138 波谱学杂志第 19 卷 Nelson 等归属出了羊水中 18 种代谢物的 360 MHz 1 H NMR 谱 [16]. 此后, 有关人羊水中部分代谢物的含量及其与孕期和胎儿生长状况的关系的 NMR

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玲凤
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1 波谱学杂志第 19 卷第 2 期 Vol.19No 年 6 月 ChineseJournalofMagneticResonance Jun.2002 文章编号 : (2002) 鸡胚羊水的核磁共振波谱分析冯越 1,2, 常建华 1, 张许 2, 刘买利 2 (1. 西北大学化学系, 陕西西安 ;2. 中国科学院武汉物理与数学研究所波谱与原子分子物理国家重点实验室, 湖北武汉 ) 摘要 : 羊水是胚胎的正常发育必不可少的物质, 因此, 分析鸡胚羊膜内羊水的组成及含量, 对于研究鸡胚的发育及发育过程中卵内发生的生物化学变化有着极为重要的意义. 本文应用高分辨核磁共振波谱技术对鸡胚发育过程初期羊水中的主要代谢物进行了分析, 检测到了氨基酸脂类葡萄糖乳酸等 29 种代谢物, 并对它们的 1 H NMR 谱进行了归属. 关键词 : 鸡胚羊水 ; 1 H NMR 归属 ; 代谢物中图分类号 :O 文献标识码 :A 1 引言鸡蛋的孵化过程是一个十分复杂的生命活动过程, 其中包括多种多样的生物化学和生物物理变化. 在鸡胚孵化的第 3 天, 羊膜腔形成, 其中很快就积聚了羊水. 胚胎始终漂浮在羊水中, 这样可以减小外界碰撞对胚胎的损伤, 同时, 胚胎在羊水中的运动对其正常发育有促进作用 [1,2]. 从第 13 天开始, 胚胎逐渐吸收羊水, 当胚胎发育成熟时 ( 约 18 天 ), 羊水几乎全部被吸收掉 [1]. 在胚胎的发育过程中, 羊水血液和尿囊中的营养物质之间存在着荷尔蒙调控的单向或双向交换 [3~6]. 尿囊液与羊水之间的交换, 可以防止鸡胚胎腹部畸形的发生 [4,5]. 因此, 分析羊水的组成及相对含量对于研究鸡胚的发育有重要的意义. 核磁共振波谱法 (NMR) 集定性定量和分离技术于一体, 在复杂体系 ( 如体液组织或植物提取液等 ) 的无损分析中具有重要用途, 在研究药物的毒性和代谢等方面发挥着越来越大的作用 [8~12]. 早在 1980 年代初期就有人把 NMR 用于研究人羊水 [13~15]. 收稿日期 : ; 收修改稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 作者简介 : 冯越 (1975), 男, 陕西咸阳人, 硕士研究生通讯联系人电话 : 传真 : ml.liu@wipm.ac.cn

2 138 波谱学杂志第 19 卷 Nelson 等归属出了羊水中 18 种代谢物的 360 MHz 1 H NMR 谱 [16]. 此后, 有关人羊水中部分代谢物的含量及其与孕期和胎儿生长状况的关系的 NMR 研究报道不断出现 [17~21]. 作为鸡胚胎发育过程的核磁共振成象和波谱学研究的第一步, 我们把 NMR 技术用于鸡胚羊水的分析, 鉴定并且归属了 29 种组分的 1 H NMR 谱. 2 实验实验用新鲜的受精鸡蛋, 在孵化箱中进行孵化, 温度 311±0.2K, 相对湿度 70%. 取孵化 5 天的鸡蛋, 固定好之后用镊子小心地剥去顶部的一小部分蛋壳和壳膜, 暴露出胚胎, 用一次性注射器抽取其羊水 0.5mL, 加入 0.05mL 重水 (D 2O) 用于谱仪频率锁定, 制成待测样品. 所有 NMR 实验在 BrukerARX500 高分辨核磁共振谱仪进行, 质子共振频率 MHz. 使用 5mm 双共振反相探头. 实验温度 298.2K. 采用预饱和脉冲 (2s,50Hz) 抑制水共振峰,30 激发角单脉冲方法采集一维 (1D) 1 H NMR 谱, 谱宽 6kHz, 采样点数 16k, 累加次数 128.Fourier 变换 (FT) 前用高斯函数 (0.4 Hz) 对时域数据作权重处理, 同时填零至 32k, 以提高分辨率. 二维 (2D) 1 H 1 H COSY 实验的谱宽为 4.5kHz, 犉 1 和犉 2 维采样点数分别为 512 和 2048, 累加 32 次, 在恢复期间 (2s) 和演化期间均进行水峰抑制 (50Hz),Fourier 变换前犉 1 维填零至 H NMR 谱的归属从图 1 所示的羊水的 1D 1 H NMR 谱 ( 部分区域作了放大 ) 可以看出, 羊水中所含的物质十分复杂, 除含量较大的水 ( 吸收峰已被抑制 ) 和脂类物质 ( 图中较宽的共振峰 ) 之外, 还有种类繁多的氨基酸有机酸糖类和其他一些有机小分子物质 [27]. 其中部分物质由于含量较低, 1 H NMR 信号很弱, 在高场区 (δ0.5~4.5) 谱峰严重重叠, 这些都给 [12] 谱峰的归属带来困难. 由于鸡胚羊水 NMR 谱没有报道, 人羊水的 NMR 数据也不全, [27] 而鸡胚羊水中的代谢物绝大多数也存在于血清中, 比较羊水的 1 H NMR 谱和人血清的 1 [9] H NMR 谱可以发现, 除了羊水中蛋白质含量较少外, 尖锐的共振峰的位置和形状极为相似, 说明两者所含的小分子代谢物的种类基本相同. 这些小分子共振峰的相对强 [10] 度不同, 表明它们的相对含量有差异. 比较已有的 NMR 数据就可以对鸡胚羊水的 1 H NMR 谱中的大多数共振峰进行可靠归属. 如在 δ1.33 的双峰和 δ4.12 的四重峰, 在 COSY( 图 2) 谱中相应的位置上有明显的交叉峰, 可以分别指定为乳酸的甲基和 αh 的共振峰.δ5.24 和 δ4.65 处的特征的二重峰分别是 α 葡萄糖和 β 葡萄糖 1 位质子的共振信号. 在 δ1.0 附近可以清晰的分辨出缬氨酸的两个甲基质子的两组特征的二重峰 (δ0. 98,δ1.04), 在 COSY 谱可以清楚地观察到 βh(δ2.25) 和 αh(δ3.59) 的交叉峰. 异亮氨酸的两个甲基峰出现在 δ0.92 处 ( 三重峰 ) 和 δ1.01 处 ( 二重峰 ). 亮氨酸的两个甲基峰别出现在 δ0.94( 二重峰 ) 和 δ0.96 处 ( 二重峰 ). 低场区 (δ8.50~ 6.50) 吸收峰的特征明显又没有重叠, 比较容易归属 ( 图 1). 对于重叠严重的 NMR 谱的归属,COSY 谱的优势能够得到充分体现. 从图 2 所示的部分 COSY 谱很容易找到天冬氨酸 (δ2.64 和 δ2.80) 和天冬酰胺 (δ2.77 和 δ2.89)

3 第 2 期冯越等 : 鸡胚羊水的核磁共振波谱分析 139 的两个磁不对称的 βch 2 之间的交叉峰, 进而使 αch 的位置得以确定 ( 图 2, 表 1). 肌醇瓜氨酸赖氨酸和苏氨酸等的存在及其共振峰的化学位移也通过 COSY 谱中的交叉峰得到确证 ( 表 1). 谷氨酰胺和谷氨酸 αh 的化学位移十分接近并受脂肪宽峰的影响而分辨不清, 但它们的两个 βch 2 的化学位移有所区别, 通过 COSY 谱中的交叉峰可以得到归属 ( 图 2). 图 1 鸡胚羊水的一维 1 H NMR 谱. 部分区域进行了放大. 标注了主要共振峰的归属, 其中 L1L10 为脂类物质的共振峰 :L1,CH3;L2,(CH2) 狀 ;L3,CH2CH2CO;L4, CH2 CH ;L5,CH2CO;L6, CHCH2 CH ;L78,CH2OCOR;L9,CHOCOR;L10, CH. Fig MHz1D 1 H NMRspectrumofchickamnioticfluid.Partsofthespectrum wereenlargedand plotedasinert.assignmentsofthemajorresonanceswerelabeled,wherel1l10representthereso nancesoflipids:l1,ch3;l2,(ch2) 狀 ;L3,CH2CH2CO;L4, CH2 CH ;L5,CH2CO;L6, CHCH2 CH ;L78,CH2OCOR;L9,CHOCOR;L10, CH. 鸡胚羊水中的脂类物质有很强的 NMR 共振峰 ( 图 1,L1L10), 可能与脂类在卵黄中含量比较高有关. 各个共振峰的位置根据 COSY 谱 ( 图 2) 提供的耦合关系和文献 [9~ 12] 进行归属, 其中 L1 为 CH 3,L2 为 (CH 2 ) 狀,L3 为 CH 2CH 2CO,L4 为 CH 2 CH, L5 为 CH 2CO,L6 为 CHCH 2 CH,L7,L8 为甘油脂 CH 2OCOR,L9 为甘油脂 CHOCOR,L10 为 CH. 说明这些脂类物质中包括低密度脂蛋白 (L1L3,L5) 不饱和脂 (L2,L4,L6,L10) 和甘油脂 (L7L9) 等. 表 1 列出了鸡胚羊水中所含主要物质及其 1 H NMR 谱的归属.

4 140 波谱学杂志第 19 卷表 1 鸡胚羊水中主要物质及其 1 H NMR 谱的归属 Tab.1 Assignmentsof 1 H NMRofamnioticfluidofchickembryo δ No. Compound 1 Hchemicalshiftandmultiplicity 1 lipid(mainlyvldl) 0.88(t);1.27 (m);1.57(m);2.23(m) 2 isoleucine 0.92(t);1.01(d);1.28;1.47;1.96;3.65(d) 3 leucine 0.94(d);0.96(d);1.70(m);3.72(dd) 4 valine 0.98(d);1.04(d);2.25;3.59(d) 5 3hydroxybutyrate 1.19(d);2.31(m);2.38(m); threonine 1.32;3.60(d);4.25(m) 7 citruline 1.57;1.85(m);3.15(t);3.70(m) 8 proline 1.99;2.05;2.34(m);3.34(m);3.45(m); methionine 2.14(s);2.16(m);2.64(t); pyruvate 2.38(s) 11 glutamine 2.10;2.44(m);3.72(m) 12 glutamate 2.06;2.34(m);3.71(m) 13 alanine 1.47(d);3.77(q) 14 unsaturatedlipids 1.30(m);2.01(m);2.75(m);5.31(m) 15 lactate 1.33(d);4.12(q) 16 lysine 1.48(m);1.72(m);1.92(m);3.03(t);3.75(t) 17 citrate 2.54(d);2.70(d); 18 aspartate 2.64(dd);2.80(dd);3.94(dd) 19 asparagine 2.77(dd);2.89(dd);3.98(dd) 20 tyrosine 3.02(dd);3.17(dd);3.90(dd);6.88(d);7.18(d) 21 histidine 3.08(dd);3.26;3.95(t);7.03(s);7.74(s) 22 choline 3.22(s);3.66(m);4.29(m); 23 βglucose 3.25(dd);3.41(t);3.45(dd);3.47(m);3.72(m);3.92(dd);4.65(d) 24 αglucose 3.42(t);3.53(dd);3.71(t);3.76(m);3.83(dd);3.84(m);5.24(d) 25 phenylalanine 3.08(dd);3.26;3.92(t);7.33(d);7.37(t);7.43(t) 26 tryptophan 3.11;3.23;4.65;7.19;7.28(t);7.54(d);7.75(d) 27 myoinositol 3.28(t);3.56(dd);3.63(dd);4.06(t) 28 glyceryloflipids 4.07(m);4.27(m);5.20(m) 29 formate 8.46(s) :s,singlet;d,doublet;dd,doubletdoublet;t,triplet;m multiplet.chemicalshiftreferencedtoch3oflactateat 1.33for 1 H. 4 结论本文应用 1D NMR 和 2DCOSY 方法确定了羊水中主要代谢物及其共振峰的归属, 结果表明羊水的高分辨 1 H NMR 谱能够提供丰富的生化组成信息. 由于 NMR 实验无需任何样品预处理, 因此, 能够准确反映和监测鸡胚的自然孵化和发育过程中的生物化学过程. 此外, 利用定量 NMR 的方法还可对孵化过程中羊水中代谢物的物质含量变化进

5 第 2 期冯越等 : 鸡胚羊水的核磁共振波谱分析 141 行跟踪观测, 进而研究鸡胚发育过程中所吸收的营养物质和代谢的产物是否有种类或数量上的改变. 图 2 鸡胚羊水的二维 1 H 1 H COSY 谱. 图中交叉峰的归属 (1~29) 见表 1 Fig MHz2D 1 H 1 H COSYspectrumofamnioticfluidofchickembryo.Assignmentsofthe numberedcrosspeaksaregivenintab.1 参考文献 [1] SmithA H,AbbotU K,MorzentiA.Physiologist[J],1984,27: [2] 蒋日希东. 鸡胚发育图谱 [M]. 北京 : 科学出版社,1983. [3] HohlwegA,HareT,MilakofskyL, 犲狋犪犾.GenCompEndocrinol[J],1999,114(3): [4] OlgunerM,AkgurF M,OzdemirT, 犲狋犪犾.PediatrNeurosurg[J],2000,33(5): [5] AktugT,UcanB,OlgunerM, 犲狋犪犾.EurJPediatrSurg[J],1998,8(6):

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138 波 谱 学 杂 志 第 19 卷 Nelson 等 归 属 出 了 羊 水 中 18 种 代 谢 物 的 360 MHz 1 H NMR 谱 [16]. 此 后, 有 关 人 羊 水 中 部 分 代 谢 物 的 含 量 及 其 与 孕 期 和 胎 儿 生 长 状 况 的 关 系 的 NMR

138 波谱学杂志第 19 卷 Nelson 等归属出了羊水中 18 种代谢物的 360 MHz 1 H NMR 谱 [16]. 此后, 有关人羊水中部分代谢物的含量及其与孕期和胎儿生长状况的关系的 NMR