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溲方
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1 ISSN CN / Q 中国生物化学与分子生物学报 http: / / cjbmb. bjmu. edu. cn Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2014 年 11 月 30(11):1155 ~ 1159 技术与方法 DOI: / j. cnki. cjbmb 一种精子表面 GPI 锚定蛋白初步鉴定方法的建立辛玲, 王慧萍, 王小强, 于和鸣 ( 国家人口计生委科学技术研究所, 北京 ) 摘要精子表面糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定蛋白 (GPI Aps) 在精子不同阶段都发挥着关键作用. 本研究介绍了嗜水气单胞菌毒素 (aerolysin) 作为生物探针来鉴定精子表面的 GPI 锚定蛋白. 实验依次进行了嗜水气单胞菌培养毒素提取纯化多克隆抗体制备以及三明治蛋白印迹验证实验. 凝胶蛋白分离实验显示, 硫酸铵沉淀加 Sephadex G 100 层析柱纯化得到了分子质量为 45 kd 高纯度细菌毒素 ; 蛋白印迹实验验证了制备的多克隆抗体的特异性 ; 三明治蛋白印迹结果显示, 嗜水气单胞菌毒素能识别出 12 条精子脂筏提取蛋白条带, 其分子质量主要分布在 15 ~ 130 kd 之间 ;Alex488 标记的免疫荧光实验显示, 嗜水气单胞菌毒素识别的 GPI 锚定蛋白主要分布在精子头部和尾部. 研究结果提示, 嗜水气单胞菌毒素能够有效地识别精子表面的 GPI 锚定蛋白. 关键词中图分类号糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定蛋白 (GPI Aps); 嗜水气单胞菌毒素 ; 精子 Q51 Development of a Novel Method for Identification of GPI anchored Surface Proteins on Spermatozoon XIN Ling, WANG Hui Ping, WANG Xiao Qiang, YU He Ming ( National Research Institute for Family Planning, Beijing , China) Abstract Glycosyphosphatidylinositol anchored proteins ( GPI Aps ) on spermatozoon surface play crucial roles in spermatogenesis. In the present study, aerolysin was found to recognize spermatozoa GPI APs. Aerolysin was extracted and purified from the culture of aeromonas hydrophila. Polyclonal antibody against aerolysin was prepared and used for detecting GPI Aps by Sandwich Western blot. Aerolysin purifed by Sephadex G 100 chromatography was determined as a 45 kd molecule in SDS PAGE. Western blot showed that the prepared anti aerolysin polyclone antibody recognized the target with high specificity. Sandwich Western blot indicated that aerolysin interacted with 12 GPI Aps ranging from 15 to 130 kd. Immunofluorescence showed that Alex488 labeled aerolysin was distributed at the head and tail of spermatozoa. The results demonstrated that aerolysin could be a probe for detecting GPI anchored proteins on spermatozoon. Key words glycosyphosphatidylinositol anchored proteins ( GPI Aps); aerolysin; spermatozoa 糖基化磷脂酰肌醇 ( glycosylphosphatidylinositol (GPI) 锚定蛋白 (APs) 是一类通过羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇锚定在细胞表面而不跨越膜磷脂双层的细胞膜蛋白. 该类蛋白广泛分布在真核细胞表面, 独特的结构使其具有水解酶受体粘附分子补体调节蛋白等多种功能 [1 4]. 精子表面 GPI APs 在精子发生精子成熟精子免疫保护获能及顶体反应精卵识别男性不育及生育等生理及病理过程中发挥重要的作用 [5 10], 但精子表面 GPI APs 的鉴定研究尚不充分和系统. 嗜水气单胞菌毒素 ( aerolysin) 是由革兰氏阴性嗜水性气单胞菌分泌的外毒素, 能与 GPI 锚蛋白的 GPI 锚基和 N glycan 的多糖核心特异收稿日期 : ; 接受日期 : 中央级公益科研院所基本科研业务费专项 (No. 2010GJSSJKA0I) 联系人 Tel: ; E mail: yu. he. ming@ 163. com Received: April 18, 2014; Accepted: June 3, 2014 Supported by Fundamental Research Funds for Central Public Welfare Research Institutes( No. 2010GJSSJKA0I) Corresponding author E mail: yu. he. ming@ 163. com Tel: ;

2014 11 15 一种精子表面 GPI 锚定蛋白初步鉴定方法的建立辛玲, 王慧萍, 王小强, 于和鸣 ( 国家人口计生委科学技术研究所, 北京 100081) 摘要精子表面糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 锚定蛋白 (GPI Aps) 在精子不同阶段都发挥着关键作

2 1156 中国生物化学与分子生物学报第 30 卷性结合. 本研究引入这种能特异性识别 GPI APs 的细菌毒素作为蛋白生物探针, 通过三明治蛋白印迹及免疫荧光的方法鉴定精子表面的 GPI APs. 1 材料与方法 1 1 材料嗜水性气单胞菌株购自中国科学院水生生物研究所 ; 标准嗜水性气单胞菌毒素 ( proaerolysin) 购自加拿大萨省大学 ; 荧光标记的嗜水性气单胞菌毒素 FLAER(Alexa 488 Proaeroysin) 购自加拿大 Protox 公司 ; 嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体 ( 兔源多抗 ) 自制 ; 碱性磷酸酶标记 Protein A / G PVDF 膜 (0 45 μm) 购自 Pierce 公司 ; 蛋白酶混合抑制剂 ( Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ) 购自 Calbiochem 公司 ; 酵母提取物胰蛋白胨 ( Tryptone) 购自 OXOID 公司 ; 弗氏完全佐剂 (Freund adjuvant complete) 弗氏不完全佐剂 ( Freund adjuvantincomplete) TX100 TX114 及 PEG 购自 Sigma 公司 ; 蛋白预染 Marker 购自 Fermentas 公司 ; 硫酸铵 ( 分析纯 ) 购自北京化学试剂公司 ; 其余试剂均为国产分析纯. Sephadex G cm 层析住 2 50 cm 层析柱以及 AKTA 蛋白色谱纯化及回收系统购自 GE 公司 ;Spectrapor 透析袋 ( 分子截留 ~ kd ) 购自 Spectrum 公司, 荧光显微镜购自 Nikon 公司. 新西兰雌性长耳兔购买于北京大学医学部实验动物中心. 1 2 毒素制备菌株复苏与扩大培养无菌吸管吸取 0 3 ~0 5 ml 营养肉汤加入到装有真空冷冻干燥的菌种安瓿管内, 冻干菌株溶解呈悬浮状. 吸取全部菌体悬液, 移植于斜面培养基中,30 培养箱中培养 36 h 后, 挑取乳白色菌苔用连续分区划线法接种至培养皿中, 继续培养 24 h. 挑取培养皿中单个菌落, 研磨法接种于盛有 5 ml LB 肉汤培养基的 50 ml 灭菌离心管中, 在 30 恒温振荡器中 (150 r / min) 培养 12 h 后倒入 250 ml LB 肉汤培养基, 继续培养 36 h, 菌液离心 r / min,15 min, 上清回收待用. 1 3 毒素提纯回收的菌液上清在冰浴条件下, 采用硫酸铵沉 [11] 淀法初步提纯回收毒素. 然后用 Sephadex G 100 色谱柱纯化毒素, 色谱条件 : 平衡液及洗脱液均为 50 mmol / L Tris HCl, ph 7 8 缓冲液, 流速 12 ml / h, 按 4 ml / 管收集, 上样量为柱体积 5% ( 即为 6 ml 粗提毒素, 上样浓度为 5 ~ 10 mg / ml). 紫外 280 nm 进行检测, 回收吸收峰段的样品即为提纯的毒素, 提纯的毒素装入透析袋埋入 PEG 中浓缩. 1 4 兔抗毒素多克隆抗体制备用嗜水气单胞菌毒素 (aerolysin) 免疫雌性成年新西兰大耳兔, 首次免疫后每隔 2 周加强免疫 3 次, 首次免疫将弗氏完全佐剂乳化, 加强免疫以弗氏不完全佐剂乳化, 每次免疫的毒素蛋白量约为 0 1 mg. 3 次加强免疫后, 耳缘静脉无菌取血,Western 印迹检测血清抗体的效价, 第 8 周再加强免疫 1 次,2 周后颈总动脉取血制备血清. 1 5 大鼠精子膜脂筏成份提取分离收集大鼠附睾尾部精子, 调节精子悬液浓度至 cell / ml, 用 TX114 膜蛋白提取液提取大鼠精子膜蛋白, 冷丙酮沉淀浓缩备用. 1 6 多克隆抗体的 Western 印迹鉴定纯化后的 aerolysin 进行 12% SDS PAGE, 蛋白电转移至 PVDF 膜, 以溶解于 TBS 的 5% 脱脂牛奶, 室温封闭 30 min, 用上述制备的多克隆抗体以及阴性对照血清 ( 免疫前 )4 孵育过夜. TBS T 洗膜, 以碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG 室温孵育 2 h, 洗膜后以 BCIP / NBT 显色试剂盒显色. 1 7 精子膜表面 GPI 锚蛋白鉴定 Sandwich Western 印迹鉴定精子膜表面 GPI 锚蛋白上述提取到的精子膜蛋白进行 12% SDS PAGE, 电转移至 PVDF 膜, 以溶解于 TBS 的 5% 脱脂奶粉室温封闭 30 min, 加入制备的毒素 (5% TBS 脱脂奶粉稀释 )4 孵育过夜,TBS T 洗膜, 加入上述制备的多克隆抗体 ( 稀释同前 ) 室温 4 h, TBS T 洗膜, 以碱性磷酸酶标记的羊抗兔 IgG 室温孵育 2 h, 洗膜后以 BCIP / NBT 显色试剂盒显色免疫荧光检测精子膜表面 GPI 锚蛋白取大鼠附睾精子, 用 4% 多聚甲醛 4 静置过夜, 充分固定精子, 调整精子密度为 cell / ml. 按比例将 FLAER 加入到精子悬液, 避光冰上孵育 1 h, 然后加入 PI 衬染液, 继续避光冰上孵育 1 h. 孵育结束用预冷的 PBS 洗涤后重悬精子, 取 20 μl 精子悬液均匀涂在载玻片上, 干燥后用含 2% 抗荧光淬灭剂的甘油封片液封片, 荧光显微镜油镜下观察并记录图像资料 : 激发波长 490 nm. 2 结果 2 1 嗜水气单胞菌菌株复苏培养冻干菌株经斜面培养管复苏并接种到普通营养肉汤培养皿中,30 培养 24 h 后, 培养皿中长出单个 2 mm 左右凸起的灰白色光滑湿润的菌落 (Fig. 1), 菌落有淡香气味.

司 ; 嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体 ( 兔源多抗 ) 自制 ; 碱性磷酸酶标记 Protein A / G PVDF 膜 (0 45 μm) 购自 Pierce 公司 ; 蛋白酶混合抑制剂 ( Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅲ) 购自 Calbiochem 公司 ; 酵母提取物胰蛋

3 第１１期辛玲等一种精子表面ＧＰＩ锚定蛋白初步鉴定方法的建立Ｆｉｇ１ＢａｃｔｅｒｉａｌｃｏｌｏｎｙｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａＦｒｅｅｚｉｎｇｄｒｙｓｔｒａｉｎｗｈｉｃｈｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｅｄｗｅｒｅｓｔｒｅａｋｉｎｇｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙｔｏｏｒｄｉｎａｒｙｎｕｔｒｉｅｎｔａｇａｒｉｎＰｅｔｒｉｄｉｓｈｅｓｃｕｌｔｕｒｅｄｆｏｒ２４ｈｏｕｒｓａｔ３０１１５７Ｆｉｇ３Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｅｒｏｌｙｓｉｎ１０ μｌｏｆａｅｒｏｌｙｓｉｎｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｂｙｕｓｉｎｇａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎＬａｎｅ１ａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＬａｎｅ２ｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙ１２ＳＤＳＰＡＧＥＴｈｅｇｅｌｗａｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ２２嗜水气单胞菌毒素的提纯经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００色谱柱对硫酸铵分级沉淀的嗜水气单胞菌毒素提纯发现在２５ｈ时开始出ＴｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆａｅｒｏｌｙｓｉｎＭｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ现洗脱峰至４ｈ时洗脱峰降至基线附近洗脱峰为单一峰值Ｆｉｇ２洗脱液浓缩后的ＳＤＳＰＡＧＥ图谱显示在４５ｋｄ附近有一明显蛋白条带Ｆｉｇ３Ｆｉｇ４ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｅｐａｒｅｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙＦｉｇ２ＳｅｐｅｒａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｅｒｏｌｙｓｉｎＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｃｕｌｔｕｒｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓｗｅｒｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｆａｔｅｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｐｕｒｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００Ｃｏｌｕｍｎｖｏｌｕｍｅｉｓ６０ｃｍ１５ｃｍ５０ｍｍｏｌＬＴｒｉｓＨＣｌｐｈ７８ｗａｓｕｓｅｄａｓｅｌｕｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒＴｈｅｆｌｏｗｒａｔｅｗａｓ１２ｍｌｈ２３多克隆抗体效价的Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ多克隆抗体与嗜水气单胞菌毒素提纯液及购买的毒素杂交后均在毒素蛋白相应位置４０５５ｋｄ出现明显条带阴性对照血清与毒素杂交后未出现相应条带Ｆｉｇ４ＡｆｔｅｒｐｕｒｉｆｉｅｄａｅｒｏｌｙｓｉｎＬａｎｅ１ａｎｄｐｕｒｃｈａｓｅｄａｅｒｏｌｙｓｉｎＬａｎｅ２ｗｅｒｅｒｅｓｏｌｖｅｄｏｎ１２ＳＤＳＰＡＧＥｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｇｅｌｓｗｅｒｅｂｌｏｔｔｅｄｏｎｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｐｒｏｂｅｄｗｉｔｈａｎｔｉｒａｔｒｅｄｕｃｅｄａｅｒｏｌｙｓｉｎｐｏｌｙｃｌｏｎｅａｎｔｉｂｏｄｙｗｈｉｃｈｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｏｕｒｌａｂａｎｄａｓｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓｅｒｕｍＬａｎｅ３ＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＩｇＧｗａｓｕｓｅｄａｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙＴｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｐｏｓｉｔｉｏｎｗｈｅｒｅａｅｒｏｌｙｓｉｎｐｏｌｙｃｌｏｎｅａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｃｏｇｎｉｔｅｄａｅｒｏｌｙｓｉｎ２４精子膜表面ＧＰＩ锚蛋白的鉴定２４１精子膜脂筏成分的ＳａｎｄｗｉｃｈＷｅｓｔｅｒｎ印迹结果嗜水气单胞菌毒素和制备的ａｅｒｏｌｙｓｉｎ多克隆抗体与２ＴＸ１１４裂解液提取的精子膜蛋白脂筏成

ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＬａｎｅ２ｗｅｒｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｙ１２ＳＤＳＰＡＧＥＴｈｅｇｅｌｗａｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅ２２嗜水气单胞菌毒素的提纯经过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００色谱柱对硫酸铵分级沉淀的嗜水气单胞菌毒素提纯发现在２５ｈ时开始出Ｔｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅ

4 １１５８第３０卷中国生物化学与分子生物学报份经过ＳａｎｄｗｉｃｈＷｅｓｔｅｒｂｌｏｔ杂交后在１０１３０ｋｄ之间出现明显１２条左右的蛋白条带且本实验纯化的毒素及购买的标准毒素识别的蛋白条带分子质量位置一致Ｆｉｇ５２４２精子表面ＧＰＩ锚蛋白的ＦＬＡＥＲ荧光检测使用ＦＬＡＥＲＡｌｅｘ４８８标记的ａｅｒｏｌｙｓｉｎ直接标记附睾头部和尾部精子后荧光显微镜下可看到在精子的头部和鞭毛段均有ＧＰＩ蛋白分布Ｆｉｇ６３讨论嗜水性气单胞菌是革兰氏阴性球杆状细菌属于致病菌是导致鱼类死亡的主要菌类１２其所含嗜水气单胞菌毒素ａｅｒｏｌｙｓｉｎ能特异与ＧＰＩ锚基的糖链结合１３１５由于目前尚无市售的ａｅｒｏｌｙｓｉｎ本实验通过嗜水性气单胞菌株培养物经蛋白质化学技术及原理纯化了嗜水气单胞菌毒素自制了兔抗嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体通过与国外大学制备的标准毒素比较确认了纯化毒素及自制抗体的特异性的有效成份与纯度并使用纯化毒素和自制抗体对精子表面ＧＰＩ锚蛋白进行初步鉴定本实验结Ｆｉｇ５ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＧＰＩＡＰｓｏｎｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｏｎＭｅｍｂｒａｎｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｅｐｉｄｉｄｙｍａｌｓｐｅｒｍｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｕｓｉｎｇ２ＴＸ１１４ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ１０ μｇｏｆｐｒｏｔｅｉｎｐｅｒｓａｍｐｌｅｗｅｒｅｓｕｂｊｅｃｔｅｄｔｏＳＤＳＰＡＧＥａｎｄｔｈｅｎｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃａｌｌｙｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｏｎｔｏｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅｍｅｍｂｒａｎｅＯｎｅｇｅｌｗａｓｆｏｒＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅｓｔａｉｎＬａｎｅ５Ａｆｔｅｒｂｌｏｃｋｉｎｇ３０ｍｉｎａｄｄａｅｒｏｌｙｓｉｎｄｉｌｕｔｅｄ１５００ｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｏｕｒｌａｂｌａｎｅ１ａｎｄｐｕｒｃｈａｓｅｄｆｒｏｍＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳａｓｋａｔｃｈｅｗａｎｌａｎｅ２ｔｏｅａｃｈｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｃｕｂａｔｉｎｇｏｖｅｒｎｉｇｈｔａｔ４ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｗｉｔｈｐｏｌｙｃｌｏｎｅ果显示自制的兔抗嗜水气单胞菌毒素多克隆抗体ａｎｔｉｂｏｄｙｄｉｌｕｔｅｄ１１０００４ｈｏｕｒｓａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ后期的实验本研究验证了理论假说嗜水气单胞菌ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｔｉｏｂｏｄｙＭｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒＬａｎｅ３Ｃｏｎｔｒｏｌ效价高工作浓度为１１０００特异性好可以用于毒素能识别精子表面的ＧＰＩＡＰｓ并为精子表面ＧＰＩＡＰｓ的深入研究提供了实验材料及方法基础ＡｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄＩｇＧｗａｓｕｓｅｄａｓｗｉｔｈｏｕｔａｅｒｏｌｙｓｉｎＬａｎｅ４Ｃｏｎｔｒｏｌｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗｉｔｈｏｕｔ精子表面的ＧＰＩＡＰｓ部分是在精子发生过程中生殖管道中附睾在精子成熟贮存和保护中起重要ＧＰＩＡＰｓ则是转移并整合到精子表面的１６１８雄性包括很多ＧＰＩＡＰｓ它们通过微囊泡附睾小体转由精子细胞自行合成并表达的其它的精子表面作用附睾上皮细胞合成并分泌各种蛋白质１９２０Ｆｉｇ６ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＧＰＩＡＰｓｕｐｏｎｓｐｅｒｍｍｅｍｂｒａｎｅＳｐｅｒｍｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｅｐｉｄｉｄｙｍａｌｃａｐｕｔＡａｎｄｅｐｉｄｉｄｙｍａｌｔａｉｌＢｗｅｒｅｆｉｘｅｄｗｉｔｈ４ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅｆｏｒｏｖｅｒｎｉｇｈｔａｔ４ａｎｄｓｐｅｒｍｄｅｎｓｉｔｙｗａｓａｄｊｕｓｔｅｄｔｏ１１０６ｃｅｌｌｍｌＡｄｄＦＬＡＥＲｄｉｌｕｔｅｄ１１００ｔｏｔｈｅｓｐｅｒｍｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｉｎｃｕｂａｔｅｆｏｒ１ｈｏｕｒｏｎｉｃｅａｖｏｉｄｉｎｇｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｄｉｒｅｃｔｌｉｇｈｔＴｈｅｎａｄｄｉｎｇＰＩｆｏｒｃｏｎｔｒａｓｔｄｙｅａｎｄｉｎｃｕｂａｔｉｎｇ１ｈｏｕｒｃｏｎｔｉｎｕａｌｌｙ２０ μｌｏｆｓｐｅｒｍｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｗｅｒｅｃｏａｔｅｄｏｎｓｌｉｄｅａｎｄ２ａｎｔｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕｅｎｃｈｅｒｗｅｒｅｕｓｅｄＳｐｅｒｍｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｗｉｔｈＦＩＴＣｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｔ４９０ｎｍＴｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓＧＰＩＡＰｓｌａｂｅｌｅｄｂｙＦＬＡＥＲ

及原理纯化了嗜水气单胞菌毒素自制了兔抗嗜水性气单胞菌毒素多克隆抗体通过与国外大学制备的标准毒素比较确认了纯化毒素及自制抗体的特异性的有效成份与纯度并使用纯化毒素和自制抗体对精子表面ＧＰＩ锚蛋白进行初步鉴定本实验结Ｆｉｇ５ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＧＰＩＡＰｓｏｎｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｏｎＭｅｍｂｒａｎｅｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｅｐｉｄｉｄｙｍａｌｓｐｅｒｍ

5 第 11 期辛玲等 : 一种精子表面 GPI 锚定蛋白初步鉴定方法的建立 1159 运, 整合到精子细胞膜表面, 使精子获得新的蛋白成分 [16]. 本实验中使用 FLAER 直接标识精子表面的 GPI APs, 为 GPI APs 的鉴定及细胞定位提供初步信息. 结果 (Fig. 6) 显示, 附睾头段和尾段荧光强度的不同也在一定程度上验证了附睾精子从附睾头运行至附睾尾时, 有新的 GPI 锚蛋白成份添加到精子表面, 主要分布在精子头部及精子尾部. 但是精子在附睾的穿行中, 移行 GPI APs 的定位结构功能及其具体机制有待进一步研究. 本实验探索性地对精子表面的 GPI APs 进行了初步分析. 研究结果表明, 嗜水气单胞菌毒素能够有效识别精子表面的 GPI APs, 验证了其可以作为生物探针鉴定精子表面的 GPI APs 的假说 ; 同时, 还制备了后期实验所需的主要实验工具, 为 GPI APs 蛋白的鉴定及功能研究奠定了基础. 参考文献 (References) [ 1 ] Yuan X, Braunstein E M, Ye Z, et al. Generation of glycosylphosphatidylinositol anchor protein deficient blood cells from human induced pluripotent stem cells[ J]. Stem Cells Transl Med, 2013, 2(11): [ 2 ] Imamura M, Kato N, Yoshioka M., et al. Glycosylphosphatidylinositol anchor dependent stimulation pathway required for generation of baculovirus derived recombinant scrapie prion protein [ J]. J Virol, 2011, 85 (6 ): [ 3 ] Breitinger H H, Rojewski M T, Schrezenmeier H. Antibodies to glycosylphosphatidyl inositol anchored proteins ( GPI AP ) in antithymocyte and antilymphocyte globulin: possible role for the expansion of GPI AP deficient cells in aplastic anemia[ J]. Ann Hematol, 2009, 88(9): [ 4 ] Edidin M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells [ J]. Annu Rev Biophys Biomol Struct, 2003, 32: [ 5 ] Fujihara Y, Okabe M, Ikawa M. GPI anchored protein complex, LY6K / TEX101, is required for sperm migration into the oviduct and male fertility in mice[j]. Biol Reprod,2014, 90(3): 60 [ 6 ] Boerke A, van der Lit J, Lolicato F, et al. Removal of GPI anchored membrane proteins causes clustering of lipid microdomains in the apical head area of porcine sperm [ J]. Theriogenology, 2014, 81(4): [ 7 ] Watanabe H, Kondoh G. Mouse sperm undergo GPI anchored protein release associated with lipid raft reorganization and acrosome reaction to acquire fertility[ J]. J Cell Sci, 2011, 124 (Pt 15): [ 8 ] Yin L, Chung C M, Huo R., et al. A sperm GPI anchored protein elicits sperm cumulus cross talk leading to the acrosome reaction[j]. Cell Mol Life Sci, 2009, 66(5): [ 9 ] Gibbons R, Adeoya Osiguwa S A, Fraser L R. A mouse sperm decapacitarion factor receptor is phosphatidy lethanolamine binding protein[ J]. Reproduction, 2005, 130(4): [10] Yudin A I, Li M W, Robertson K R, et al. Identification of a novel GPI anchoed CRISP glycoprotein, MAK248, located on the posterior head and equatorial segment of cynomolgus macaque sperm[j]. Mol Reprod Dev, 2002, 63(4): [11] 吴冠芸, 潘华珍, 吴羿, 主编. 生物化学与分子生物学实验常用数据手册 [ M]. 科学出版社 ( Wu G Y, Pan HZ, Wu Y. Laboratory Manual for Biochemistry and Molecular Biology. Beijing: Scince Press), 2000: 162 [12] 储卫华, 陆承平. 嗜水气单胞菌侵袭力与宿主细胞信号转导和骨架的关系 [J]. 微生物学报 (Chu W H, Lu C P. Invasion of Aeromonas hydrophila in cells involving signal transduction and cytoskeleton[ J]. Acta Microbiol Sin), 2003, 43(6): [13] Degiacomi M T, Iacovache I, Pernot L, et al. Molecular assembly of the aerolysin pore reveals a swirling membrane insertion mechanism[ J]. Nat Chem Biol, 2013, 9 (10 ): [14] Hong Y, Ohishi K, Inoue N, et al. Requirement of N glycan on GPI anchored proteins for efficient binding of aerolysin but not Clostridium septicum alpha toxin[ J]. EMBO J, 2002, 21(19): [15] Abrami L, Velluz M C, Hong Y, et al. The glycan core of GPI anchored proteins modulates aerolysin binding but is not sufficient: the polypeptide moiety is required for the toxin receptor interaction[ J]. FEBS Lett, 2002, 512(1 3): [16] Sullivan R, Frenette G, Girouard J. Epididymosomes are involved in the acquisition of new sperm proteins during epididymal transit[ J]. Asian J Androl, 2007, 9(4): [17] Kirchhoff C, Hale G. Cell to cell transfer of glycosylphosphatidylinositol anchored membrane proteins during sperm maturation[ J]. Mol Hum Reprod, 1996, 2(3): [18] Cummerson J A, Flanagan B F, Spiller D G, et al. The complement regulatory proteins CD55 ( decay ccelerating factor) and CD59 are expressed on the inner acrosomal membrane of human spermatozoa as well as CD46( membrane cofactor protein) [ J]. Immunology, 2006, 118(3): [19] Hutchinson T E, Rastogi A, Prasad R, et al. Phospholipase C sensitive GPI anchoredproteins of goat sperm: possible role in sperm protection[j]. Anim Reprod Sci, 2005, 88 (3 4): [20] 王小强, 齐晓伟, 程露阳, 等. 过氧化物酶 6 在大鼠附睾中的表达及分布 [J]. 中国生物化学与分子生物学报 ( Wang X Q, Qi X W, Cheng L Y, et al. Expression and distribution of peroxiredoxin 6 in rat epididymidis [ J]. Chin J Biochem Mol Biol),2010,26(3) :

但是精子在附睾的穿行中, 移行 GPI APs 的定位结构功能及其具体机制有待进一步研究. 本实验探索性地对精子表面的 GPI APs 进行了初步分析.

第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序

第期王兴涛等猪流行性乙型脑炎病毒种猪精液分离株的鉴定及进化分析病料毒株及细胞试剂引物设计提取及基因克隆及测序河南农业科学王兴涛罗俊滕蔓樊剑鸣鄂巍禹斌刘力张改平利用技术对河南省某规模化猪场乙脑疑似病例的种猪精液进行分析从部分样本中扩增出与流行性乙型脑炎病毒基因和基因具有高度同源性的预期产物在日龄乳鼠脑内接种种猪