新穎奈米質譜技術在生醫檢測的運用

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1 一無所知和勇氣的交會 : 當質譜學遇上疾病蛋白質體 1

2 摘要 (I) 蛋白質和蛋白質體生命的行為長久以來一直是人類試圖去探討的問題, 在早期的研究中, 對於生物體的活動. 包括生物的代謝, 細胞的複製, 生物間的訊息傳遞, 科學家比較著重於基因的層次. 因此延生出基因體學的出現, 在 2003 年人體的基因秘碼已經完全被解出. 所以科學家開始對真正在執行功能的蛋白質著手進行研究, 進而延生出了蛋白質體學的發展蛋白質是主要表現生命行為的分子, 當生物體受到外來物質的刺激或是體內發生不正常的異變時, 例如癌細胞的分化, 體內一些調控蛋白質的含量可能會產生改變, 可能是含量的增加或減少, 例如一些肝癌患者血液當中的 AFP 這個蛋白質的含量會增加, 像這些會因為疾病而變化的蛋白質, 我們稱之為標記蛋白質, 藉由這些蛋白質含量的改變, 我們可以進行疾病的檢測. 然而標記蛋白質在一些體液的含量可能是相當稀少的, 如何開發一個簡單而且靈敏的檢測方法是化學家的首要任務之一 2

3 (II) 以質譜儀鑑定蛋白質身份質譜法是一門在 20 世紀初期即已啟蒙的古老技術, 這項技術可測量世界上最小的物質之一 - 原子及分子的重量, 質譜儀由五年的曼哈頓計畫, 歷經七年石油化學八年的醫藥工業的快速發展, 成為化學及醫藥領域極為重要的儀器 Henzel Stults 及 Watanabe 等結合生物質譜法及電腦的跨領域研究群發明蛋白質質量指紋鍵鑑定技術, 將蛋白質切碎後, 可由這些碎片的質譜圖, 利用生物資訊軟體在電腦資料庫中作比對, 即可分析出蛋白質的名稱, 好比警察可利用犯罪現場的一個指紋, 以電腦比對找出嫌犯的身分這個革命性的技術催生了一門新興的領域蛋白質體學, 蛋白質體學彷彿一個在細胞內神秘而令人著迷的探險, 經由比較在不同生理狀態下的蛋白質差異, 或探索彼此之間的關係, 我們可以了解疾病及生命在不同階段或生理狀態之關連質譜儀成了開啟生命科學之秘的鑰匙, 透過生化分子的微觀角度, 我們可以研究生命的各個面相, 醫生們得以尋找癌症病人血液中特有的蛋白質, 以作為診斷或醫療的標記蛋白, 一滴血, 為臨床醫療帶來了期待與未來, 在基礎研究上, 結合分子生物技術, 科學家們解出了細胞內密密麻麻互相作用的蛋白質網路 3

4 (III) 蛋白質作為疾病檢測之標的奈米科技在我們的生活中已經儼然成為了一個尖端科技的代名詞, 奈米科技的意義到底是什麼? 簡單的來說, 奈米科技就是一項能將分子變的相當微小的技術, 在單位上一奈米就等於 10 的負九次方米, 奈米粒子的微小尺寸也正好可以解決我們在上述標記蛋白質檢測所遇到的問題, 因為表面積和半徑成反比, 因此奈米粒子具有很大的表面積, 讓我們可以在粒子表面上裝配許多不同的蛋白質, 例如可以裝配上抗體, 像釣魚一般, 將我們所要研究的蛋白質從複雜的血液當中分離, 濃縮, 純化出來. 再利用質譜儀可以測定蛋白質的種類, 利用此種技術我們可以運用在一些癌症病人血液當中的標記蛋白質的檢測, 來研究這些蛋白質在正常與病人的變化量. 可以運用在一些快速的高通量藥物篩檢, 蛋白質的純化, 一些致病原的檢測, 例如病毒是否感染人體. 也可以去看蛋白質之間的互相影響的結合位置, 進而提供新藥開發的新方向. 4

5 延平中學 - 書蟲的日子 ( ) 上學放學讀書自閉. 上學放學讀書自閉. 5

6 臺大化學系 - 多彩的生活 ( ) 專題研究 - 原分所曾文碧教授 6

7 進入研究的殿堂 - PhD study at Iowa State University, USA Cheuk Yiu Ng 努力 + 努力 + 努力 + 專心 + 堅持 + 不服輸 + 9:00 am -10:00 pm, Monday-Friday (Saturday) 晴天陰天雨天下雪天寒流天 ( 零下 50F) 7

挑戰新的研究課題 - Postdoc study, 清華大學 1998-1999 李遠鵬教授 10:00 am

8 挑戰新的研究課題 - Postdoc study, 清華大學李遠鵬教授 10:00 am -12:00 pm 2:00 pm 星期一星期五星期三 / 星期五回家努力 + 努力 + 努力 + 接受挫折 + 8

9 回到 1999 年中研院化學所.... 做什麼研究??? 生物分子很有趣, 反正就是把你可以試試看啊! 分析樣品倒入質譜儀吧? 9

10 陳玉如中央研究院化學研究所年臺北市延平中學年國立台灣大學化學學士年美國愛荷華州立大學物理化學博士 86 年美國 Ames 實驗室博士後研究員年國立清華大學博士後研究員年中央研究院 NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 榮譽 : 2008 吳大猷先生紀念獎行政院國家科學委員會 2008 年輕學者著作獎 ( 數理組跨生命組 ) 中央研究院 2007 傑出青年化學家獎 Federation of Asian Chemical Societies 2006 傑出青年獎中國化學會生化質譜技術實驗室 10

11 我是誰?? 肉體的存在? 腦指揮中心? 感覺? 其他? 達爾文進化論上帝是外星人指揮官 11

12 生命的起源 -DNA 科學發展 2004 年 6 月,378 期 DNA 也就是所謂的去氧核醣核酸 DNA 是一條很長的雙鍊分子很密集地纏繞在染色體中上面有四種含氮的鹼基, 簡稱為氮基分別縮寫成 A T G C 它們在 DNA 雙鍊分子中間, 12 以 A-T 與 G-C 的方式排列在其上, 因而形成遺傳密碼

13 人類基因組簡介人體中有六兆個細胞, 每個細胞中間都有個核染色體即位於細胞核內人類的染色體有廿三對 ( 四十六個 ), 每對都是一半遺傳自生父, 一半自生母 13

14 人類基因組解碼計劃 (1988) 目標 - 解讀構成人類二十三對染色體所記錄的鹼基 (nucleotide), 並尋找出多達十四萬各別基因 (gene) 的位置及功能團隊美國聯邦能源部 (Department 0f Energy) 美國國家衛生院 (National Institutes of Health) 美國基因科技大廠 - 賽勒拉 ( Celera Genomics) 生物科技公司 (1997 加入 ) 14

15 DNA 定序方法 : 衝鋒槍法 (Shotgun sequencing) 1. 用不同的限制酶去切割 DNA 產生各種不同的小片段基因定序染色體 2. 定出小片段序列 3. 再運用電腦運算, 拼湊出完整的序列. ( 利用碎列片段不同, 但是會有重複的序列而定出一段完整的序列 ) 15

16 人類基因定序完成 2003, 4, 14 由中法德日英美等 6 國合作的人類基因組定序計畫業已完成人體約有萬個基因, 其中約有 3 萬個功能基因 16

17 人類基因圖譜 3 萬個功能基因生命的藍圖從前只有上帝才知悉內容的手冊, 我們已略窺其堂奧了 17

18 Genomics ( 基因體學 ) 1953: Watson and Crick: DNA double helix C. Elegans (1998, Danio rerio genes) Rattus norvegicus Anopheles gambiae (2002, genes) Homo sapiens (2001) Fugu rubripes (2002, genes) Drosophila melanogaster (2000, genes) 18 Mus musculus (2002, genes)

19 林大師與猩猩的相似度? 林志民 Chimpanzee 人類 98% 的 DNA 和猩猩一模一樣 Nature Sep 1;437(7055):

20 人類基因組的相似度??? 金城武史蒂芬霍金林志民 20

21 J. Craig Venter, Ph.D J. Craig Venter Institute 是一位生物學家, 同時也是企業家人類基因體計畫中, 是兩個解密人類基因序列團隊之一, 一個私人機構 Celera Genomics 基因公司的總裁, 他曾試圖將定序後的基因申請專利, 堅持要使用解密出來的基因體序列必須付費, 但最後敗訴 2007 年, J. Craig Venter 發表個人雙套染色體基因體序列 21

22 人與人的相似度? 人與人的相似度高達 99.5% 22

23 DNA 轉錄產生 RNA 基因轉錄與轉譯 RNA 聚合脢 mrna RNA 轉譯產生蛋白質 trna 核醣體胺基酸 mrna 密碼子

24 蛋白質的合成示意圖 24

25 DNA mrna Protein 基因藉密碼子決定蛋白質中胺基酸的種類和序列蛋白質是維持細胞生理功能的重要物質 25

基因突變造成蛋白質表現異常資料來源 :(A)Audesirk, T. and G. Audesirk. 1999. Biology.

26 基因突變造成蛋白質表現異常資料來源 :(A)Audesirk, T. and G. Audesirk Biology. Prentice Hall, p.217, Fig (B)Audesirk, T. and G. Audesirk Biology. Prentice Hall, p.217

27 蛋白質體 (proteome) 1994 年澳洲生物科學家 (Marc Wilkins) 第一次提出蛋白質體學 (Proteomics) Marc Wilkins The University of New South Wales (UNSW), Australia 相對於基因體 (genome) 所表達的意涵是某生物中所有基因的總稱, 蛋白質體 (proteome) 則是用來表達某生物中根據所有基因體所表現出來之所有蛋白質的集合總稱 27 吳啟裕博士

28 蛋白質體學 (proteomics) 簡單地說, 蛋白質體學是針對整體蛋白質作定性定量及功能的分析, 但由於蛋白體在數量及結構上的複雜性遠超過基因體, 人類 30,000 個基因所能表現的蛋白質即可能超過 100,000 個, 再加上轉譯後修飾作用 (post-translational modification,ptm), 其複雜性難以估計蛋白質表現程度轉譯後的蛋白質修飾作用蛋白質之折疊立體結構決定蛋白質蛋白質之間交互作法 28

29 如何鑑定蛋白質身份? 以質譜法探索生命的蛋白質網路? 29

30 蛋白質體學三大關鍵技術分離方法 Postseparation chemistry Staining/imaging digestion 質譜儀 Protein separation 1D/2D gels LC Microfludic chips MDLC Mass analysis MALDI-TOF PMF ESI-MS/MS Sample preparation 2-D based experimental flow Data analysis µ-dissection, cell sorting, lysis, sub-cellular fractionation 生物資訊 reduction of spectral information to protein ID and characterization, database searching 30

質譜儀在生物科技之應用 + + + + + + + + + + 質譜技術在 20 世紀初期即已啟蒙, 由於高準確性高靈敏度及快速分析等特質, 在基礎物理化學現象, 有機及無機物分析等各領域有廣泛的應用近年來, 源於新興的質譜法出現, 再加上基因體及蛋白質體研究的蓬勃發展, 質譜技術被大量應用於生物分子的分析,

31 質譜儀在生物科技之應用質譜技術在 20 世紀初期即已啟蒙, 由於高準確性高靈敏度及快速分析等特質, 在基礎物理化學現象, 有機及無機物分析等各領域有廣泛的應用近年來, 源於新興的質譜法出現, 再加上基因體及蛋白質體研究的蓬勃發展, 質譜技術被大量應用於生物分子的分析, 以質譜儀為主的技術平台已成為生命科學研究主力工具之一, 其快速的鑑定及定性定量分析, 對生命科學臨床醫學都提供了革命性的分析工具, 而生物分子的複雜性也間接驅使了高靈敏生物質譜的開發, 不論在游離方法的開發偵測的靈敏度解析度或精確度方面, 都以讓人應接不暇的高倍率成長, 本課程將介紹生物質譜法的基本原理及其應用

32 Mass Spectrometer ( 質譜儀 ) 量測分子重量的磅秤質譜儀是分析離子的質量 / 電荷比 ( 質荷比 ) 的儀器可以分辨具有相異質荷比的不同離子, 也能對特定離子進行定性與定量分析 M M + or M m/z (mass-to-charge ratio) 32

J.J. Thomson delivers his Bakerian Lecture, Rays of Positive

33 Back to the history 為兩種氖同位素 : 氖 -20(neon-20) 氖 -22(neon-22) J.J. Thomson J.J. Thomson observes a line at mass 22 in the spectrum of neon. J.J. Thomson delivers his Bakerian Lecture, Rays of Positive Electricity to the Royal Society of 33 London.

34 Francis Aston is awarded the Nobel Prize in chemistry for his discovery of isotopes of inactive elements. Francis Aston 34

Advances in Modern Mass Spectrometry Limitations

High molecular weight >50,000 Amount of Sample <

Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MS

35 Advances in Modern Mass Spectrometry Limitations of traditional MS on biological applications High molecular weight >50,000 Amount of Sample < mole ElectroSpray Ionization MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MS John B. Fenn ESI 2002 Nobel Prize Koichi Tanaka MALDI 35

36 Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) 基質輔助雷射脫附游離法 36

37 基質輔助雷射脫附游離法 (MALDI-TOF MS) + 分子游離化高壓電高壓電 + 基質結晶飛行時間 + + 終點 - 偵測器 ev=1/2 mv 2 獲得相同動能的分子, 分子量越大質荷比飛行速度越慢, 飛行的時間則越長, 越晚到偵測器 37

38 中央研究院化學所 (1999-) - 從一無所知開始學習糟糕, 什麼都不會!! ESI? MALDI? 什麼是蛋白質? 什麼是氨基酸?? 什麼是蛋白質體學? 註 : 生物背景國中生物 38

Mass=1015 Da H 3 N + - Y ion : Gly 57 B ion : 2464 Ile 113 Val 99 171.1 2351 270.1 2252 Cys 103 Glu 129 373.1 2149 502.2 2202 Gln 128 Ala 71 630.2 1891 701.3 1820 Ser 87 788.3 901.

39 Mass=1015 Da H 3 N + - Y ion : Gly 57 B ion : 2464 Ile 113 Val Cys 103 Glu Gln 128 Ala Ser Leu Asp Arg COO- Asn Lys His Leu Thr Tyr Mass = 1050 Da 1746 Phe Lys Pro Val 99 Cys Mass = 455 Da 1349

40 Peptide Mass Fingerprinting 蛋白質身份鑑定 H 2 N - - COOH 40

41 步驟一 : 以酵素將蛋白質切成碎片 H 2 N - Protein Cys Lys Arg - COOH Reduction / Alkylation Tryptic Digest 每一個蛋白質有一套獨特的 peptide 碎片 41

42 步驟二 : 將 peptide 碎片作質譜分析 m 1 m 2 A unique list m 3 m 4 m 1 m 2 Peptide Mixtures m 5 Peptide Mass Lists for each protein in Database m 3 m 4 % Intensity m 3 Mass Spectrum m 1 Extraction, clean up Mass Spectrometry Analysis m 4 m 2 m 5 m m/z

43 步驟三 : 將質譜圖送到電腦資料庫比對 Digest Reagents Peptide Properties Mol Weight Isoelectric Point Database Tolerance Exclude List Modification Hits to return Fixed Optional Peptide Match 43

44 Intensity 步驟四 : 電腦蛋白質資料庫計算 % 蛋白質序列 MVYIIAEIGC NHNGDINLAK KMVDVAVSCG VDAVKFQTFK AEKLISKFAP KAEYQKATTG TADSQLEMTK RLELSFEEYL EMRDYAISKG VETFSTPFDE ESLEFLISTD MPIYKIPSGE ITNLPYLEKI GKQQKKVILS TGMAVMEEIH QAVNILRQNG TTDISILHCT TEYPTPYPSL NLNVIHTLKD EFKDLTIGYS DHSIGSEVPI AAAAMGAEVI EKHFTLDTNM EVPDHKASAT PDILAALVKG FALLNQALGR FEKIPDPVEE KNKIVARKSV VALKPIKKGD IYSIENITVK RPGNGISPMN WYDILGQEAQ DDFEEDEVIR DSRFENQLPE LHHHHHH m/z Digestion 3000 Mass Peptide Sequence QNGTTDISILHCTTEYPTPY PSLNLNVIHTLK RPGNGISPMNWYDILGQEAQ DDFEEDEVIR GVETFSTPFDEESLEFLIST DMPIYK DLTIGYSDHSIGSEVPIAAA AMGAEVIEK VILSTGMAVMEEIHQAVNIL R MVYIIAEIGCNHNGDINLAK FENQLPELHHHHHH HFTLDTNMEVPDHK IPSGEITNLPYLEK LELSFEEYLEMR ATTGTADSQLEMTK MVDVAVSCGVDAVK GDIYSIENITVK ASATPDILAALVK GFALLNQALGR SVVALKPIK IPDPVEEK DYAISK FQTFK AEYQK DEFK 44

45 Peptide Mass Fingerprinting (PMF) 蛋白質身份鑑定 In-Gel Digestion Extract peptides; mass analyze Each protein has a unique peptide mass list Database search 45

46 面對陌生的的領域一無所知從哪裡開始呢? 46

47 陳水田教授阮雪芬教授 47

48 數目龐大的蛋白質體 Haemophilus 1742 E. coli 4413 Yeast 6600 Caenorhabditis Drosophila Human

49 Principle of Electrophoresis ( 電泳 ) - v = m E v = migration velocity (cm/s) m = electrophoretic mobility (cm 2 /V s) charge, size, shape of molecule, viscosity, pore size, buffer ph and ionic strength, temperature of medium

50 2003 SARS 病毒大舉侵害人類 www-micro.msb.le.ac.uk Probable SARS Case Distribution in Taiwan 50

51 每個蛋白質有不同的大小體積 SARS 病人的血液蛋白質圖譜 (A) (A) Ⅱ Ⅰ (B) Ⅰ Ⅱ Control (n=20) SARS (n=40) Ⅳ Ⅲ 1 Ⅴ Ⅲ Ⅳ Ⅴ ph 4 每個蛋白質有不同的酸鹼值 Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101, (2004) ph 7 Normal Patient n=20 n=40 51

52 找到 Prx II 蛋白質和 SARS 進展有相關性 April. 29 May 5 Prx II: peroredoxin II May 8 May 10 May 12 Prx II was detected in 36% (15 of 42) of samples from patients with SARS, and it has been reported to inhibit the HIV virus Secreted from T lymphocyte earlier than antibody secretion Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 101, (2004) 52

53 不滿足現況.. 遇到了瓶頸 Glutathione peroxidase Peroxiredoxin II Antithrombin III fragment Thrombin Kininogen Angiotensinogen Complement C4 fragment Complement C3 fragment Mannose-binding protein Retinol-binding protein Vitamin-D-binding protein Serum amyloid A Haptoglobin beta-chain fragment Tetranectin 怎麼總是看到發炎反應相關的蛋白質 53

54 不滿足現況可以發展更靈敏的偵測方法, 找到更多和疾病有關的蛋白質嗎 54

55 細胞上的捍衛戰士 - 膜蛋白質物質 ( 藥物 ) 輸送接受訊息分子 / 細胞 / 細菌辨識 55

56 Methodology Development for Proteomics Surfacefunctionalized nanomaterial Advanced mass spectrometry + + Bioinformatic Algorithm Disease proteomic profiling and diagnosis PNAS, 2004, Proteomics, 2004, J.Proteome Res., 2006, J. Hum Genet, 2005, Clin. Chem, 2006 Nanoprobe-based affinity mass spectrometry Anal Chem. 2005, 2006, 2007, 2008, 2009; ChemBioChem., 2005; Small,, 2006, Proteomics, 2007, J. Proteome Res New proteomics strategies for membrane proteome, phosphoprotome, nitrosylproteome J. Proteome Res. 2008, 2009; Proteomics, 2008, J. Am. Chem. Soc. 2008, Mol. Cell. Proteomics, 2008, 2009, 2010

Data Preparation Computational tools for Quantitative Proteomics MS/MS labeling

mzxml format Labeling itraq TM 16 O/ 18 O Multi-Q J. Proteome Res.

Nucl. Acids Res., 2009 IDEAL-Q De novo sequencing Blast Mol. Cell. Proteomics.

57 Data Preparation Computational tools for Quantitative Proteomics MS/MS labeling MS labeling Data Interpretation Converter Converter Converter Converter Mass Data mzxml format Labeling itraq TM 16 O/ 18 O Multi-Q J. Proteome Res., 2006 Spectra (peak list and LC-MS data) Spectrum 1 Spectrum 2 Peptide Database Approach Mascot, SEQUEST X!Tandem, InsPecT Protein Score Validation Label-free SILAC ICAT 14 N/ 15 N MaXIC-Q Nucl. Acids Res., 2009 IDEAL-Q De novo sequencing Blast Mol. Cell. Proteomics., 2010 Identification Quantitation & Data Analysis Collaborated with Dr. Ting-Yi Sung & Dr. Wen-Lian Hsu (Institute of Information Science, Academia Sinica) 57

58 A New Quantitative Strategy for Membrane Proteomics Lysis Centrifugation Reduction Alkylation Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Cell State 1 Cell State 2 Membrane Fraction Membrane Fraction Gel-assisted digestion Cell State 3 Cell State 4 Membrane Fraction Membrane Fraction Isobaric Tags for Related and Absolute Quantitation NH NH NH NH NH NH NH NH NH Proteomics, 2008 Mol. Cell. Proteomics, 2008 Retention Time MS Scan m/z MS/MS Scan m/z 58

59 Systematic Manifestation of the Membrane Proteome in Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease ADPKD mice model Pkd1 Conditional Knockout by Dr. Hung LI, Academia Sinica 845 proteins are quantified (False discovery rate =0) Mol. Cell. Proteomics, 2008, 7,

60 蛋白質作為疾病檢測之標的當蛋白質和奈米科技在後基因體時代相遇 60

61 標記蛋白質標正常人當人在發生疾病時身體當中會大量表現某種特定的蛋白質, 我們在臨床上會用此種蛋白質來做檢測. 我們稱之為標記蛋白質病人因為發炎而大量表現的蛋白質發炎 61

CA19-9 抗原胰臟癌大腸癌胃癌肺癌膽道癌卵巢癌肝癌食道癌乳癌淋巴癌 (4). 前列腺特異抗原 PSA 前列腺癌 (5).

62 疾病的預防及早期診斷藥物治療的成效研究疾病的機制癌症篩檢標記蛋白質的重要性臨床癌症篩檢項目 (1). 甲種胎兒蛋白 α-fp 肝細胞癌 (2). 癌胚抗原 (CEA) 大腸癌胃癌食道腺癌胰臟癌膽道癌肺癌乳癌肝細胞癌卵巢癌甲狀腺隨樣癌癌症標記蛋白質 (3). CA19-9 抗原胰臟癌大腸癌胃癌肺癌膽道癌卵巢癌肝癌食道癌乳癌淋巴癌 (4). 前列腺特異抗原 PSA 前列腺癌 (5). CA125 卵巢癌子宮頸癌胰臟癌肺癌大腸癌膽道癌肝癌子宮內膜癌胃癌良性卵巢腫瘤 (6). CA153 乳癌 62 C 反應蛋白檢測 CRP 當體內有急性炎症或細菌感染

63 血漿中蛋白質的組成複雜, 濃度差異很大含有許多標記蛋白質 0-90% 90-99% Fig. Pie chart representing the relative contribution of proteins within plasma. Twenty-two proteins constitute 99% of the protein content of plasma 63 Ref: Molecular & Cellular Proteomics 2: , 2003

64 癌症標記蛋白質的濃度 Biomarker Cancer Type Concentration [pmol/liter] a-fetoprotein (AFP) Hepatoma; testicular 150 PSA Prostate 140 Carcinoembryonic antigen Colon; breast; lung; pancreatic 30 Chroriogonadotropin (hcg) Testicular cancer; 20 Albumin 600,000,000 Immunoglobulins 30,000,000 64

003 公尺長 169,000 血漿蛋白質總量約 80 mg/ml 正常人 CRP

65 標記蛋白質的偵測難度相當於找尋 101 大樓上的一隻小螞蟻台北 101 大樓約 508 公尺高小螞蟻約公尺長 169,000 血漿蛋白質總量約 80 mg/ml 正常人 CRP 含量約 mg/ml 160,000 CRP (C-reactive protein): 和心血管疾病有關的標記蛋白質 65

66 特異性防衛抗原刺激細菌淋巴細胞製造抗體 66

67 抗原與抗體間的關係病毒或細菌抗原細菌抗體 1. 專一性 2. 記憶能力抗原 67

68 當科學走到奈米... 血滴紅血球 2~7 μm 68

69 蛋白質奈米科技的神奇之處??? 抗原抗體藥物分子分子等體積的分子, 體積越小, 總表面積越高, 可以裝備抗體的分子數量越多, 效率也就越高此外, 奈米等級的分子也會表現出不同的物理與化學特性球表面積 = 4πr 2 DNA 奈米級分子球表面積 / 球體積 = 3 / r 球體積 = 4/3πr 3 等體積時球半徑越小表面積越大 69

70 2 奈米粒子的製備 Fe 3 O 4 磁性奈米粒子 O O Si 3 NH O O Si O Si 3 NH O O 3 H N 6 O O (Linker) 6 H N 抗體 O Human Plasma (MEG-blocking) 2 O 4-50 nm = 2-50 x 10-9 m = 2-50 x 10-7 cm O O 6 NH O 標記蛋白質 O m/z (100nm) 70

71 以奈米粒子當釣餌的概念 Y Y NH 2 Silane Y NH2 NH 2 NH 2 Y 71

72 大海撈針林俊成教授 72

73 強度實驗流程圖血漿抽血取得全血樣品血液成份分離血球 Y Y NH 2 Silane Y Y NH2 NH 2 Y Y Y Y Y NH 2 Silane NH 2 NH 2 Silane Y NH2 Y Y NH 2 NH 2 NH2 Y NH2 Y Y NH NH 2 2 Silane NH 2 NH 2 B NH 2 Y 功能性磁性奈米粒子免疫親和反應濃縮及純化質譜分析質荷比 73

74 檢測蛋白質介紹血清澱粉蛋白 P 38.4 ± 9.3 mg/l Dement Geriatr Cogn Disord 9, 126-9, 1998 SAP 在蛋白質的澱粉樣變性時會快速增加, 所以被認為在一些澱粉樣變性的相關疾病中扮演著重要的角色, 例如阿茲海默症系統性類澱粉症或傳染性海綿狀腦病 C- 反應蛋白質 0.8 mg/l J. Clin. Invest. 111: (2003) CRP 已經是臨床檢驗應用上的一個重要因子, 用來檢測動脈粥狀硬化和冠狀動脈心臟病等舉例來說, 如果患者血液中的 C- 反應蛋白質濃度超過 2 mg/l, 心臟病發作的危險就會增加三倍, 中風的可能性也會加倍低含量 74

75 Relative Intensity (%) Y Y Axis Title Y Y Axis Title 特色 -- 高專一性據估計, 人的血漿中約有超過一百萬個不同的物質現代的蛋白質體技術, 已偵測到至少有兩千個蛋白質在人的血漿中相對強渡 (%) 100 血紅蛋白 [Hb-B] [Hb-B] + 載脂蛋白 [ApoA-I] [ApoA-I] + A1 50 [HSA] [HSA] 血清蛋白 C [CRP] [CRP] 反應蛋白 + [HSA] [HSA] + A B 質荷比 m/z 血清蛋白 CRP (C-reactive protein): 和心血管疾病有關的標記蛋白質 75

相對強渡 (%) 強渡 Intensity / 10 3 counts 特色高靈敏度 10 5 A (1.9 10-6 M) [SAP] + S/N = 904 0 10 B 蚊子吸一滴血約 40 微升 (4 10-5 升 ) 取 0.

76 相對強渡 (%) 強渡 Intensity / 10 3 counts 特色高靈敏度 10 5 A ( M) [SAP] + S/N = B 蚊子吸一滴血約 40 微升 ( 升 ) 取 0.1 微升的實驗結果血清澱粉質 P 成份 ( M) C ( M) D ( M) S/N = 594 S/N = 144 S/N = E (x10) ( M) S/N = 3 質荷比 m/z 質荷比 76

77 Relative 相對強渡 Intensity (%) 整個實驗流程在一小時內即可完成 Incubation time (min) 反應時間 ( 分鐘 ) 77

78 奈米質譜技術可針對不同生理狀態的人進行初步的篩選 C 反應蛋白

79 Enhanced, soft, background-free identification of diverse groups of small molecules by nanoparticle-assisted MALDI-TOF, see page xxx. Elsevier ISSN JASMS, 2011 封面故事 Small, 2006 封面故事 Anal, Chimic. Acta, 2011, 79 封面故事

80 蛋白質純化與分離致病原檢測高通量藥物篩檢磁性奈米粒子抗原決定區之定位 80

81 Synthesis / Nanomaterial 林俊成教授林俊宏教授 Cell Biology 邱繼輝教授廖楓教授詹爾昌教授李鴻教授張智芬教授余兆松教授中央研究院, 國科會 Biomedical science 陳振漢醫師楊泮池院士呂衍達醫師陳進勳醫師 Bioinformatics 許聞廉教授宋定懿教授巫坤品教授

82 蛋白質體的異想世界 By Sarah Mitchell, MCP, April

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计

《中国科学》A、E、G与F小开本版式设计 222 E 2006, 36(2): 222~234 * 1** 1,2 1,2 1,2 1,2 3 3 1 1 1,2 (1., 100080; 2., 100039; 3., 200031),. ;,,.. 20 90 (human genome project, HGP), ; HGP 2003, 21. (proteomics) ; (computational proteomics),,,