本 课 题 为 苏 州 市 科 技 局 应 用 基 础 研 究 计 划 (No:YJS0930) 香 港 保 健 协 会 资 助 项 目 (No: ,HK) 导 师 : 顾 振 纶 教 授 指 导 小 组 : 谢 梅 林 教 授 赵 笑 东 主 任 郭 次 仪 教 授 蒋 小 岗

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1 硕 士 学 位 论 文 (2011 届 ) 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 Therapeutic Effect of Tiaozhi granules on Hyperlipidemic Fatty Liver and Its Mechanisms in Rats 研 究 生 姓 名 指 导 教 师 姓 名 专 业 名 称 研 究 方 向 论 文 提 交 日 期 丁 爽 顾 振 纶 谢 梅 林 药 理 学 调 脂 药 物 药 理 学 2011 年 4 月

2 本 课 题 为 苏 州 市 科 技 局 应 用 基 础 研 究 计 划 (No:YJS0930) 香 港 保 健 协 会 资 助 项 目 (No: ,HK) 导 师 : 顾 振 纶 教 授 指 导 小 组 : 谢 梅 林 教 授 赵 笑 东 主 任 郭 次 仪 教 授 蒋 小 岗 副 教 授 钱 培 刚 博 士

3 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 中 文 摘 要 中 文 摘 要 目 的 : 研 究 调 脂 颗 粒 (Tiaozhi granules) 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 可 能 的 作 用 机 制 方 法 : 采 用 脂 肪 乳 剂 灌 胃 的 方 法 建 立 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 模 型, 观 察 调 脂 颗 粒 对 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 脂 质 水 平 肝 功 能 和 抗 氧 化 能 力 的 影 响 ; 光 镜 和 透 射 电 镜 观 察 肝 组 织 脂 肪 变 性 程 度 和 超 微 结 构 改 变 ;RT-PCR 和 Western blot 方 法 检 测 肝 组 织 中 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 α/γ(pparα/γ) 胆 固 醇 7α- 羟 化 酶 (CYP7A1) 清 道 夫 受 体 B1(SR-B1)mRNA 和 蛋 白 以 及 肝 型 脂 肪 酸 结 合 蛋 白 (L-FABP) 二 酰 基 甘 油 酰 基 转 移 酶 (DGAT) 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 1c/2(SREBP-1c/2) 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 (LDLR)mRNA 表 达 的 变 化 结 果 : 调 脂 颗 粒 g/kg 治 疗 6 周 后, 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 的 肝 重 系 数 血 清 TC TG FFA LDL-C AST ALT MDA 以 及 肝 组 织 中 TC TG FFA 和 MDA 含 量 显 著 降 低 (P<0.05 或 P<0.01), 血 清 HDL-C 及 GSH 水 平 肝 组 织 中 SOD 和 GSH 水 平 明 显 升 高 (P<0.01), 并 有 一 定 的 剂 量 依 赖 趋 势 光 镜 和 电 镜 观 察 结 果 显 示, 经 调 脂 颗 粒 治 疗 的 大 鼠 肝 细 胞 脂 肪 变 性 程 度 明 显 减 轻 (P<0.01) RT-PCR 结 果 显 示, 调 脂 颗 粒 可 明 显 上 调 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 肝 组 织 中 PPARα/γ L-FABP CYP7A1 和 SR-B1mRNA 的 表 达 (P<0.05 或 P<0.01), 下 调 SREBP-1c/2 DGAT 和 LDLR mrna 的 表 达 (P<0.01) Western blot 结 果 显 示, 调 脂 颗 粒 可 明 显 上 调 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 肝 组 织 中 PPARα/γ CYP7A1 和 SR-B1 蛋 白 的 表 达 (P<0.01) 结 论 : 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 有 一 定 的 治 疗 作 用, 其 作 用 机 制 可 能 与 通 过 激 活 PPARα/γ 的 表 达, 抑 制 SREBP-1c/2 表 达, 进 而 调 节 下 游 靶 基 因 CYP7A1 SR-B1 L-FABP DGAT LDLR 的 表 达 以 及 增 强 机 体 的 抗 氧 化 能 力 有 关 关 键 词 : 调 脂 颗 粒 ; 高 脂 性 脂 肪 肝 ; 作 用 机 制 ; 大 鼠 研 究 生 : 丁 爽 导 师 : 顾 振 纶 教 授 赵 笑 东 主 任 谢 梅 林 教 授 郭 次 仪 教 授 I

4 英 文 摘 要 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 Therapeutic Effect of Tiaozhi granules on Hyperlipidemic Fatty Liver and Its Mechanisms in Rats Abstract Objective: To study the therapeutic effect and its possible mechanisms of Tiaozhi granules on hyperlipidemic fatty liver in rats. Methods: Rat model with hyperlipidemic fatty liver was established by feeding the rats with fatty milk. Then effects of tiaozhi granules on lipid level, liver function and antioxidative index in hyperlipidemic fatty liver were observed respectively. Histopathological changes of rat liver and ultrastructure were observed under light and electron microscopy. The expressions of peroxisome proliferator-activated receptor α/γ (PPARα/γ), cholesterol 7α-hydroxylase (CYP7A1), scavenger receptor B1(SR-B1) mrna and protein, liver fatty acid-binding protein ( L-FABP ), diacylglycerol acyltransferase (DGAT), sterol regulatory element binding protein 1c/2 (SREBP-1c/2) and low density lipoprotein receptor (LDLR) mrna were inspected by RT-PCR and Western-blot methods, respectively. Results: After treatment with tiaozhi granules g/kg for 6 weeks, the coefficient of hepatic weight, serum TC TG FFA LDL-C AST ALT MDA and hepatic TG, TC, FFA and MDA levels were significantly decreased(p<0.05 or P<0.01), while the serum levels of HDL-C and GSH and the hepatic levels of SOD and GSH were obviously increased(p<0.01)with a certain trend of dose-dependence, and under light and electron microscopy the degree of hepatocyte steatosis was lessened to a large extent (P<0.01). According to the results of RT-PCR, tiaozhi granules could significantly increase the PPARα/γ, L-FABP, CYP7A1 and SR-B1mRNA expressions (P<0.05 or P<0.01), and decrease the SREBP-1c/2 DGAT and LDLR mrna expressions in hepatic tissue in hyperlipidemic fatty liver rats(p<0.01). Tiaozhi granules could also increase the hepatic PPARα/γ, CYP7A1 and SR-B1 protein expressions in hyperlipidemic fatty liver rats(p<0.01). Conclusion: Tiaozhi granules have certain therapeutic effect on hyperlipidemic fatty liver in rats, and the mechanism might be related to its ability to regulate the II

5 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 英 文 摘 要 CYP7A1, SR-B1, L-FABP, DGAT, and LDLR expressions via activating the PPARα/γ and subsequently inhibiting SREBP-1c/2 expression, and to enhance antioxidation. Key words: Tiaozhi granules; Hyperlipidemic fatty liver; Mechanisms ; Rats Written by:ding Shuang Supervised by:prof. Gu Zhen-lun Prof. Xie Mei-lin Dr. Zhao Xiao-dong Pror. Kwok Chi-yi III

6 目 录 前 言 1 第 一 部 分 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 治 疗 作 用 的 研 究 6 第 二 部 分 调 脂 颗 粒 对 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 肝 中 脂 代 谢 相 关 基 因 及 蛋 白 表 达 的 影 响 20 讨 论 41 结 论 47 参 考 文 献 48 综 述 54 攻 读 硕 士 学 位 期 间 发 表 的 文 章 62 中 英 文 缩 略 词 表 63 致 谢 64

7 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 前 言 前 言 一 研 究 背 景 脂 肪 肝 (fatty liver) 是 一 种 由 多 种 原 因 引 起 的 肝 脏 脂 肪 代 谢 紊 乱, 根 据 病 因 的 不 同, 临 床 上 将 脂 肪 肝 分 为 酒 精 性 脂 肪 肝 病 (alcoholic fatty liver disease, AFLD) 和 非 酒 精 性 脂 肪 肝 病 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) NAFLD 是 一 种 除 外 酒 精 和 其 它 明 确 损 肝 因 素 所 致 的 以 弥 漫 性 肝 细 胞 大 泡 性 脂 肪 变 为 主 要 特 征 的 肝 脏 病 变, 包 括 单 纯 性 脂 肪 肝 及 其 演 变 的 脂 肪 性 肝 炎 和 肝 硬 化 [1] 在 我 国, 随 着 人 们 经 济 水 平 的 提 高 生 活 习 惯 和 饮 食 结 构 的 改 变, 近 年 来 NAFLD 已 成 为 病 毒 性 肝 炎 以 外 最 常 见 的 慢 性 肝 脏 疾 病 虽 然 脂 肪 肝 被 认 为 是 良 性 病 变, 但 它 是 许 多 慢 性 肝 脏 疾 病 的 早 期 阶 段,17% 的 NAFLD 在 5-10 年 内 发 展 为 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 炎 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH), 后 者 年 内 肝 硬 化 的 发 生 率 为 15%-25%,30%-40% 的 肝 硬 化 患 者 多 于 起 病 后 10 年 左 右 死 于 肝 癌 肝 衰 竭 或 肝 移 植 术 后 复 发 [2-4] 更 为 危 险 的 是, 肝 脏 疾 病 并 非 脂 肪 肝 患 者 主 要 的 致 死 原 因, 由 代 谢 紊 乱 引 起 的 心 脑 血 管 疾 病 才 是 主 要 的 威 胁 所 在 [5] 对 脂 肪 肝 若 能 早 期 发 现 并 及 时 治 疗, 可 阻 止 其 发 展 并 有 可 能 使 其 逆 转 1.NAFLD 的 发 病 机 制 NAFLD 是 一 种 遗 传 环 境 代 谢 应 激 相 关 性 疾 病, 其 发 病 机 制 至 今 尚 末 阐 明 目 前 认 为,NAFLD 最 常 见 的 3 个 相 关 因 素 为 肥 胖 血 脂 紊 乱 和 Ⅱ 型 糖 尿 病, 与 高 血 压 病 动 脉 粥 样 硬 化 冠 心 病 等 均 属 于 代 谢 综 合 征 的 范 畴, 其 共 同 土 壤 是 胰 岛 素 抵 抗 (insulin resistance, IR) [6-8] IR 是 指 机 体 需 要 超 常 量 的 胰 岛 素 才 能 引 起 正 常 量 反 应 的 一 种 状 态, 即 胰 岛 素 的 靶 组 织 器 官 ( 肝 脏 肌 肉 脂 肪 组 织 ) 对 胰 岛 素 的 反 应 性 敏 感 降 低 受 损 或 丧 失 而 产 生 的 一 系 列 病 理 变 化 和 临 床 症 状 肥 胖 Ⅱ 型 糖 尿 病 脂 代 谢 紊 乱 等 均 可 导 致 IR [9-10] Day 和 James 等 在 1998 年 提 出 NAFLD 发 病 机 制 的 二 次 打 击 学 说 目 前 已 被 广 泛 接 受 存 在 IR 时 外 周 脂 肪 的 分 解 受 到 抑 制, 游 离 脂 肪 酸 (free fatty acid, FFA) 含 量 升 高, 干 扰 胰 岛 素 受 体 或 受 体 后 水 平 的 信 号 转 导, 脂 肪 酸 的 合 成 进 一 步 1

8 前 言 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 增 加, 进 而 加 重 IR, 形 成 一 个 病 理 情 形 下 的 正 反 馈 调 节, 导 致 肝 细 胞 内 脂 肪 沉 积 和 脂 肪 变 性, 引 发 单 纯 性 脂 肪 肝 的 发 生 [11-12], 并 使 肝 脏 对 炎 症 反 应 和 各 种 损 伤 因 素 的 易 感 性 增 高, 成 为 NAFLD 发 病 中 的 首 次 打 击 氧 化 应 激 脂 质 过 氧 化 以 及 炎 症 因 子 的 释 放 线 粒 体 功 能 异 常 等 因 素 作 为 二 次 打 击, 诱 导 脂 肪 变 性 的 肝 脏 进 一 步 发 生 炎 症 坏 死 和 纤 维 化 [13] 在 肝 脏 中 FFA 可 能 是 氧 化 应 激 和 随 后 产 生 脂 质 过 氧 化 的 根 源 FFA 作 为 具 有 肝 细 胞 毒 性 的 分 子, 可 通 过 加 强 脂 质 过 氧 化 反 应 与 细 胞 因 子 如 肿 瘤 坏 死 因 子 α (tumor necrosis factor alpha, TNF-α) 相 互 作 用 等 途 径 直 接 或 间 接 作 用 于 肝 细 胞, 导 致 线 粒 体 肿 胀 和 通 透 性 增 加, 损 伤 生 物 膜, 诱 导 细 胞 凋 亡 或 造 成 细 胞 变 性 坏 死 和 炎 细 胞 浸 润 [14] 肝 实 质 细 胞 中 线 粒 体 过 氧 化 物 酶 体 和 微 粒 体 都 可 产 生 活 性 氧 自 由 基 (reactive oxygen species, ROS), 当 肝 细 胞 内 ROS 的 产 生 及 其 作 用 超 过 抗 氧 化 系 统 的 清 除 能 力 时 便 产 生 氧 化 应 激 [15] ROS 刺 激 花 生 四 烯 酸 的 代 谢, 产 生 白 三 烯 类 脂 质, 触 发 链 式 过 氧 化 反 应 产 生 脂 质 过 氧 化 物, 从 而 改 变 线 粒 体 DNA, 与 线 粒 体 蛋 白 反 应 抑 制 氧 化 呼 吸 链 上 的 电 子 传 递, 使 ROS 脂 质 过 氧 化 产 物 的 生 成 持 续 增 加, 进 一 步 损 害 线 粒 体 呼 吸 链 复 合 物, 形 成 一 个 恶 性 循 环 [16-17] 与 此 同 时 丙 二 醛 (malondialdehyde, MDA) 释 放 增 多, 可 促 使 炎 性 细 胞 浸 润 肝 组 织, 并 导 致 细 胞 蛋 白 质 形 成 交 链 聚 合, 造 成 肝 脏 结 构 破 坏 和 功 能 受 损, 细 胞 外 基 质 的 合 成 大 于 降 解, 星 状 细 胞 增 加 胶 原 蛋 白 的 合 成, 从 而 导 致 肝 纤 维 化 [18] 此 外, 瘦 素 脂 联 素 细 胞 色 素 氧 化 酶 血 管 紧 张 素 Ⅱ, 解 偶 联 蛋 白, 自 然 杀 伤 T 细 胞, 内 质 网 压 力, 肠 道 菌 群 失 调, 血 流 动 力 学 改 变, 铁 超 载 等 一 系 列 因 素 都 可 能 参 与 NAFLD 的 发 生 与 发 展, 也 为 临 床 治 疗 NAFLD 提 供 更 多 的 方 法 和 途 径 [19-23] 2. NAFLD 的 药 物 治 疗 NAFLD 的 发 病 机 制 复 杂 病 程 发 展 缓 慢, 其 治 疗 长 期 以 来 未 得 到 足 够 的 重 视 目 前 尚 未 确 定 最 佳 的 治 疗 方 案, 亦 没 有 特 异 性 的 治 疗 药 物 改 变 生 活 习 惯 调 整 饮 食 加 强 体 育 锻 炼 和 控 制 体 重 一 直 是 NAFLD 的 首 要 治 疗 措 施 药 物 仅 起 辅 助 治 疗 作 用 [24] (1) 胰 岛 素 增 敏 剂 根 据 二 次 打 击 学 说,IR 在 NAFLD 的 发 生 发 展 中 起 核 心 作 用, 胰 岛 素 增 敏 剂 可 以 提 高 机 体 对 胰 岛 素 的 敏 感 性, 对 NAFLD 有 较 好 的 疗 效 2

9 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 前 言 二 甲 双 胍 可 减 少 肝 脏 糖 异 生, 同 时 增 加 肌 肉 等 组 织 对 血 糖 的 摄 取 和 利 用, 改 善 胰 岛 素 敏 感 性, 减 轻 体 重 噻 唑 烷 二 酮 类 药 物 可 活 化 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 γ(peroxisome-proliferator-activated receptor-γ, PPARγ), 提 高 脂 肪 组 织 对 胰 岛 素 的 敏 感 性, 具 有 改 善 NAFLD 患 者 肝 脏 脂 肪 变 性 和 脂 质 沉 积 的 作 用 [25] (2) 血 脂 调 节 药 物 血 脂 调 节 药 物 在 降 低 血 脂 的 同 时 也 会 使 血 脂 集 中 于 肝 脏 代 谢, 促 进 脂 质 在 肝 内 蓄 积, 进 一 步 损 害 肝 功 能 因 此, 仅 伴 有 高 脂 血 症 的 NAFLD 患 者 可 以 考 虑 适 当 加 用 降 脂 药 物, 但 仍 需 注 意 血 清 氨 基 转 移 酶 水 平 的 监 测 临 床 上 常 用 于 脂 肪 肝 治 疗 的 血 脂 调 节 药 物 可 分 为 6 类 : 他 汀 类 贝 特 类 烟 酸 类 胆 酸 螯 合 剂 胆 固 醇 吸 收 抑 制 剂 及 其 它, 其 中 他 汀 类 和 贝 特 类 药 物 的 应 用 最 广 泛 [26] 他 汀 类 即 羟 甲 戊 二 酰 辅 酶 A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzymea, HMG-CoA) 还 原 酶 抑 制 剂, 主 要 抑 制 胆 固 醇 合 成, 可 降 低 血 清 总 胆 固 醇 (total cholesterol, TC) 甘 油 三 酯 (triglyceride, TG) 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 及 极 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (very low density lipoprotein-cholesterol, VLDL-C) 水 平, 提 高 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 (high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C) 水 平, [27] 并 可 改 善 NAFLD 患 者 的 肝 脏 炎 症 ; 贝 特 类 药 物 是 过 氧 化 物 酶 体 增 生 物 激 活 受 体 α(peroxisome-proliferator-activated receptor-α, PPARα) 的 激 活 剂, 主 要 用 于 高 TG 血 症 的 治 疗, 其 对 NAFLD 的 疗 效 尚 存 在 争 议 [28-30] (3) 脂 肪 酶 抑 制 剂 饮 食 和 运 动 控 制 体 重 效 果 不 佳 的 肥 胖 患 者, 可 以 考 虑 使 用 脂 肪 酶 抑 制 剂 来 减 轻 体 重 和 体 脂 西 布 曲 明 和 奥 利 司 他 是 目 前 最 常 用 的 减 肥 药, 除 了 可 以 降 低 体 重 以 外, 亦 可 增 加 胰 岛 素 敏 感 性, 降 低 Ⅱ 型 糖 尿 病 的 患 病 风 险 [31] (4) 细 胞 保 护 剂 熊 脱 氧 胆 酸 牛 磺 酸 等 可 维 持 组 织 渗 透 压 稳 定 肝 细 胞 膜 抗 脂 质 过 氧 化 并 减 少 食 物 中 脂 质 的 吸 收, 但 临 床 随 机 双 盲 安 慰 剂 对 照 研 究 未 证 实 [32] 其 相 关 疗 效 (5) 抗 氧 化 剂 维 生 素 E 是 常 用 的 抗 氧 化 剂, 但 其 对 NAFLD 的 作 用 尚 未 有 明 确 的 定 论 ; 甜 菜 碱 是 胆 碱 的 天 然 代 谢 产 物, 长 期 应 用 对 血 清 氨 基 转 移 酶 水 平 肝 脏 脂 肪 变 性 炎 症 坏 死 和 纤 维 化 均 有 一 定 的 改 善 作 用, 但 目 前 没 有 证 据 表 明, 对 脂 肪 肝 抗 氧 化 治 疗 的 效 果 会 优 于 饮 食 控 制 和 生 活 习 惯 的 改 变 [33] (6) 血 管 紧 张 素 转 化 酶 抑 制 剂 (angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI) 和 血 管 紧 张 素 Ⅱ 受 体 阻 断 剂 (angiotensin Ⅱ receptor antagonists, ARB) 肝 病 患 者 体 内 3

10 前 言 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 肾 素 - 血 管 紧 张 素 - 醛 固 酮 系 统 处 于 活 化 状 态, 因 此,ARB 和 ACEI 类 药 物 不 仅 仅 可 以 作 为 降 压 药 物, 还 可 通 过 活 化 PPARγ 缓 解 IR, 改 善 代 谢 紊 乱, 并 且 通 过 抑 制 肝 脏 星 状 细 胞 增 生 发 挥 抗 纤 维 化 作 用 [34] (7) 中 草 药 中 草 药 在 我 国 利 用 传 统 悠 久, 有 着 广 博 的 理 论 基 础 和 药 物 资 源, 中 医 将 非 酒 精 性 脂 肪 肝 分 为 脾 虚 痰 湿 肝 郁 气 滞 湿 热 蕴 结 血 阻 络 型 肝 肾 亏 虚 五 型, 分 别 采 用 健 脾 化 湿 疏 肝 理 气 清 热 化 湿 活 血 化 瘀 通 络 补 益 肝 肾 的 手 法 进 行 治 疗 近 半 个 世 纪 以 来 通 过 动 物 实 验 和 药 理 学 研 究, 从 传 统 方 剂 中 已 筛 选 出 一 批 具 有 保 肝 调 脂 抗 氧 化 作 用 的 单 味 中 药 及 其 复 方, 如 人 参 丹 参 泽 泻 决 明 子 桃 仁 姜 黄 何 首 乌 绞 股 蓝 灵 芝 枸 杞 山 楂 柴 胡 虎 杖 茵 陈 银 杏 叶 姜 绿 茶 橄 榄 果 等 这 些 中 药 可 有 效 通 过 减 少 肠 道 脂 质 吸 收, 调 整 肝 脏 脂 肪 代 谢 拮 抗 脂 质 过 氧 化 损 伤 来 降 低 血 清 中 TC TG LDL-C 及 VLDL-C 含 量, 提 高 HDL-C 水 平, 起 到 防 治 脂 肪 肝 的 作 用 [35] 二 调 脂 颗 粒 概 述 调 脂 颗 粒 源 于 吴 门 医 派 的 传 人 苏 州 市 中 医 医 院 名 老 中 医 汪 达 成 临 床 用 于 治 疗 高 脂 血 症 和 高 脂 性 脂 肪 肝 的 经 验 方, 由 泽 泻 (Rhizoma Alismatis) 姜 黄 (Rhizoma Curcumae Longae) 蒲 黄 (Pollen Typhae) 和 莱 菔 子 (Semen Raphani) 等 4 味 中 药 按 照 一 定 的 比 例 配 伍 后 提 取 而 成, 具 有 活 血 化 瘀 消 导 通 滞 之 功 效, 在 苏 州 市 中 医 医 院 心 血 管 内 科 多 年 临 床 实 践 中 每 获 良 效 [36] 但 目 前 尚 缺 乏 对 调 脂 颗 粒 系 统 的 动 物 实 验 研 究 及 对 其 作 用 机 制 的 探 讨, 本 研 究 旨 在 通 过 动 物 实 验 观 察 调 脂 颗 粒 对 高 脂 性 脂 肪 肝 的 影 响, 为 临 床 应 用 提 供 实 验 依 据 调 脂 颗 粒 组 方 内 泽 泻 姜 黄 蒲 黄 等 四 味 中 药 都 是 具 有 调 节 血 脂 改 善 脂 肪 肝 和 保 护 肝 脏 功 能 的 传 统 药 物 文 献 报 道, 泽 泻 可 降 低 血 清 中 TC TG 和 LDL-C, 升 高 血 清 HDL-C 水 平, 可 能 是 通 过 抑 制 胆 固 醇 在 肠 道 的 吸 收, 促 进 胆 固 醇 向 胆 汁 酸 转 化 并 抑 制 胆 汁 酸 的 肝 肠 循 环 而 发 挥 作 用 的 此 外, 泽 泻 对 脂 肪 肝 急 性 肝 损 伤 肝 硬 化 等 肝 脏 疾 病 具 有 一 定 的 抑 制 作 用 [37] 姜 黄 作 为 食 物 调 味 品 和 药 物 具 有 悠 久 的 历 史, 其 有 效 成 分 姜 黄 素 可 以 影 响 脂 蛋 白 相 关 代 谢 酶 的 活 性 降 低 血 浆 TC TG 改 善 载 脂 蛋 白 含 量 促 进 胆 囊 对 胆 固 醇 的 排 泄, 且 对 过 氧 化 肝 损 伤 和 肝 纤 维 化 具 有 一 定 的 保 护 作 用, 产 生 调 节 脂 质 代 谢 和 对 抗 肝 损 伤 的 效 果 [38] 蒲 黄 能 抑 制 胆 固 4

11 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 及 其 机 制 研 究 前 言 醇 在 肠 道 的 吸 收 合 成, 并 促 进 胆 固 醇 的 排 泄, 具 有 明 显 的 降 低 TC TG 及 防 止 动 脉 粥 样 斑 块 发 生 和 发 展 的 作 用 [39] 这 几 味 药 组 方 的 配 伍 作 用, 产 生 了 比 较 满 意 的 调 脂 保 肝 的 药 理 学 效 应 调 脂 颗 粒 在 苏 州 中 医 医 院 临 床 应 用 多 年, 但 有 关 该 方 剂 的 药 效 学 基 础 及 其 分 子 机 制 至 今 未 见 报 导 三 课 题 设 计 思 路 本 实 验 拟 采 用 整 体 动 物 实 验 的 方 法 进 行 研 究 首 先 建 立 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 模 型, 观 察 调 脂 颗 粒 对 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 的 调 脂 保 肝 作 用, 然 后 根 据 整 体 实 验 的 结 果, 拟 通 过 PPARα/γ 固 醇 调 节 元 件 结 合 蛋 白 1c/2 (sterol regulatory element-binding protein, SREBP-1c/2) 靶 基 因 和 蛋 白 的 脂 代 谢 途 径 以 及 抗 氧 化 作 用 两 方 面 探 讨 其 可 能 的 作 用 机 制 1 观 察 肝 脂 质 含 量 肝 重 系 数 肝 功 能 指 标 及 肝 脂 肪 变 性 程 度 的 影 响 2 调 节 脂 代 谢 机 制 研 究 利 用 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 模 型, 测 定 给 药 后 大 鼠 肝 组 织 中 PPARα/γ 胆 固 醇 7α- 羟 化 酶 (cholesterol 7α-hydroxylase, CYP7A1) 清 道 夫 受 体 B1(scavenger receptor class B type 1, SR-B1)mRNA 和 蛋 白 肝 型 脂 肪 酸 结 合 蛋 白 (liver fatty acid-binding protein,l-fabp ) 二 脂 酰 甘 油 酰 基 转 移 酶 (diacylglycerol acyltransferase, DGAT) SREBP-1c/2 低 密 度 脂 蛋 白 受 体 (low density lipoprotein receptor, LDLR)mRNA 表 达 的 变 化, 以 期 从 分 子 水 平 探 讨 调 脂 颗 粒 调 脂 保 肝 作 用 机 制 3 抗 氧 化 作 用 利 用 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 模 型, 分 析 治 疗 性 用 药 后 大 鼠 血 清 及 肝 组 织 中 与 氧 化 相 关 的 指 标 如 超 氧 化 物 歧 化 酶 (superoxide dismutase, SOD) MDA 和 谷 胱 甘 肽 (glutathione, GSH) 的 改 变 5

12 第 一 部 分 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 的 研 究 第 一 部 分 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 治 疗 作 用 的 研 究 为 了 探 讨 调 脂 颗 粒 对 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用, 采 用 雄 性 SD 大 鼠 制 备 高 脂 性 脂 肪 肝 模 型, 观 察 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 血 脂 肝 脂 氧 化 应 激 及 肝 组 织 形 态 学 的 影 响 材 料 与 方 法 1 药 物 调 脂 颗 粒 水 提 取 物, 棕 黄 色 粉 末, 含 量 为 5 g 生 药 /1 g 粉 末, 批 号 : , 由 苏 州 中 药 研 究 所 植 化 研 究 室 提 供, 临 用 时 以 蒸 馏 水 溶 解 配 制 成 相 应 的 药 物 浓 度 ; 力 平 之 ( 非 诺 贝 特 ) 胶 囊, 200 mg/ 粒, 批 号 :93405, 进 口 药 品 注 册 证 号 : H , 法 国 利 博 福 尼 制 药 有 限 公 司 生 产, 临 用 时 用 0.5 % 羧 甲 基 纤 维 素 钠 溶 液 配 制 成 1 % 的 药 物 浓 度 血 脂 康 胶 囊,0.3 g/ 粒, 批 号 , 北 京 北 大 维 信 生 物 科 技 有 限 公 司 生 产, 临 用 时 用 0.5 % 羧 甲 基 纤 维 素 钠 溶 液 配 制 成 3 % 的 药 物 浓 度 2 主 要 试 剂 胆 固 醇, 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司, 批 号 0828;3 号 胆 盐, 上 海 楷 洋 生 物 技 术 有 限 公 司, 批 号 : ; 丙 基 硫 氧 嘧 啶, 苏 州 东 瑞 制 药 有 限 公 司, 批 号 : ; 丙 二 醇, 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司, 批 号 :T ; 吐 温 -80, 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司, 批 号 :F ; 猪 油, 市 售 测 定 试 剂 盒 均 购 自 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所 TC 试 剂 盒, 批 号 : ; TG 试 剂 盒, 批 号 : ;HDL-C 试 剂 盒, 批 号 : ;MDA 试 剂 盒, 批 号 ; 谷 丙 转 氨 酶 (alanine amino transferase, ALT) 谷 草 转 氨 酶 (aspartate amino transferase, AST) FFA SOD GSH 和 考 马 斯 亮 兰 蛋 白 试 剂 盒, 批 号 均 为

13 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 的 研 究 第 一 部 分 3 主 要 仪 器 紫 外 可 见 分 光 光 度 计, T6 新 世 纪, 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司 ; 内 切 式 匀 浆 机, ZS83-1 型, 浙 西 机 械 厂 ; 倒 置 荧 光 显 微 镜,X71 型,OLYMPUS 公 司 ; 电 热 恒 温 水 浴 锅, HH-S26s 型, 金 坛 市 大 地 自 动 化 仪 器 厂 ; 台 式 高 速 离 心 机,H1650 型, 湖 南 湘 仪 实 验 室 仪 器 开 发 有 限 公 司 ; 高 速 微 量 台 式 冷 冻 离 心 机,Fresco 21 型, Thermo 公 司 4 实 验 动 物 SD 大 鼠, 雄 性, 体 重 160±20 g, 上 海 斯 莱 克 实 验 动 物 有 限 责 任 公 司, 清 洁 级, 实 验 动 物 生 产 许 可 证 号 :SCXK( 沪 ) , 实 验 动 物 使 用 许 可 证 号 :SYXK ( 苏 ) 实 验 期 间 动 物 房 温 度 控 制 在 20±2, 湿 度 60% 5 实 验 方 法 [40-42] 5.1 高 脂 性 脂 肪 肝 大 鼠 模 型 制 备 及 分 组 给 药 SD 大 鼠 适 应 性 喂 养 3 d 后 随 机 分 为 正 常 对 照 组 和 造 模 组 造 模 组 大 鼠 于 每 天 上 午 9:00-10:30 灌 服 脂 肪 乳 剂 ( 含 胆 固 醇 10 %,3 号 胆 盐 2 %, 丙 基 硫 氧 嘧 啶 0.2 %, 丙 二 醇 15 %, 猪 油 20%, 吐 温 %)1 ml/100 g 体 重,1 次 / 日, 正 常 对 照 组 灌 服 等 体 积 的 蒸 馏 水, 连 续 造 模 4 周 按 照 调 脂 颗 粒 生 药 提 取 物 的 得 率, 参 照 人 体 大 鼠 体 表 面 积 比 值 法 进 行 换 算, 以 临 床 人 用 药 量 (40 g 生 药 /d) 作 为 中 剂 量, 确 定 小 剂 量 为 0.3 g/kg, 中 剂 量 为 0.6 g/kg, 大 剂 量 为 1.2 g/kg 将 已 形 成 脂 肪 肝 的 大 鼠, 随 机 分 为 6 组, 每 组 10 只, 分 别 为 调 脂 颗 粒 小 中 大 三 个 剂 量 组, 力 平 之 20 mg/kg 组 血 脂 康 0.1 g/kg 组 和 脂 肪 肝 模 型 组, 开 始 给 药 各 给 药 组 于 每 天 下 午 2:00-3:30 按 不 同 剂 量 以 0.2 ml/100 g 体 重 灌 胃, 正 常 对 照 组 和 脂 肪 肝 模 型 组 给 予 等 容 积 蒸 馏 水, 连 续 给 药 6 周 在 给 药 的 前 两 周, 除 正 常 组 外, 各 组 大 鼠 于 每 天 上 午 继 续 灌 服 脂 肪 乳 剂 处 理 前 12 h 禁 食, 不 禁 水,4 % 水 合 氯 醛 1 ml/100g 体 重 腹 腔 注 射 麻 醉 后 腹 主 动 脉 取 血, 用 于 检 测 各 项 血 生 化 指 标 取 肝 脏 称 重 后 用 三 氯 甲 烷 : 甲 醇 (1:1) 混 合 液 制 成 10 % 匀 浆, 供 肝 组 织 脂 质 含 量 测 定 ; 另 制 10 % 生 理 盐 水 匀 浆 供 检 测 肝 组 织 中 蛋 白 含 量 和 抗 氧 化 指 标 ; 另 取 同 一 部 位 肝 脏 以 10 % 福 尔 马 林 溶 液 和 4% 戊 二 醛 溶 液 固 定 固 定, 分 7

14 第 一 部 分 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 的 研 究 别 用 光 镜 和 透 射 电 镜 观 察 肝 组 织 的 形 态 学 改 变 ; 取 1.5 g 肝 组 织 入 冻 存 管 中,-80 冰 箱 储 存 备 用 5.2 肝 重 系 数 和 血 清 指 标 测 定 肝 重 系 数 = 肝 重 (g)/ 鼠 重 (100g) 按 试 剂 盒 提 供 的 方 法, 用 胆 固 醇 氧 化 酶 -PAP 法 测 定 血 清 TC 含 量, 磷 酸 甘 油 氧 化 酶 -PAP 法 测 定 血 清 TG 含 量, 以 磷 钨 酸 镁 (PTA-Mg 2+ ) 沉 淀 法 测 定 血 清 HDL-C 按 下 列 公 式 计 算 LDL-C, 即 LDL-C=TC- (TG/2.2+HDL-C), 赖 氏 法 测 定 ALT 含 量, 比 色 法 测 定 血 清 AST GSH 和 FFA 含 量, 黄 嘌 呤 氧 化 酶 法 测 定 SOD 活 力,TBA 法 测 定 MDA 含 量 5.3 肝 脂 质 测 定 称 取 各 个 大 鼠 肝 组 织 500 mg, 加 三 氯 甲 烷 : 甲 醇 (1:1) 混 合 液 至 5 ml 后 匀 浆, 匀 浆 液 置 4 24 h 后 3500 转 离 心 15 min, 取 上 清 20 μl 置 另 一 试 管 中, 室 温 放 置 12 h 以 上, 待 三 氯 甲 烷 和 甲 醇 挥 发 后, 用 胆 固 醇 氧 化 酶 -PAP 和 磷 酸 甘 油 氧 化 酶 -PAP 法 分 别 测 定 肝 中 的 TC 和 TG 含 量, 用 比 色 法 测 定 肝 中 的 FFA 含 量 5.4 肝 组 织 中 SOD 活 性 MDA 和 蛋 白 含 量 测 定 称 取 大 鼠 肝 组 织 200 mg, 加 冰 生 理 盐 水 2 ml 后 匀 浆,3500 转 离 心 15min 后 取 上 清, 按 试 剂 盒 方 法 分 别 测 定 SOD 活 性 MDA 和 蛋 白 含 量 [43] 5.5 大 鼠 肝 组 织 病 理 标 本 制 作 及 半 定 量 分 析 取 大 鼠 肝 组 织, 经 石 蜡 包 埋 切 片, 光 镜 下 观 察 肝 脏 脂 肪 变 性 情 况 肝 脏 脂 肪 变 性 程 度 分 为 五 个 等 级 :0 级 ( ) 为 正 常 肝 小 叶, 肝 细 胞 结 构 正 常, 肝 细 胞 脂 变 数 占 肝 小 叶 比 例 0%; 一 级 (+) 为 轻 度 脂 肪 肝, 肝 脂 变 细 胞 以 小 脂 滴 为 主, 可 有 少 数 中 等 大 小 脂 滴, 肝 细 胞 脂 变 数 占 肝 小 叶 比 例 25%; 二 级 (++) 为 中 度 脂 肪 肝, 肝 脂 变 细 胞 以 中 小 脂 滴 为 主, 有 少 数 大 脂 滴, 肝 细 胞 脂 变 数 占 肝 小 叶 比 例 在 25% 50% 之 间 ; 三 级 为 重 度 脂 肪 肝 (+++), 肝 脂 变 以 中 大 脂 滴 为 主, 肝 细 胞 脂 变 数 占 肝 小 叶 比 例 在 50% 75%; 四 级 为 重 度 脂 肪 肝 (++++), 肝 脂 变 以 大 中 脂 滴 为 主, 肝 细 胞 脂 变 数 占 肝 小 叶 比 例 75% 电 镜 标 本 制 作 大 鼠 肝 组 织 经 4% 戊 二 醛,1% 饿 酸 固 定, 梯 度 丙 酮 脱 水,618 环 氧 树 脂 包 埋, LKB 超 薄 切 片 机 切 片, 日 立 H-600 透 射 电 镜 观 察 8

15 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 的 研 究 第 一 部 分 6 实 验 数 据 统 计 学 处 理 实 验 数 据 以 x ± s 表 示, 采 用 SPSS 13.0 软 件 进 行 统 计, 显 著 性 检 验 采 用 one-way ANOVA 检 验 实 验 结 果 1 对 大 鼠 体 重 肝 重 和 肝 重 系 数 的 影 响 与 正 常 对 照 组 相 比 较, 脂 肪 肝 模 型 组 大 鼠 肝 重 和 肝 重 系 数 明 显 升 高 (P<0.01) 与 模 型 组 相 比, 给 予 调 脂 颗 粒 6 周 后, 各 给 药 组 大 鼠 肝 重 肝 重 系 数 降 低 非 常 显 著 (P<0.01); 阳 性 药 血 脂 康 组 大 鼠 的 肝 重 肝 重 系 数 也 有 明 显 的 降 低 (P<0.01), 但 力 平 之 组 大 鼠 肝 重 和 肝 重 系 数 与 模 型 组 相 比 有 所 升 高 (P<0.05), 提 示 力 平 之 对 肝 脏 可 能 有 一 定 的 损 伤 作 用 ; 各 给 药 组 大 鼠 体 重 未 见 明 显 差 异 (Tab.1) Tab.1 Effect of tiaozhi granules on body weight, hepatic weight and coefficient of hepatic weight in hyperlipidemic fatty liver rats( x ± s, n=10) Group Body weight (g) Liver weight (g) Coefficient of hepatic weight (g/100 g) Control 232.7± ± ±0.19 Model 256.8± ±0.45 ## 3.41±0.26 ## Tiaozhi Granules 0.3 g/kg 250.5± ±0.47 ** 2.99±0.29 ** Tiaozhi Granules 0.6 g/kg 246.7± ±0.61 ** 2.95±0.17 ** Tiaozhi Granules 1.2 g/kg 244.1± ±0.47 ** 2.90±0.26 ** Lipanthyl 20 mg/kg 227.6± ±0.29 * 3.68±0.18 * Xuezhikang 0.1g/kg 229.1± ±0.51 ** 2.85±0.25 ** # P<0.05, ## P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group. 2 对 血 清 TC TG FFA HDL-C 及 LDL-C 的 影 响 与 正 常 对 照 组 相 比 较, 模 型 组 大 鼠 血 清 TC TG FFA 及 LDL-C 的 水 平 升 高 非 常 显 著, 而 HDL-C 的 水 平 明 显 降 低 (P<0.01) 与 模 型 组 大 鼠 相 比, 调 脂 颗 粒 各 剂 量 组 大 鼠 血 清 TC TG FFA LDL-C 水 平 降 低 或 显 著 降 低 (P<0.05 或 P<0.01), 9

16 第 一 部 分 调 脂 颗 粒 对 大 鼠 高 脂 性 脂 肪 肝 的 治 疗 作 用 的 研 究 血 清 HDL-C 显 著 升 高 (P<0.01) 阳 性 药 力 平 之 也 可 明 显 降 低 大 鼠 血 清 TC TG FFA 和 LDL-C 含 量 升 高 血 清 HDL-C 水 平 (P<0.01); 血 脂 康 可 以 降 低 大 鼠 血 清 TC TG 和 LDL-C 的 水 平 (P<0.05), 明 显 减 少 血 清 FFA 含 量 (P<0.01) 并 对 大 鼠 血 清 HDL-C 水 平 有 显 著 的 升 高 作 用 (P<0.01)(Tab.2) Tab.2 Effect of tiaozhi granules on serum TC, TG, FFA, HDL-C and LDL-C levels in hyperlipidemic fatty liver rats( x ± s, n=10) Group TC (mmol/l) TG (mmol/l) FFA (μmol/l) HDL-C (mmol/l) LDL-C (mmol/l) Control 1.59± ± ± ± ±0.09 Model 2.43±0.42 ## 0.64±0.06 ## 864.4±102.3 ## 0.61±0.10 ## 1.53±0.24 ## Tiaozhi granules 0.3 g/kg Tiaozhi granules 0.6 g/kg Tiaozhi granules 1.2 g/kg Lipanthyl 20 mg/kg 1.86±0.43 ** 0.63± ±88.6 ** 0.82±0.10 ** 0.75±0.11 ** 1.64±0.17 ** 0.59±0.05 * 627.7±95.2 ** 0.85±0.21 ** 0.53±0.08 ** 1.57±0.23 ** 0.52±0.10 ** 599.7±95.0 ** 0.87±0.13 ** 0.46±0.06 ** 1.58±0.17 ** 0.55±0.07 ** 567.4±65.7 ** 0.84±0.12 ** 0.49±0.12 ** Xuezhikang 0.1g/kg 2.10±0.09 * 0.59±0.05 * 508.4±77.4 ** 0.98±0.12 ** 0.85±0.19 * # P<0.05, ## P<0.01 vs control group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group. 3 对 血 清 ALT AST SOD MDA 和 GSH 的 影 响 与 正 常 对 照 组 相 比 较, 模 型 组 大 鼠 血 清 ALT 和 AST 水 平 明 显 升 高 (P<0.01) 与 模 型 组 大 鼠 相 比, 调 脂 颗 粒 各 剂 量 组 大 鼠 血 清 ALT 和 AST 水 平 都 有 显 著 降 低 (P<0.01), 阳 性 药 血 脂 康 亦 可 明 显 降 低 大 鼠 血 清 ALT 和 AST 的 水 平, 力 平 之 可 以 降 低 血 清 AST 水 平 (P<0.05), 但 对 血 清 ALT 未 见 明 显 影 响 与 正 常 对 照 组 相 比, 模 型 组 大 鼠 血 清 SOD 和 GSH 水 平 降 低 非 常 显 著 (P<0.01), 血 清 MDA 含 量 有 所 升 高 (P<0.05) 与 模 型 组 大 鼠 相 比, 调 脂 颗 粒 各 剂 量 组 大 鼠 血 清 MDA 含 量 均 有 显 著 降 低 (P<0.01), 血 清 GSH 含 量 升 高 或 显 著 升 高 (P<0.05 或 P<0.01), 调 脂 颗 粒 大 剂 量 组 对 血 清 SOD 活 性 也 有 一 定 升 高 作 用 (P<0.05); 阳 性 药 力 平 之 和 血 脂 康 可 以 明 显 降 低 大 鼠 血 清 MDA 含 量 (P<0.01), 升 高 或 明 显 升 高 血 清 GSH 含 量 (P<0.05 或 P <0.01;Tab.3) 10

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