態 下, 培 養 及 篩 選 出 純 系 的 細 菌, 以 作 未 來 實 驗 之 依 據 細 菌 生 長 培 養 基 培 養 基 是 具 有 細 菌 生 長 所 需 營 養 成 分 (Nutrient) 的 培 養 液, 依 照 成 分 來 源 可 分 成 三 種 : 只 含 天 然 物 質 的 天 然 培 養 基 (Natural Medium) 只 有 化 學 成 份 的 合 成 培 養 基 (Synthetic Medium) 及 由 上 述 兩 種 成 分 組 合 而 成 的 複 合 培 養 基 (Complex Medium) 另 外 可 在 培 養 基 中 加 入 特 定 化 學 物 質, 而 只 有 選 擇 特 定 細 菌 生 長, 這 種 培 養 基 稱 為 選 擇 性 培 養 基 (Selective Medium); 而 在 培 養 基 中 加 入 特 定 成 分, 以 直 接 區 別 生 長 在 培 養 基 上 細 菌 種 類 的 不 同, 這 類 培 養 基 稱 為 分 辨 性 培 養 基 (Differential Medium); 有 時 在 培 養 基 加 入 特 定 化 學 成 分 以 增 加 一 群 細 菌 中 的 一 特 定 類 型 細 菌 生 長, 這 種 培 養 基 成 為 豐 富 性 培 養 基 (Enriched Medium) 培 養 基 依 照 它 的 型 態 可 分 為 液 態 的 肉 湯 (Broth) 半 固 態 的 培 養 基 (Semi-solid Medium) 及 固 態 的 培 養 基 (Solid Medium) 而 固 態 培 養 基 又 依 照 培 養 基 表 面 的 角 度 不 同 分 為 平 碟 培 養 基 (Agar Plate) 及 斜 面 培 養 基 (Agar Slant)[ 圖 一 ] 31

33 無 菌 操 作 無 菌 操 作 是 微 生 物 實 驗 最 重 要 的 一 個 環 節, 而 除 去 微 生 物 可 以 使 用 物 理 及 化 學 方 法 依 照 處 理 物 品 種 類 的 不 同 有 燃 燒 (Incineration) 高 濕 熱 (Moist heat) 亁 熱 (Dry Heat) 過 濾 (Filtration) 及 離 子 (gamma) 輻 射 (radiation) 等 五 種 物 理 滅 菌 的 方 式 可 將 有 毒 性 的 物 質 燃 燒 利 用 高 蒸 氣 壓 高 溫 的 滅 菌 方 法, 在 每 平 方 英 吋 15 磅 (lb) 壓 力 下, 將 培 養 基 液 體 及 儀 器 於 121 處 理 15 分 鐘 或 者 是 將 感 染 性 醫 療 廢 棄 物 在 132 處 理 分 鐘 ; 或 是 將 玻 璃 器 皿 等 利 用 亁 熱 方 式 在 處 理 小 時 ; 而 上 述 兩 種 方 式 可 使 用 高 壓 滅 菌 爐 進 行 而 液 體 培 養 基 成 分 在 高 溫 時 會 被 破 壞, 則 使 用 過 濾 方 式 將 細 菌 隔 離 而 可 拋 棄 的 塑 膠 製 品 等 則 可 用 附 設 方 式 滅 菌 而 化 學 滅 菌 常 使 用 的 化 學 藥 物 有 Ethlene oxide 及 70% 的 酒 精 圖 一 培 養 基 的 種 類 及 操 作 工 具 圖 A: 液 態 培 養 基 ;1: 玻 璃 試 管 ;2: 旋 轉 玻 璃 試 管 ;3: 塑 膠 試 管 ;4: 有 LB 培 養 液 的 加 蓋 旋 轉 玻 璃 試 管 ;5: 有 LB 培 養 液 的 塑 膠 試 管 ;6: 生 化 反 應 玻 璃 試 管 圖 B: 固 態 培 養 基 ;1: 接 種 針 ;2: 接 種 環 ;3: 固 態 試 管 培 養 基 ;4: 斜 面 培 養 基 ;5-7: 不 同 種 類 平 碟 培 養 基 ;5:LB 平 碟 培 養 基 ;6:MacConkey 平 碟 培 養 基 ;7: 血 液 平 碟 培 養 基 32

34 純 系 培 養 及 繼 代 培 養 將 從 田 間 試 驗 醫 院 或 實 驗 室 取 得 的 樣 本 或 檢 體 時, 置 入 含 有 培 養 液 的 試 管 中 培 養 隔 夜 後, 可 用 下 列 兩 種 方 式 將 特 定 細 菌 做 純 系 培 養 第 一 種 方 式 是 劃 線 法 ( 圖 二 ), 先 將 試 管 口 過 火 滅 菌, 將 接 種 環 插 入 隔 夜 培 養 的 培 養 液 中 後 取 出, 連 續 塗 抹 在 平 碟 陪 養 基 上, 直 到 可 產 生 單 一 菌 落 的 情 形 第 二 種 是 塗 抹 法 ( 圖 三 ), 是 將 隔 夜 培 養 的 培 養 液 以 十 倍 連 續 稀 釋 後, 取 定 量 的 菌 液 均 勻 塗 抹 在 選 擇 性 培 養 基 或 分 辨 性 培 養 基 隔 夜 培 養, 篩 選 特 定 細 菌 圖 二 細 菌 純 系 培 養 之 劃 線 法 1: 接 種 環 高 熱 滅 菌 ;2: 以 接 種 環 取 菌 ;3: 將 平 碟 培 養 基 分 成 a b 及 c 三 部 分, 皆 將 種 環 再 培 養 基 上 依 序 劃 線 ;4: 細 菌 隔 夜 培 養 後, 菌 落 形 成 情 形 33

35 圖 三 細 菌 純 系 培 養 之 塗 抹 法 1: 隔 夜 培 養 的 大 腸 桿 菌 以 10 倍 逐 步 稀 釋 ;2: 取 定 量 (100 μl) 菌 液 ;3: 將 菌 液 加 到 平 碟 培 養 基 上 ;4: 將 L 型 玻 璃 棒 在 95% 酒 精 中 消 毒 後, 加 熱 殺 菌 ;5: 用 L 型 玻 璃 棒 均 勻 塗 抹 菌 液 6-9: 隔 夜 生 長 的 不 同 稀 釋 培 養 菌 落 34

36 細 菌 的 特 徵 細 菌 的 生 化 反 應 不 同, 可 以 利 用 選 擇 性 培 養 基 及 分 辨 性 培 養 基 來 篩 選 特 定 細 菌 而 細 菌 還 有 其 他 特 性 使 細 菌 間 的 差 異 可 以 做 比 較 細 菌 在 培 養 基 中 有 通 份 營 養 成 分, 可 進 行 複 製 使 菌 落 不 段 增 加, 而 細 菌 監 交 互 作 用 不 同, 使 的 菌 落 表 面 形 狀 不 同 細 菌 具 有 鞭 毛 而 在 培 養 基 上 移 動 速 率 及 方 向 不 同, 形 成 的 菌 落 邊 緣 形 狀 會 因 菌 種 差 異 而 不 一 樣 而 細 菌 表 免 的 結 構 不 同, 而 對 光 的 折 射 不 同, 使 得 不 同 細 菌 間 菌 落 的 透 光 度 不 同 實 驗 材 料 及 方 法 1. 實 驗 細 菌 有 格 蘭 氏 陰 性 菌 : 大 腸 桿 菌 (E. coli) 沙 門 氏 菌 (Salmonella) 及 格 蘭 氏 陽 性 菌 : 肺 炎 鏈 球 菌 (Sreptococcus) 及 蘇 利 菌 (Bacillus) 2. 培 養 基 的 製 備 ( 圖 四 ) 培 養 基 的 種 類 有 LB broth: 每 公 升 含 10 g tryptone 5 g yeast extract 5 g NaCl 1 ml 1N NaOH LB soft agar plate: 每 公 升 含 10 g tryptone 5 g yeast extract 5 g NaCl 1 ml 1N NaOH 3 g agar LB semisolid agar: 每 公 升 含 10 g tryptone 5 g yeast extract 5 g NaCl 1 ml 1N NaOH 7.5 g agar LB agar slant 及 LB agar plate: 每 公 升 含 10 g tryptone 5 g yeast extract 5 g NaCl 1 ml 1N NaOH 15 g agar MacConkey broth: 每 公 升 含 20 g peptone 10 g lactose 5 g bile salt 5 g NaCl g Bromocresol purple ph7.4 MacConkey agar plate: 每 公 升 含 20 g peptone 10 g lactose 5 g bile salt 5 g NaCl g neutral red 12 g agar ph7.4 此 次 實 驗 只 練 習 配 置 LB 平 碟 陪 養 基 及 MacConkey 平 碟 陪 養 基 35

37 圖 四 培 養 基 的 配 置 1:MacConkey 培 養 基 藥 品 ;2: 加 水 ;3: 秤 藥 ;4-5: 加 入 藥 品 ;6: 利 用 攪 拌 器 將 藥 品 攪 拌 均 勻 ;7: 調 整 ph 值 ;8: 加 水 定 量 後, 高 溫 高 壓 滅 菌 3. 菌 種 培 養 ( 圖 五 ) a. 從 含 上 述 菌 種 的 培 養 基 中, 挑 取 單 一 菌 落 分 別 加 入 培 養 液 或 培 養 基 中, 隔 夜 培 養, 觀 察 及 記 錄 生 長 結 果 b. 將 在 45 的 3 ml 半 固 體 陪 養 基 與 100 μl 菌 液 充 份 混 合 後, 倒 入 LB 平 碟 陪 養 基 上, 在 37 生 長 培 養 箱 中 培 養, 隔 夜 培 養, 觀 察 及 記 錄 生 長 結 果 36

38 圖 五 其 他 不 同 接 種 方 式 1: 以 接 種 針 作 穿 刺 培 養 ;2: 以 接 種 環 在 斜 面 培 養 基 作 畫 線 培 養 ;3: 以 接 種 環 將 細 菌 接 種 在 意 態 培 養 基 中 4. 純 系 培 養 從 含 上 述 菌 種 的 培 養 基 中, 將 菌 落 收 集 後, 加 入 含 1 ml LB broth 中, 將 細 菌 均 勻 打 散 然 後 以 下 述 方 式 操 作 : a. 劃 線 法 將 接 種 環 插 入 培 養 液 中, 取 出 後 連 續 塗 抹 在 LB 平 碟 陪 養 基 及 MacConkey 平 碟 陪 養 基, 在 37 生 長 培 養 箱 中 培 養, 觀 察 及 記 錄 細 菌 生 長 狀 態 及 單 一 菌 落 是 否 形 成 b. 塗 抹 法 將 菌 液 以 十 倍 連 續 稀 釋 後, 再 稀 釋 10-5 倍 稀 釋 後, 取 100 μl 菌 液 於 平 碟 陪 養 基 上, 在 37 生 長 培 養 箱 中 培 養, 觀 察 及 記 錄 細 菌 生 長 狀 態 及 單 一 菌 落 是 否 形 成 5. 細 菌 的 移 動 性 將 接 種 針 插 入 菌 液 後 取 出, 插 入 半 固 體 凝 膠 中, 直 接 抽 回, 在 37 生 長 培 養 箱 中 培 養, 隔 日 觀 察 實 驗 結 果 1. 紀 錄 不 同 細 菌 在 不 同 培 養 基 生 長 之 特 徵 2. 菌 種 培 養 中 是 否 在 畫 線 法 及 在 幾 倍 稀 釋 後 的 塗 抹 法 有 單 一 菌 落 出 現 3. 細 菌 培 養 中 是 否 有 雜 菌 污 染 出 現 37

39 實 驗 討 論 1. 不 同 培 養 機 基 使 用 狀 況 及 目 的 是 什 麼? 2. 如 何 避 免 雜 菌 污 染? 3. 純 系 培 養 中 之 劃 線 法 及 塗 抹 法 之 比 較 及 應 用? 38

40 實 驗 五 細 菌 的 生 長 曲 線 實 驗 目 的 本 章 實 驗 主 要 是 讓 你 能 了 解 1. 影 響 細 菌 生 長 不 同 因 子 ; 2. 不 同 計 算 細 菌 數 目 方 式 ; 3. 細 菌 在 培 養 液 中 生 長 速 率 估 及 生 長 曲 線 繪 製 及 計 算 前 言 受 到 外 界 環 境 因 子 生 長, 細 菌 數 目 增 倍 所 需 的 時 間 不 同, 且 因 菌 種 不 同 而 有 差 別, 因 此 計 算 研 究 細 菌 生 理 作 用 或 細 菌 與 其 他 生 物 作 用 時, 常 需 使 用 定 量 的 細 菌 數, 因 此 必 須 明 白 每 個 菌 株 的 生 長 速 率, 而 繪 製 及 計 算 兩 中 生 長 曲 線 : 時 間 與 細 菌 數 目 的 生 長 曲 線 及 吸 光 值 (OD) 與 細 菌 數 目 的 生 長 曲 線 進 而 利 用 吸 光 值 與 時 間 的 生 長 曲 線 是 否 成 直 線 相 關, 作 為 評 估 實 驗 的 誤 差 細 菌 生 長 影 響 因 子 影 響 細 菌 生 長 有 物 理 因 子 及 化 學 因 子 主 要 的 物 理 因 子 有 生 長 溫 度 酸 鹼 度 (ph 值 ) 及 膨 壓 (osmotic pressure), 膨 壓 有 時 亦 可 考 慮 是 化 學 因 子 之 一 細 菌 因 生 長 溫 度 可 分 為 嗜 冷 生 物 (psychrophile, ) 嗜 低 溫 生 物 (psychrotrophs,0-30 ) 嗜 中 溫 生 物 (mesophiles,20-55 ) 嗜 熱 生 物 (thermophile,40-70 ) 及 嗜 高 熱 生 物 (hyperthermophiles,65-110, 不 同 細 菌 在 不 同 溫 度 的 生 長 情 形 也 不 同 ( 圖 一 ) 大 多 數 細 菌 都 生 長 在 接 近 中 性 的 ph 值, 也 就 是 在 ph 間, 而 黴 菌 (mold) 及 酵 母 菌 (yeast) 正 常 生 長 ph 值 較 細 菌 為 低, 也 就 是 在 ph5 6. 在 鹼 性 狀 態 下 會 抑 制 微 生 物 生 長, 但 在 保 存 食 物 時, 並 不 會 將 食 物 保 在 鹼 性 狀 態 下 有 些 細 菌 能 生 長 在 ph 值 小 於 4 的 環 境, 這 種 生 物 稱 為 嗜 酸 性 生 物 (acidophiles) 微 生 物 從 環 境 中 的 水 溶 液 中 獲 取 它 們 主 要 的 營 養 物 質, 因 此 需 依 賴 水 生 長, 而 她 們 深 體 中 約 80 90% 是 由 水 組 成, 因 此 若 失 去 水 會 使 生 物 失 去 正 常 功 能 若 外 界 環 境 中 膨 壓 較 低 ( 如 鹽 類 離 子 濃 度 較 低 ), 細 胞 會 吸 收 水 而 膨 脹 破 裂 ; 若 外 界 39

41 膨 壓 太 高 ( 如 鹽 類 離 子 濃 度 太 高 ), 細 胞 會 脫 水 而 萎 縮, 此 現 象 稱 為 原 形 質 溶 解 而 不 同 種 類 微 生 物 可 生 長 在 不 同 鹽 類 濃 度, 如 極 端 嗜 鹽 生 物 (extreme halophiles) 有 時 刻 生 長 在 30% 鹽 類 環 境 下 有 微 生 物 是 兼 性 嗜 鹽 生 物 (facultative halophiles) 可 生 長 在 最 高 2% 鹽 類 環 境 影 響 微 生 物 生 長 的 化 學 因 子 有 碳 (carbon) 氮 (nitrogen) 硫 (sulfur) 及 磷 (phosphorus), 這 些 化 學 元 素 是 構 成 糖 類 和 酸 及 蛋 白 質 主 要 成 份 而 因 大 氣 中 含 有 約 20% 氧 氣, 而 氧 氣 在 水 中 溶 解 度 不 高, 而 且 溫 度 愈 高, 氧 的 溶 解 度 愈 低 因 此 細 菌 會 可 分 為 需 氧 氣 才 能 生 長 的 絕 對 好 氧 菌 (obligate aerobes) 在 有 氧 及 無 氧 狀 態 下 都 能 生 長 的 兼 性 厭 氧 菌 (facultative anaerobes) 及 在 無 氧 狀 態 下 才 能 生 長 的 絕 對 厭 氧 菌 (obligate anaerobes) 圖 一 大 腸 桿 菌 (E) 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (S) 及 枯 草 桿 菌 (B) 在 4 (1) 20 (2) 37 (3) 及 60 (4) 生 長 情 形 40

42 細 菌 生 長 曲 線 細 菌 在 培 養 液 中 生 長 情 形 可 分 四 種 時 期 : (1) 遲 滯 期 (lag phase) (2) 對 數 期 [exponential (log) phase] (3) 靜 止 期 (stationary phase) 及 (4) 減 數 期 (reduction phase)( 圖 二 ) 當 細 菌 加 入 新 的 營 養 液 中, 為 適 應 新 環 境 要 表 現 新 的 基 因, 以 便 從 環 境 中 獲 得 營 養 成 分 進 行 複 製, 在 這 階 段 細 菌 數 目 並 未 增 加, 所 以 稱 為 遲 滯 期 當 基 因 表 現 使 細 菌 能 進 行 正 常 複 製, 而 進 入 對 數 期 當 環 境 中 養 分 因 細 菌 攝 取 而 減 少, 使 得 細 菌 無 法 進 行 正 常 複 製, 同 時 也 改 變 基 因 的 表 現, 細 菌 數 目 不 再 增 加, 此 階 段 稱 為 靜 止 期 當 細 菌 逐 漸 老 化 而 死 亡 時, 活 細 菌 數 目 逐 漸 降 低, 時 間 愈 久 活 菌 數 目 愈 少, 此 階 段 稱 為 減 數 期 圖 二 細 菌 正 常 生 長 曲 線 實 驗 材 料 及 方 法 1. 實 驗 細 菌 有 格 蘭 氏 陰 性 菌 : 大 腸 桿 菌 (E. coli) 沙 門 氏 菌 (Salmonella) 及 41

43 格 蘭 氏 陽 性 菌 : 肺 炎 鏈 球 菌 (Sreptococcus) 及 蘇 利 菌 (Bacillus thuringiensis) 2. 培 養 基 LB broth: 如 前 章, 但 分 別 配 置 ph3 ph5 ph7 及 ph9 培 養 液 LB agar plate: 3. 評 估 影 響 細 菌 生 長 不 同 因 子 a. ph 值 : 取 5 μl 隔 夜 培 養 的 菌 液 於 四 種 不 同 ph 值 的 LB Broth 中, 在 37 溫 度 下 培 養, 第 二 天 紀 錄 培 養 液 生 長 情 形 b. 取 接 種 環 至 菌 液 中, 依 劃 線 法 將 菌 液 塗 抹 在 LB 平 碟 培 養 基 上, 分 別 置 放 及 50 生 長 培 養 箱 中 培 養, 第 二 天 紀 錄 培 養 液 生 長 情 形 c. 重 複 實 驗 b 步 驟, 但 將 細 菌 置 放 在 無 氧 培 養 罐 中, 於 37 生 長 培 養 箱 中 培 養, 第 二 天 紀 錄 培 養 液 生 長 情 形 4. 生 長 曲 線 製 作 及 回 歸 曲 線 計 算 a. 取 1 ml 隔 夜 培 養 菌 液 至 含 5 ml LB 培 養 液 的 15 ml 試 管 中, 於 0 小 時 1 小 時 2 小 時 3 小 時 及 4 小 時 分 別 取 1 ml 菌 液, 分 別 作 下 面 實 驗 b. OD 550 測 試 將 菌 液 加 入 玻 璃 或 塑 膠 測 管 (cuvette 或 cell) 中, 利 用 分 光 光 度 計 (spectrophotometer), 以 550 nm 波 長 測 定 菌 液 的 吸 光 值, 紀 錄 OD 550 值 ( 圖 三 ) c. 細 菌 數 目 計 算 將 菌 液 分 別 以 十 倍 連 續 稀 釋, 也 就 是 倍 後, 以 下 列 方 式 計 算 - 血 球 計 數 盤 ( 圖 四 ) 取 10-4 倍 稀 釋 菌 加 在 血 球 計 數 盤 上 後, 蓋 上 蓋 波 片 後, 在 顯 微 鏡 下 計 算 及 紀 錄 細 菌 數 目 - 塗 抹 法 在 0 小 時 及 1 小 時, 取 50 μl 的 10-4 稀 釋 菌 液 塗 抹 在 LB 平 碟 培 養 基 上, 在 42

44 2 小 時 3 小 時 及 4 小 時, 則 取 50 μl 的 10-5 稀 釋 菌 液 塗 抹 在 LB 平 碟 培 養 基 上, 個 培 養 基 在 37 生 長 培 養 箱 中 培 養, 第 二 天 計 算 及 紀 錄 細 菌 數 目 圖 三 分 光 光 度 計 使 用 方 法 1: 開 啟 分 光 光 度 計 ;2: 加 入 定 量 菌 抑 制 玻 璃 測 管 ; 3: 將 玻 璃 測 管 至 於 測 量 位 置 ;4: 紀 錄 OD 550 數 值 43

45 圖 四 血 球 計 數 器 使 用 方 式 1: 測 觀 血 球 計 數 器, 葢 波 片 至 血 球 計 數 氣 之 距 離 是 0.1 mm;2: 俯 觀 血 球 計 數 器 ;3: 計 數 之 平 面 面 積, 共 有 九 個 單 位, 每 單 位 面 積 是 1 mm x 1 mm, 每 單 位 體 積 是 0.1 mm x 1 mm x 1 mm = 10-4 cm 3, 細 菌 數 目 之 計 算 是 紀 錄 總 合 四 角 之 菌 數 (n) 除 以 四 在 乘 以 10 4, 也 就 是 每 毫 升 菌 數 = n/4 x 10 4 實 驗 結 果 1. 各 種 細 菌 在 不 同 ph 值 溫 度 及 氧 氣 狀 態 下 生 長 情 形 2. 生 長 曲 線 a. 細 菌 數 與 時 間 的 生 長 曲 線 橫 軸 是 細 菌 生 長 時 間, 縱 軸 是 細 菌 數 目, 將 不 同 時 間 點 的 細 菌 數 目 以 顏 色 筆 標 記 在 格 子 圖 上, 並 將 各 點 連 接, 以 形 成 生 長 曲 線 b. 細 菌 數 與 OD 值 的 生 長 取 線 橫 軸 是 細 菌 的 OD 550 值, 縱 軸 是 細 菌 數 目, 將 不 同 時 間 點 的 細 菌 數 目 以 顏 色 筆 標 記 在 格 子 圖 ( 圖 五 ) 上, 並 將 各 點 連 接, 以 形 成 生 長 曲 線 c. 細 菌 的 生 長 迴 歸 曲 線 Y = a + b X Y = log 10 細 菌 數 目 X = OD 550 值 44

46 圖 五 細 菌 生 長 曲 線 格 子 圖 討 論 1. 為 何 不 同 細 菌 的 環 境 生 長 因 子 不 同? 2. 利 用 血 球 計 數 盤 及 塗 抹 法 的 生 長 曲 線 是 否 相 同? 3. 生 長 曲 線 在 對 數 期 是 否 是 直 線? 若 不 是 曲 線, 原 因 是 什 麼? 4. 生 長 回 歸 曲 線 b 所 代 表 的 意 義 是 什 麼? 可 用 來 評 估 什 麼? 可 應 用 在 什 麼 實 驗? 45

47 實 驗 六 影 響 微 生 物 生 長 的 環 境 因 子 目 的 : 環 境 中 細 菌 生 長 快 速, 我 們 以 細 菌 族 群 的 增 加 來 表 示 細 菌 的 生 長 速 度 首 先 我 們 先 來 了 解 細 菌 的 生 長 情 形 以 及 影 響 生 長 的 因 素 有 哪 些 本 章 節 要 進 行 的 實 驗 是 溫 度 ph 值 滲 透 壓 含 氧 量 紫 外 光 的 照 射 對 細 菌 生 長 的 影 響 學 習 鑑 別 與 分 析 細 菌 的 特 徵 材 料 與 設 備 : 1. 天 平 2. 滅 菌 釜 3. 加 熱 攪 拌 器 4. 恆 溫 培 養 箱 5. 分 光 光 度 計 6. 無 菌 操 作 臺 7. 無 菌 試 管 x 16 支 8. 無 菌 水 100 ml 9. 平 板 培 養 基 x % 酒 精 11. 酒 精 燈 12. 大 腸 桿 菌 Escherichia Coli 枯 草 桿 菌 Bacillus subtilis 活 菌 乳 酸 菌 13. 培 養 基 :NB (Nutrient broth) NA (Nutrient agar) 14. ph 儀 15. 無 菌 試 管 含 3 ml NB (ph=3)x 2 支 16. 無 菌 試 管 含 3 ml NB (ph=4.6)x 2 支 17. 無 菌 試 管 含 3 ml NB (ph=7)x 2 支 18. 無 菌 試 管 含 3 ml NB (ph=10)x 2 支 19. 1N HCl 20. 白 金 耳 21. 接 種 針 水 浴 鍋 23. 螺 旋 試 管 x ml 吸 管 x2 25. L 形 玻 棒 泡 酒 精 26. NaCl 46

48 生 長 曲 線 微 生 物 在 封 閉 的 環 境 中 的 生 長 情 形, 隨 著 營 養 物 的 消 耗 代 謝 物 的 產 生 等 交 互 作 用, 微 生 物 的 族 群 密 度 隨 時 間 所 呈 現 出 來 的 曲 線, 就 是 微 生 物 族 群 的 生 長 曲 線 生 長 曲 線 依 斜 率 不 同 又 可 區 分 為 : 遲 滯 期 (lag phase) 對 數 期 (logarithmic phase) 穩 定 期 (stationary phase) 死 亡 期 (death phase) 生 長 曲 線 圖 穩 定 期 菌 數 死 亡 期 對 數 期 還 遲 滯 期 時 間 遲 滯 期 (lag phase): 微 生 物 適 應 新 環 境, 開 始 利 用 養 分, 代 謝 加 速, 細 菌 長 大 對 數 期 (logarithmic phase): 細 菌 快 速 增 生 穩 定 期 (stationary phase): 營 養 受 限, 細 菌 死 亡 與 增 生 速 率 相 當 死 亡 期 (death phase): 營 養 不 足 代 謝 物 過 多, 死 亡 大 於 增 生, 最 終 進 入 休 眠 狀 態 不 再 活 躍 而 測 定 細 菌 的 生 長 區 線 主 要 有 : 直 接 計 數 法 平 板 計 數 法 混 濁 度 計 算 法 直 接 計 數 法 : 由 顯 微 鏡 下 計 算 細 菌 數 平 板 計 數 法 : 將 菌 液 連 續 稀 釋, 將 稀 釋 後 的 各 個 濃 度 菌 液 取 一 定 量 塗 抹 在 平 板 培 養 基 上 培 養, 計 算 培 養 基 上 的 菌 落 數, 來 推 算 原 菌 液 的 細 菌 數 混 濁 度 計 算 法 : 利 用 分 光 光 度 計 波 長 590~600 nm 的 可 見 光 來 測 量 菌 液 的 混 濁 度, 通 常 以 OD 600 來 測 量 OD 600 超 過 0.9 以 上 時, 將 菌 液 稀 釋 10 倍 後 再 測 定, 讀 值 需 乘 以 10 才 是 正 確 的 混 濁 度 在 此 實 驗 裡 利 用 分 光 光 度 計 來 測 試 細 菌 的 生 長 曲 線 方 法 與 步 驟 : 1. 取 2 ml E. coli 菌 液 到 含 有 200 ml NB 中 混 勻 2. 取 0.1 ml 混 合 液 塗 抹 平 板,37 培 養, 作 為 0 小 時 的 細 菌 數 3. 混 合 液 37 震 盪 培 養, 每 隔 2 小 時 取 出 0.5 ml, 以 無 菌 水 10 倍 連 續 稀 釋 直 到 24 小 時 4. 將 各 稀 釋 液 取 0.1 ml 塗 抹 平 板,37 培 養 5. 紀 錄 各 個 時 間 點 的 菌 落 數 (cfu), 以 菌 落 數 對 時 間 做 圖 47

49 溫 度 環 境 中 的 微 生 物 生 長 溫 度 範 圍 含 蓋 -5~80, 但 是 每 一 種 微 生 物 都 具 有 其 適 合 的 生 長 溫 度 範 圍, 可 生 長 的 最 高 溫 度 稱 之 為 最 高 生 長 溫 度, 反 之 稱 為 最 低 生 長 溫 度, 並 只 有 一 個 最 適 生 長 溫 度, 即 此 微 生 物 生 長 速 度 最 大 時 的 溫 度 依 最 柿 適 生 長 溫 度 的 不 同 又 可 區 分 為 嗜 高 溫 菌 (thermophiles) 嗜 中 溫 菌 (mesophiles) 適 低 溫 菌 (psychrophiles) 菌 種 : 大 腸 桿 菌 Escherichia coli 方 法 與 步 驟 : 1. 連 續 稀 釋 : 將 6 支 含 4.5 ml NB 試 管 標 示 上 取 500 ul E. coli 菌 液 到 標 示 10-1 的 試 管 中 混 勻, 再 取 100 ul 的 混 合 液 到 標 示 10-2 的 試 管 3. 以 相 同 的 方 法 稀 釋 倍 並 搖 勻 4. 以 4 37 或 60 培 養 24hr 5. 從 各 管 菌 液 中 取 100 ul 到 平 板 培 養 基 NA 中 央 6. 將 L 形 玻 棒 過 火, 以 L 形 玻 棒 將 菌 液 均 勻 塗 抹 在 培 養 基 上,37 培 養 24hr 後 觀 察 記 錄 ph 值 嗜 酸 菌 分 佈 在 酸 性 礦 水 酸 性 熱 泉 等 地 區, 最 適 生 長 ph 值 在 3.0~3.5 之 間 的 環 境 中 嗜 鹼 微 生 物 可 在 ph 11~12 的 條 件 下 生 長, 但 在 中 性 ph 條 件 下 卻 不 能 生 長 例 如 巴 氏 芽 孢 桿 菌 (Bacillus pasturii ) 嗜 鹼 芽 孢 桿 菌 (Bacillus alcalophilus ) 等 細 菌 即 是 如 此 在 高 ph 的 鹼 水 泉 中, 曾 分 離 出 一 種 黃 桿 菌 (Flavobacterium ), 它 在 ph 11.4 的 條 件 下 生 長 良 好 菌 種 : 大 腸 桿 菌 Escherichia coli 活 菌 乳 酸 菌 方 法 與 步 驟 : 1. 分 別 取 一 loop 的 E. Coli B. subtilis 乳 酸 菌 菌 液 到 ph 值 分 別 為

50 9 的 3 ml NB 中 混 合 均 勻 培 養 24 小 時 3. 以 分 光 光 度 計 OD 600 測 吸 光 值, 並 記 錄 吸 光 值 0.1 表 示 約 有 10 8 /ml 大 腸 桿 菌 含 氧 量 微 生 物 行 有 氧 呼 吸 無 氧 呼 吸 的 程 度 不 同, 因 而 對 氧 氣 的 需 求 量 不 同, 又 可 分 為 : 1. 好 氧 菌 (aerobic): 需 要 氧 氣 來 維 持 生 長 和 繁 衍 2. 厭 氧 菌 (anaerobic): 在 無 氧 的 環 境 下 生 存, 氧 氣 對 細 菌 造 成 氧 化 傷 害 而 致 死 3. 兼 性 厭 氧 菌 (facultative anaerobes): 在 有 氧 的 環 境 下 生 長 較 好, 但 無 氧 的 環 境 下 也 能 生 存 菌 種 : 大 腸 桿 菌 Escherichia Coli 枯 草 桿 菌 Bacillus subtilis 活 菌 乳 酸 菌 方 法 與 步 驟 : 1. 將 裝 有 10 ml NA 的 試 管 行 濕 熱 滅 菌 後, 置 於 50 水 浴 鍋 直 到 溫 度 到 達 平 衡 2. 以 接 種 針 取 菌 液, 從 10 ml NA 的 試 管 中 央 插 到 試 管 底 部, 控 制 組 不 行 穿 刺 3. 試 管 瓶 口 過 火 上 蓋, 兩 手 搓 試 管 使 菌 液 均 勻 4. 試 管 以 水 降 溫 後,37 培 養 小 時 觀 察 並 記 錄 之 滲 透 壓 嗜 鹽 菌 通 常 分 佈 在 曬 鹽 場 鹽 湖 腌 製 品 中 以 及 世 界 上 著 名 的 死 海 中 嗜 鹽 菌 能 夠 在 鹽 濃 度 為 15~20% 的 環 境 中 生 長, 有 的 甚 至 能 在 32% 的 鹽 水 中 生 長 菌 種 : 大 腸 桿 菌 Escherichia coli 枯 草 桿 菌 Bacillus subtilis 方 法 與 步 驟 : 1. 取 一 loop 的 E. coli 菌 液 到 3 ml NB 中 混 合 均 勻 49

51 2. 取 一 loop 的 B. subtilis 菌 液 到 3 ml NB 中 混 合 均 勻 3. 從 各 管 菌 液 中 取 0.1 ml 到 鹽 度 % 的 平 板 培 養 基 NA 中 央 4. 將 L 形 玻 棒 過 火, 以 L 形 玻 棒 將 菌 液 均 勻 塗 抹 在 培 養 基 上,37 培 養 24hr 後 觀 察 記 錄 紫 外 光 的 照 射 紫 外 光 可 分 為 UV-A,UV-B 與 UV-C 三 種 波 長 在 nm 之 UV-C 最 具 有 殺 菌 效 果, 一 般 被 稱 為 殺 菌 光 紫 外 光 照 射 細 菌 或 病 毒, 導 致 細 菌 或 病 毒 之 DNA 或 RNA 產 生 結 構 變 化, 使 其 喪 失 複 製 能 力, 因 而 無 法 繁 殖, 最 終 命 運 就 是 被 消 滅 菌 種 : 大 腸 桿 菌 Escherichia coli 方 法 與 步 驟 : 1. 取 稀 釋 100 倍 的 E. Coli 菌 液 到 5 個 平 板 培 養 基 2. 將 L 形 玻 棒 過 火, 以 L 形 玻 棒 將 菌 液 均 勻 塗 抹 在 培 養 基 上 3. 將 4 個 平 板 培 養 基 標 示 上 30 秒 1 分 鐘 5 分 鐘 以 及 10 分 鐘 4. 以 鋁 薄 紙 包 裹 培 養 基 的 一 半 後, 進 行 UV 照 射 30 秒 1 分 鐘 5 分 鐘 10 分 鐘 以 及 光 修 復 10 分 鐘 培 養 24hr 後 觀 察 記 錄 50

52 結 果 : 1. 細 菌 生 長 曲 線 圖 以 時 間 對 cfu 作 圖, 以 時 間 為 橫 軸,cfu 為 縱 軸, 菌 液 進 入 log phase 後 的 各 點 應 落 在 一 直 線 上, 連 續 測 量 至 三 個 以 上 的 測 量 值 成 一 直 線, 利 用 此 直 線 找 出 細 菌 生 長 的 加 倍 時 間 (doubling time) 與 平 均 生 長 速 率 (mean growth rate constant) 生 長 曲 線 圖 cfu 小 時 2. 溫 度 記 錄 : 稀 釋

53 3. ph 值 記 錄 : ph 值 大 腸 桿 菌 Escherichia coli 活 菌 乳 酸 菌 4. 含 氧 量 記 錄 : 24 小 時 48 小 時 Escherichia coli Bacillus subtilis 活 菌 乳 酸 菌 控 制 組 52

54 5. 滲 透 壓 記 錄 : 鹽 度 % 1.7% 3% 10% 大 腸 桿 菌 稀 釋 鹽 度 % 1.7% 3% 10% 枯 草 桿 菌 稀 釋

55 時 間 6. 紫 外 光 的 照 射 記 錄 : 30 秒 1 分 鐘 5 分 鐘 10 分 鐘 光 修 復 10 分 鐘 繪 圖 問 題 與 討 論 : 1. 將 菌 液 連 續 稀 釋 的 目 的 為 何? 2. 蜜 餞 臘 肉 沒 有 經 過 高 溫 殺 菌, 是 用 什 麼 原 理 避 免 微 生 物 的 生 長? 3. 如 何 培 養 厭 氧 菌? 4. 一 封 閉 培 養 環 境, 假 設 含 有 多 種 細 菌, 培 養 10 天 後 酸 性 代 謝 產 物 過 多, 此 培 養 環 境 的 菌 相 會 發 生 什 麼 改 變?( 優 勢 菌 種 不 再 優 勢 ) 5. 環 境 中 還 有 哪 些 可 能 對 微 生 物 造 成 影 響 的 因 子? 6. 細 菌 如 何 適 應 惡 劣 的 生 長 環 境? 54

56 實 驗 七 微 生 物 的 代 謝 ( 一 ) 前 言 實 驗 室 中 透 過 簡 單 的 染 色 方 式, 可 以 得 到 相 關 微 生 物 的 基 本 資 訊, 例 如 微 生 物 的 型 態 細 胞 壁 的 革 蘭 氏 屬 性 夾 膜 或 內 胞 子 的 特 殊 型 結 構 等 ; 然 而 對 於 微 生 物 的 種 原 判 定 需 要 更 進 一 步 的 資 訊 提 供, 始 得 進 行 鑑 別 目 前 常 使 用 的 方 式 為 生 化 鑑 別 法, 近 年 來 由 於 對 於 微 生 物 染 色 體 的 特 性 逐 漸 清 楚 了 解, 因 此 透 過 染 色 體 中 的 各 種 分 析, 亦 為 一 有 效 進 行 微 生 物 的 鑑 別 方 式 本 章 的 實 驗 著 重 於 利 用 簡 易 的 生 化 方 式, 對 於 微 生 物 進 行 鑑 別 主 要 的 邏 輯 思 考 是 基 於 每 種 微 生 物 均 有 屬 於 自 己 的 家 族 圖 譜 可 供 辨 識, 因 為 : 每 種 微 生 物 均 有 專 屬 獨 特 的 基 因 序 列 基 因 序 列 可 影 響 蛋 白 質 的 生 合 成, 若 微 生 物 之 間 的 特 性 不 同, 則 所 具 有 的 基 因 亦 會 有 所 差 異, 表 示 表 現 出 的 蛋 白 質 或 酵 素 亦 會 有 所 差 別 酵 素 會 催 化 生 物 體 內 的 許 多 化 學 反 應 不 同 種 類 的 微 生 物 所 具 有 的 酵 素 群 若 有 所 差 異, 則 表 現 出 的 生 化 反 應 將 具 有 個 別 的 獨 特 性 一 般 而 言, 進 行 微 生 物 鑑 別 時, 必 須 先 將 微 生 物 培 養 於 許 多 不 同 的 培 養 基 中, 透 過 培 養 基 中 所 呈 現 的 最 後 代 謝 產 物 來 判 定 微 生 物 的 屬 性 本 章 的 第 一 部 分, 為 透 過 微 生 物 的 不 同 胞 外 酵 素 表 現 的 差 異, 來 區 別 不 同 種 類 的 微 生 物 第 二 部 分 則 是 根 據 不 同 的 鑑 別 目 的, 設 計 特 殊 的 培 養 基 對 於 一 些 常 見 的 工 業 微 生 物 或 病 源 微 生 物 進 行 鑑 別 第 一 部 分 微 生 物 胞 外 酵 素 產 生 能 力 之 鑑 別 一 般 對 於 酵 素 在 細 胞 的 情 形, 可 區 分 為 胞 外 酵 素 (exoenzymes) 及 胞 內 酵 素 (endoenzymes) 所 謂 的 胞 外 酵 素, 是 會 對 於 細 胞 外 環 境 中 的 大 分 子 的 營 養 性 物 質 進 行 分 解 至 可 以 進 入 細 胞 的 一 種 酵 素 一 旦 這 些 小 分 子 進 入 細 胞 後, 就 可 以 透 過 所 謂 的 胞 內 酵 素 進 行 代 謝 反 應, 最 後 轉 換 為 能 量, 或 是 建 構 成 其 他 的 細 胞 成 分 55

57 A. 多 醣 水 解 (Polysaccharides hydrolysis) 酵 素 目 的 多 醣 為 許 多 糖 分 子 鍵 結 而 成 的 大 分 子 物 質, 澱 粉 為 葡 萄 糖 以 -1,6 鍵 結 而 成 的 分 子 ; 纖 維 素 主 要 是 以 葡 萄 糖 以 -1,4 鍵 結 而 成 的 分 子 結 構 有 些 微 生 物 可 以 對 多 醣 進 行 分 解 而 變 成 小 分 子, 進 而 可 進 入 細 胞 內 被 利 用 本 節 的 實 驗 重 點, 主 要 是 透 過 以 澱 粉 或 纖 維 素 為 主 的 培 養 基, 來 鑑 別 不 同 微 生 物 對 於 此 兩 類 碳 源 的 利 用 情 形 材 料 器 材 : 接 種 環 滴 管 奇 異 筆 澱 粉 培 養 基 : 含 0.5 % 可 溶 性 澱 粉 的 營 養 培 養 基 製 作 成 平 板 培 養 基 纖 維 素 培 養 基 : 含 2 %CMC(Carboxymethyl cellulose) 的 營 養 培 養 基 製 作 成 平 板 培 養 基 試 藥 : 革 蘭 氏 碘 液 : 碘 (I 2 ) 1g+ 氫 氧 化 鉀 (KOH) 2g, 以 蒸 餾 水 補 至 300ml 剛 果 紅 液 ( 0.1% 剛 果 紅 ):0.1g 剛 果 紅 粉 末, 以 蒸 餾 水 補 至 100ml 微 生 物 : 培 養 於 TSB 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 及 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 步 驟 1. 在 澱 粉 培 養 皿 及 纖 維 素 培 養 皿 背 面, 以 奇 異 筆 將 培 養 皿 先 行 區 分 為 2 區 2. 以 直 線 畫 線 法 將 沾 有 菌 液 的 接 轉 環 於 無 菌 環 境 下 塗 抹 於 上 述 培 養 皿 中 的 指 定 區 域 盡 量 讓 各 區 的 菌 集 中 在 各 自 範 圍 的 中 間 部 位 3. 置 於 37 培 養 箱 中, 隔 日 進 行 觀 察 4. 在 澱 粉 培 養 皿 上 滴 入 碘 液, 碘 液 會 與 澱 粉 分 子 形 成 大 分 子 複 合 物, 而 呈 現 深 藍 色, 若 澱 粉 被 微 生 物 分 解 轉 變 成 小 分 子 的 單 糖 時, 碘 液 則 維 持 原 來 的 褐 色 5. 在 纖 維 素 培 養 皿 上 滴 入 剛 果 紅 染 料, 待 10 min 後 以 1M NaCl 退 染 即 可 因 為 剛 果 紅 與 較 長 鏈 的 多 糖 結 合 力 較 佳, 若 纖 維 素 被 微 生 物 分 解 轉 變 成 小 分 子 的 單 糖 時, 則 將 無 法 和 剛 果 紅 結 合 而 呈 現 透 明 狀 態 56

58 圖 : 左 方 為 枯 草 桿 菌 (B. subtilis) 培 養 於 含 有 澱 粉 之 營 養 培 養 基 後, 分 解 澱 粉 的 情 形 經 碘 液 染 色 後 的 未 變 色 的 部 分, 即 是 被 枯 草 桿 菌 所 分 泌 出 的 胞 外 酵 素 溶 解 澱 粉 後 的 情 形 ; 而 相 對 於 大 腸 桿 菌, 在 營 養 培 養 基 上 僅 有 生 長 的 現 象, 但 並 無 法 對 澱 粉 進 行 分 解 B. 蛋 白 質 水 解 目 的 蛋 白 質 為 由 許 多 胺 基 酸 彼 此 以 peptide bond 鍵 結 而 成 的 大 分 子 物 質 許 多 微 生 物 可 以 分 解 蛋 白 質 成 為 peptide 後, 再 分 解 成 胺 基 酸 進 而 被 細 胞 利 用 分 解 蛋 白 質 的 過 程, 稱 為 蛋 白 質 水 解 (proteolysis), 參 與 反 應 的 酵 素 稱 為 蛋 白 質 分 解 酵 素 (protease) 在 本 節 的 實 驗 中, 檢 測 微 生 物 對 於 酪 蛋 白 (casein) 及 吉 力 丁 (gelatin) 的 分 解 能 力 其 中 吉 力 丁 分 解 能 力 之 測 試, 常 可 作 為 鑑 別 葡 萄 球 菌 屬 中 的 Staphylococcus aureus 及 Staphylococcus epidermidis. 材 料 器 材 : 接 種 環 奇 異 筆 酪 蛋 白 培 養 基 : 含 10% casein 的 營 養 培 養 基 製 作 成 平 板 培 養 基 吉 力 丁 培 養 基 : 含 10 % gelatin 及 5% agar 的 營 養 培 養 基, 製 作 成 試 管 直 立 培 養 基 微 生 物 : 培 養 於 TSB 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus ) 及 表 皮 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis) 57

59 步 驟 1. 在 含 有 酪 蛋 白 培 養 基 的 素 培 養 皿 背 面, 以 奇 異 筆 將 培 養 皿 先 行 區 分 為 4 區 2. 以 直 線 畫 線 法 將 沾 有 菌 液 的 接 轉 環 於 無 菌 環 境 下 塗 抹 於 上 述 培 養 皿 中 的 指 定 區 域 盡 量 讓 各 區 的 菌 集 中 在 各 自 範 圍 的 中 間 部 位 3. 置 於 37 培 養 箱 中, 隔 日 進 行 觀 察 在 菌 體 周 圍 出 現 透 明 環 者, 即 為 酪 蛋 白 分 解 能 力 positive 4. 將 微 生 物 以 穿 刺 培 養 方 式 接 種 至 含 有 吉 力 丁 培 養 基 的 試 管 中 5. 置 於 37 培 養 箱 中, 隔 日 進 行 觀 察 及 第 一 次 紀 錄, 隨 後 將 試 管 置 入 4 冰 箱 30 分 鐘 後 取 出, 進 行 第 二 次 觀 察 試 管 中 仍 呈 現 水 狀 物 者, 即 為 吉 力 丁 分 解 能 力 positive 圖 : 左 上 方 為 枯 草 桿 菌 (B. subtilis) 培 養 於 含 有 酪 蛋 白 之 營 養 培 養 基 後, 分 解 酪 蛋 白 的 情 形 菌 體 周 圍 出 現 的 透 明 環, 即 是 被 枯 草 桿 菌 所 分 泌 出 的 包 外 酵 素 溶 解 後 的 情 形 ; 而 相 對 於 大 腸 桿 菌 及 金 黃 色 葡 萄 球 菌, 在 營 養 培 養 基 上 僅 有 生 長 的 現 象, 但 並 無 法 對 酪 蛋 白 進 行 分 解 C. 脂 肪 水 解 反 應 目 的 一 般 脂 肪 為 甘 油 及 脂 肪 酸 所 組 成 微 生 物 可 透 過 脂 解 酵 素, 將 脂 肪 水 解 成 為 甘 油 及 脂 肪 酸 供 給 細 胞 直 接 利 用 或 透 過 氧 化 的 代 謝 作 用 產 生 能 量 可 透 過 培 養 基 ph 質 的 變 化 或 是 利 用 特 殊 的 培 養 基 進 行 微 生 物 種 類 的 辨 識 材 料 器 材 : 接 種 環 奇 異 筆 丁 酸 甘 油 脂 - 玫 瑰 紅 B(tributyrin-rhodamine B) 培 養 基 : 58

60 含 1% 丁 酸 甘 油 脂 及 1% 玫 瑰 紅 B 的 營 養 培 養 基 製 作 成 平 板 培 養 基 橄 欖 油 - 玫 瑰 紅 B(olive-rhodamine B) 培 養 基 : 含 1% 橄 欖 油 及 1% 玫 瑰 紅 B 的 營 養 培 養 基 製 作 成 平 板 培 養 基 * 培 養 基 配 製 法 : 1. 以 無 菌 水 配 製 10% rhodamineb stock 溶 液 (1g/10ml) tributyrin( 皆 以 過 濾 膜 0.2 m 過 濾 滅 菌 ) 2. 配 製 NB+1.2% agar 98ml, 以 高 溫 高 壓 滅 菌 後, 置 於 60 水 浴 中, 待 溫 度 平 衡 3. 於 無 菌 操 作 台 中 加 入 1ml 的 10% rhodamine B 溶 液 與 1ml tributyrin(olive oil) 4. 超 音 波 震 盪, 使 油 狀 的 tributyrin(olive oil) 均 勻 分 散, 同 時 溫 度 保 持 50~60, 20~30 分 鐘 5. 倒 入 微 生 物 用 的 培 養 皿 (Petri dish), 待 完 全 凝 固 後, 放 在 室 溫 或 4 中 備 用 微 生 物 : 培 養 於 TSB 之 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 及 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtils) 步 驟 1. 在 1% 橄 欖 油 - 玫 瑰 紅 B 培 養 皿 及 1% 丁 酸 甘 油 脂 - 玫 瑰 紅 B 培 養 皿 背 面, 以 奇 異 筆 將 培 養 皿 先 行 區 分 為 2 區 2. 以 直 線 畫 線 法 將 沾 有 菌 液 的 接 種 環 於 無 菌 環 境 下 塗 抹 於 上 述 培 養 皿 中 的 指 定 區 域 盡 量 讓 各 區 的 菌 集 中 在 各 自 範 圍 的 中 間 部 位 3. 置 於 37 培 養 箱 中, 隔 日 進 行 觀 察 4. 若 有 分 解 現 象, 則 可 以 直 接 從 培 養 皿 上 看 到 顏 色 產 生 橘 黃 色 螢 光 59

61 實 驗 八 微 生 物 的 代 謝 ( 二 ) 第 二 部 分 微 生 物 各 種 代 謝 能 力 之 鑑 別 A. 微 生 物 厭 氧 性 判 定 (Catalase activity) 目 的 一 般 微 生 物 進 行 有 氧 呼 吸 時, 會 產 生 許 多 氫 離 子, 一 定 要 設 法 排 出 細 胞 外, 否 則 將 會 影 響 細 胞 生 理 狀 態 而 細 胞 膜 上 的 電 子 傳 遞 鏈, 可 將 這 些 氫 離 子 帶 離 細 胞 外, 在 此 過 程 中, 氫 離 子 可 與 氧 原 子 結 合 成 為 水 分 子, 成 為 對 細 胞 無 傷 害 的 分 子, 並 可 同 時 產 生 出 能 量 以 ATP 的 形 式 儲 存 於 細 胞 內 在 細 胞 膜 上 的 的 電 子 傳 遞 鏈 由 許 多 細 胞 色 素 (cytochrome), 可 協 助 氫 離 子 與 氧 分 子 的 結 合, 但 此 步 驟 的 產 物 多 為 具 有 毒 性 的 過 氧 化 氫 (H 2 O 2 ), 必 須 存 在 有 觸 酶 (catalase) 始 得 協 助 將 H 2 O 2 轉 換 成 為 無 毒 性 水 分 子 因 此 無 法 執 行 有 氧 呼 吸 的 微 生 物 菌 屬, 如 鏈 球 菌 (Streptococcus) 乳 酸 桿 菌 (Lactobacillus) 以 及 梭 狀 桿 菌 (Clostridium) 等 均 屬 於 catalase-negative 材 料 器 材 : 接 種 環 滴 管 微 生 物 : 培 養 於 TSA 平 板 培 養 基 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 及 鏈 球 菌 (Streptococcus aglactiae) 試 藥 : 3% 過 氧 化 氫 溶 液 步 驟 1. 在 TSA 培 養 皿 背 面, 以 奇 異 筆 將 培 養 皿 先 行 區 分 為 2 區 2. 以 直 線 畫 線 法 將 沾 有 菌 液 的 接 種 環 於 無 菌 環 境 下 塗 抹 於 上 述 培 養 皿 中 的 指 定 區 域 盡 量 讓 各 區 的 菌 集 中 在 各 自 範 圍 的 中 間 部 位 60

62 3. 置 於 37 培 養 箱 中, 隔 日 進 行 觀 察 4. 在 菌 體 上 滴 上 數 滴 3% 過 氧 化 氫 溶 液, 觀 察 氧 氣 汽 泡 的 產 生 與 否 圖 : 左 方 為 金 黃 色 葡 萄 球 菌, 滴 上 過 氧 化 氫 後 有 汽 泡 產 生, 故 其 為 catalase-positive ; 右 方 之 鏈 球 菌 則 無 汽 泡 產 生, 為 catalase-negative B. 碳 水 化 合 物 的 發 酵 能 力 測 試 目 的 微 生 物 由 於 種 源 的 歧 異 度 高, 因 此 對 於 碳 源 的 利 用 具 有 選 擇 性, 在 微 生 物 的 分 類 上, 亦 可 利 用 對 於 碳 水 化 合 物 轉 換 成 為 能 量 的 狀 態 進 行 鑑 別 不 同 於 好 氣 性 微 生 物, 可 利 用 呼 吸 作 用 進 行 能 量 的 產 生, 兼 性 厭 氧 菌 (facultative anaerobic) 及 厭 氧 菌 (anaerobic bacteria) 可 以 利 用 發 酵 的 形 式 轉 換 營 養 素 成 為 能 量 的 來 源 一 般 而 言, 可 偵 測 碳 水 化 合 物 經 過 微 生 物 代 謝 後 的 產 物, 進 行 初 步 的 判 定 例 如 以 下 的 發 酵 產 物, 經 常 被 利 用 作 為 判 別 微 生 物 所 具 有 的 代 謝 酵 素 型 態 1. 酸 性 代 謝 產 物 2. 酸 性 及 氣 體 同 時 出 現 的 代 謝 產 物 將 培 養 基 中 的 碳 源 控 制 在 單 一 種 類 ( 如 葡 萄 糖 乳 糖 或 麥 芽 糖 ), 同 時 在 培 養 基 中 加 入 酸 鹼 指 示 劑 ( 如 酚 紅 ), 裝 入 發 酵 管 後 ( 可 偵 測 氣 體 產 生 之 裝 置 ) 接 菌 進 行 培 養 若 是 培 養 基 中 的 碳 源 被 微 生 物 利 用, 產 生 岀 之 酸 性 物 質 將 會 降 低 發 酵 液 中 的 ph 值, 使 酸 鹼 指 示 劑 變 色 ( 如 酚 紅 會 轉 並 成 為 黃 色 ) ; 若 氣 體 伴 隨 著 酸 性 物 質 同 時 產 岀, 則 可 透 過 發 酵 管 中 氣 體 佔 據 之 空 間 進 行 判 別 若 是 培 養 基 中 的 碳 源 均 無 法 被 微 生 物 利 用, 則 在 發 酵 管 中 觀 察 到 的 仍 舊 維 持 原 培 養 基 的 顏 色, 且 發 酵 管 上 部 不 會 出 現 被 空 氣 佔 據 之 空 間 61

63 材 料 器 材 : 發 酵 管 橡 皮 塞 ( 橡 皮 塞 孔 洞 以 牙 籤 塞 入 棉 花 ) pipet tip 培 養 基 : Lactose broth: 3% lactose 添 加 於 營 養 培 養 基 中 Glucose broth: 3% glucose 添 加 於 營 養 培 養 基 中 Sucrose broth: 3% sucrose 添 加 於 營 養 培 養 基 中 試 藥 : 酚 紅 (phenol red) 試 劑 : 稱 取 % 酚 紅 粉 末 加 入 培 養 基 中 一 同 滅 菌 * 將 發 酵 管 與 培 養 基 分 開 滅 菌, 再 將 培 養 基 填 入 發 酵 管 中 ( 每 管 約 可 填 入 50ml) 微 生 物 : 培 養 於 TSB 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 步 驟 1. 將 微 生 物 分 別 培 養 於 各 培 養 基 ( 約 50ml) 中 ( 接 入 菌 液 1ml) 2. 將 大 腸 桿 菌 枯 草 桿 菌 及 金 黃 色 葡 萄 球 菌 靜 置 於 37 培 養 箱,12 小 時 後 進 行 觀 察 顏 色 的 變 化 及 氣 體 空 間 出 現 的 體 積 並 紀 錄 0 小 時 圖 (1): 菌 剛 接 至 培 養 基 時 發 酵 管 底 部 呈 紅 色 62

64 12 小 時 圖 (2): 左 發 酵 管 為 大 腸 桿 菌 培 養 至 10% maltose 培 養 基 中, 箭 頭 指 出 部 分 為 有 氣 體 產 出, 培 養 基 亦 呈 現 黃 色 ; 右 為 大 腸 桿 菌 培 養 至 10% lactose 培 養 基 中, 培 養 基 幾 乎 呈 現 黃 色, 但 底 部 仍 可 見 部 份 呈 橘 紅 色, 且 無 氣 體 生 成 C. 微 生 物 具 有 色 胺 酸 分 解 酵 素 / 含 硫 氨 基 酸 分 解 酵 素 能 力 之 鑑 別 目 的 色 氨 酸 (tryptophan) 為 一 不 易 被 分 解 之 氨 基 酸, 而 少 數 具 有 色 氨 酸 分 解 酵 素 (tryptophanase) 之 微 生 物, 則 可 將 色 氨 酸 分 解 為 indole pyruvic acid 及 ammonia Kovac's reagent 等 試 劑 可 與 indole 反 應 產 生 紅 色 反 應 物, 因 此 透 過 以 添 加 於 培 養 基 中 Kovac's reagent 等 試 劑 的 顏 色 變 化, 即 可 鑑 別 微 生 物 對 於 培 養 基 中 額 外 添 加 的 色 氨 酸 是 否 具 有 分 解 之 能 力 此 類 測 試 經 常 用 於 大 腸 桿 菌 的 鑑 別 含 硫 氨 基 酸 如 胱 胺 酸 (cystine) 及 甲 硫 胺 酸 (methionine ) 或 是 還 原 態 的 無 機 含 硫 化 合 物 如 亞 硫 酸 鹽 (sulfite) 硫 酸 鹽 (sulfate) 或 硫 代 硫 酸 鹽 (thiosulfate) 等 意 識 部 亦 在 自 然 界 中 被 分 解 的 物 質 而 有 一 些 微 生 物 如 變 形 桿 菌 (Proteus ) 及 沙 門 氏 菌 (Salmonella) 等, 可 將 上 述 之 含 硫 化 合 物 代 謝 還 原 成 硫 化 氫 (H 2 S), 而 這 些 可 在 進 入 細 胞 內 與 其 他 的 氨 基 酸 結 合 或 與 輔 酶 結 合, 重 新 被 循 環 利 用 若 是 含 硫 化 合 物 被 微 生 物 還 原 成 硫 分 子 或 硫 化 氫, 即 可 與 鐵 鹽 形 成 黑 色 的 硫 化 鐵, 可 迅 速 鑑 別 微 生 物 是 否 具 有 含 硫 氨 基 酸 分 解 酵 素 之 能 力 材 料 器 材 : 63

65 試 管 接 種 環 SIM (Sulfide Indole Motility) 培 養 基 : Peptone 30 g;beef extract 3 g; ferrous ammonium sulfate 0.2 g; sodium thiosulfate g; agar 3 g; ph 7.3; 以 蒸 餾 水 調 整 至 1000 ml 微 生 物 : 培 養 於 TSA 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 及 變 形 桿 菌 (Proteus mirabilis) 試 藥 : Kovac s 試 劑 將 P-dimethyl amino benzaldehyde 5 g 溶 於 75 ml 之 amyl alcohol 中, 再 加 入 25 ml hydrochloric acid (concentrated) 混 合 均 勻 完 成 步 驟 1. 將 微 生 物 以 穿 刺 培 養 方 式, 分 別 培 養 於 含 有 SIM 培 養 基 的 試 管 中 2. 靜 置 37 C 培 養 箱 中,12 小 時 後 進 行 觀 察 及 紀 錄 3. 觀 察 各 試 管 中 的 顏 色 變 化 紀 錄 後, 隨 即 加 入 Kovac s 試 劑, 觀 察 顏 色 擴 散 之 狀 態 若 有 擴 散, 則 為 motility-positive, 表 示 培 養 的 微 生 物 具 有 游 動 的 能 力 圖 :Escherichia coli 在 加 入 Kovac s 試 劑 後 試 劑 呈 現 紅 色, 表 其 對 色 氨 酸 具 有 分 解 能 力, 為 indole- positive, 但 其 顏 色 並 未 擴 散, 表 Escherichia coli 不 具 游 動 能 力 64

66 D. 利 用 葡 萄 糖 發 酵 產 物 鑑 別 微 生 物 代 謝 路 徑 之 差 異 目 的 不 同 的 微 生 物 轉 換 葡 萄 糖 為 丙 酮 酸 (pyruvate) 可 能 使 用 不 同 的 代 謝 路 徑 部 分 代 謝 路 徑 產 生 出 pyruvate 後, 會 形 成 穩 定 的 酸 性 物 質, 如 乳 酸 醋 酸 蟻 酸 等 ; 部 分 微 生 物 可 透 過 其 他 的 如 butylene glycol pathway 等 代 謝 路 徑 快 速 降 解 pyruvate 成 為 acetoin 及 2,3-butanediol 等 中 性 物 質 利 用 甲 基 紅 (Methyl Red) 測 試 培 養 基 經 過 微 生 物 發 酵 的 顏 色 變 化, 可 以 快 速 的 鑑 定 微 生 物 所 使 用 代 謝 葡 萄 糖 的 路 徑 例 如 微 生 物 若 使 用 酸 性 代 謝 路 徑 (mixed acid fermentation pathway) 而 產 生 出 穩 定 態 的 有 機 酸 時, 加 入 甲 基 紅 於 發 酵 液 中, 呈 現 出 的 是 紅 色 的 結 果 ; 若 微 生 物 採 用 的 是 butylene glycol 代 謝 路 徑, 則 代 謝 物 為 中 性 物 質, 此 時 的 發 酵 液 仍 維 持 黃 色 為 了 更 進 一 步 確 認 此 類 中 性 物 質 如 acetoin 的 存 在 與 否, 可 使 用 Voges-Proskauer(VP) 試 劑 ( 銅 藍 色 ), 利 用 試 劑 中 所 含 有 的 氫 氧 化 鉀 (KOH) 可 氧 化 acetoin 成 為 diacetyl, 之 後 在 creatine 或 -naphthol 的 催 化 下 會 與 guanidine group 縮 合 成 紅 色 之 化 合 物 以 上 兩 種 測 試 方 式 經 常 合 併 使 用, 稱 為 MR-VP test, 經 常 用 於 鑑 別 腸 內 菌 材 料 器 材 : 試 管 接 種 環 pipet tip MR-VP 培 養 基 : Peptone 7 g;dextrose 5 g; potassium phosphate 5 g(k 2 HPO 4 KH 2 PO 4 各 2.5g); ph 6.9; 以 蒸 餾 水 調 整 至 1 L 微 生 物 : 培 養 於 TSB 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 及 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 試 藥 : 甲 基 紅 試 劑 : 將 0.1g 甲 基 紅 溶 於 300 ml 的 95% 酒 精 中, 再 加 入 200mL 蒸 餾 水 混 合 均 勻 完 成 VP 試 劑 : 65

67 VP I: 6% -naphthol ( 溶 於 95% 酒 精 中 ) VP II: 40% KOH 步 驟 1. 將 各 種 微 生 物 培 養 於 含 有 MR-VP 培 養 基 ( 約 3 ml) 的 試 管 中, 各 二 重 複 ( 接 入 菌 液 100 l) 2. 靜 置 37 C 培 養 箱 中,12 小 時 後 進 行 觀 察 及 紀 錄 3. 將 含 有 各 微 生 物 之 試 管 分 為 兩 組, 其 中 一 組 的 各 試 管 中, 加 入 約 0.1 ml 的 甲 基 紅 溶 液, 觀 察 各 試 管 中 的 顏 色 變 化 並 加 以 紀 錄, 若 呈 現 出 紅 色 者, 則 表 示 MR-positive 4. 另 一 組 的 各 試 管 中, 分 別 加 入 0.5 ml 的 VP I 及 VP II 溶 液, 混 合 均 勻 靜 置 15 分 鐘 後, 觀 察 各 試 管 中 的 顏 色 變 化 並 加 以 紀 錄, 若 呈 現 出 紅 色 者, 則 表 示 VP-positive MR MR VP VP 圖 : 在 MR-VP 測 試 中,Escherichia coli 的 結 果 為 MR-positive VP-negative ; 而 Bacillus subtilis 的 結 果 為 MR-negative VP-positive E. 利 用 檸 檬 酸 之 代 謝 與 否 鑑 別 微 生 物 代 謝 路 徑 之 差 異 目 的 一 般 微 生 物 無 法 利 用 檸 檬 酸 為 唯 一 碳 源, 必 須 微 生 物 具 有 citrase 或 citratepermease 的 酵 素 系 統, 才 能 將 胞 外 的 檸 檬 酸 送 入 細 胞 內 使 用 此 類 微 生 物 共 同 特 徵 是 具 有 將 硫 酸 銨 轉 換 成 為 氨 及 氫 氧 化 銨, 釋 放 出 細 胞 外 後 造 成 培 養 基 環 境 中 的 酸 鹼 值 上 升 至 ph 7.5 以 上 因 此 可 利 用 Simmons citrate agar, 此 種 培 養 基 中 以 檸 66

68 檬 酸 為 唯 一 碳 源, 以 硫 酸 銨 作 為 唯 一 氮 源, 並 含 有 綠 色 的 溴 瑞 香 草 酚 藍 (bromothymol blue; 變 色 範 圍 是 ph <6.0 為 黃 色, ph >7.6 為 藍 色 ) 作 為 酸 鹼 指 示 劑, 測 試 微 生 物 是 否 具 有 利 用 檸 檬 酸 或 是 利 用 無 機 銨 鹽 的 能 力 此 方 法 又 被 稱 為 citrate test, 常 用 以 鑑 別 腸 道 菌 科 (Enterobacteriaceae) 例 如 沙 門 氏 菌 (Salmonella enterica servoar Typhimurium) 培 養 在 Simmons citrate agar 中, 會 造 成 培 養 基 的 變 色 成 為 藍 色, 此 時 可 稱 有 citrate test- positive ; 而 培 養 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 於 Simmons Citrate agar 中, 培 養 基 仍 維 持 原 綠 色 之 狀 態, 則 稱 此 現 象 為 citrate test- negative 材 料 器 材 : 試 管 接 種 環 Simmons citrate agar: Ammonium dihydrogen phosphate (NH 4 H 2 PO 4 ) 1g;dipotossium phosphate (K 2 HPO 4 ) 1g;sodium chloride (NaCl) 5g;sodium citrate (Na 3 C 6 H 5 O 7 ) 2g;Magnesium sulfate (MgSO 4 ) 0.2g;agar 12g;bromothymol blue 0.08g, 以 蒸 餾 水 調 整 至 1L, 配 製 成 斜 面 培 養 基 微 生 物 : 培 養 於 TSB 的 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 枯 草 桿 菌 (Bacillus subtilis) 金 黃 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus aureus) 步 驟 1. 以 接 種 環 沾 取 菌 液 塗 至 Simmon citrate agar 之 斜 面 培 養 基 上 2. 培 養 至 37 培 養 箱 之 中, 隔 日 觀 察 及 記 錄, 若 培 養 基 呈 現 藍 色 者, 即 為 citrate test- positve 67

69 Positive Negative 圖 : 在 Citrate Test 中, 藍 色 的 為 Citrate Test-positive 綠 色 的 為 Citrate Test-negative 應 用 例 : IMViC tests 利 用 IMViC tests 可 快 速 鑑 別 腸 內 菌 群 如 : 大 腸 桿 菌 (Escherichia coli) 產 氣 性 大 腸 桿 菌 (Enterobacter aerogene) 泄 殖 腔 腸 桿 菌 (Enterobacter cloacae) 及 克 雷 氏 肺 炎 桿 菌 (Klebsiella pneumoniae ) 所 謂 的 IMViC tests 包 括 下 列 一 系 列 的 檢 測 : Indole 產 物 生 成 能 力 ( 可 使 用 SIM 培 養 基 測 試 ) Methyl red ( 甲 基 紅 ) 測 試 Voges-Proskauer 測 試 Citrate 產 物 生 成 能 力 68

70 實 驗 九 細 菌 生 長 的 控 制 目 的 : 細 菌 生 長 的 條 件 是 營 養 跟 空 間, 如 果 缺 一 細 菌 的 生 長 將 會 受 到 影 響 另 外 生 長 環 境 的 改 變 即 可 達 到 菌 的 減 少, 本 實 驗 希 望 讓 同 學 了 解 如 何 利 用 物 理 及 化 學 的 方 法 來 控 制 細 菌 的 生 長 以 及 達 到 滅 菌 的 效 果 材 料 與 設 備 : 1. 鋁 薄 紙 2. 無 菌 操 作 台 3. 恆 溫 培 養 箱 分 光 光 度 計 4. 比 色 管 5. 大 腸 桿 菌 枯 草 桿 菌 與 金 黃 色 葡 萄 球 菌 之 培 養 液 各 1 管 ml 之 營 養 肉 湯 7. 無 菌 水 8. 無 菌 試 管 每 組 20 支 9. 營 養 平 碟 每 組 20 個 10. 殺 菌 劑 ( 漂 白 水 ) 水 浴 震 盪 培 養 器 之 水 浴 13. 紫 外 燈 14. 鑷 子 簽 字 筆 15.1ml 與 10 ml 無 菌 吸 管 16.L 形 玻 棒 泡 酒 精 17. 酒 精 燈 69

71 影 響 微 生 物 生 長 之 物 理 條 件 高 溫 滅 菌 從 古 希 臘 時 代 開 始, 火 和 滾 水 就 被 用 來 殺 菌 及 消 毒 使 用, 一 直 到 今 天, 不 論 乾 熱 或 溼 熱, 加 熱 仍 然 是 最 常 被 用 來 消 滅 微 生 物 的 方 法 之 一 例 如 : 我 們 將 生 長 中 的 細 胞 與 真 核 孢 子 暴 露 於 滾 水 10 分 鐘, 便 能 有 效 地 將 其 消 滅 不 過,100 (212 ) 的 溫 度 並 無 法 殺 死 細 菌 之 內 孢 子, 頑 強 的 它 們 可 以 在 滾 水 中 存 活 數 小 時 之 久 因 此 煮 沸 這 個 動 作, 只 能 被 用 來 消 毒 飲 用 水, 使 人 們 不 致 因 飲 水 而 生 病, 並 無 法 達 到 完 全 滅 菌 之 效 果 在 此 實 驗 裡 利 用 不 同 加 熱 的 方 法 看 看 是 否 可 以 達 到 滅 菌 的 效 果 方 法 與 步 驟 : 1. 取 金 黃 色 葡 萄 球 菌 枯 草 桿 菌 大 腸 桿 菌 的 隔 夜 培 養 菌 液 1ml 2. 將 三 個 培 養 皿 底 部 標 上 菌 種 及 不 同 作 用 時 間 和 溫 度, 如 下 圖 : E E E E 30 30min S S 30 60min 50 30min S S 50 60min B B B B E E min S S Control B B 3. 將 不 同 條 件 試 管 中 的 菌 置 於 水 浴 鍋 加 熱, 依 不 同 時 間 以 及 溫 度 將 細 70

72 菌 接 種 於 培 養 基 上 4. 將 培 養 基 放 入 於 37 的 培 養 箱 中 培 養, 於 隔 天 觀 察 其 結 果 紫 外 光 滅 菌 紫 外 光 在 波 長 260nm, 其 光 粒 子 能 穿 透 細 胞 壁 將 細 菌 細 胞 內 之 核 酸 分 子 切 斷 分 解, 使 細 菌 喪 失 生 活 機 能 而 死 亡 在 此 實 驗 裡 利 用 不 同 時 間 的 照 射 紫 外 光 達 到 滅 菌 的 效 果 方 法 與 步 驟 : 1. 將 三 個 培 養 皿 底 部 標 上 菌 種 及 不 同 作 用 時 間, 如 下 圖 : 1 min 5 min 10 min E S E S E S B B B 2. 以 接 種 環 取 出 菌 液, 於 劃 線 法 化 於 該 培 養 基 區 域 上 3. 將 劃 好 菌 的 培 養 基 放 至 於 無 菌 操 作 台 上, 並 將 蓋 子 打 開 71

73 5. 以 短 波 (254nm) 的 紫 外 光 於 培 養 基 上 照 射, 分 別 作 用 分 鐘, 對 照 組 為 不 照 射 紫 外 光 5. 將 培 養 基 放 入 於 37 的 培 養 箱 中 培 養, 於 隔 天 觀 察 其 結 果 影 響 微 生 物 生 長 之 化 學 條 件 殺 菌 劑 滅 菌 微 生 物 的 種 類 繁 多, 其 菌 體 本 身 的 構 造 及 生 理 特 性, 或 生 化 代 謝 各 有 不 同 造 成 對 化 學 試 劑 產 生 了 不 同 的 抵 抗 性 在 本 實 驗 裡 利 用 不 同 濃 度 的 殺 菌 劑 達 到 滅 菌 的 效 果 方 法 與 步 驟 : 1. 將 市 售 的 殺 菌 劑 ( 漂 白 水 ), 已 無 菌 操 作 1:10 ~ 1:500 的 稀 釋, 如 下 圖 : 稀 釋 液 體 積 (ml) 無 菌 水 (ml) 最 後 的 稀 釋 度 原 液 /10 1/ /100 1/ /200 72

74 1/ /300 1/ /400 1/ / 取 各 稀 釋 液 體 2ml, 至 於 無 菌 試 管 中, 在 加 入 同 體 積 的 金 黃 色 葡 萄 球 菌 於 內, 於 混 何 均 勻 後 開 始 計 時 3. 分 別 作 用 於 分 鐘 後, 以 接 種 環 取 出 億 體 於 3ml 的 液 態 培 養 基 中 培 養 4. 將 培 養 基 放 入 於 37 的 培 養 箱 中 震 盪 培 養, 於 隔 天 觀 察 其 結 果 抗 生 素 滅 菌 臨 床 上 用 來 評 估 某 特 定 抗 生 素 對 病 原 菌 的 療 效, 在 體 外 (in vitro) 最 直 接 方 便 的 測 定 方 式, 即 是 測 定 菌 株 抗 生 素 感 受 性 體 外 試 驗 有 非 常 多 種, 舉 凡 紙 錠 擴 散 試 驗 (disk-diffusion test) 最 低 抑 菌 濃 度 測 定 (minimum inhibitory concentration; MIC) 最 低 殺 菌 濃 度 測 定 (minimum bactericidal concentration; MBC) 棋 盤 格 殺 菌 試 驗 (checkerboard test) 殺 菌 時 間 曲 線 試 驗 (time-kill curves test) 在 抗 生 素 敏 感 性 測 驗 中, 可 測 量 出 細 菌 對 不 同 抗 生 素 的 感 受 程 度, 以 便 篩 選 出 適 合 的 抗 生 素 用 藥 方 法 與 步 驟 : 1. 取 金 黃 色 葡 萄 球 菌 枯 草 桿 菌 大 腸 桿 菌 的 隔 夜 培 養 菌 液, 以 塗 抹 法 均 勻 塗 於 培 養 基 中 如 圖 : 金 黃 色 葡 萄 球 菌 枯 草 桿 菌 大 腸 桿 菌 A T A T 73 A T N C N C N C E E E

75 2. 以 無 菌 鑷 子 夾 取 抗 生 素 紙 環 Ampicillin (A) Tetracycline (T) Chloramphenicol (C) Erythromycin (E) 與 Neomycin (N) 等 5 種 3. 將 各 紙 環 直 接 放 於 塗 好 菌 的 培 養 基 上 ( 紙 環 之 間 要 保 持 一 定 的 距 離 ) 4. 與 37 培 養 箱 內 陪 養, 於 隔 天 觀 察 其 結 果 結 果 : 7. 高 溫 滅 菌 觀 察 不 同 溫 度 及 時 間 的 變 化 對 細 菌 生 長 的 影 響, 以 (-) 到 (++) 表 示 之 (-) 為 無 菌 落,(+) 為 有 少 許 菌 落,(++) 為 菌 落 很 多 金 黃 色 葡 萄 球 菌 30 分 鐘 作 用 溫 度 ( )

76 60 分 鐘 枯 草 桿 菌 30 分 鐘 作 用 溫 度 ( ) 分 鐘 大 腸 桿 菌 30 分 鐘 作 用 溫 度 ( ) 分 鐘 75

77 8. 紫 外 線 照 射 滅 菌 觀 察 不 同 時 間 量 的 變 化 對 細 菌 生 長 的 影 響, 以 (-) 到 (++) 表 示 之 (-) 為 無 菌 落,(+) 為 有 少 許 菌 落,(++) 為 菌 落 很 多 菌 種 金 黃 色 葡 萄 球 菌 作 用 時 間 ( 分 鐘 ) 枯 草 桿 菌 大 腸 桿 菌 9. 化 學 滅 菌 觀 察 不 同 稀 釋 量 的 變 化 對 細 菌 生 長 的 影 響, 以 (-) 到 (++) 表 示 之 (-) 為 澄 清,(+) 為 有 少 許 混 濁,(++) 為 混 濁 處 理 時 間 ( 分 鐘 ) 稀 釋 濃 度 1/10 1/100 1/200 1/300 1/400 1/500 76