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1 细 胞 生 物 学 实 验 指 导 主 编 朱 卫 平 湖 南 农 业 大 学 植 物 科 学 实 验 教 学 中 心 二 六 年 七 月

2 目 录 实 验 一 细 胞 形 态 大 小 与 显 微 结 构 观 察 1 实 验 二 细 胞 膜 的 渗 透 性 5 实 验 三 叶 绿 体 的 分 离 与 荧 光 观 察 7 实 验 四 线 粒 体 和 液 泡 系 的 超 活 染 色 与 观 察 11 实 验 五 细 胞 凝 集 反 应 17 实 验 六 DNA 的 Feulgen 染 色 法 19 实 验 七 PAS 反 应 法 显 示 多 糖 22 实 验 八 植 物 细 胞 骨 架 的 光 学 显 微 镜 观 察 24 实 验 九 植 物 染 色 体 标 本 的 制 备 与 观 察 26 实 验 十 细 胞 电 融 合 方 法 29 综 合 大 实 验 39 一 石 蜡 切 片 法 39 二 半 自 动 显 微 镜 摄 影 技 术 41 三 全 自 动 显 微 照 相 技 术 44 四 暗 室 技 术 印 相 与 放 大 47 1

3 实 验 一 细 胞 形 态 大 小 与 显 微 结 构 观 察 一 实 验 目 的 1 观 察 各 种 不 同 细 胞 的 形 态 大 小, 从 而 对 细 胞 的 分 类, 进 化 及 分 化 有 所 了 解 2 判 断 和 识 别 光 学 显 微 镜 下 各 种 细 胞 器 的 形 态, 大 小 和 数 目 3 掌 握 普 通 光 学 显 微 镜 及 测 微 尺 的 使 用 方 法 二 实 验 原 理 生 物 种 类 繁 多, 形 态 大 小 各 异. 构 成 生 物 有 机 体 的 最 基 本 结 构 和 功 能 单 位 一 细 胞 山 冈 其 物 种 部 位 和 功 能 不 同 在 形 态 与 大 小 上 呈 现 一 些 区 别 由 于 细 胞 比 较 小, 我 们 借 助 于 显 微 镜 就 可 以 观 测 出 细 胞 形 态 大 小 的 差 异 光 学 显 微 镜 的 最 高 分 辨 率 为 0.2μm, 而 细 胞 器 大 郎 分 在 0.1 μm 和 10μm 之 间, 所 以 光 学 显 微 镜 下 可 见 到 一 股 细 胞 器 的 外 部 形 态 较 大 的 细 胞 器 和 细 胞 核, 质 体 等 还 可 见 到 其 细 微 结 构 细 胞 器 往 往 由 特 殊 物 质 组 成, 因 而 可 通 过 对 特 异 物 质 的 区 别 染 色 把 各 种 结 构 区 分 开 束, 每 种 细 胞 器 都 有 特 殊 的 形 态 大 小 分 布 位 置 及 数 目, 这 也 是 我 们 判 断 识 别 细 咆 器 的 依 据 而 每 种 细 胞 器 在 不 同 细 胞 不 同 发 育 时 期 和 不 同 生 理 状 态 下 的 形 态 大 小 会 有 所 不 同 所 以 细 胞 器 的 观 察 可 用 来 判 断 细 胞 的 生 理 状 和 发 育 情 况 投 们 在 取 材 和 观 察 上 要 注 意 各 种 细 胞 在 不 同 细 胞 中 的 特 殊 性 三 实 验 用 品 1 器 材 显 微 镜 测 微 尺 1

4 2 试 剂 Wright 溶 液 :Wright 真 粉 剂 0.1g 甲 醇 60ml 苏 木 精 硝 酸 银 等 3 材 料 真 核 原 核 细 胞 涂 片 及 切 片, 动 植 物 不 同 组 织 的 切 片 及 新 鲜 材 料 ( 见 实 验 方 法 中 所 列 ) 四 实 验 方 法 ( 一 ) 细 胞 形 态 与 大 小 的 观 测 1 用 目 镜 测 微 尺 分 别 在 高 倍 镜 下 和 油 镜 下 测 量 镜 台 测 微 尺, 从 而 算 出 称 所 用 显 微 镜 中 目 镜 测 微 尺 每 格 所 代 表 的 实 际 长 度 2 用 高 倍 镜 及 油 镜 检 测 各 种 切 片, 并 且 用 目 镜 测 微 尺 测 量 细 胞 和 细 胞 核 的 长 短 径 的 长 度 3. 选 取 细 胞 膜 和 核 膜 界 限 清 晰 的 切 片 或 涂 片 测 量 测 量 时 可 旋 转 目 镜 ( 测 微 尺 ) 及 移 动 载 玻 片, 置 被 测 细 胞 于 测 微 尺 轴 线 上 4. 根 据 测 量 结 果 计 算 各 种 细 胞 及 细 胞 核 的 体 积 1 椭 球 形 : V=4nab 2 /3 式 中 :a 长 半 径 b 短 半 径 2 圆 球 球 : 4 V= πr 2 3 式 中 r 半 径 3V=πr 2 h 式 中 :r 半 径 2

5 h 高 度 表 1-1 实 验 结 果 细 胞 名 称 形 态 特 征 细 胞 体 积 核 体 积 核 质 比 例 酵 母 大 肠 杆 菌 洋 葱 表 皮 细 胞 蛙 血 细 胞 ( 二 ) 细 胞 显 微 结 构 观 察 注 意 观 察 下 列 结 构 1 细 胞 核 及 核 仁 1 不 同 细 胞 的 核 和 核 仁 洋 葱 根 尖 切 片 黄 花 菜 二 倍 体 与 四 倍 体 根 切 片 ( 示 范 ) 2 多 核 及 多 核 仁 现 象 百 合 花 药 切 片 黄 花 菜 四 倍 体 根 尖 切 处 3 染 色 体 : 洋 葱 根 尖 切 片 小 麦 根 尖 压 片 ( 示 范 ) 荻 根 尖 压 片 ( 示 范 ) 2 线 粒 体 : 洋 葱 根 尖 切 片, 蚕 豆 根 尖 切 片 (Rubins 或 苏 木 精 染 色 ) 3 叶 绿 体 : 水 绵 新 鲜 材 料 临 时 装 片 由 波 菜 叶 片 剥 下 叶 肉 细 胞 层, 镜 检, 注 意 类 囊 体 形 态 数 目 4 高 尔 基 体 : 蚕 豆 根 尖 切 片 ( 硝 酸 银 或 四 氧 化 锇 染 色 ) 3

6 作 业 : 1 说 明 有 细 胞 分 化 过 程 中 细 胞 大 小 相 对 稳 定 的 原 因 2 绘 制 细 胞 显 微 结 构 图, 把 你 所 见 到 的 各 种 细 胞 器 绘 制 在 一 个 细 胞 内 注 意 细 胞 器 外 形 特 点, 大 小, 分 布 位 置, 数 目 3 查 资 料 回 答 问 题 : 某 些 细 胞 多 核 及 多 核 仁 的 原 因 4

7 实 验 二 细 胞 膜 的 渗 透 性 实 验 目 的 了 解 细 胞 膜 的 渗 透 性 及 各 类 物 质 进 入 细 胞 的 速 度 实 验 原 理 将 经 细 胞 放 入 数 种 等 渗 溶 液 中, 由 于 红 细 胞 对 各 种 溶 质 的 透 性 不 同, 有 的 溶 质 可 以 渗 入, 有 的 溶 质 不 能 渗 入, 渗 入 的 溶 质 能 够 提 高 红 细 胞 的 渗 透 压, 所 以 促 使 水 分 进 入 细 胞, 引 起 溶 血 由 于 溶 质 透 入 速 度 互 不 相 同, 因 此 溶 血 时 间 也 不 相 同 实 验 用 品 一 器 材 50ml 小 烧 杯,10ml 移 液 管, 试 管 (1 10cm), 度 管 架 二 试 剂 0.17mol/L 氯 化 钠 0.17mol/L 氯 化 铵 0.17mol/L 醋 酸 胺 0.17mol/L 硝 酸 钠 0.12mol/L 草 酸 铵 0.12mol/L 硫 酸 钠 0.32mol/L 葡 萄 糖 0.32mol/L 甘 油 0.32mol/L 乙 醇 0.32mol/L 丙 酮 三 材 料 羊 血 实 验 方 法 一 羊 血 细 胞 悬 液 取 50ml 小 烧 杯 一 只, 加 1 份 羊 血 和 10 份 0.17mol/L 氯 化 钠 溶 液, 形 成 一 种 不 透 明 的 红 色 液 体, 此 即 稀 释 的 羊 血 二 低 渗 溶 液 取 试 管 一 支, 加 入 10ml 蒸 馏 水, 再 加 入 1ml 稀 释 的 羊 血, 注 意 观 察 溶 液 颜 色 的 变 化, 由 不 透 明 的 红 色 逐 渐 澄 清, 说 明 红 细 胞 5

8 发 生 破 裂 造 成 100% 红 细 胞 溶 血, 使 光 线 比 较 容 易 透 过 溶 液 三 羊 红 细 胞 的 渗 透 性 1 取 试 管 一 支, 加 入 0.17mol/L 氯 化 钠 溶 液 10ml, 再 加 入 1ml 衡 释 的 羊 血, 轻 轻 摇 动, 注 意 颜 色 有 无 变 化? 有 无 溶 血 现 象? 为 什 么? 2 取 试 管 一 支, 加 入 0.17mol/L 氯 化 钠 溶 液 10ml, 再 加 入 1ml 稀 释 的 羊 血, 轻 轻 摇 动, 注 意 颜 色 有 无 变 化? 有 无 溶 血 现 象? 若 发 生 溶 血, 记 下 时 间 ( 自 加 入 稀 释 羊 血 到 溶 液 变 成 红 色 透 明 澄 清 所 需 时 间 ) 3 分 别 在 另 外 8 种 等 渗 溶 液 中 进 行 同 样 实 验 步 骤 同 2 实 验 结 果 将 观 察 到 现 象 列 入 下 表, 对 实 验 结 构 进 行 比 较 和 分 析 不 同 低 渗 溶 液 下 的 溶 血 现 象 试 管 编 号 是 否 溶 血 时 间 结 果 分 析 1.10 氯 化 钠 +1ml 稀 释 羊 血 2.10 氯 化 钠 +1ml 稀 释 羊 血 3.10ml 醋 酸 铵 +1ml 稀 释 羊 血 4.10ml 硝 酸 钠 +1ml 稀 释 羊 血 5.10ml 草 酸 铵 +1ml 稀 释 羊 血 6.10ml 硫 酸 钠 +1ml 稀 释 羊 血 7.10ml 葡 萄 糖 +1ml 稀 释 羊 血 8.10ml 甘 油 +1ml 稀 释 羊 血 9.10ml 乙 醇 +1ml 稀 释 羊 血 10.10ml 丙 酮 +1ml 稀 释 羊 血 6

9 实 验 三 叶 绿 体 的 分 离 与 荧 光 观 察 叶 绿 体 足 植 物 细 胞 所 特 有 的 能 量 转 换 细 胞 器, 光 合 作 川 就 是 在 叶 绿 体 中 进 行 的 由 于 具 有 这 一 重 要 功 能, 所 以 它 一 直 是 细 胞 生 物 学 遗 传 学 和 分 子 生 物 学 的 重 要 研 究 对 象 叶 绿 体 是 植 物 细 胞 中 较 大 的 一 种 细 胞 器, 利 用 低 速 离 心 即 可 分 离 集 中 进 行 各 种 研 究 实 验 目 的 一 通 过 植 物 细 胞 叶 绿 体 的 分 离 了 解 细 胞 器 分 离 的 一 般 原 理 和 方 法 二. 观 察 叶 绿 体 的 自 发 荧 光 和 次 生 荧 光. 井 熟 悉 荧 光 显 微 镜 的 使 用 方 法 实 验 原 理 将 组 织 匀 浆 后 悬 浮 在 等 渗 介 质 中 进 行 差 迷 离 心, 是 分 离 细 胞 器 的 常 用 方 法, 一 个 颗 粒 在 离 心 场 中 的 沉 降 速 率 取 决 于 颗 粒 的 大 小 形 状 和 密 度, 也 同 离 心 力 以 及 悬 浮 介 质 的 粘 度 有 关 在 一 给 定 的 离 心 场 中, 同 一 时 间 内, 密 度 和 大 小 不 同 的 颗 粒 其 沉 降 速 度 不 同 依 次 增 加 离 心 力 和 离 心 时 间, 就 能 够 使 非 均 一 悬 浮 中 的 颗 粒 按 其 大 小 密 度 先 后 分 批 沉 降 在 离 心 管 底 部. 分 批 收 集 即 可 获 得 各 种 亚 细 胞 组 分 叶 绿 体 的 分 离 应 在 等 渗 溶 液 (0.35mol/L 氯 化 钠 或 0.4moJ/L 蔗 糖 溶 液 ) 中 进 行, 以 免 渗 透 压 的 改 变 使 叶 绿 体 受 到 损 伤 将 匀 浆 液 在 1000r/min 的 条 件 下 离 心 2min, 以 去 除 其 中 的 组 织 残 渣 和 一 些 未 被 破 碎 的 完 整 细 胞 然 后, 在 3000r/min 的 条 件 下 离 心 5mia, 即 可 获 得 沉 淀 的 叶 绿 体 ( 混 有 部 分 细 胞 核 ) 分 离 过 程 最 好 在 0 5 的 条 件 下 进 行 : 如 果 在 室 温 下, 要 迅 速 分 离 和 观 察 荧 光 显 微 术 是 利 用 荧 光 显 微 镜 对 可 发 荧 光 的 物 质 进 行 观 察 的 7

10 一 种 技 术 某 些 物 质 在 定 短 波 长 的 光 ( 如 紫 外 光 ) 的 照 射 下 吸 收 光 能 进 入 激 发 态, 从 激 发 态 回 到 基 态 时, 就 能 在 极 短 的 时 间 内 放 射 出 比 照 射 光 波 长 更 长 的 光 ( 如 可 见 光 ), 这 种 光 就 称 为 荣 光. 若 停 止 供 能 荧 光 现 象 立 即 停 止 有 些 生 物 体 内 的 物 质 受 激 发 光 照 射 后 直 接 发 出 荧 光, 称 为 自 发 荧 光 ( 或 直 接 荧 光 ), 如 叶 绿 索 的 火 红 色 荧 光 和 水 质 素 的 黄 色 荧 光 等 有 的 生 物 材 料 本 身 不 发 荧 光, 但 它 吸 收 荧 光 染 料 后 同 样 也 能 发 出 荧 光, 这 种 荧 光 称 为 次 生 荧 光 ( 或 间 接 荧 光 ), 如 叶 绿 体 吸 附 吖 啶 橙 后 可 发 桔 红 色 荧 光 利 用 荧 光 显 微 镜 对 可 发 荧 光 物 质 进 行 检 测 时, 将 受 到 许 多 因 素 的 影 响, 如 温 度 光 淬 灭 剂 等 因 此 在 荧 光 观 察 时 应 抓 紧 时 间, 有 必 要 时 立 即 拍 照 另 外, 在 制 作 荧 光 显 微 标 本 时 最 好 使 用 无 荧 光 载 玻 片, 益 玻 片 和 无 荧 光 油 实 验 用 品 一 器 材 1 主 要 设 备 : 普 通 离 心 机 组 织 捣 碎 机, 粗 天 平 荧 光 显 微 镜 2 小 型 器 材,500ml 烧 杯 2 个,250ml 量 筒 1 个, 滴 管 10 支, 10ml 刻 度 离 心 管 20 支, 纱 布 若 干, 无 荧 光 载 片 和 盖 片 各 4 片 二 材 料 新 鲜 菠 菜 三 试 剂 0.35mol/L 氯 化 钠 溶 O.01% 吖 啶 橙 (acridine orange) 实 验 方 法 1 选 取 新 鲜 的 嫩 菠 菜 叶, 洗 净 擦 干 后 去 除 叶 梗 及 粗 脉, 称 30g 于 150ml0.35mol/L NaCI 溶 液 中, 装 入 组 织 捣 碎 机 2 利 用 组 织 捣 碎 机 低 速 (5000r/min) 匀 浆 3 5min 8

11 3 将 匀 浆 用 6 层 纱 布 过 滤 于 500ml 烧 杯 中 4 取 滤 液 4ml 在 1000r/min 下 离 心 2min 弃 去 沉 淀 5 将 上 沾 液 在 3000r/min 下 离 心 5rmin. 弃 去 上 清 液, 沉 淀 即 为 叶 绿 体 ( 混 有 部 分 细 胞 陔 ) 6 将 沉 淀 用 0.35mol/LNaCI 溶 液 悬 浮 7 取 叶 绿 体 悬 液 一 消 滴 于 载 片 上, 加 盖 片 后 即 可 在 普 通 光 镜 和 荧 光 显 微 镜 下 观 察 1 在 普 通 光 镜 下 观 察 2 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 3 取 叶 绿 体 悬 液 一 滴 滴 在 无 荧 光 载 片 上, 再 漓 加 一 滴 0.01% 吖 啶 橙 荧 光 染 料, 加 无 荧 光 盖 片 后 即 可 以 荧 光 显 微 镜 下 观 察 二 菠 菜 叶 手 切 片 观 察 用 剖 须 刀 将 新 鲜 的 嫩 菠 菜 切 削 一 斜 面 置 于 载 片 上, 滴 加 1--2 滴 0.35mol/LNaCI 溶 液, 加 盖 片 后 轻 压, 置 显 微 镜 下 观 察 1 在 普 通 光 镜 下 观 察 2 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 3 用 同 样 方 法 制 片, 但 滴 加 I--2 滴 0.01% 吖 啶 橙 染 液 染 色 lmin, 洗 去 余 液, 加 盖 廾 后 即 町 以 荧 光 显 微 镜 下 观 察 实 验 结 果 一 叶 绿 体 的 分 离 和 观 察 1 普 通 光 镜 下, 可 看 到 叶 绿 体 为 绿 色 橄 榄 形, 在 高 倍 镜 下 可 看 到 叶 绿 体 内 部 含 有 较 深 的 绿 色 小 颗 粒, 即 基 粒 2 以 Olympus 荧 光 显 微 镜 为 例, 在 选 用 B(blue) 激 发 滤 片,B 双 色 镜 和 O 530(orange) 阻 断 滤 片 的 条 件 下, 叶 绿 体 发 出 火 红 色 荧 光 3 加 入 吖 啶 橙 染 色 后, 叶 绿 体 可 发 出 桔 红 色 荧 光, 而 其 中 混 有 的 细 胞 核 则 发 绿 色 荧 色 9

12 二 菠 菜 叶 手 切 片 观 察 1 在 普 通 光 镜 下 可 以 看 到 三 种 细 胞 (1) 表 面 细 胞 : 为 边 缘 呈 锯 齿 形 的 鳞 片 状 细 胞 (2) 保 卫 细 胞 : 为 构 成 气 孔 的 成 对 存 在 的 肾 形 细 胞 (3) 叶 肉 细 胞 : 为 排 成 栅 状 的 长 方 形 和 椭 幽 形 细 胞 叶 绿 体 呈 绿 色 橄 榄 形, 在 高 倍 镜 下 还 可 以 看 到 绿 色 的 基 粒 2 在 荧 光 显 微 镜 下, 叶 绿 体 发 出 火 红 色 荧 光, 但 其 荧 光 强 度 要 比 游 离 叶 绿 体 弱 气 孔 发 绿 色 荧 光, 两 保 卫 细 胞 内 的 火 红 色 叶 绿 体 则 环 绕 气 孔 排 列 成 一 圈 表 皮 细 胞 内 叶 绿 体 数 量 要 比 叶 肉 细 胞 少 3 用 吖 啶 橙 染 色 后, 叶 绿 体 则 发 出 枯 红 色 荧 光, 细 胞 核 町 发 出 绿 色 荧 光, 气 孔 仍 为 绿 色 作 业 1 在 普 通 光 镜 下, 用 目 镱 测 微 尺 和 台 镜 测 微 尺 测 量 一 下 叶 绿 体 的 长 轴 和 短 轴, 分 别 测 重 5 10 个 叶 绿 体, 求 其 平 均 值 2 在 荧 光 显 微 镜 下 观 察 叶 绿 体 的 自 发 荧 光 时, 更 换 滤 片 系 统, 叶 绿 体 的 颜 色 是 否 有 变 化? 3 游 离 叶 绿 体 和 整 体 细 胞 内 的 叶 绿 体, 在 荧 光 显 微 镜 下, 具 颜 色 和 强 度 合 无 差 异? 思 考 题 1 叶 绿 体 分 离 的 实 验 原 理 是 什 么? 在 分 离 叶 绿 体 时 应 注 意 些 什 么 问 题? 2 普 通 光 镜 与 荧 光 显 微 镜 有 何 异 同 点? 10

13 实 验 四 线 粒 体 和 液 泡 系 的 超 活 染 色 与 观 察 实 验 目 的 一 观 察 动 植 物 活 细 胞 内 线 粒 体, 液 泡 系 的 形 态 数 量 与 分 布 二 学 习 一 些 细 胞 器 的 超 活 染 色 技 术 实 验 原 理 活 体 染 色 是 指 对 生 活 有 机 体 的 细 胞 或 组 织 能 着 色 但 又 无 害 毒 的 一 种 染 色 方 法 它 的 目 的 是 显 示 生 活 细 胞 内 的 某 些 结 构 而 不 影 响 细 胞 的 生 命 活 动 和 产 生 任 何 物 理 化 学 变 化 以 致 引 起 细 胞 的 死 亡 活 染 技 术 可 用 来 研 究 生 活 状 态 下 的 细 胞 形 态 结 构 和 生 理. 病 理 状 态 根 据 所 用 染 色 剂 的 性 质 和 染 色 方 法 的 不 同, 通 过 把 活 体 染 色 分 为 体 内 活 染 与 体 外 活 染 两 类 体 内 活 染 是 以 胶 体 状 的 染 料 溶 液 注 入 动 植 物 体 内, 染 料 的 胶 粒 固 定 堆 积 在 细 胞 内 某 些 特 殊 结 构 里, 达 到 易 于 识 别 的 目 的 体 外 活 染 又 称 超 活 染 色, 它 是 由 活 的 动 植 物 分 离 出 部 分 细 胞 或 组 织 小 块, 以 染 料 溶 液 浸 染, 染 料 被 选 择 固 定 在 活 细 胞 的 某 种 结 构 上 而 显 色 活 体 染 料 之 所 以 能 固 定 堆 积 在 细 胞 内 某 些 特 殊 的 部 分, 主 要 是 染 料 的 电 化 学 特 性 起 重 要 作 用 碱 性 染 料 的 胶 粒 表 面 带 阳 离 子, 酸 性 染 料 的 胶 粒 表 现 带 有 阴 离 子, 而 被 染 的 部 分 本 身 也 是 具 有 阴 离 子 或 阳 离 子, 这 样, 它 们 彼 此 之 间 就 发 生 了 吸 引 作 用 但 不 是 任 何 染 料 皆 可 以 作 为 活 体 染 色 剂 之 用, 应 选 择 那 些 对 细 胞 无 毒 性 或 毒 性 极 小 的 染 料, 而 且 总 是 要 配 成 稀 淡 的 溶 液 来 使 用 一 般 足 以 碱 性 染 料 最 为 适 用, 可 能 因 为 它 具 有 溶 解 在 类 脂 质 ( 如 卵 磷 脂 胆 固 醇 等 ) 的 特 性, 易 于 被 细 胞 吸 收 詹 纳 斯 绿 B(Janus peen B) 和 中 性 红 (neutral red) 两 种 碱 性 染 料 是 活 体 染 色 剂 中 最 重 要 的 11

14 染 料, 对 于 线 粒 体 和 液 泡 系 的 染 色 各 有 专 一 性 实 验 用 品 一 器 材 显 微 镜 恒 温 水 浴 锅 解 剖 盘 剪 刀 罐 子 双 面 刀 片 载 玻 片 凹 面 载 玻 片 盖 玻 片, 表 面 皿, 吸 管, 牙 签 吸 水 纸 二 试 剂 1 Ringer 溶 液 氯 化 钠 0.85g( 变 温 动 物 用 0.65g) 氧 化 钾 氯 化 钙 0.03g 蒸 馏 水 100ml 2 10% 1/3000 中 性 红 溶 液 称 取 0.5g 中 性 红 溶 于 50ml Ringer 液, 稍 加 热 (30 40 ) 使 之 很 快 溶 解, 用 滤 纸 过 滤, 装 入 棕 色 瓶 于 暗 处 保 存, 否 则 易 氧 化 沉 淀, 失 去 染 色 能 力 临 用 前, 取 已 配 制 的 1% 中 性 红 溶 液. 取 l 呢 原 液 lml, 加 入 29ml Ringer 溶 液 混 匀, 装 入 棕 色 瓶 备 用 3 l% 1/5000 詹 纳 斯 绿 B 溶 液 称 取 50rug 詹 纳 斯 绿 B 溶 于 5mi Ringer 溶 液 中. 稍 加 微 热 (30 40 ), 使 之 溶 解, 用 滤 纸 过 滤 后, 即 为 1% 原 液 1mI, 加 入 49ml Ringer 溶 解, 即 生 1/5000 工 作 液 装 入 瓶 中 备 用 最 好 现 用 现 配, 以 保 持 它 的 充 分 氧 化 能 力 三 材 料 1 小 白 鼠 肝 细 胞 2 人 口 腔 上 皮 细 胞 3 洋 葱 磷 茎 内 表 皮 细 胞 12

15 4 蟾 蜍 胸 骨 剑 突 软 骨 细 胞 5 小 麦 或 黄 豆 幼 根 根 尖 实 验 方 法 一 线 粒 体 的 超 活 染 色 与 观 察 线 粒 体 是 细 胞 进 行 呼 吸 作 用 的 场 所, 具 形 态 和 数 量 随 不 同 物 种 不 同 组 织 器 官 和 不 同 的 生 理 状 态 面 发 生 变 化 詹 纳 斯 绿 B 是 毒 性 较 小 的 碱 性 染 性, 可 专 一 性 地 对 线 粒 体 进 行 超 活 染 色, 这 是 由 于 线 粒 体 内 的 细 胞 色 素 氧 化 酶 系 的 作 用, 使 染 料 始 终 保 持 氧 化 状 态 ( 即 有 色 状 态 ), 呈 蓝 绿 色 : 而 线 粒 体 周 围 的 细 胞 质 中, 这 些 染 料 被 还 原 为 无 色 的 色 基 ( 即 无 色 状 态 ) ( 一 ) 人 口 腔 粘 膜 上 皮 细 胞 线 粒 体 的 超 活 染 色 观 察 1 取 清 洁 载 玻 片 放 在 37 恒 温 水 溶 锅 的 金 属 板 上, 滴 2 滴 1/5000 詹 纳 斯 绿 B 染 液 2 实 验 者 用 牙 签 宽 头 在 自 己 口 腔 颊 粘 膜 处 稍 用 力 刮 取 上 皮 细 胞, 将 刮 下 的 粘 液 状 物 放 入 载 玻 片 的 染 液 滴 中, 染 色 10-15min( 注 意 不 可 染 液 干 燥, 必 要 时 可 再 加 滴 染 液 ), 盖 上 盖 玻 片, 用 吸 水 纸 吸 去 四 周 溢 了 的 染 液, 置 显 微 镜 下 观 察 3 在 低 倍 镜 下, 选 择 平 展 的 口 腔 上 皮 细 胞, 换 高 倍 镜 或 油 镜 进 行 观 察 可 见 扁 平 状 上 皮 细 胞 的 核 周 围 胞 质 中, 分 布 着 一 些 被 染 成 蓝 绿 色 的 颗 粒 状 或 短 棒 状 的 结 构, 即 是 线 粒 体 ( 二 ) 小 自 鼠 肝 细 胞 线 粒 体 的 超 活 染 色 观 察 1 用 颈 椎 脱 臼 法 处 死 小 白 鼠, 置 于 解 剖 盘 中, 剪 开 腹 腔, 取 小 白 鼠 肝 边 缘 较 薄 的 肝 组 织 一 小 块, 放 入 表 面 皿 内 用 吸 管 吸 取 Ringer 液, 反 复 浸 泡 冲 洗 肝 脏, 洗 去 血 液 2 在 干 净 的 凹 面 载 玻 片 的 凹 穴 中, 漓 加 1/5000 詹 纳 绿 B 溶 液, 再 将 肝 组 织 块 移 入 染 液, 注 意 不 可 将 组 织 块 完 全 淹 没, 要 使 13

16 蛆 织 块 上 面 部 分 半 露 在 染 液 外, 这 样 细 胞 内 的 线 粒 体 酶 系 可 充 分 得 到 氧 化, 易 被 染 色 当 组 织 块 边 缘 被 染 成 蓝 绿 色 即 成 ( 一 般 需 染 min). 3 吸 去 染 液, 滴 加 Ringer 溶 液, 用 眼 科 剪 将 组 织 块 着 色 部 分 剪 碎, 使 细 胞 或 细 胞 群 散 出 然 后, 用 吸 管 吸 取 分 离 出 的 细 胞 悬 液, 滴 一 滴 于 载 玻 片 上, 盖 上 盖 玻 片 进 行 观 察 4 在 低 倍 镜 下 选 择 不 重 叠 的 肝 细 胞, 在 高 倍 镜 或 油 镜 下 观 察, 可 见 具 有 1--2 个 核 的 肝 细 胞 质 中, 有 许 多 被 染 成 蓝 绿 色 的 线 粒 体, 注 意 其 形 态 和 分 布 状 况 ( 三 ) 洋 葱 鳞 茎 表 皮 细 胞 线 粒 体 的 超 活 染 色 观 察 1 用 吸 管 吸 取 1/5000 詹 纳 斯 绿 B 染 液, 滴 一 滴 于 干 净 的 载 玻 片 上, 然 后, 撕 取 一 小 片 洋 葱 鳞 茎 内 表 皮, 置 于 染 液 中, 染 色 min. 2 用 吸 管 吸 去 染 液, 加 一 滴 Ringer 液, 注 意 使 内 表 皮 组 织 展 平, 盖 上 盖 玻 片 进 行 观 察 3 在 高 倍 镜 下, 可 见 洋 葱 表 皮 细 胞 中 央 被 一 大 液 泡 所 占 据, 细 胞 核 被 挤 至 一 侧 贴 细 胞 壁 处. 仔 细 观 察 细 胞 质 中 线 粒 体 的 形 态 与 分 布 二 液 泡 系 的 超 活 染 色 与 观 察 中 性 红 为 弱 碱 性 染 料, 对 液 泡 系 ( 即 高 尔 基 体 ) 的 染 色 有 专 一 性, 只 将 活 细 胞 中 的 液 泡 系 染 红 色, 细 胞 核 与 细 胞 质 完 全 不 着 色, 这 可 能 是 与 液 泡 中 某 些 蛋 白 质 有 关 ( 一 ) 蟾 蜍 脚 骨 剑 实 软 骨 细 胸 的 液 泡 系 中 性 红 染 色 观 察 软 骨 细 胞 能 分 泌 软 骨 粘 蛋 白 质 和 胶 原 纤 维 等, 因 而 粗 面 内 质 网 和 高 尔 基 体 都 发 达, 用 中 性 红 超 活 染 色 可 明 显 地 显 示 出 液 泡 系 1 将 蟾 蜍 处 死, 剪 取 胸 骨 纠 突 最 薄 的 部 分 一 小 块, 放 放 载 玻 14

17 片 上 的 1/3000 中 性 红 染 液 滴 中, 染 色 5--10min 2 用 吸 管 吸 去 染 液, 滴 加 Ringer 液, 盖 上 盖 玻 片 进 行 观 察 3 在 高 倍 镜 下, 可 见 软 骨 细 胞 为 椭 圆 形, 细 胞 核 及 核 仁 清 楚 易 见, 在 细 胞 核 的 上 方 胞 质 中, 有 许 多 被 染 成 玫 瑰 红 色 大 小 不 一 的 泡 状 钵. 这 一 特 定 区 域 叫 高 尔 基 区, 即 液 泡 系 ( 二 ) 小 麦 根 尖 细 胞 液 泡 系 的 中 性 红 染 色 观 察 1 实 验 前, 把 小 麦 种 子 或 黄 豆 培 养 在 培 养 皿 内 潮 湿 的 滤 纸 上, 使 具 发 芽, 胚 根 伸 长 到 lcm 以 上. 2 用 双 面 刀 得 把 初 生 的 小 麦 或 黄 豆 幼 苗 根 尖 (1-2cm) 小 心 切 一 纵 切 面, 放 入 载 玻 片 上 的 1/3000 中 性 红 染 液 滴 中, 染 色 5 一 10min 3 吸 去 染 液, 滴 一 滴 Ringer 液, 盖 上 盖 玻 片, 并 用 镊 子 轻 轻 地 下 压 盖 玻 片, 使 根 尖 压 扁, 利 于 观 察 4 在 高 倍 镜 下, 先 观 察 根 尖 部 分 的 生 长 点 的 细 胞, 可 见 细 胞 质 中 散 在 很 多 大 小 不 等 的 染 成 玫 瑰 红 色 的 圆 形 小 泡, 这 是 初 生 的 幼 小 液 泡 然 后, 由 生 长 点 向 延 长 区 观 察, 在 一 些 已 分 化 长 大 的 细 胞 内, 液 泡 的 染 色 较 浅, 体 积 增 大, 数 目 变 少 在 成 热 区 细 胞 中, 一 般 只 有 一 个 淡 红 色 的 巨 大 液 泡, 占 据 细 胞 的 绝 大 部 分, 将 细 胞 核 挤 到 细 胞 一 侧 贴 近 细 胞 壁 处 从 以 上 的 观 察 结 果, 想 想 标 题 物 细 胞 液 泡 系 的 形 态 演 进 情 况 作 业 一 绘 口 腔 上 皮 细 胞 示 线 粒 体 形 态 与 分 布 二 绘 蟾 蜍 脚 骨 剑 突 软 骨 细 胞 示 液 泡 系 形 态 与 分 布 思 考 题 1 用 一 种 活 体 染 色 剂 对 细 胞 进 行 超 活 染 色 2 小 麦 或 黄 豆 根 尖 经 中 性 红 超 活 染 色, 为 什 么 看 到 生 长 点 的 15

18 细 胞 中 液 泡 多, 而 且 染 色 深, 伸 长 区 细 胞 中 液 泡 数 量 变 少, 染 色 浅? 3 高 等 动 物 和 高 等 檀 物 细 胞 中 的 液 泡 系 ( 高 尔 基 体 ) 分 布 上 有 何 不 同? 16

19 实 验 五 细 胞 凝 集 反 应 实 验 原 理 细 胞 膜 是 双 层 脂 镶 嵌 蛋 白 质 结 构, 脂 和 蛋 白 质 又 能 与 糖 分 子 结 合 为 细 胞 表 面 的 分 枝 状 糖 外 被 目 前 认 为 : 细 胞 间 的 联 系, 细 胞 的 生 长 和 分 化, 免 疫 反 应 和 肿 瘤 发 生 都 和 细 胞 表 面 的 分 枝 状 糖 分 子 有 关 凝 集 素 (1ectin) 是 一 类 含 糖 的 ( 少 数 例 外 ) 并 能 与 糖 等 专 一 性 结 合 的 蛋 白 质, 它 具 有 凝 集 细 胞 刺 激 细 胞 分 裂 的 作 用 凝 集 素 使 细 胞 凝 集 是 由 于 它 与 细 胞 表 面 的 糖 分 子 连 接, 在 细 胞 间 形 成 桥 的 结 果, 加 入 与 凝 集 素 互 补 的 糖 可 以 抑 制 细 胞 的 凝 集 实 验 用 品 1 土 豆 块 茎 2 显 微 镜 粗 天 平 载 玻 片 滴 管 2 支 离 心 管 2 支 3 PBS 缓 冲 液 称 取 NaC 17.2g Na2HP g KH2PO40.43g 加 蒸 馏 水, 定 容 至 1000ml 调 ph 值 到 % 的 红 细 胞 以 无 菌 方 法 抽 取 兔 子 静 脉 血 液 ( 加 抗 凝 剂 ), 用 生 理 盐 水 洗 5 次, 每 次 2000r/min, 离 心 5min, 最 后 按 压 积 红 细 胞 体 积 用 生 理 盐 水 配 成 2% 红 细 胞 液 实 验 方 法 称 取 土 豆 去 皮 块 茎 2g, 加 10ml PBS 缓 液, 漫 泡 2h, 浸 出 的 粗 提 液 中 含 有 可 溶 性 土 豆 凝 集 索 用 滴 管 吸 取 土 豆 凝 集 素 和 2% 红 细 胞 液 各 一 滴, 置 载 玻 片 上, 充 分 混 匀, 静 置 20min 后 于 低 倍 显 微 镜 下 观 察 血 球 凝 集 现 象 17

20 实 验 作 业 3 以 PBS 液 加 2% 血 细 胞 液 作 对 照 实 验 简 图 表 示 血 细 胞 凝 集 原 理 18

21 实 验 六 DNA 的 FeulSeH 染 色 法 实 验 目 的 学 习 DNA 的 Feulgen 染 色 方 法, 了 解 反 应 原 理 实 验 原 理 DNA 经 弱 酸 (1mol/LHCI) 水 解, 其 上 的 嘌 岭 碱 和 脱 氧 核 糖 之 间 的 键 打 开, 使 脱 氧 糖 的 一 端 形 成 游 离 的 醛 基, 这 些 醛 基 在 原 位 与 Schiff 试 剂 ( 无 色 晶 红 亚 硫 酸 溶 液 ) 反 应, 形 成 紫 红 色 的 化 合 物, 使 细 胞 内 含 有 DNA 的 部 位 呈 紫 红 色 阳 性 反 应 紫 红 色 的 产 生, 是 由 于 反 应 产 物 的 分 子 内 含 有 醒 基, 醌 基 是 一 个 发 色 团, 所 以 具 有 颜 色 对 照 组 预 先 用 热 三 氯 醋 酸 或 DNA 酶 处 理, 抽 提 去 细 胞 中 的 DNA 而 得 到 阴 性 反 应, 从 而 证 明 了 Feulgen 反 应 的 专 一 性. 实 验 用 品 一 材 料 1 Camoy 液 固 定 的 鼠 肝 石 蜡 切 片 2 Camoy 液 固 定 的 洋 葱 根 尖 或 根 豆 根 尖 切 片 二 试 剂 1 Camoy 固 定 液 3 份 95% 酒 精 加 入 1 份 冰 醋 酸 2 l mol/lhci 取 比 重 1.18 的 浓 HCI82.5ml, 加 水 至 100ml 3 Schiff 试 剂 先 将 200mi 蒸 馏 水 煮 沸, 由 火 上 取 下, 加 入 碱 性 品 红 1g, 充 分 搅 拌, 有 助 于 溶 解. 待 溶 液 冷 到 50 时 过 滤 到 磨 口 棕 色 试 剂 瓶 中 加 入 1mol/L HCI 20ml, 冷 却 到 25 时 加 入 1g 偏 亚 硫 酸 钾 (K 2S 2O 2) 或 偏 亚 硫 酸 钠 (Na 2S 2O 5) 充 分 振 荡 后 盖 紧 瓶 塞, 放 于 暗 19

22 处 过 液 次 口 取 出, 呈 淡 黄 色 或 近 于 无 色, 加 中 性 活 性 炭 一 匙, 约 0.5g, 剧 烈 振 荡 1min, 过 滤 后 即 得 无 色 品 红 4 亚 硫 酸 水 溶 液 ( 漂 白 液 ) 100% 偏 重 亚 硫 酸 钠 水 溶 液 5ml, 蒸 馏 水 100ml,1mol/L HCI5ml, 摇 匀, 塞 紧 瓶 塞 5 5% 三 氯 醋 酸 6 0.5% 固 绿 酒 精 溶 液 (95% 酒 精 溶 液 ) 实 验 方 法 石 蜡 切 片 溶 蜡 二 甲 苯 I 溶 蜡 二 甲 苯 II (3-5min) 1/2 纯 酒 精 +2/2 二 甲 苯 (3-5min) 纯 酒 精 I 纯 酒 精 II (3-5min) (2-3min) 95% 酒 精 (2-3min) 83% 酒 精 (2-3min) 70% 酒 精 (2-3min) 蒸 馏 水 实 验 组 1mol/L 对 照 组 5% 三 氯 醋 酸,90,15min 70% 酒 精 (2-3min) 蒸 馏 水 ( 过 一 下 ) 20

23 1mol/L HCI min( 水 浴 或 温 箱 中 ) Schiff 试 剂 亚 硫 酸 水 (I II III) 流 水 冲 洗 (60-90min) ( 各 5 min) (5-15min) 蒸 馏 水 0.5% 固 绿 水 溶 液 ( 复 染 ) (1min)( 此 步 要 快, 以 免 过 染 ) 蒸 馏 水 70% 酒 精 83% 酒 精 95% 酒 精 纯 酒 精 I 纯 酒 精 II 纯 酒 精 III 透 明 二 甲 苯 I 透 明 二 甲 苯 II 封 面 ( 贴 上 标 签, 注 意 材 料, 反 应 名 称, 作 者 姓 名 及 日 期 ) 显 微 镜 下 检 查 : 实 验 组 : 细 胞 核 呈 现 紫 红 色 核 仁 及 细 胞 呈 现 绿 色 对 照 组 : 由 于 DNA 被 提 取 破 坏 所 以 细 胞 核 无 紫 红 色 作 业 1 验 交 Feulgen 反 应 制 片 1 张 2 简 图 表 示 Feulgen 反 应 的 染 色 结 果 3 说 明 Feulgen 反 应 中 设 立 对 照 组 的 必 要 性 21

24 实 验 七 PSA 反 应 法 显 示 多 糖 一 实 验 目 的 掌 握 PAS( 高 碘 酸 - 希 夫 试 剂 ) 反 应 显 示 多 糖 的 方 法 了, 了 解 多 糖 在 细 胞 内 的 分 布 及 其 特 性 二 实 验 原 理 此 法 的 基 本 原 理 是 利 用 高 碘 酸 ( 氧 化 剂 ) 破 坏 多 糖 分 子 中 的 C-C 健, 变 为 醛 基, 此 醛 基 与 希 夫 试 剂 ( 无 色 品 红 亚 硫 酸 溶 液 ) 反 应, 生 成 一 种 紫 红 邑 的 反 应 产 物 这 一 过 程 称 为 PAS 反 应 表 现 PAS 阳 性 反 应 的 物 质, 除 多 糖 外, 还 有 糖 蛋 白 及 粘 蛋 白 等, 后 二 者 是 糖 类 化 合 物 与 蛋 白 质 的 络 合 物. 上 述 成 分 与 高 碘 酸 希 犬 试 剂 反 应 即 生 成 正 反 应 的 红 色 产 物 其 生 成 物 可 得 到 定 性 的 定 位 测 定 三 实 验 方 法 方 法 1 试 剂 的 配 制 (1) % 高 碘 酸 (HIO4) 水 溶 液 (2) 希 夫 试 剂 将 1 克 碱 性 晶 红 溶 于 200 毫 升 沸 腾 的 蒸 馏 水 中, 摇 动 分 钟, 冷 却 到 50 时 过 滤. 向 滤 液 中 加 入 1NHCl20 毫 升, 冷 至 25, 加 2 克 偏 亚 硫 酸 钾 ( 或 钠 盐 ), 摇 匀, 静 置 暗 处 过 液. 加 活 性 炭 2 克, 摇 动 2--3 分 钟, 用 滤 纸 将 溶 液 过 滤 于 棕 色 瓶 中. 滤 液 应 该 是 无 色 或 淡 黄 色, 若 呈 红 色 则 不 能 用 用 前 将 染 液 升 到 室 温 根 据 我 们 的 经 验 : 使 偏 亚 硫 酸 钾 2--3 倍 于 碱 性 品 红, 可 增 强 希 夫 试 剂 活 力 在 提 高 偏 亚 硫 酸 钾 用 量 的 情 况 下, 即 可 使 碱 性 晶 红 变 成 无 色, 不 用 活 性 炭 去 色 过 滤 22

25 (3) 洗 涤 液 偏 亚 硫 酸 钾 ( 或 钠 ) 溶 液 10% 偏 亚 硫 酸 钾 5 毫 升 INHCl 5 毫 升 蒸 馏 水 90 毫 升 临 川 时 将 三 者 混 合, 使 用 新 鲜 混 合 液 2 实 验 程 序 (1) 切 片 脱 蜡 后, 经 各 纯 浓 度 酒 精 下 降 至 蒸 馏 水 (2) 流 水 冲 洗 分 钟. (3) % 高 碘 酸 溶 液 处 理 10 分 钟. (4) 流 水 洗 涤 分 钟, 蒸 馏 水 过 一 下. (5) 移 入 希 夫 试 剂 中 分 钟. (6) 用 偏 亚 硫 酸 钾 溶 液 洗 三 次, 每 次 2--3 分 钟 (7) 流 水 洗 涤 分 钟, 并 通 过 蒸 馏 水 5 分 钟. (8) 按 常 规 通 过 各 级 乙 醇 脱 水, 二 甲 苯 透 明, 树 胶 封 片 对 照 片 : 切 片 通 过 第 二 步 后, 分 别 经 以 下 处 理. 然 后 与 正 反 应 并 列 进 行 a)1% 淀 粉 酶,25 处 理 1 小 时. b)10% 醋 酸 酐 的 吡 啶 溶 液 中, 室 温 下 4-2 小 时, c) 用 唾 液 37 下 消 化 处 理 30 分 钟, 更 换 一 次 3 结 果 淀 粉 粒 纤 维 素 细 胞 壁 及 细 胞 内 的 一 些 中 性 粘 多 糖 粘 蛋 白 及 糖 蛋 白 被 染 紫 色 作 业 交 PAS 反 应 玻 片 一 张 23

26 实 验 八 植 物 细 胞 骨 架 的 光 学 显 微 镜 观 察 一 实 验 目 的 学 习 用 光 用 显 微 镜 观 察 植 物 细 胞 内 骨 架 的 基 本 方 法 了 解 植 物 细 胞 的 骨 架 的 结 构 特 征. 二 实 验 原 理 当 用 适 当 浓 度 的 Triton X-100 处 理 时, 可 将 细 胞 内 蛋 白 质 破 坏, 但 细 胞 内 骨 架 系 统 的 蛋 白 质 却 被 保 存, 后 者 有 考 马 斯 亮 蓝 R250 染 色, 可 在 光 学 是 显 微 镜 下 观 察 到 细 胞 骨 架 的 网 状 结 构 三 实 验 用 品 ( 一 ) 材 料 洋 葱 鳞 茎 ( 二 ) 器 材 显 微 镜,5ml 烧 杯, 胶 头 滴 管, 容 量 瓶 试 剂 瓶 载 玻 片 盖 玻 片 镊 子 试 剂 ( 1 ) M- 缓 冲 液 :50mmol/L 味 唑 50mmol/L KCJ 0.5mmol/LMgCl 2 mmol/l EGTA 0.1mmol/LEDTA 1 mmol/l 巯 基 乙 醇 (2)6mmol/L ph6.8 磷 酸 缓 冲 液, 用 NaHC03 调 ph) (3)1%TritonX-1OO, 用 M- 缓 冲 液 配 制 (4)O.2% 考 马 斯 亮 蓝 R250, 其 溶 剂 是 : 甲 醇 46.5ml, 冰 醋 酸 7ml 蒸 馏 水 46.5ml (5)3% 戊 二 醛, 用 磷 酸 缓 冲 液 配 (6)50% 70% 95% 乙 醇 (7) 叔 丁 醇 24

27 (8) 正 丁 醇 (9) 二 甲 苯 (10) 中 性 树 胶 四 实 验 方 法 (1) 撕 取 洋 葱 鳞 茎 内 的 表 皮 缅 胞 ( 约 1cm2 大 小 若 干 片 ) 置 于 装 有 ph6.8 磷 酸 缓 冲 液 的 5ml 烧 杯 中, 使 其 下 觉 (2) 吸 去 磷 酸 缓 冲 液, 用 1%Triton X-100 处 理 分 钟 (3) 吸 去 Triton X-100, 用 M- 缓 冲 液 洗 三 次, 每 次 10 分 钟 (4)3% 二 醛 固 定 小 时. (5)pH6.8 磷 酸 缓 冲 液 洗 三 次, 每 次 10 分 钟 (6)0.2% 考 马 斯 亮 蓝 R250 染 色 分 钟, (7) 用 蒸 馏 水 洗 1--2 次, 细 胞 置 于 载 玻 片 上, 加 盖 玻 片, 于 普 通 光 学 显 微 镜 下 观 察 (8) 如 观 察 装 什 效 果 好, 可 制 作 成 永 久 装 片. 在 样 品 的 5mt 烧 杯 中, 按 顺 序 通 过 如 下 药 物 :50% 乙 醇 70 % 乙 醇,90% 乙 醇 1/295%7 醇 +1/2 叔 丁 醇 叔 丁 醇 ( 每 级 分 钟 ); 或 正 丁 醇 二 甲 苯 二 甲 苯 二 甲 苯 ( 每 级 分 钟 ), 然 后 捞 取 样 品, 平 展 于 载 玻 片 上, 经 镜 检, 效 果 好, 可 加 一 滴 中 性 树 胶, 盖 上 盖 玻 片 作 业 绘 一 个 洋 葱 磷 叶 表 皮 细 胞 的 细 胞 骨 架 图 25

28 实 验 九 植 物 染 色 体 标 本 的 制 备 与 观 察 实 验 目 的 学 习 植 物 染 色 体 标 本 的 制 备 技 术, 掌 握 染 色 体 的 计 数 方 法, 了 解 染 色 体 的 生 物 学 意 义. 实 验 用 品 一 材 料 大 麦 黑 麦 或 小 麦 种 子 二 试 剂 1 Camoy 固 定 液 2 O.1% 秋 水 仙 素 溶 液 3 lmol/l HCl 4 Schiff 试 剂 5 亚 硫 酸 水 溶 液 ( 漂 洗 液 ) 6 混 合 酶 液 ( 纤 维 素 酶, 果 胶 酶 各 1%--2%) 7 Carbor fuchsin( 卡 宝 晶 红 ) 染 液 配 方 I: 原 液 A: 称 取 38 碱 性 晶 红, 溶 于 100ml 70% 酒 精 中 ( 此 液 可 无 限 期 保 存 ) 原 液 :B 取 10mi 原 液 A, 加 入 90ml 115% 石 炭 酸 ( 苯 酚 ) 水 溶 液 ( 两 周 内 使 用 ) 染 色 液 :55ml 原 液 B 加 6ml 冰 醋 酸 和 6ml 37% 甲 醛 ( 此 液 适 用 于 植 物 原 生 质 体 培 养 中 细 胞 核 和 按 分 裂 的 染 色 ). 配 方 II: 取 配 方 I 中 的 染 色 液 2--10ml, 加 90 98ml45% 醋 酸 和 1.8g 山 梨 醇 ( 此 液 适 用 于 核 和 染 色 体 的 一 般 形 态 观 察, 具 有 广 泛 的 适 用 26

29 性 ) 实 验 方 法 I 取 材 : 将 大 麦 黑 麦 或 小 麦 种 子 培 养 在 培 养 [ 阻 内 的 漫 滤 纸 上 下 发 芽, 特 胚 根 长 达 I--2cm 时, 切 取 0.5cm 长 的 根 尖 部 分 2 预 处 理 ; 将 切 下 的 根 尖 浸 入 0.1% 秋 水 仙 素 液 中, 室 温 下 处 理 3--4h 也 可 把 根 尖 浸 入 小 烧 杯 内 的 自 来 水 中, 杯 内 加 冰 两 小 块, 置 0--4 冰 箱 内 低 温 处 理 24h 左 右 3 固 定 : 取 出 根 尖, 投 入 Carnoy 液 中 固 定 2-24h, 换 入 70% 酒 精, 暂 时 保 存 4 水 解 : 把 根 尖 投 入 预 热 的 mol/L 热 HCI 中, 恒 温 条 件 下 水 解 14-15min 5 染 色 : 倒 去 热 HCl, 滴 加 Schiff 试 剂 ( 五 色 晶 红 ) 少 许, 染 色 h( 也 可 在 冰 箱 内 染 色 h) 6 漂 洗 : 吸 去 Schiff 试 剂, 用 漂 洗 液 换 洗 2--3 次, 每 次 1--2min. 7 酶 解 : 在 载 玻 片 上 切 取 根 尖 着 色 深 的 部 分, 浸 入 小 酒 杯 内 1--2 滴 混 合 酶 液 中, 室 温 下 酶 解 40min 左 右 或 在 28 温 箱 中 酶 解 20min 左 右 8 洗 涤 : 吸 去 酶 液, 加 蒸 馏 水, 用 吸 管 换 洗 几 次, 除 去 残 留 酶 液 后 加 入 45% 醋 酸 9 压 片 : 用 吸 管 从 醋 酸 中 吸 取 材 料, 置 干 净 载 玻 片 上, 材 料 周 围 保 留 半 滴 45% 醋 酸, 盖 上 盖 玻 片 其 上 放 一 片 吸 水 纸. 左 手 揩 压 住 吸 水 纸 的 左 边 右 手 指 从 吸 水 纸 的 左 端 向 右 方 轻 轻 抹 去, 再 用 铅 笔 擦 头 从 盖 片 上 轻 轻 敲 打, 使 细 胞 均 匀 散 开 10 镜 检 ; 把 压 好 的 片 于 放 显 微 镜 下, 先 观 察 细 胞 分 散 状 况 和 中 期 分 裂 相 的 多 少, 再 检 查 分 裂 中 期 细 胞 中 的 染 色 体 是 否 完 全 27

30 敞 开. 如 若 染 色 体 分 散 不 好 而 难 以 分 辨 和 计 数 可 取 下 片 子, 平 放 桌 面 上, 用 手 指 隔 着 吸 水 纸 在 盖 玻 片 上 稍 施 压 力, 如 果 操 作 细 心, 用 力 适 度, 便 可 很 容 易 得 到 染 色 分 散 良 好 的 压 力 标 本, 供 观 察, 计 数 和 照 相 用 11 封 存 : 压 好 的 片 子 如 果 来 不 及 观 察 或 照 相, 必 须 进 行 暂 时 封 存 封 存 时 先 在 盖 玻 片 四 周 各 放 麦 粒 大 石 蜡 一 块, 然 后 用 烧 热 的 解 剖 针 迅 速 熔 化 石 蜡, 使 盖 片 四 周 严 密 封 闭. 封 好 的 片 于 可 放 培 养 皿 内 湿 滤 纸 上 的 火 柴 棒 支 架 上, 盖 上 培 养 皿, 可 放 冰 箱 内 保 存 2 3 天. Schiff 试 剂 染 色 效 果 不 够 理 想 的 材 料, 可 于 水 解 后 改 用 Cart)orfuchsin 染 色 (5-5rain) 由 于 Carbor fuchsin 具 有 染 色 快 着 色 深 以 及 适 用 性 广 等 特 点, 因 此 多 数 植 物 的 根 尖 幼 芽 花 药 以 及 培 养 的 细 胞 或 愈 伤 组 织, 经 Carbor fuchsin 染 色, 都 能 得 到 良 好 的 结 果 作 业 验 变 压 片 标 本 1-2 张, 要 求 细 胞 分 散 均 匀, 形 态 完 整, 中 期 分 裂 相 中 染 色 体 数 目 齐 全, 互 不 重 叠 能 够 进 行 准 确 计 数 和 照 相 28

31 实 验 十 细 胞 电 融 合 方 法 实 验 目 的 动 物 的 游 离 细 胞 以 及 植 物 成 微 生 物 去 壁 后 的 原 生 质 体, 在 电 刺 激 下 进 行 细 胞 融 合, 且 融 合 率 高 无 毒 性, 操 作 简 便 及 融 合 后 的 细 胞 继 续 培 养 成 活 率 高 等 优 点, 是 细 胞 工 程 手 段 的 又 一 进 展 实 验 原 理 将 制 备 的 游 离 细 胞 或 原 生 质 体, 置 于 电 融 合 室 中, 在 高 频 交 流 电 场 的 作 用 下, 细 胞 被 极 化, 成 为 偶 极 子, 造 成 细 胞 之 间 相 互 连 接, 如 果 施 加 的 高 频 交 流 电 压 ( 即 正 弦 波 的 p-p 值 ) 过 高 或 作 用 时 间 过 长, 则 细 胞 连 接 成 串 珠 状, 应 适 当 控 制 以 上 条 件, 尽 量 使 两 细 胞 处 于 点 接 触 状 态, 然 后 施 加 方 波 脉 冲 予 以 刺 激, 由 于 电 脉 冲 的 瞬 间 作 用, 可 击 破 两 细 胞 接 触 点 部 位 的 质 膜, 此 时 质 膜 的 脂 类 分 子 发 生 重 组, 同 时 由 于 细 胞 表 面 的 张 力 作 用, 使 两 细 胞 融 合 逐 步 完 全 实 验 用 品 一 仪 器 JCF-I 型 细 胞 电 融 合 仪 细 胞 融 合 池 普 通 离 心 机 倒 置 显 微 镜 ( 或 研 究 用 显 微 镜 ), 刻 度 吸 管 不 锈 钢 网 (200 目 ) 镊 子 解 剖 刀 解 剖 剪 注 射 器 毛 细 吸 智 刻 度 吸 蕾 小 烧 杯 (10m1) 滴 瓶 培 养 皿 毛 笔 等 二 药 品 甘 露 醇 氧 化 钠, 纤 罐 索 醇 (Onozura R-10) 离 析 酶 (Macerozyme R-10) 蜗 牛 酶 ( 中 科 院 生 物 物 理 所 产 ) CaCl 2 2H 2O 29

32 MES (2-N- 吗 啉 乙 烷 磺 酸 ) 葡 聚 糖 硫 酸 钾 等 三 材 料 实 验 方 法 如 果 只 观 察 细 胞 的 融 合 过 程 和 掌 握 融 合 方 法, 本 实 验 所 有 步 骤 均 可 在 有 菌 条 件 下 操 作 一 植 物 原 生 质 体 的 制 备 1 取 幼 嫩 的 叶 片 或 充 分 展 开 的 子 叶, 先 用 水 洗 净 并 吸 去 表 面 的 水 份, 再 置 入 小 烧 杯 中 将 叶 片 剪 成 碎 块 2 将 碎 块 放 入 1.5% 纤 维 素 酶 0.3% 离 析 酶 0.5% 蜗 牛 酶 0.6mol/L 甘 露 醇 50mmol/L CaCl2 2H 20 MES 3mmol/L 葡 聚 糖 硫 酸 钾 0.3%,pH5.6 的 酶 液 中, 置 于 25 暗 处 游 离 5h( 或 15 过 液 ), 游 离 时 间 结 束 时, 可 镜 检 原 生 质 体 分 离 情 况, 如 果 大 多 数 原 生 质 体 还 未 从 组 织 中 释 放 出 来, 需 增 加 在 酶 液 中 的 游 离 时 间 新 出 厂 的 酵 在 5h 内 一 般 就 可 将 原 生 质 体 游 离 出 来, 但 因 药 品 质 量 问 题 或 存 放 时 间 过 长, 致 使 酶 活 力 下 降, 要 适 当 延 长 酶 解 时 间 3 将 醇 解 出 来 的 原 生 质 体 用 不 锈 钥 网 过 滤, 以 除 去 未 被 酶 解 的 组 织, 过 滤 后 用 0.6M 的 蔗 糖 冲 洗 网 上 残 留 的 原 生 质 体, 然 后 以 200r/min 进 行 离 心 处 理 5min 4 用 带 长 针 头 的 注 射 器 吸 去 上 清 液, 然 后 加 入 1 1.5ml 0.2mol/L 的 CaCl 2H 2O, 将 原 生 质 体 混 匀 5 用 细 头 滴 管 或 带 长 针 头 的 注 射 器 向 管 底 慢 慢 注 入 20% 的 蔗 糖 液, 再 以 300r/min 离 心 10min, 此 时 可 见 到 在 上 下 两 液 体 间 的 界 面 处 有 一 层 乳 白 质 的 带 状 物, 即 为 纯 净 的 原 生 质 体, 其 破 碎 的 部 份 及 其 它 杂 质 都 沉 降 到 离 心 管 底 部, 用 长 针 头 注 射 器 或 毛 细 吸 臂 分 别 吸 去 管 底 的 杂 质 和 蔗 蔗 糖 液 以 及 原 生 质 体 上 层 的 CaCl 2 液. 30

33 6 向 离 心 管 加 入 2ml 0.2mol/L 的 CaCl 2H2O 溶 液, 混 匀 后 以 300r/min 离 心 5min 去 掉 上 清 液, 量 后 用 0.6mol/L 的 甘 露 醇 溶 液 稀 释 并 调 整 每 毫 升 含 个 原 生 质 体 二 动 物 细 胞 的 制 备 用 灭 菌 的 注 射 器 先 吸 入 Alsver 液 ( 葡 萄 糖 2.05g, 枸 椽 酸 钠 0.88,NaCl0.42g, 加 重 蒸 水 至 100mil)lml, 再 从 鸡 的 翼 下 静 脉 取 血 ml, 取 出 后 放 入 刻 度 离 心 管 中, 再 加 入 2--3ml Alsver 液, 使 总 量 为 4--5ml, 混 匀 并 封 口, 置 于 4 冰 箱 内 可 供 一 周 内 使 用, 实 验 时 取 贮 备 的 鸡 血 细 胞 lml, 加 入 4ml85% 生 理 盐 水, 混 匀 后 以 1200rr/min 离 心 5min, 去 上 清 液 后, 最 后 用 0.6mol/L 的 甘 露 醇 液 ( 或 0.6mol/L 蔗 糖 溶 液 ) 混 匀 后 以 上 述 离 心 条 件 洗 涤 两 次, 最 后 用 0.6mol/L 的 甘 露 醇 液 将 鸡 细 胞 稀 释 并 调 整 成 每 毫 升 含 个 如 采 用 传 代 培 养 的 骨 髓 或 腹 水 瘤 细 胞, 可 先 用 0.9% 的 生 理 盐 水 洗 涤 两 次, 离 心 速 度 为 r/min, 每 次 5min, 再 用 0.6mol/L 的 甘 露 醇 或 蔗 糖 液 洗 涤 两 次, 每 次 r/min, 离 心 5min, 最 后 用 甘 露 醇 调 整 成 每 毫 升 含 瘤 细 胞 个 三 细 胞 电 融 合 方 法 1 仪 2S 结 构 和 使 用 方 法 JCF- 型 细 胞 电 融 事 仪 的 各 项 技 术 参 数 是 通 过 大 量 的 融 合 实 验 数 据, 并 参 考 岛 津 公 司 ( 日 )SSH 型 电 融 合 装 置 的 参 数 值 而 设 计 的. 当 打 开 电 源, 指 示 灯 亮, 并 拨 通 输 出 开 关 和 正 弦 输 出 开 关, 选 择 和 按 下 正 弦 频 率 按 键 ( 共 分 为 MHz 五 档 ), 此 时 将 输 出 电 缆 与 示 波 器 相 接, 在 示 波 器 上 即 出 现 高 频 正 弦 波 形, 当 左 右 旋 转 正 弦 幅 度 旋 钮, 则 正 弦 电 压 的 p-p 值, 也 随 之 降 低 和 升 高, 如 果 将 输 出 电 缆 与 电 融 合 室 相 接, 则 细 胸 相 互 连 接. 此 时 31

34 再 旋 动 正 弦 幅 度 ( 即 正 弦 电 压 ) 旋 扭, 则 仪 器 上 电 压 表 指 针 随 之 升 高 和 降 低. 如 果 正 弦 电 压 过 高, 则 细 胞 连 接 速 度 加 快, 并 呈 串 珠 状, 不 利 于 两 细 胞 融 合 将 正 弦 输 出 开 关 搬 至 复 合 输 出 档, 根 据 所 需 功 率 大 小 选 拔 复 合 输 出 I 或 II 档 I 档 为 低 功 率,II 档 为 高 功 率 ; 再 根 据 实 验 要 求, 选 择 并 按 下 你 所 需 要 的 脉 冲 宽 度 拨 键 ( 分 1ms,0.2ms 0.1ms 10ms 1us 五 档 ) 和 脉 冲 幅 度 按 键 (50V 100V 150V 200V 250V 五 档 ), 还 配 有 脉 冲 幅 度 旋 扭 ( 细 调 ), 调 整 范 围 0-50V, 可 使 每 档 增 值 50V 施 加 脉 冲 刺 激 可 分 为 自 控 和 手 控 两 档, 当 使 用 自 控 输 出 脉 冲 时, 先 将 开 关 搬 向 自 控 档, 然 后 根 据 需 要 选 择 并 按 下 脉 冲 频 率 按 健 ( 分 为 2sl 次 及 每 秒 1 次 2 次 5 次 l0 次 共 五 档 ), 即 可 自 动 发 送 电 脉 冲 ; 如 果 将 开 关 搬 至 手 控 档, 需 按 动 手 控 按 扭, 每 按 动 一 次 发 送 一 个 脉 冲 无 论 自 控 或 手 控 输 出, 每 个 脉 冲 输 出 都 伴 有 报 鸣 音 响, 将 输 出 端 与 脉 冲 示 波 器 连 接, 则 可 观 察 到 由 脉 冲 宽 度 幅 度 及 脉 冲 间 隔 所 构 成 的 示 波 图 像, 当 改 变 以 上 有 关 参 数 值 时, 其 图 像 亦 发 生 变 化 : 把 开 关 搬 向 反 向, 则 产 生 负 脉 冲, 当 脉 宽 和 幅 度 等 值 不 变 时, 其 图 像 与 正 脉 冲 波 形 相 同, 但 方 面 相 反, 上 下 对 称. 将 电 缆 输 出 端 与 电 融 合 室 的 两 电 极 相 接, 并 按 上 述 要 求 发 送 一 定 方 波 脉 冲, 细 胞 受 到 电 刺 激 后, 可 产 生 融 合 2 电 融 合 操 作 植 物 原 生 质 体 融 合 (1) 开 启 电 源, 关 闭 输 出 开 关, 将 开 关 搬 向 正 弦 输 出 档, 此 时 可 根 据 实 验 需 要, 将 正 弦 额 度 选 择 在 1 1.3MHz, 脉 冲 宽 度 为 0.1ms 或 )10μs, 脉 冲 幅 度 为 150V, 脉 冲 频 率 为 1 次 /s, 并 依 次 32

35 按 下 各 标 定 按 键, 最 后 调 整 正 弦 电 压 ( 即 正 弦 幅 度 ) 旋 扭, 使 电 压 表 处 于 5-10V 处 (2) 将 电 融 合 池 内 两 电 极 距 离 调 整 成 1-1.5mm, 并 用 毛 细 吸 管 吸 取 制 备 的 原 生 质 体 悬 液 约 ml 置 融 合 池 中, 盖 上 盖 片, 注 意 在 融 合 池 中, 特 别 是 在 两 电 极 间 不 能 容 有 气 泡 (3) 净 融 合 池 置 于 显 微 镜 载 物 台 上, 并 将 两 电 极 的 精 出 端 与 仪 器 的 输 出 电 缆 接 通, 然 后 用 低 倍 镜 (10 10) 找 出 融 合 室 中 央 两 电 极 间 的 焦 面, 此 时 可 观 察 到 原 生 质 体 呈 平 均 分 布 状 态, 互 不 接 触 (4) 打 开 输 出 开 关, 原 生 质 体 在 高 频 交 流 电 场 作 用 下, 迅 速 按 电 极 垂 直 方 向 排 列, 此 时 应 控 制 正 弦 电 压 大 小, 如 果 原 生 质 体 接 触 缓 慢, 可 适 当 提 高 正 弦 电 压 : 如 果 原 生 质 体 间 接 触 过 快, 应 立 即 降 低 电 压, 否 则 相 互 接 触 的 原 生 质 体 很 快 会 连 接 成 串 珠 状 (5) 选 择 两 个 相 互 接 触 的 原 生 质 体, 并 转 向 高 倍 镜 (1OX40) 观 察 ( 图 1), 将 开 头 搬 向 复 合 输 出, 然 后 将 控 制 开 关 搬 向 自 控 档, 此 时 会 按 给 定 的 频 率 发 出 连 续 脉 冲, 每 一 脉 冲 都 伴 有 报 鸣 音 响, 两 原 生 质 体 每 接 受 一 次 脉 冲 刺 激 后, 在 视 野 中 可 观 察 到 产 生 轻 微 颤 动, 当 连 续 发 送 5-10 个 脉 冲 刺 激 后, 约 30s 内 可 观 察 到 两 原 生 质 体 接 触 点 处 的 质 膜 被 击 破 穿, 并 开 始 融 合 ( 图 2), 经 过 7 至 10 几 分 钟, 原 生 质 体 逐 步 融 合 ( 图 1), 当 融 合 的 两 细 胞 变 成 一 个 圆 球 形, 融 合 过 程 结 束 ( 图 2), 如 果 此 时 再 观 察 电 融 合 室 中 两 电 极 间 其 它 部 位, 由 于 原 生 质 体 大 小 的 不 同 决 定 其 表 面 张 力 及 其 膜 特 性 的 差 异, 可 观 察 到 有 的 已 融 合 完 毕, 有 的 正 在 融 合 之 中, 即 两 原 生 质 体 有 的 呈 哑 铃 状, 有 的 呈 长 圆 形 或 卵 圆 形 动 物 细 胞 融 合 的 融 合 方 法 及 条 件 基 本 同 上, 但 因 动 物 细 胞 的 膜 结 构 ( 特 别 是 红 细 胞 膜 ) 比 原 生 质 体 具 有 更 大 的 电 刺 激 耐 受 性, 33

36 因 此 要 造 成 细 胞 接 触 点 处 的 膜 击 穿, 需 要 适 当 加 大 脉 冲 电 压, 脉 冲 宽 度 或 增 加 刺 激 次 数, 通 常 在 做 动 物 细 融 合 时, 当 电 极 距 离 在 1-1.5mm 范 围, 可 将 脉 冲 电 压 调 到 V, 脉 冲 宽 度 调 至 0.1ms, 电 刺 激 次 数 为 次 ; 如 果 以 鸡 红 细 胞 为 融 合 材 料, 当 施 加 以 上 电 刺 激 参 数 后, 可 在 显 微 镜 下 观 察 到 很 多 的 双 按 体 细 胞 34

37 附 一 影 响 细 胞 融 合 的 因 素 一, 用 于 供 原 生 质 体 或 动 物 细 胞 悬 浮 的 介 质, 必 须 满 足 两 个 条 件 : 一 是 为 了 保 持 细 胞 的 生 物 活 性, 使 融 合 后 的 细 胞 能 继 续 存 活, 并 通 过 培 养 能 继 续 分 裂 和 分 化, 其 介 质 要 求 与 细 胞 本 身 具 有 等 渗 性 ; 二 是 为 了 保 证 融 合 之 前 所 施 加 的 各 项 电 参 数 充 分 发 挥 作 用, 其 介 质 应 具 有 高 纯 度 的 非 离 子 溶 液, 如 果 在 溶 液 中 存 在 Na + K + Ca 2+ 等 金 属 离 子 或 Cl 离 子, 将 使 介 质 的 导 电 性 增 加, 当 施 加 脉 冲 波 刺 激 时, 据 报 导, 其 总 能 量 Q 将 通 过 离 子 的 传 导 作 用 损 失 80 % 以 上, 而 直 接 通 过 细 胞, 用 于 击 穿 膜 接 触 点 使 其 细 胞 融 合 的 能 量 仅 占 10 20%, 当 有 离 子 存 在 并 使 电 脉 冲 能 量 高 度 损 失 的 情 况 下, 将 不 能 保 证 细 胞 进 行 融 合 在 介 质 中 有 金 属 离 子 存 在, 当 施 加 高 频 正 弦 波 电 场 时, 不 能 将 细 胞 极 化 成 偶 极 子, 从 而 不 能 使 细 胞 间 相 互 接 触 和 连 接, 更 谈 不 上 细 胞 间 相 互 融 合 为 了 解 决 以 上 存 在 的 问 题, 一 是 采 用 高 纯 度 的 蒸 馏 水 ( 三 蒸 水 或 四 蒸 水 ) 来 配 制 介 质, 二 是 选 用 适 当 的 非 电 介 质 溶 质. 如 甘 露 醇 山 梨 醉 或 蔗 糖 等 来 配 制 供 细 胞 悬 浮 的 等 渗 溶 液, 另 外, 在 清 洗 电 融 合 室 时, 以 要 以 高 纯 度 的 蒸 馏 水 用 毛 笔 擦 净 二 在 做 原 生 质 体 融 合 时, 其 原 生 质 体 游 离 的 状 况 对 完 全 细 胞 融 合 至 关 重 要, 游 离 出 好 的 原 生 质 体 应 具 有 折 光 性 强, 呈 饱 满 的 球 状 体, 质 膜 与 细 胞 质 无 明 显 界 限, 此 种 原 生 质 体 在 电 刺 激 下 很 易 融 合. 当 观 察 到 原 生 质 体 不 呈 现 球 状 体, 且 折 光 性 差, 呈 暗 褐 色, 细 胞 的 质 膜 部 位 有 一 层 较 厚 的 膜 状 物, 这 与 游 离 过 程 脱 壁 不 净 有 关, 此 种 原 生 质 体 在 电 刺 激 下 很 难 产 生 融 合, 如 果 继 续 加 大 各 项 电 参 数 刺 激, 则 细 胞 被 击 破 三 根 据 近 几 年 国 外 报 导, 在 细 胞 悬 液 中 加 入 链 霉 蛋 白 酶 E 35

38 (pronase E), 可 改 变 细 胞 膜 结 构, 并 增 强 膜 活 性, 按 每 毫 升 l-3mg 配 制, 能 使 细 胞 融 合 率 增 高, 我 们 利 用 0.6mol/L 的 甘 露 醇 液 配 制 成 每 毫 升 含 pronae E lmg 做 为 细 胞 悬 液, 然 后 按 每 毫 升 含 红 细 胞 个, 在 37 下 温 育 30min, 然 后 按 原 定 各 项 电 参 数 进 行 电 融 合, 通 常 以 GXN 液 作 为 稀 释 剂, 一 般 使 用 浓 度 都 在 50% 左 右, 对 细 胞 的 毒 性 作 用 较 大, 虽 然 在 融 合 后 马 上 进 行 洗 涤, 但 融 合 后 经 过 培 养 阶 段, 融 合 细 胞 的 存 活 率 仍 然 很 低. 我 们 的 实 验 证 明, 如 果 在 0.6mol/L 的 甘 露 醇 作 溶 剂, 配 制 成 6%--8% 的 PEG(Mw=000) 作 为 细 胞 悬 液, 再 按 上 述 条 件 进 行 电 融 合 实 验, 其 融 合 速 度 和 融 合 事 与 不 加 PEG 相 比 都 有 提 高. 36

39 附 二 利 用 聚 乙 二 醇 (polycthyleneglycol, 简 称 PEG) 为 媒 介 物 进 行 细 胞 融 合 一 实 验 目 和 的 原 理 掌 握 利 用 聚 乙 二 醇 为 介 导 物 对 各 类 细 胞 的 融 合 方 法. 当 前 普 遍 认 为 聚 乙 二 醇 分 子 能 改 变 各 类 细 胞 的 腆 结 构, 使 两 细 胞 接 触 点 处 质 膜 的 脂 类 分 子 发 生 疏 散 和 重 组, 由 于 两 细 胞 接 口 处 双 分 子 层 质 膜 的 相 互 亲 和 以 及 彼 此 的 表 面 张 力 作 用, 使 细 胞 发 生 融 合 二 溶 液 配 制 1 Alsver 液 ( 同 前 ) % 生 理 盐 水 液 3,GXN 液 NaC l8g KCl0.4g Na2lOP04 2H201.77g NaH2P04 H2O0.69g, 葡 萄 糟 2g, 酚 红 (phenolrad)0.01g, 溶 于 1000ml 重 蒸 水 中 4 50%PEG 液 实 验 前 临 时 配 制, 根 据 需 要 称 取 定 量 PEG(Mw=4000), 放 入 刻 度 试 管 或 刻 度 离 心 管 内, 在 沸 水 浴 中 加 热, 使 其 熔 化, 如 做 细 胞 培 养 融 合 实 验, 可 用 高 压 蒸 汽 灭 菌 30min, 待 冷 却 至 50 时, 加 入 预 热 至 50 等 体 积 的 GKN 液, 混 匀 三 融 合 方 法 1 取 制 备 的 鸡 红 细 胞 ( 制 备 方 法 同 前 ) 悬 液 lml, 加 入 4min0.85 % 生 理 盐 水, 混 匀 后 以 r/min 离 心 5min, 去 上 清 液 后. 再 以 上 述 条 件 离 心 洗 涤 两 次 (5min 10min), 如 果 采 用 各 种 瘤 细 胞, 只 将 洗 涤 液 改 为 0.9 的 生 理 盐 水, 其 它 条 件 同 上 2 将 最 后 一 次 离 心 沉 降 的 鸡 虹 细 胞 或 有 关 瘤 细 胞 ( 去 上 清 液 ) 加 入 2 3mlGKN 液, 混 匀 后 待 用 37

40 3 取 以 上 悬 液, 用 血 细 胞 计 数 法 计 数, 再 以 GKN 液 将 鸡 红 细 胞 稀 释 成 每 毫 升 含 个, 瘤 细 胞 每 毫 升 含 1.5 l0 5 个 4 如 做 同 种 细 胞 间 融 合, 可 取 有 关 细 胞 悬 液 1ml, 加 入 50% 的 PEG 液 混 匀, 置 于 30 水 浴 内 温 育 lo-15min; 如 采 用 异 种 细 胞 融 合 ( 如 鸡 红 细 胞 与 腹 水 瘤 细 胞 ), 可 分 别 取 0.5ml, 再 加 入 0.5miGKN 液 一 起 混 匀, 其 它 步 骤 同 上 5 用 吸 管 或 移 液 器 吸 取 以 上 细 胞 悬 液 ml, 滴 在 薄 底 小 培 养 皿 中, 利 用 倒 置 显 微 镜 进 行 观 察 四 结 果 在 倒 置 显 微 镜 下 可 观 察 到 由 同 种 细 胞 融 合 形 成 的 细 胞, 称 为 同 核 体 (homokaryons), 利 用 不 同 亲 本 的 不 同 细 胞 彼 此 融 合 所 形 成 的 细 胞, 称 为 异 核 体 (heterokaryons), 还 可 观 察 到 3 个 以 上 细 胞 融 合 在 一 起 的 合 胞 体 细 胞 融 合 率 系 指 在 显 微 镜 的 视 野 内, 已 发 生 融 合 的 细 胞 其 细 胞 核 总 数 与 该 视 野 内 所 有 细 胞 ( 包 括 已 融 合 的 细 胞 ) 的 细 胞 核 总 数 之 比, 称 为 融 合 率, 通 常 以 百 分 比 表 示, 而 且 要 进 行 多 个 视 野 测 定, 再 加 以 平 均 统 计, 更 为 准 确 作 业 思 考 题 1 绘 图 表 示 所 观 察 到 的 融 合 细 胞. 2 请 写 出 细 胞 电 融 合 的 注 意 事 项. 1 说 明 细 胞 电 融 合 的 原 理. 2 在 细 胞 电 融 合 中, 设 对 细 胞 产 生 可 逆 性 电 击 穿 的 总 能 量 为 Q, 如 何 理 解 各 项 电 参 数 之 间 及 其 与 Q 值 的 关 系? 38

41 综 合 大 实 验 一 石 蜡 切 片 法 目 的 要 求 了 解 石 蜡 切 片 法 的 整 个 过 程, 初 步 掌 撑 石 蜡 切 片 技 术 材 料 及 用 具 ( 一 ) 材 料 : 选 择 适 用 于 石 蜡 切 片 的 根, 茎 叶 芽 子 房 花 药 做 材 料 ( 二 ) 用 具 : 恒 温 箱 弓 字 板 镊 子 刀 片 解 剖 刀, 切 片 机 切 片 刀, 毛 笔 牛 皮 纸 染 色 缸 培 养 皿 石 蜡 熔 点 (51 54C) 载 玻 片 盖 玻 片 ( 三 ) 药 品 : 固 定 剂 各 级 浓 度 酒 精 二 甲 苯 l% 番 红 水 溶 液 半 自 动 显 微 镜 技 术 0.2%~0.5% 亮 绿 精 液 0.5% 苏 木 清 液 2% 铁 明 矾 液, 粘 贴 剂, 中 性 树 胶 等 操 作 过 程 1 取 材 : 切 取 新 鲜 材 料 数 段, 每 段 3-4 毫 米 : 2 固 定 : 用 于 观 察 组 织 的 材 料, 入 FAA 液 固 定 24 小 时, 用 于 观 察 细 胞 分 裂 的 材 料, 入 桑 弗 利 斯 固 定 24 小 时 ; 3 冲 洗 : 用 FAA 固 定 的 材 料, 用 70% 酒 精 洗 3 次, 每 次 2 小 时, 用 桑 弗 利 斯 固 定 的 材 料, 用 流 水 冲 洗 24 小 时, 然 后 经 30% 50% 70%, 的 酒 精 中 脱 水, 每 级 半 小 时 至 1 时 4 脱 水 : 材 料 经 80% 95% 100% 纯 酒 糟 中, 继 续 脱 水, 每 级 半 小 时 至 1 小 时 1 5 透 明 : 入 纯 酒 精 + 1 二 甲 苯 + 二 甲 苯, 每 级 半 小 时 至 2 小 2 2 时 6 浸 蜡 : 已 透 明 材 料 1 二 甲 苯 + 1 石 蜡, 在 35 左 右 的 室

42 温 中 浸 蜡 1-2 天, 然 后 移 入 纯 石 蜡 中 ( 放 入 56 恒 温 箱 内 ) 每 隔 半 小 时 更 换 纯 蜡 一 次, 约 换 纯 虹 2-3 次, 即 可 进 行 包 埋 7 包 埋 : 先 用 牛 皮 纸 折 成 适 当 大 小 的 纸 盘, 放 在 用 酒 精 灯 加 热 的 弓 字 板 上, 然 后 从 温 箱 中 取 出 盛 有 石 蜡 和 材 料 的 小 杯, 放 在 弓 字 板 上, 同 时 从 温 箱 中 取 出 已 熔 解 的 石 蜡, 迅 速 倒 入 纸 盒 里, 并 将 石 蜡 杯 放 回 温 箱, 将 熔 解 的 石 蜡 保 存 备 用, 再 用 烤 热 的 镊 子 将 材 料 从 小 杯 中 移 入 纸 盒 内, 并 使 材 料 间 隔 开 来, 排 列 整 齐, 然 后 将 纸 盒 轻 轻 放 入 冷 水 中, 待 表 面 石 蜡 凝 结 后, 将 纸 盒 沉 入 水 中, 约 20 分 钟 后, 取 出 撕 去 纸 盒, 将 蜡 块 保 存 8 切 片 : 先 将 蜡 块 沿 两 个 材 料 之 间 切 开, 并 将 带 材 料 的 小 蜡 块, 根 据 切 片 的 方 向, 修 整 成 矩 形, 然 后 用 荡 片 器 将 小 蜡 块 固 着 在 小 木 块 上, 用 旋 转 切 片 机 将 蜡 块 切 成 连 续 的 蜡 带, 其 厚 度 为 微 米, 将 蜡 带 放 在 黑 色 蜡 光 纸 上, 使 蜡 带 正 面 朝 上 9 粘 片 : 在 洁 净 的 载 玻 片 上, 滴 上 一 层 粘 片 剂, 将 分 割 的 蜡 片, 浮 载 于 粘 片 剂 上 ( 使 反 面 朝 下 ), 置 温 台 上 加 热, 使 蜡 片 平 展, 然 后 吸 去 多 余 的 粘 片 剂, 将 蜡 片 排 列 整 齐, 把 载 玻 片 平 放 木 板 上, 放 入 30 的 温 箱 中 烘 片 2 小 时 10 染 色 : 任 选 一 种 进 行 甲 : 用 番 红 与 亮 绿 染 色 法 (1) 切 片 入 二 甲 苯 中, 约 10 分 钟 左 右, 使 石 蜡 完 全 溶 去 ; (2) 入 纯 酒 精 与 二 甲 苯 等 量 混 合 液 中 5 分 钟 : (3) 经 100%,95%,70%,50% 酒 精 下 降 到 水 ; (4) 用 I% 番 红 水 溶 液 染 色 2-12 小 时 : (5) 用 水 洗 去 多 余 染 液 ; (6) 脱 水 : 经 50% 酒 精 一 70% 酒 精, 各 5 分 钟 : (7) 用 0.2% 亮 绿 染 色 2-3 分 钟 ; 40

43 二 半 自 动 显 微 镜 摄 影 技 术 目 的 要 求 了 解 半 自 动 显 微 摄 影 机 的 基 本 结 构, 学 会 显 微 摄 影 的 操 作 方 法 材 料 与 工 具 ( 一 ) 材 料 : 动 植 物 切 片 标 本 ( 二 ) 用 具 : 显 微 镜 旁 视 式 显 微 摄 影 装 置,EMM-7 型 光 电 测 光 表 电 压 调 节 器 实 验 内 容 ( 一 ) 黑 白 胶 卷 显 微 摄 影 的 操 作 步 骤 1 打 开 电 压 调 节 器 电 源 开 关, 调 节 电 源 电 压, 使 光 线 强 度 适 当 ; 2 将 切 片 标 本 置 于 载 物 台 上, 进 行 显 微 镜 调 焦 使 物 象 清 晰 ; 3 将 显 微 镜 光 路 选 择 杆 拔 至 绿 档 (CV), 使 光 源 的 80% 的 光 线 进 入 显 微 摄 影 装 置,20% 的 光 线 进 入 目 镜 供 观 察 : 4 旋 转 聚 焦 望 远 镜 的 视 力 较 正 环, 使 谓 焦 标 志 双 十 字 线 清 晰, 然 后 调 节 显 微 镜 粗 细 调 焦 螺 旋, 使 标 本 观 察 清 晰, 井 根 据 摄 影 框, 移 动 标 本, 选 择 摄 影 范 围 5 将 显 微 镜 摄 影 机 的 光 路 选 择 标 拔 至 黄 档 (E), 应 用 光 电 测 光 表 进 行 曝 光 测 试, 测 定 其 曝 光 时 间 (1) 将 光 电 信 增 管 (EM) 插 入 显 微 摄 影 机 的 镜 筒 内 ; (2) 根 据 胶 卷 的 感 光 度 调 整 感 光 度 调 节 钮 (ASASPEED), 使 其 与 胶 卷 感 光 度 相 符, 如 胶 卷 感 光 度 为 GB21, 则 将 感 光 调 节 钮 调 至 100ASA( 与 GB21 相 等 ) 41

44 (3) 打 开 测 光 表 电 源 钮, 使 电 源 开 关 指 示 对 着 HIGH 档, 进 行 曝 光 测 试 ; 若 光 线 太 弱 HIGH 档 无 法 测 出 时, 再 将 电 源 开 关 指 示 对 着 LOW 档 (4) 根 据 电 源 开 关 指 示 的 位 置 (HIGH 或 LOW) 和 测 光 看 指 针 所 指 位 置, 读 出 曝 光 时 间, 即 为 该 光 线 强 度 下, 进 行 显 微 摄 影 的 曝 光 时 间 (5) 将 显 微 影 机 光 路 选 择 杆 拔 至 绿 档 (CV) 6 调 整 显 微 镜 投 影 机 曝 光 时 间 档 次, 使 之 与 所 测 的 曝 光 时 间 相 符, 若 曝 光 时 间 在 1 秒 以 上, 则 将 曝 光 时 间 看 调 至 B 门, 曝 光 时 间 可 人 为 控 制 7 打 开 摄 影 机 暗 盒, 上 胶 卷, 按 一 下 卷 片 钮, 旋 转 眷 片 钮, 上 好 胶 卷, 关 上 暗 盒, 再 按 一 下 卷 片 钮, 旋 转 卷 片 钮 到 位. 8 上 快 门, 按 快 门 线, 胶 卷 曝 光 ( 二 ) 彩 色 胶 卷 的 垦 微 摄 影 操 作 步 骤 1 4 步 骤 与 黑 白 胶 卷 显 微 摄 影 操 作 步 骤 相 同 ; 5 将 显 微 镜 摄 影 机 的 光 路 选 择 杆 拔 至 黄 档 (E) 应 用 光 电 测 光 看 进 行 色 温 测 试, 测 定 出 与 彩 色 胶 卷 色 温 相 适 应 的 色 温 来 (1) 将 光 借 倍 增 (CT) 插 入 显 微 摄 影 机 的 镜 筒 内 (2) 根 据 胶 卷 的 色 温 调 整 曝 光 表 的 色 温 钮, 使 其 与 胶 卷 的 色 温 相 符, 如 胶 卷 色 温 为 日 光 型, 则 将 色 温 钮 调 至 D.TYPE, 中 央 指 示 点, 如 胶 卷 色 温 为 灯 光 型, 则 将 色 温 钮 谓 至 T.TYPE 中 央 指 示 点 (3) 打 开 测 光 表 电 源, 将 电 源 开 关 旋 至 CT, 进 行 色 温 测 试, 如 若 指 针 向 CTR 红 的 方 向 移 动, 则 光 潭 韵 光 线 色 温 偏 低, 则 可 调 整 电 源 电 压, 或 加 用 色 温 滤 色 片 LB45, 使 其 光 源 色 温 升 高, 使 指 针 回 到 零 位 : 如 若 指 针 向 CTR 蓝 的 方 向 移 动, 则 光 源 的 色 温 过 高, 则 可 降 低 光 源 电 压. 或 加 用 色 温 片 LBD, 使 其 光 源 色 降 低, 使 指 针 42

45 回 到 零 单, 因 零 位 是 胶 卷 要 求 的 正 确 色 温 5 待 色 温 调 准 后, 再 按 黑 白 胶 卷 步 骤 依 次 进 行 注 意 事 项 1 对 标 本 进 行 显 微 调 焦 时, 应 先 将 载 物 台 移 动 至 标 本 接 近 镜 头, 然 后 再 调 节 调 焦 螺 旋 钮, 使 载 物 台 慢 慢 台 向 下 移 动, 使 标 本 谓 至 清 晰, 以 防 损 坏 镜 头 或 镜 片 2 聚 焦 望 远 镜 中 的 双 十 字 线 和 被 摄 标 本 图 像 一 定 要 调 节 清 晰 3 测 色 温 时 使 用 的 光 电 倍 增 管 是 CT, 测 曝 光 时 间 使 用 的 光 电 倍 增 管 是 EM 4 测 色 温 测 曝 光 时 间 摄 影 机 上 的 光 路 选 择 杆 应 拔 至 黄 档 (E), 照 相 时 应 拔 至 绿 档 (CV) 5 目 镜 和 调 焦 望 远 镜 在 观 察 后 应 勤 盖 镜 头 盖, 以 防 镜 头 污 染 6 胶 卷 照 完 后, 应 先 按 倒 片 钮, 再 进 行 倒 片 43

46 三 全 自 动 显 微 照 相 技 术 目 的 要 求 了 解 全 自 动 显 微 照 相 的 结 构 原 理, 学 会 显 微 镜 摄 影 的 操 作 材 料 与 用 具 材 料 : 取 镜 片 ( 动 植 物 材 料 ) 为 摄 影 对 象,135 胶 片 : 用 具 : 显 微 镜 PM--10AD 型 全 自 动 式 显 微 照 相 装 置. 实 验 内 容 和 步 骤 ( 一 ) 显 微 照 相 设 备 (1)PM--10AD 型 全 自 动 皇 微 照 相 机 装 置 及 附 件 (2) 自 动 曝 光 控 制 装 置 ( 二 ) 摄 影 前 的 准 备 工 作 I 照 相 装 置 检 查 (1) 曝 光 体 的 光 程 转 柄 换 处 于 OE 绿 带 处 ; (2) 摄 影 方 式 转 换 盘 处 于 自 动 处 AUTO; (3)ASA 感 光 度 处 于 胶 片 感 度 的 相 应 位 置 处 ; (4) 曝 光 警 告 灯 呈 黄 色 亮 点 : (5) 轻 按 曝 按 钮, 快 门 灯 亮 ; (6) 当 快 门 关 上 时, 快 门 灯 熄 灭, 接 着 进 行 卷 片, 同 时 相 机 指 示 灯 亮, 这 时 听 到 电 动 机 轻 轻 动 作 声 2 上 胶 卷 (1) 把 反 卷 钮 上 拉, 打 开 后 盖 ; (2) 把 胶 片 暗 盒 放 入 暗 盒 室 里, 把 反 卷 钮 自 封 回 到 原 来 位 置 上 ; (3) 把 胶 片 头 拉 出, 插 入 反 卷 卷 轴 槽 内 (4) 胶 卷 片 钮, 直 至 胶 片 两 边 孔 跟 入 齿, 盖 上 后 盖 (5) 按 卷 片 钮, 使 胶 片 计 数 器 上 出 现 1 数 字 44

47 ( 三 ) 操 作 步 骤 1 35mm 黑 白 胶 片 摄 影 法 (1) 将 摄 影 方 式 放 在 AUTO 位 置 上 ; (2) 把 胶 片 尺 寸 35 按 下 ; (3) 把 胶 片 感 光 度 钮 调 至 胶 片 感 光 度 的 指 数 上 : (4) 把 胶 片 特 性 补 偿 盘 调 节 在 标 准 位 置 上 ; (5) 确 定 警 告 灯 为 绿 色 ; 如 为 红 灯 闪 烁, 可 加 ND 滤 光 片, 以 降 低 亮 度 ; 如 为 红 灯 亮, 则 增 加 照 明 亮 度 ; (6) 调 节 标 本 分 布 曝 光 补 偿 钮 处 于 标 准 位 置 1 上 ; (7) 按 下 曝 光 按 钮, 进 行 摄 影 ; (8) 胶 片 照 完, 卷 片 电 动 器 会 停 止 ; 胶 片 用 完 显 示 灯 亮, 并 发 出 警 告 声, 取 出 胶 卷 后, 警 告 声 消 除 ; (9) 拉 起 反 卷 轴, 顺 时 方 向 旋 转, 使 胶 片 退 回 暗 盒 中, 胶 片 退 完, 转 轴 旋 转 就 会 突 然 变 轻 ; (10) 打 开 后 盖, 取 出 胶 卷 ; 2 35mm 彩 色 胶 片 摄 影 方 法 彩 色 摄 影 与 黑 白 胶 卷 摄 影 顺 序 一 样, 所 不 同 的 需 要 对 照 明 的 色 温 进 行 调 节, 以 适 应 胶 片 指 定 颜 色 的 色 温, 调 节 灯 光 色 温 可 用 色 温 计 (PM--CTR), 其 步 骤 如 (1) 标 本 对 焦 后, 移 动 标 本, 把 透 明 区 移 入 视 场 内 (2) 把 自 动 曝 光 体 拉 至 黄 带 ; (3) 根 据 胶 卷 类 型, 调 节 好 色 温 刻 度 盘 标 记 ; 日 光 型 对 准 D 灯 光 型 对 准 T (4) 调 节 照 明 电 压, 使 数 字 指 示 器, 中 间 黄 色 1 标 记 点 亮, 如 45

48 上 侧 绿 色 部 分 点 亮, 则 照 明 色 温 过 高, 如 下 侧 红 色 部 分 点 亮, 则 照 明 色 温 过 低, 可 调 节 色 温 器, 以 达 到 黄 色 1 标 记 点 亮 : (5) 将 自 动 曝 光 体 光 程 移 到 CVE 绿 带 位 置 ; 其 余 操 作 按 35mm 黑 白 胶 片 摄 影 操 作 46

49 四 暗 室 技 术 一 印 相 与 放 大 目 的 要 求 : 初 步 学 会 配 置 显 影 液 定 影 液, 印 相 与 放 大, 以 及 正 确 使 用 暗 定 等 基 本 技 能 材 料 与 用 具 ( 一 ) 材 料 2 号 光 面 印 相 纸 ;3 号 光 面 放 大 纸 ; 底 片 :D 72 显 影 液 ; 常 用 酸 性 定 影 液 ( 三 ) 用 具 : 放 大 机 印 相 机 暗 房 安 全 灯 上 光 机 竹 夹 冲 洗 盘 等 实 验 内 容 与 步 骤 印 相 与 放 大. 以 及 正 确 使 用 暗 室 等 基 本 技 能 : ( 一 ) 做 好 印 相 与 放 大 前 的 准 备 工 作 : 清 洗 干 净 冲 洗 盆, 擦 净 印 相 机 上 的 玻 璃 纹, 把 D 72 显 影 液 原 液 一 份 与 二 份 水 稀 释 使 用, 将 显 影 液 停 影 液 定 影 液 分 别 倒 入 三 个 冲 诜 盆 ( 二 ) 关 好 白 灯, 开 虹 灯 ( 暗 室 安 全 灯 ) ( 三 ) 切 割 印 相 纸 及 放 大 纸, 印 相 纸 大 小 稍 比 底 片 大 半 公 分, 放 大 纸 大 小 根 据 需 要 比 底 片 大 3~5 倍, 切 好 后 放 入 暗 房 袋 中 备 用 ( 四 ) 印 相 1, 选 好 底 片, 放 在 印 相 箱 玻 璃 板 上, 使 药 物 面 朝 上, 将 相 框 放 上 定 好 位, 然 后 将 相 纸 的 药 物 面 朝 下, 与 底 片 紧 贴, 盖 上 箱 盖 ; 2 将 曝 光 后 的 相 纸, 投 入 显 影 液 中, 进 行 显 影, 到 显 影 适 度 时, 立 即 用 木 夹 取 出, 投 入 停 影 液 中, 稍 停, 取 出 投 入 定 影 液 中, 定 影 约 15 分 钟, 显 影 定 影 时 要 经 常 移 动 相 纸, 使 药 液 作 用 均 匀 3 将 定 影 后 相 纸 投 入 流 水 中 漂 洗 半 小 时 47

50 4 捞 取 相 片, 稍 干 后 贴 在 上 光 机 上 光 板 上, 压 上 粗 布, 用 橡 皮 滚 筒 压 滚 后, 接 上 电 源 加 热, 待 相 片 干 后, 自 行 脱 落 5 切 割 整 齐, 即 得 一 张 完 好 的 相 片 ( 五 ) 放 大 1 选 好 底 片. 放 入 玻 璃 片 夹 之 间, 使 感 光 药 面 朝 下, 移 动 相 框 将 放 大 部 分 定 好 位. 然 后 插 入 放 大 机 中, 压 下 锁 紧, 使 底 片 压 紧 2 根 据 需 要 选 择 好 镜 头 (50mm 或 75mm), 将 镜 推 入 光 路 中 ; 3 打 开 曝 光 定 时 稳 压 器, 使 电 压 调 至 200 伏 ; 然 后 打 开 放 大 机 的 开 关 钮, 点 亮 放 大 机 灯 泡 4 旋 松 锁 柄 钮, 拉 下 镜 头 架. 使 镜 头 架 下 沿 停 在 需 要 放 大 倍 数 的 数 值, 如 放 大 3 倍, 则 停 在 标 尺 的 3 字 上 ; 5 用 调 焦 器 进 行 谓 焦, 调 节 好 光 圈 大 小, 放 好 放 大 尺 板 位 置 6 将 红 色 滤 光 片 移 入 光 程 中, 确 定 曝 光 时 间, 将 放 大 纸 放 在 放 大 尺 扳 上, 用 尺 板 压 边 力 将 定 时 按 钮 上 拔, 放 大 机 灯 泡 熄 灭. 然 后 将 滤 光 片 偏 离 光 程 7 按 下 曝 光 钮, 进 行 曝 光, 曝 光 后, 将 放 大 纸 迅 速 投 入 显 檄 液 进 行 显 影 ; 以 后 的 步 骤 与 印 相 部 分 的 2~5 步 骤 相 同. 为 了 要 使 放 大 易 于 成 功, 最 好 先 进 行 五 级 曝 光 试 验, 找 到 准 确 曝 光 时 间, 再 进 行 正 式 放 大 作 业 交 一 张 印 好 的 相 片 及 放 大 相 片 ( 相 背 后 注 明 曝 光 时 间, 光 圈 大 小, 姓 名 等 48