Drug Evaluation Research 第 36 卷 第 1 期 2013 年 2 月 料 ), 山 西 皇 城 相 府 药 业 有 限 公 司, 批 号 ( 人 口 服 推 荐 剂 量 为 每 日 3 次, 每 次 4 粒, 成 人 体 质 量 按 60

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1 Drug Evaluation Research 第 36 卷 第 1 期 2013 年 2 月 柴 青 消 癖 胶 囊 对 乳 腺 增 生 模 型 大 鼠 的 治 疗 作 用 研 究 * 刘 聪, 岳 永 花, 郝 旭 亮 山 西 省 中 医 药 研 究 院, 山 西 太 原 摘 要 : 目 的 探 讨 柴 青 消 癖 胶 囊 对 乳 腺 增 生 模 型 大 鼠 的 治 疗 作 用 及 可 能 的 作 用 机 制 方 法 清 洁 级 SD 大 鼠 70 只, 随 机 分 成 7 组 : 对 照 组, 模 型 组, 枸 橼 酸 他 莫 昔 芬 组, 消 乳 散 结 胶 囊 组, 柴 青 消 癖 胶 囊 低 中 高 剂 量 ( g/kg) 组 5 周 后, 测 定 乳 头 直 径 及 高 度 脏 器 指 数 血 清 中 孕 激 素 (P) 雌 激 素 (E 2 ) 泌 乳 素 (PRL) 睾 酮 (T) 水 平 及 超 氧 歧 化 酶 (SOD) 丙 二 醛 (MDA) 量, 镜 下 观 察 乳 腺 组 织 病 理 形 态 学 变 化 结 果 柴 青 消 癖 胶 囊 中 高 剂 量 组 能 显 著 减 小 大 鼠 乳 头 直 径 及 高 度 ; 升 高 胸 腺 脾 指 数, 降 低 子 宫 卵 巢 指 数 ; 能 提 高 血 清 中 P E 2 PRL 水 平, 降 低 T 的 量 ; 可 明 显 增 加 血 清 中 SOD 活 性, 降 低 MDA 水 平 结 论 柴 青 消 癖 胶 囊 对 乳 腺 增 生 模 型 大 鼠 有 显 著 的 治 疗 作 用, 其 作 用 机 制 可 能 与 增 强 免 疫 力 调 节 血 清 中 性 激 素 水 平 及 抗 氧 化 作 用 有 关 关 键 词 : 柴 青 消 癖 胶 囊 ; 乳 腺 增 生 ; 大 鼠 ; 性 激 素 ; 抗 氧 化 中 图 分 类 号 :R982 R655.8 文 献 标 志 码 :A 文 章 编 号 : (2013) DOI: /j.issn Therapeutic effect of Chaiqing Xiaopi Capsule on hyperplasia of mammary gland in rats LIU Cong, YUE Yong-hua, HAO Xu-liang Shanxi Academy of Traditional Chinese Medicine, Taiyuan , China Abstract: Objective To investigate the therapeutic action of Chaiqing Xiaopi Capsule (CXC) on the hyperplasia of mammary gland (HMG) in rats and to analyze the possible mechanism in treating HMG. Methods Seventy clean Sprague-Dawley rats were divided into seven groups including control, model, tamoxifen citrate, Xiaoru Sanjie Capsule, low-, mid-, and high-dose CXC (0.433, 0.855, and g/kg) groups. After treatment for five weeks, the height and diameter of nipple were measured, the viscera indexes and the levels of progestogen (P), estrogen (E 2 ), prolactin (PRL), testosterone (T), superoxide dismutase (SOD), and malondialdehyde (MDA) in serum were determined, and the pathologic changes in morphology of breast tissue in rats were observed by microscopy. Results The mid- and high-dose CXC could remarkably reduce the diameter and height of nipple, increase the coefficient of thymus and spleen, and decrease the coefficient of uterus and ovaries. It could also increase the levels of E 2, P, and PRL, decrease T level in serum, increase the SOD activity, and decrease the content of MDA. Conclusion CXC has obvious therapeutic effect on HMG in rats, and the mechanism may be related to enhancing immunity, regulating sex hormone level in serum, and antioxidation. Key words: Chaiqing Xiaopi Capsule; hyperplasia of mammary glands; rats; estrogen; anti-oxidation 乳 腺 增 生 病 (hyperplasia of mammary gland, HMG) 为 女 性 常 见 的 以 周 期 性 的 乳 房 疼 痛 为 主 要 特 征 的 非 炎 症 非 肿 瘤 慢 性 乳 房 疾 病 主 要 病 因 是 雌 激 素 与 孕 激 素 的 比 例 失 调 目 前 对 乳 腺 增 生 病 的 治 疗 主 要 以 纠 正 神 经 内 分 泌 系 统 紊 乱 的 方 式 为 主, 但 只 能 暂 时 缓 解, 且 毒 副 作 用 较 大, 易 复 发 柴 青 消 癖 胶 囊 是 临 床 治 疗 肝 郁 气 滞, 血 瘀 痰 凝 型 乳 腺 增 生 的 经 验 方, 疗 效 较 好 本 实 验 以 苯 甲 酸 雌 二 醇 联 合 黄 体 酮 肌 注 射 建 立 大 鼠 乳 腺 增 生 模 型, 研 究 柴 青 消 癖 胶 囊 对 乳 腺 增 生 大 鼠 模 型 的 治 疗 作 用 及 可 能 的 作 用 机 制 1 实 验 材 料 与 方 法 1.1 药 物 与 试 剂 柴 青 消 癖 胶 囊 (CXC,3.92 g 生 药 /g, 不 含 辅 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 山 西 省 科 技 攻 关 项 目 资 助 ( ) 作 者 简 介 : 刘 聪 (1985 ), 女, 在 读 硕 士, 研 究 方 向 为 中 药 作 用 物 质 基 础 及 作 用 机 制 研 究 Tel: * 通 信 作 者 郝 旭 亮 (1975 ) 男, 汉, 博 士, 硕 士 生 导 师, 主 要 从 事 中 药 作 用 物 质 基 础 及 作 用 机 制 研 究 Tel: (0351)

2 Drug Evaluation Research 第 36 卷 第 1 期 2013 年 2 月 料 ), 山 西 皇 城 相 府 药 业 有 限 公 司, 批 号 ( 人 口 服 推 荐 剂 量 为 每 日 3 次, 每 次 4 粒, 成 人 体 质 量 按 60 kg 计 算, 折 合 剂 量 为 g/kg); 苯 甲 酸 雌 二 醇, 天 津 金 耀 氨 基 酸 有 限 公 司, 批 号 ; 黄 体 酮, 浙 江 医 药 股 份 有 限 公 司 仙 琚 制 药 厂, 批 号 ; 枸 橼 酸 他 莫 昔 芬 片, 扬 子 江 药 业 集 团 有 限 公 司, 批 号 ; 消 乳 散 结 胶 囊, 山 东 神 州 制 药 有 限 公 司, 批 号 ; 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 丙 二 醛 (MDA) 试 剂 盒, 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 所, 批 号 , ; 雌 激 素 (E 2 ) 孕 激 素 (P) 泌 乳 素 (PRL) 睾 酮 (T) 的 ELISA 试 剂 盒, 上 海 丰 翔 生 物 与 科 技 有 限 公 司, 批 号 仪 器 AT 858 型 自 动 酶 标 分 析 仪, 上 海 安 泰 分 析 仪 器 有 限 公 司 ;KDC 2046 低 速 冷 冻 离 心 机, 科 大 创 新 股 份 有 限 公 司 中 佳 分 公 司 ;TU 1901 双 光 束 紫 外 可 见 分 光 光 度 计, 北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司 1.3 动 物 健 康 SD 大 鼠, 体 质 量 200~250 g, 雌 性 未 孕, 共 70 只, 购 自 北 京 华 阜 康 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司, 许 可 证 编 号 SCXK( 京 ) 饲 养 于 清 洁 恒 温 环 境 中, 自 由 饮 水 进 食 1.4 乳 腺 增 生 模 型 的 建 立 苯 甲 酸 雌 二 醇 im 给 药 0.5 g/kg, 连 续 30 d, 再 im 给 予 大 鼠 4 g/kg 黄 体 酮, 注 射 时 间 为 5 d, 复 制 大 鼠 乳 腺 增 生 模 型 [1], 外 观 可 见 乳 头 红 肿 增 大, 竖 起, 较 坚 实, 充 血, 乳 头 直 停 药 期 间 ( 第 36~45 天 ), 分 别 随 机 取 模 型 组 5 只 大 鼠 其 余 建 模 5 组 各 1 只 大 鼠 的 第 2 对 乳 腺, 经 病 理 证 实 模 型 制 造 成 功 后 于 第 46 天 开 始 药 物 治 疗 1.5 分 组 与 给 药 实 验 设 7 个 组, 分 别 为 对 照 组 模 型 组 阳 性 西 药 对 照 ( 枸 橼 酸 他 莫 昔 芬 片 1.6 mg/kg) 组 阳 性 中 药 对 照 ( 消 乳 散 结 胶 囊 g/kg) 组 CXC 低 中 高 剂 量 ( g/kg) 组 样 品 配 制 时, 低 中 高 剂 量 分 别 取 柴 青 消 癖 胶 囊 g, 消 乳 散 结 胶 囊 组 取 11.3 g, 枸 橼 酸 他 莫 昔 芬 片 组 取 0.5 g( 含 药 8%), 加 蒸 馏 水 至 250 ml 各 治 疗 组 按 上 述 剂 量 以 10 ml/kg ig 给 药, 对 照 组 和 模 型 组 ig 等 体 积 生 理 盐 水, 每 日 1 次, 连 续 给 药 5 周 每 周 测 量 一 次 体 质 量, 调 整 给 药 剂 量 1.6 指 标 观 察 乳 腺 测 量 末 次 给 药 后 禁 食 12 h, 称 体 质 量, 大 鼠 ip 注 射 1% 戊 巴 比 妥 钠 (5 ml/kg) 麻 醉, 游 标 卡 尺 测 量 各 组 大 鼠 腹 部 第 二 对 乳 头 的 直 径 与 高 度 脏 器 指 数 摘 取 胸 腺 脾 脏 子 宫 卵 巢, 按 以 下 公 式 计 算 脏 器 系 数 脏 器 系 数 = 脏 器 质 量 / 体 质 量 血 清 中 相 关 指 标 测 定 心 脏 取 血,3 000 r/min 离 心 15 min, 制 备 血 清, 20 保 存, 用 于 检 测 血 清 中 E 2 P PRL T 水 平 及 SOD MDA 的 量, 均 按 试 剂 盒 说 明 书 进 行 测 定 乳 腺 组 织 病 理 学 观 察 取 第 二 对 左 侧 完 整 的 乳 腺 组 织, 以 10% 福 尔 马 林 固 定, 常 规 制 片, HE 染 色, 光 镜 检 查, 由 中 国 防 辐 射 研 究 院 GLP 中 心 完 成 1.7 统 计 学 处 理 实 验 数 据 以 x ± s 表 示, 采 用 SPSS13.0 统 计 软 件 进 行 数 据 处 理 2 实 验 结 果 2.1 对 大 鼠 乳 头 直 径 与 高 度 的 影 响 模 型 组 与 对 照 组 比 较 乳 头 直 径 和 高 度 明 显 增 大, 乳 腺 小 叶 腺 泡 数 明 显 增 多, 腺 泡 腔 明 显 扩 张 腺 泡 及 导 管 内 红 染 分 泌 物 增 多 (P<0.01); 各 组 给 药 后, 与 模 型 组 比 较, 阳 性 对 照 组 及 CXC 各 剂 量 组 均 能 显 著 减 小 乳 腺 增 生 模 型 大 鼠 乳 头 直 径 和 高 度 (P<0.01), 明 显 减 少 乳 腺 增 生 症 模 型 大 鼠 的 乳 腺 小 叶 腺 泡 数 减 小 腺 泡 腔 直 径 (P<0.01), 结 果 见 表 对 大 鼠 脏 器 指 数 的 影 响 模 型 组 与 对 照 组 比 较, 胸 腺 脾 脏 指 数 均 显 著 降 低 (P<0.01), 卵 巢 子 宫 指 数 明 显 升 高 (P< 0.05); 阳 性 西 药 及 阳 性 中 药 组 脾 脏 胸 腺 指 数 较 模 型 组 均 有 所 提 高 (P<0.05), 卵 巢 子 宫 指 数 与 模 型 组 相 比 较 均 降 低 (P<0.05);CXC 各 剂 量 组 胸 腺 脾 脏 指 数 较 模 型 组 均 有 升 高 (P<0.01), 卵 巢 子 宫 指 数 下 降 (P<0.05), 结 果 见 表 对 大 鼠 血 清 中 性 激 素 水 平 的 影 响 模 型 组 E 2 P PRL 水 平 均 明 显 降 低,T 明 显 上 升, 与 对 照 组 比 较 差 异 显 著 (P<0.01); 阳 性 西 药 组 及 阳 性 中 药 组 E 2 P PRL 水 平 明 显 上 升,T 水 平 下 降 (P<0.01);CXC 各 剂 量 组 E 2 P PRL 水 平 均 明 显 上 升,T 水 平 与 模 型 组 比 较 有 显 著 下 降 (P<0.01), 结 果 见 表 3

3 Drug Evaluation Research 第 36 卷 第 1 期 2013 年 2 月 剂 量 / (g kg 1 ) 表 1 柴 青 消 癖 胶 囊 对 各 组 大 鼠 乳 头 直 径 高 度 的 影 响 ( x ± s, n =10) Table 1 Effects of CXC on height and diameter of nipple of rats ( x ± s, n =10) 乳 头 直 径 /mm 乳 头 高 度 /mm 乳 腺 小 叶 泡 / ( 个 mm 2 ) 腺 泡 腔 直 径 / 造 模 给 药 后 造 模 给 药 后 给 药 后 给 药 后 μm 对 照 ± ± ± ± ± ±0.11 模 型 ± ± ± ± ± ±0.91 阳 性 西 药 ±0.166 * 0.940±0.232 ** 2.349±0.132 * 0.851±0.210 ** 7.31±2.30 ** 0.19±0.23 ** 阳 性 中 药 ±0.293 * 1.334±0.304 ** 2.339±0.160 ** 1.184±0.245 ** 7.97±1.67 ** 0.31±0.12 ** 柴 青 消 癖 ±0.162 ** 1.320±0.145 ** 2.314±0.177 ** 0.104±0.013 ** 8.01±2.54 * 0.39±0.15 * 胶 囊 ±0.179 ** 1.295±0.353 ** 2.294±0.166 ** 1.028±0.163 ** 7.84±2.33 ** 0.34±0.22 * ±0.167 ** 1.240±0.266 ** 2.346±0.148 ** 0.963±0.342 ** 7.64±3.10 ** 0.34±0.07 ** 与 对 照 组 比 较 : P<0.05 P<0.01; 与 模 型 组 比 较 : * P<0.05 ** P<0.01, 下 表 同 P < 0.05 P < 0.01 vs control group; * P < 0.05 ** P < 0.01 vs model group, same as below 表 2 柴 青 消 癖 胶 囊 对 各 组 模 型 大 鼠 脏 器 系 数 的 影 响 ( x ± s, n =10) Table 2 Effects of CXC on viscera indexes of rats ( x ± s, n =10) 剂 量 / (g kg 1 ) 脏 器 系 数 子 宫 卵 巢 胸 腺 脾 脏 对 照 ± ± ± ±0.021 模 型 ± ± ± ±0.033 阳 性 西 药 ±0.047 ** 0.033±0.006 * 0.124±0.014 ** 0.251±0.031 * 阳 性 中 药 ±0.062 * 0.036± ±0.014 ** 0.298±0.041 ** 柴 青 消 癖 胶 囊 ±0.090 * 0.031±0.006 * 0.104±0.013 ** 0.277±0.057 * ±0.075 * 0.032±0.006 * 0.101±0.013 ** 0.328±0.059 ** ±0.049 * 0.029±0.012 * 0.134±0.013 ** 0.344±0.043 ** 表 3 柴 青 消 癖 胶 囊 对 各 组 模 型 血 清 中 E 2 P PRL T 的 量 的 影 响 ( x ± s, n =10) Table 3 Effects of CXC on contents of E 2, P, PRL, and T in serum of rats ( x ± s, n =10) 剂 量 / 内 分 泌 激 素 / (nmol L 1 ) (g kg 1 ) E 2 P PRL T 对 照 ± ± ± ±19.01 模 型 ± ± ± ±22.68 阳 性 西 药 ±4.919 ** 311.3±95.56 ** ±35.33 ** 35.53±8.172 ** 阳 性 中 药 ±3.994 * 300.7±106.6 * ±73.66 ** 48.63±15.93 * 柴 青 消 癖 胶 囊 ±6.208 ** 255.8± ±92.21 ** 56.07± ±3.467 ** 333.5±144.9 * ±47.60 ** 45.79±12.96 * ±2.342 ** 359.5±130.0 ** ±64.94 ** 39.12±16.88 ** 2.4 对 大 鼠 血 清 中 SOD MDA 量 的 影 响 模 型 组 SOD 水 平 较 低, 与 对 照 组 比 较 有 显 著 差 异 (P<0.01); 阳 性 西 药 组 阳 性 中 药 组 CXC 各 剂 量 组 SOD 水 平 较 模 型 组 显 著 升 高 (P<0.01), 而 MDA 水 平 有 所 降 低 (P<0.05); 见 表 对 大 鼠 乳 腺 组 织 结 构 变 化 的 影 响 给 药 后, 光 镜 下 观 察 大 鼠 乳 腺 组 织 变 化 空 白 组 大 鼠 乳 腺 为 静 息 期 状 态, 无 增 生 性 病 变, 小 叶 结 构 不 明 显 ; 导 管 及 腺 泡 无 扩 张 模 型 组 乳 腺 导 管 腺 泡 扩 张, 内 含 可 见 大 量 红 染 分 泌 物 ;CXC 各 剂 量

4 - 16 表4 Drug Evaluation Research 第 36 卷 第 1 期 2013 年 2 月 柴青消癖胶囊对各组大鼠血清中 SOD MDA 量的影 对乳腺组织导管 腺泡的增生 扩张状态均有不同 响 x ± s, n = 10 程度的改善 表现为乳腺小叶略微增生 部分腺泡 Table 4 Effects of CXC on contents of SOD and MDA in serum of rats 对照 剂量/(g kg 1) 模型 3 SOD/(U ml 1) 34.90±13.17 MDA/(nmol ml 1) 讨论 近年来乳腺增生病的发病率呈明显上升趋势且 病程长 30 岁以上的女性发病率达 90%以上[2] 且 6.628± ±3.599 有 3% 5%的癌变几率 严重危害女性的身心健康 ** 16.94±12.90 扩张 含有少量可见红染分泌物 见图 1 阳性西药 ± ±3.292* 西医认为该疾病与内分泌紊乱有关 但尚未有特效 阳性中药 ±24.49** 7.690±2.231 疗法 而中医药在治疗乳腺增生病方面有独到之处 柴青消癖 ± ±2.120 中医学认为乳腺增生主要由于情志不畅 肝气郁结 胶囊 ±16.55** 6.045±3.155* 思虑伤脾 痰湿内蕴 以致气滞血瘀 痰浊互结 ±97.54** 5.890±2.214** 气血痰结聚于乳腺局部日久而成 柴青消癖胶囊由 对照 模型 g kg 1 柴青消癖胶囊 阳性西药 g kg 1 柴青消癖胶囊 图1 阳性中药 g kg 1 柴青消癖胶囊 乳腺组织的 HE 化学染色 Fig. 1 HE staining of mammary gland in each group 青皮 柴胡 香附疏肝解郁 利气止痛 调经 白 性 E2 分子与受体结合 而发挥雌激素样作用 有效 芍养血 柔肝敛阴 增强止痛调经之功 丹参 三 地减弱了乳腺组织对 E2 的应答 起到拮抗雌激素的 七养血活血止血 夏枯草 浙贝母清热解毒 消肿 作用 从而减弱 E2 的促细胞增殖作用 P 在乳腺病 散结 清肺祛痰 王不留行通经下乳 全方共奏疏 变组织中的高表达 导致了乳腺上皮细胞孕激素反 肝解郁 活血散结 养血益阴 调经止痛 清肺化 应紊乱 促进了 E2 诱导的乳腺组织内间质胶原纤维 痰之功效 柴青消癖胶囊是治疗乳腺增生的临床经 的增加及细胞的恶变 乳腺细胞中 PRL 水平在 P 的 验方 取得了较好的疗效 刺激下升高 通过激活乳腺膜细胞内的腺苷酸环化 柴青消癖胶囊 3 个剂量组治疗给药 能明显减 酶 改变细胞膜的功能 加重乳腺增生 T 以血清 小由苯甲酸雌二醇联合黄体酮所致乳腺增生大鼠乳 双清睾酮 DHT 的形式存在 芳香化酶 P450 arom 头的直径与高度 且各指标与模型组比较具有显著 是雄性体内唯一将雄激素转化为雌激素的酶系 而 差异 P 其作用机制可能是 ①增 睾丸生殖细胞中均含有 P450 arom 且极易激活 因 强模型大鼠免疫力 升高胸腺 脾脏指数 降低子 此 DHT 诱导 P450 arom 的量增高[3] 催化 T 转化成 宫 卵巢指数 ②调节性激素水平 外源性 E2 与内 E2 发生雌激素效应而引起乳房肥大 ③乳腺组织 源性 E2 竞争性结合雌激素受体 ER 阻止了内源 中 E2 量增加的同时 伴随着脂质发生过氧化反应

5 Drug Evaluation Research 第 36 卷 第 1 期 2013 年 2 月 最 终 产 物 为 MDA, 具 有 细 胞 毒 性 导 致 乳 腺 细 胞 损 伤, 甚 至 诱 发 乳 腺 癌 等 恶 性 疾 病 乳 腺 增 生 的 发 生 会 由 于 机 体 内 SOD 减 少 而 加 剧 当 乳 腺 细 胞 中 自 由 基 水 平 异 常 升 高 时,SOD 能 够 特 异 性 催 化 氧 自 由 基 发 生 歧 化 反 应 生 成 H 2 O 和 O 2, 并 在 过 氧 化 氢 酶 (CAT) 的 作 用 下 清 除 炎 症 过 程 中 伴 随 产 生 的 过 氧 化 物 游 离 基, 从 而 产 生 强 大 的 抗 炎 作 用, 并 及 时 修 复 受 损 乳 腺 细 胞 [4-6] ;4 对 模 型 大 鼠 乳 腺 小 叶 导 管 增 生 程 度 显 著 改 善, 腔 内 红 染 分 泌 物 大 量 减 少, 且 随 剂 量 增 大, 效 果 更 明 显 综 上 所 述, 本 实 验 通 过 柴 青 消 癖 胶 囊 疏 肝 解 郁 活 血 散 结 清 肺 化 痰 的 治 疗 方 法 使 大 鼠 血 清 中 性 激 素 水 平 得 到 恢 复, 提 高 了 机 体 免 疫 功 能, 抑 制 乳 腺 组 织 的 过 氧 化 反 应 及 改 善 了 模 型 大 鼠 乳 腺 组 织 病 理 形 态 学 改 变, 初 步 证 明 了 柴 青 消 癖 胶 囊 对 乳 腺 增 生 的 治 疗 作 用 及 机 制, 为 临 床 上 治 疗 乳 腺 增 生 提 供 了 实 验 依 据 参 考 文 献 [1] 罗 伦 才, 季 小 平, 黄 兰 雅, 等. 均 匀 设 计 法 用 于 乳 腺 增 生 动 物 模 型 复 制 的 研 究 [J]. 中 国 实 验 方 剂 学 杂 志, 2011, 17(7): [2] 周 莉 娜. 乳 腺 增 生 的 中 医 药 治 疗 进 展 [J]. 中 医 药 导 报, 2010, 16(11): [3] 陈 秋, 洪 新 如, 宋 岩 峰. 芳 香 化 酶 雌 激 素 与 雄 性 生 殖 [J]. 中 国 男 科 学 杂 志, 2008, 22(7): [4] 李 增 英, 李 惠 林, 张 志 玲, 等. 代 谢 综 合 征 的 临 床 相 关 指 标 [J]. 中 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复, 2007, 11(39): [5] 张 欣. 长 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 及 其 研 究 进 展 [J]. 内 蒙 古 石 油 化 工, 2010, 16: [6] 时 沁 峰, 曹 威 荣. 超 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) 的 研 究 概 况 [J]. 畜 禽 业, 2009, 24(4):

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