(19) 中华人民共和国国家知识产权局 (12) 发明专利申请 (21) 申请号 (22) 申请日 (71) 申请人上海科技大学地址上海市浦东新区华夏中路 393 号 (10) 申请公布号 CN A (43) 申

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韧桂
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1 (19) 中华人民共和国国家知识产权局 (12) 发明专利申请 (21) 申请号 (22) 申请日 (71) 申请人上海科技大学地址上海市浦东新区华夏中路 393 号 (10) 申请公布号 (43) 申请公布日 C07D 295/26( ) A61K 49/00( ) A61P 35/00( ) (72) 发明人姜标陈红莉黄容盛耀赵存良 (74) 专利代理机构上海申汇专利代理有限公司代理人翁若莹 (51)Int.Cl. A61K 47/54( ) A61K 47/64( ) A61K 47/68( ) A61K 31/40( ) 权利要求书 2 页 13 页附图 8 页 (54) 发明名称一种哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子及其制备方法与应用 (57) 摘要本发明提供了一种哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子, 其特征在于, 其结构式为 : 或其药学上可接受的盐 ; 其中 :L 为连接基团,D 为活性药物或荧光物质本发明提供一种新的哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子并应用到 ADC 的定位合成中

2 权利要求书 1/2 页 1. 一种哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子, 其特征在于, 其结构式为 : 或其药学上可接受的盐 ; 其中 :L 为连接基团,D 为活性药物或荧光物质 2. 如权利要求 1 所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子, 其特征在于, 所述连接基团为羧基胺基炔基或叠氮中的一种 3. 如权利要求 1 所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子, 其特征在于, 所述活性药物为美登素类耳抑素肽类卡其霉素类阿霉素类吡咯并苯二氮卓二聚体类雷公藤甲素类秋水仙碱类康普瑞汀类高三尖杉酯碱类喜树碱类紫杉醇类或雷公藤甲素类中的一种 4. 如权利要求 1 所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子, 其特征在于, 所述活性药物的结构式为 : 5. 权利要求 1~4 任一项所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子的制备方法, 其特征在于, 包括以下步骤 : 步骤 a: 化合物 Ⅰ 的合成 : 冰浴条件下, 将哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐溶于氢氧化钠水溶液中, 缓慢加入二碳酸叔丁酯 [(Boc)2O] 的二氧六环溶液 ; 然后室温反应 12h, 随后向反应体系中加入盐酸将反应液 ph 值调制 4 左右 ; 用乙酸乙酯萃取, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后, 得到化合物 Ⅰ; 步骤 b: 化合物 Ⅱ 的合成 : 将化合物 Ⅰ 炔丙胺 HATU N N- 二异丙基乙胺溶于 N N- 二甲基甲酰胺中, 在室温下搅拌反应 12h, 用水稀释反应液后, 乙酸乙酯萃取, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得粗品, 加入乙酸乙酯和 60~100 目硅胶, 拌匀旋干, 粗品经硅胶柱层析, 得到化合物 Ⅱ; 步骤 c: 化合物 Ⅲ 的合成 : 将化合物 Ⅱ 溶于二氯甲烷中, 冰浴下加入三氟乙酸, 逐渐升至室温, 共反应 6h, 减压旋转蒸除溶液后, 得到化合物 Ⅲ; 步骤 d: 化合物 Ⅳ 的合成 : 将化合物 Ⅲ 和 Et3N 溶于 DCM 中, 冰浴下冷却至 0 后缓慢加入 2- 氯乙烷磺酰氯, 室温下反应 20min, 加入水, 产物用 DCM 萃取, 合并后的有机相用饱和 NaCl 洗后用无水 Na2SO4 干燥, 减压旋蒸除去溶剂, 加入 CH2Cl2 和 60~100 目硅胶, 拌匀旋干, 采用乙酸乙酯 / 石油醚 =1/1 作洗脱剂, 快速柱层析, 得到化合物 Ⅳ; 步骤 e: 化合物 Ⅳ 的合成 : 2

3 权利要求书 2/2 页将化合物 Ⅳ 化合物 6 抗坏血酸钠和硫酸铜溶于 tbuoh/h2o/dmf(1/1/1) 中, 室温下反应 3h, 用制备 HPLC 分离得到化合物 Ⅴ, 即哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子 6. 如权利要求 5 所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子的制备方法, 其特征在于, 所述步骤 a 中哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐包括哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐 (R)- 哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐和 (S)- 哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐中的任意一种 7. 权利要求 1~4 任一项所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子在制备抗体药物偶联物中的应用 8. 一种靶向分子和活性药物分子偶联物, 其特征在于, 包含权利要求 1 所述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子结构, 其结构式为 : 或其药学上可接受的盐 ; 其中 :A 为靶向分子,L 为连接基团,D 为活性药物或荧光物质 9. 如权利要求 8 所述靶向分子和活性药物分子偶联物, 其特征在于, 所述靶向分子为抗体, 抗体片段替代体或变体, 多肽或小分子配体中的任意一种 10. 如权利要求 8 所述靶向分子和活性药物分子偶联物, 其特征在于, 所述靶向分子为曲妥珠单抗 ; 所述活性药物的结构式为 : 3

4 1/13 页一种哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子及其制备方法与应用技术领域 [0001] 本发明属于生物制药及生物技术领域, 涉及一种用于抗体药物偶联物的连接子及其制备方法和用途背景技术 [0002] 抗体 - 药物偶联物 (ADC) 是靶向治疗药物的热门领域随着用于治疗霍奇金淋巴瘤以及系统性间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL) 的 ADCs 药物 Adcetris 和用于治疗乳腺癌的 ADCs 药物 Kadcyla 分别于 2011 和 2013 年上市,ADCs 进入高速发展期 2017 年, 主要用于治疗急性髓细胞性白血病 (AML) 的 ADCs 药物 Mylotarg, 经历了 2000 年作为首例 ADCs 药物上市,2010 年由辉瑞公司主动撤出市场后, 又重获新生同时, 辉瑞公司推出另一个用于治疗急性淋巴细胞性白血病 (ALL) 的 ADCs 药物 Besponsa 2018 年, 用于毛细胞白血病的 ADCs 药物 Lumoxiti 上市另外还有超过 60 个 ADCs 正在进行临床前研究链接子的开发在 ADCs 的研发中非常重要, 它与 ADCs 的稳定性代谢安全性等密切相关相较于早期的非定位偶联, 定位偶联有明确的连接位点, 所得 ADC 均一性高, 有显著优势近期发展的硫 - 硫键桥连技术可针对抗体链间 4 对硫 - 硫键定位修饰发明内容 [0003] 本发明的目的是提供一种新的哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子及其制备方法与应用 [0004] 为了达到上述目的, 本发明提供了一种哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子, 其特征在于, 其结构式为 : [0005] [0006] 或其药学上可接受的盐 ; 其中 :L 为连接基团,D 为活性药物或荧光物质 [0007] 优选地, 所述连接基团为羧基胺基炔基或叠氮中的一种 [0008] 优选地, 所述活性药物为可用于抗体药物偶联物的药物 [0009] 优选地, 所述活性药物为美登素类 (Maytansinoids) 耳抑素肽类 (Auristatins) 药物为卡其霉素类 (Calicheamicins) 阿霉素类 (Doxorubicins) 吡咯并苯二氮卓二聚体类 (PBDs) 雷公藤甲素类 (Triptolide) 秋水仙碱类 (Colchicine) 康普瑞汀类 (Combretastatin) 高三尖杉酯碱类 (Homoharringtonine) 喜树碱类 (Camptothecin) 紫杉醇类 (Paclitaxel) 或雷公藤甲素类 (Triptolide) 中的一种 [0010] 优选地, 所述活性药物的结构式为 : 4

5 2/13 页 [0011] [0012] 本发明还提供了上述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子的制备方法, 其特征在于, 包括以下步骤 : [0013] 步骤 a: 化合物 Ⅰ 的合成 : [0014] 冰浴条件下, 将哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐溶于氢氧化钠水溶液中, 缓慢加入二碳酸叔丁酯 [(Boc)2O] 的二氧六环溶液 ; 然后室温反应 12h, 随后向反应体系中加入盐酸将反应液 ph 值调制 4 左右 ; 用乙酸乙酯萃取, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后, 得到化合物 Ⅰ; [0015] 步骤 b: 化合物 Ⅱ 的合成 : [0016] 将化合物 Ⅰ 炔丙胺 HATU N N- 二异丙基乙胺溶于 N N- 二甲基甲酰胺中, 在室温下搅拌反应 12h, 用水稀释反应液后, 乙酸乙酯萃取, 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得粗品, 加入乙酸乙酯和 60~100 目硅胶, 拌匀旋干, 粗品经硅胶柱层析, 得到化合物 Ⅱ; [0017] 步骤 c: 化合物 Ⅲ 的合成 : [0018] 将化合物 Ⅱ 溶于二氯甲烷中, 冰浴下加入三氟乙酸, 逐渐升至室温, 共反应 6h, 减压旋转蒸除溶液后, 得到化合物 Ⅲ; [0019] 步骤 d: 化合物 Ⅳ 的合成 : [0020] 将化合物 Ⅲ 和 Et3N 溶于 DCM 中, 冰浴下冷却至 0 后缓慢加入 2- 氯乙烷磺酰氯, 室温下反应 20min, 加入水, 产物用 DCM 萃取, 合并后的有机相用饱和 NaCl 洗后用无水 Na2SO4 干燥, 减压旋蒸除去溶剂, 加入 CH2Cl2 和 60~100 目硅胶, 拌匀旋干, 采用乙酸乙酯 / 石油醚 =1/ 1 作洗脱剂, 快速柱层析, 得到化合物 Ⅳ; [0021] 步骤 e: 化合物 Ⅳ 的合成 : [0022] 将化合物 Ⅳ 化合物 6( 参考文献 R.Huang,Z.Li,Y.Sheng,J.Yu,Y.Wu,Y.Zhan, H.Chen,B.Jiang,Org.Lett.,2018,20, ) 抗坏血酸钠和硫酸铜溶于 tbuoh/h2o/ DMF(1/1/1) 中, 室温下反应 3h, 用制备 HPLC 分离得到化合物 Ⅴ, 即哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子 [0023] 优选地, 所述步骤 a 中哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐包括哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐 (R)- 哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐和 (S)- 哌嗪 -2- 羧酸二盐酸盐中的任意一种 [0024] 本发明提供上述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子在制备抗体药物偶联物中的应用 [0025] 本发明还提供了一种包含上述哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子的靶向分子和活性药物分子偶联物, 其特征在于, 其结构式为 : 5

6 3/13 页 [0026] [0027] 或其药学上可接受的盐 ; 其中 :A 为靶向分子,L 为连接基团,D 为活性药物或荧光物质 [0028] 优选地, 所述靶向分子为抗体, 抗体片段替代体或变体, 多肽或小分子配体中的任意一种 [0029] 更优选地, 所述靶向分子为曲妥珠单抗 (Trastuzumab) [0030] 本发明中的靶向抗原包括但不限于 Her2 [0031] 优选地, 所述活性药物的结构式为 : [0032] [0033] 与现有技术, 本发明的有益效果在于 : [0034] 1. 本发明提供了一种新型哌嗪类二乙烯基磺酰胺类链接子的制备及其在抗体药物偶联物中的应用 ; [0035] 2. 本发明提供的方法制备所得抗体 - 药物偶联物均一性高 ; [0036] 3. 本发明提供的方法制备所得抗体 - 药物偶联物保持和原有抗体相近的亲和力和内吞作用 ; [0037] 4. 本发明提供的方法制备所得抗体 - 药物偶联物本与上市药物 T-DM1 具有相似的肿瘤细胞杀伤作用, 但是它们在 Her-2 低表达细胞中的细胞毒性显著小于 T-DM1 [0038] 5. 本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物具有更好的安全性附图说明 [0039] 图 1 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物的 SDS-PAGE 跑胶图 ; [0040] 其中,MW:molecular weight marker,lane 1:Trastuzumab,Lane 2:Reduced Trastuzumab,Lane 3: 抗体 - 药物偶联物 7,Lane 4: 抗体 - 药物偶联物 13,Lane5: 抗体 - 药物偶联物 19; [0041] 图 2 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物的 HR-ESI-MS 谱图 ; 其中,A: 抗体 - 药物偶联物 7,B: 抗体 - 药物偶联物 13,C: 抗体 - 药物偶联物 19; [0042] 图 3 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物的 SEC-HPLC 谱图 ; [0043] 图 4 显示了本发明中涉及 100nM 的抗体 - 药物偶联物及曲妥珠单抗在 SK-BR-3 细胞的亲和力 ; [0044] 图 5 显示了本发明中涉及的不同浓度梯度的抗体 - 药物偶联物及曲妥珠单抗在 SK- BR-3 细胞的亲和力 ; [0045] 图 6 显示了本发明中涉及 100nM 的抗体 - 药物偶联物及曲妥珠单抗在 MCF-7 细胞的 6

7 4/13 页亲和力 ; [0046] 图 7 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物及曲妥珠单抗在 SK-BR-3 细胞的内吞效应 ; [0047] 图 8 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物曲妥珠单抗 T-DM1 MMAE 对在 SK- BR-3 细胞的体外增殖抑制作用 ; [0048] 图 9 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物曲妥珠单抗 T-DM1 MMAE 对在 NCI- N87 细胞的体外增殖抑制作用 ; [0049] 图 10 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物曲妥珠单抗 T-DM1 MMAE 对 MCF-7 细胞的体外增殖抑制作用 ; [0050] 图 11 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物曲妥珠单抗 T-DM1 MMAE 对 MDA- MB-231 细胞的体外增殖抑制作用 ; [0051] 图 12 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物曲妥珠单抗 T-DM1 MMAE 对 MDA- MB-468 细胞的体外增殖抑制作用 ; [0052] 图 13 显示了本发明实施例 2 中抗体药物偶联物的制备流程具体实施方式 [0053] 下面结合具体实施例, 进一步阐述本发明应理解, 这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围此外应理解, 在阅读了本发明讲授的内容之后, 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改, 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围 [0054] 实施例 1-1 化合物 7 的制备 [0055] [0056] 反应条件为 : [0057] a) 氢氧化钠,1,4- 二氧六环, 室温,12h; [0058] b)2-(7- 氧化苯并三氮唑 )-N,N,N ',N '- 四甲基脲六氟磷酸盐 (HATU),N N- 二异丙基 7

8 5/13 页 [0059] 乙胺,N N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 室温,12h; [0060] c) 三氟乙酸, 二氯甲烷,0 - 室温,6h; [0061] d) 三乙胺 (Et3N), 二氯甲烷,0 - 室温,30min; [0062] e) 抗坏血酸钠, 硫酸铜, t BuOH/H2O/DMF(1/1/1), 室温,3h [0063] 其具体制备步骤如下 : [0064] 步骤 a: 化合物 2 的合成 : [0065] 冰浴下, 将 2- 哌嗪羧酸盐酸盐 (780mg,6mmol) 溶于氢氧化钠 (960mg,40mmol) 水溶液中, 缓慢加入二碳酸叔丁酯 [(Boc)2O,2.88g,13.2mmol] 的二氧六环 (25mL) 溶液, 然后室温反应 12 小时 ; 随后向反应体系中加入 1M 盐酸将反应液 ph 值调制 4 左右 ; 用乙酸乙酯萃取 (3*20mL), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得白色固体的化合物 2 (880mg,2.67mmol,45%), 直接用于下一部反应 ;ESI-HRMS Calculated for C15H27N2O6[M+ H] + : ,Found: [0066] 步骤 b: 化合物 3 的合成 : [0067] 将化合物 2(400mg,1.21mmol), 炔丙胺 (100mg,1.8mmol),HATU(684mg,1.8mmol), N N- 二异丙基乙胺 (707mg,5.4mmol) 溶于 N N- 二甲基甲酰胺 (5mL) 中, 在室温下搅拌反应 12 小时 ; 用 100mL 水稀释反应液后, 乙酸乙酯萃取 (3*20mL), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得粗品, 加入 15mL 乙酸乙酯和 1g 目硅胶, 拌匀旋干, 粗品经硅胶柱层析 ( 石油醚 : 乙酸乙酯 =3:10) 得无色油状物的化合物 3(380mg,1.03mmol,85%) ; 1 H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.40(d,J=119.8Hz,1H),4.51(d,J=64.1Hz,2H), (m,2h),3.87(s,2h), (m,2H),2.97(s,1H),2.21(t,J=2.6Hz,1H),1.47(d,J= 11.0Hz,18H). 13 C NMR(126MHz,CDCl3)δ168.99,154.67,80.50,77.29,77.04,76.78,29.36, ESI-HRMS Calculated for C18H30N3O5[M+H] + : ,Found: [0068] 步骤 c: 化合物 4 的合成 : [0069] 将化合物 3(380mg,1.03mmol) 溶于二氯甲烷 (4mL) 中, 冰浴下加入三氟乙酸 (1.5mL), 逐渐升至室温, 共反应 6h; 减压旋转蒸除溶液后得黄色油状物的化合物 4(282mg, 1.05mmol,98%), 直接用于下一步 ;ESI-HRMS calcd for C8H14N3O[(M+H) + ]: , found: [0070] 步骤 d: 化合物 5 的合成 : [0071] 化合物 4(282mg,1.05mmol) 和 Et3N(808mg,8.0mmol) 溶于 DCM(12mL) 中, 冰浴下冷却至 0 后缓慢加入 2- 氯乙烷磺酰氯 (652mg,4.0mmol), 室温下反应 20min, 加入水 (30mL), 产物用 DCM(3x 15mL) 萃取, 合并后的有机相用饱和 NaCl(10mL) 洗后用无水 Na2SO4 干燥, 减压旋蒸除去溶剂, 加入 10mL CH2Cl2 和 0.4g 目硅胶, 拌匀旋干, 采用乙酸乙酯 / 石油醚 = 1/1 作洗脱剂, 快速柱层析得到产物淡黄色固体的化合物 5(222.34mg,0.64mmol), 产率 64%; 1 H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.54(t,J=5.5Hz,1H),6.76(ddd,J=19.0,16.5,9.9Hz, 2H), (m,4H),4.39(dd,J=4.6,1.9Hz,1H), (m,3H), (m,1H), (m,2H),3.15(t,J=2.5Hz,1H),2.92(dd,J=12.6,4.3Hz,1H),2.68(td,J= 11.9,11.4,3.8Hz,1H). 13 C NMR(126MHz,DMSO)δ168.22,136.09,133.21,130.17,128.10, 81.16,73.76,54.79,47.50,44.85,42.26,40.50,40.33,40.17,40.00,39.83,39.67, 39.50,28.76.ESI-HRMS calcd for C12H18N3O5S2[(M+H) + ]: ,found:

9 6/13 页 [0072] 步骤 e: 化合物 7 的合成 : [0073] 化合物 5(12mg,0.035mmol) 化合物 6( 参考文献 R.Huang,Z.Li,Y.Sheng,J.Yu, Y.Wu,Y.Zhan,H.Chen,B.Jiang,Org.Lett.,2018,20, )(30mg,0.032mmol) 抗坏血酸钠 (12.6mg,0.064mmol) 和硫酸铜 (10mg,0.064mmol) 溶于 3mL t BuOH/H2O/DMF(1/1/1) 中, 室温下反应 3h, 然后用制备 HPLC( 固定相为 C-18 硅胶柱, 流动相为 CH3CN/H2O=10~ 100%,30 分钟 ) 分离得到产物白色固体的化合物 7(24mg, mmol), 产率 53%; 1 H NMR (500MHz,Methanol-d4)δ8.18(dd,J=28.1,8.3Hz,1H), (m,4H),6.72(dd,J= 16.5,9.8Hz,1H),6.61(dt,J=11.1,7.1Hz,1H), (m,2H), (m,1H), (m,7H), (m,4H), (m,2H), (m,10H), (m, 10H), (m,2H), (m,3H), (m,1H), (m,2H), (m,1H), (m,4H), (m,1H), (m,1H), (m,21H). 13 C NMR(126MHz,MeOD)δ174.03,142.71,135.51,132.38,128.99,128.13,127.86,127.23, ,126.90,126.72,126.58,82.05,75.91,70.42,70.05,69.95,69.15,68.33,60.61, 60.23,59.54,59.20,56.94,55.28,54.71,51.36,49.93,48.13,47.96,47.90,47.79, 47.73,47.62,47.53,47.45,47.36,47.28,47.11,46.68,44.74,44.43,44.13,42.10, 33.77,31.70,30.50,29.02,26.27,25.62,25.20,24.48,24.21,23.07,18.37,17.79, 17.36,14.69,14.44,13.79,9.53.ESI-HRMS Calculated for C59H98N11O16S2[M+H] + : ,Found: [0074] 实施例 1-2 化合物 13 的制备 [0075] [0076] 反应条件为 : [0077] a) 氢氧化钠,1,4- 二氧六环, 室温,12h; [0078] b)2-(7- 氧化苯并三氮唑 )-N,N,N ',N '- 四甲基脲六氟磷酸盐 (HATU),N N- 二异丙基乙胺,N N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 室温,12h; [0079] c) 三氟乙酸, 二氯甲烷,0 - 室温,6h; [0080] d) 三乙胺 (Et3N), 二氯甲烷,0 - 室温,30min; [0081] e) 抗坏血酸钠, 硫酸铜, t BuOH/H2O/DMF(1/1/1), 室温,3h [0082] 其具体制备步骤如下 : [0083] 步骤 a: 化合物 9 的合成 : [0084] 冰浴下, 将 (R)- 哌嗪 -2- 羧酸盐酸盐 8(2g,10mmol) 溶于氢氧化钠 (1.6g,40mmol) 水 9

10 7/13 页溶液中, 随后加入二碳酸叔丁酯 [(Boc)2O,4.4g,20.2mmol] 的二氧六环 (20mL) 溶液, 室温反应 12 小时 ; 随后向反应体系中加入 1M 盐酸将反应液 ph 值调制 4 左右, 用乙酸乙酯萃取 (3* 20mL), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得白色固体的化合物 9(2.5g, 7.5mmol,77%), 直接用于下一步反应 ;ESI-HRMS Calculated for C15H27N2O6[M+H] + : ,Found: [0085] 步骤 b: 化合物 10 的合成 : [0086] 将化合物 9(1.3g,3.9mmol), 炔丙胺 (440mg,7.8mmol),HATU(2.28g,6.0mmol),N N- 二异丙基乙胺 (2.555g,19.5mmol) 溶于 N N- 二甲基甲酰胺 (10mL) 中, 在室温下搅拌反应 12 小时 ; 用 100mL 水稀释反应液后, 乙酸乙酯萃取 (3*20mL), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得粗品, 加入 15mL 乙酸乙酯和 1g 目硅胶, 拌匀旋干, 粗品经硅胶柱层析 ( 石油醚 : 乙酸乙酯 =3:10) 得无色油状物的化合物 10(1.4g,3.8mmol,95%) 1 H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.46(t,J=5.5Hz,1H),4.32(d,J=69.3Hz,1H), (m,1H), (m,4H),3.31(d,J=12.9Hz,1H), (m,2H),2.75(d,J=68.5Hz,1H), (m,19H). 13 C NMR(126MHz,DMSO)δ170.40,155.22,79.80,79.43,73.84,40.47, 40.30,40.13,39.97,39.80,39.63,39.47,28.52,28.40,28.34.ESI-HRMS Calculated for C18H30N3O5[M+H] + : ,Found: [0087] 步骤 c: 化合物 11 的合成 : [0088] 将化合物 10 (1.4g,3.8mmol) 溶于二氯甲烷 (5mL) 中, 冰浴下加入三氟乙酸 (1.5mL), 逐渐升至室温, 共反应 6h; 减压旋转蒸除溶液后得黄色油状物的化合物 11(600mg, 3.57mmol,94%), 直接用于下一步反应 ;ESI-HRMS calcd for C8H14N3O[(M+H) + ]: , found: [0089] 步骤 d: 化合物 12 的合成 : [0090] 化合物 11(600mg,3.57mmol) 和 Et3N(3.03g,30mmol) 溶于 DCM(12mL) 中, 冰浴下冷却至 0 后缓慢加入 2- 氯乙烷磺酰氯 (1.745g,10.71mmol), 室温下反应 20min, 加入水 (30mL), 产物用 DCM(3x 15mL) 萃取, 合并后的有机相用饱和 NaCl(10mL) 洗后用无水 Na2SO4 干燥, 减压旋蒸除去溶剂, 加入 10mL CH2Cl2 和 0.8g 目硅胶, 拌匀旋干, 采用乙酸乙酯 / 石油醚 =1/1 作洗脱剂, 快速柱层析得到产物淡黄色固体的化合物 12(916mg,2.64mmol), 产率 74%; 1 H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.54(t,J=5.5Hz,1H),6.76(ddd,J=19.1,16.5,9.9Hz, 2H), (m,4H), (m,1H), (m,3H), (m,1H), (m,2h),3.32(s,1h),3.15(t,j=2.5hz,1h),2.92(dd,j=12.6,4.3hz,1h),2.68(td,j= 11.9,11.4,3.7Hz,1H). 13 C NMR(126MHz,DMSO)δ167.74,135.61,132.73,129.69,127.62, 80.68,73.28,54.31,47.02,44.37,41.78,40.02,39.85,39.69,39.52,39.35,39.19, 39.02,28.28.ESI-HRMS calcd for C12H18N3O5S2[(M+H) + ]: ,found: [0091] 步骤 e: 化合物 13 的合成 : [0092] 化合物 12(17mg,0.05mmol) 化合物 6(46mg,0.05mmol) 抗坏血酸钠 (19mg, 0.1mmol) 和硫酸铜 (16mg,0.1mmol) 溶于 3mL t BuOH/H2O/DMF(1/1/1) 中, 室温下反应 3h, 然后用制备 HPLC( 固定相为 C-18 硅胶柱, 流动相为 CH3CN/H2O=10~100%,30 分钟 ) 分离得到产物白色固体的化合物 13(20mg,0.016mmol), 产率 32%; 1 H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ8.00(d, J=11.8Hz,1H), (m,6H), (m,2H), (m,4H), (m, 10

11 8/13 页 14H),4.08(d,J=14.5Hz,1H), (m,3H), (m,14H),3.41(ddd,J=12.2, 9.4,5.8Hz,1H),3.35(dd,J=4.1,1.7Hz,5H),3.29(d,J=3.4Hz,2H),3.13(d,J=2.0Hz, 1H), (m,5H), (m,1H),2.51(d,J=27.5Hz,2H), (m,2H), (m,6H), (m,1H), (m,3H), (m,29H). 13 C NMR (126MHz,MeOD)δ174.03,170.49,169.11,142.70,135.48,132.41,128.94,128.15,127.86, ,127.06,126.85,126.71,126.55,85.27,82.05,77.48,75.91,70.35,70.07,70.00, 69.21,68.75,60.59,60.18,59.45,59.19,57.21,56.93,56.08,55.26,55.04,54.74, 50.27,49.91,48.12,48.06,47.95,47.89,47.81,47.78,47.74,47.72,47.66,47.60, 47.55,47.43,47.31,47.26,47.22,47.09,46.68,44.74,44.45,44.12,42.07,34.47, 30.46,29.00,26.26,25.59,25.19,24.46,24.21,23.06,18.36,17.76,17.36,15.59, 14.66,14.55,14.42,13.71,9.51.ESI-HRMS Calculated for C59H98N11O16S2[M+H] + : ,Found: [0093] 实施例 1-3 化合物 19 的制备 [0094] [0095] 反应条件为 : [0096] a) 氢氧化钠,1,4- 二氧六环, 室温,12h; [0097] b)2-(7- 氧化苯并三氮唑 )-N,N,N ',N '- 四甲基脲六氟磷酸盐 (HATU),N N- 二异丙基乙胺,N N- 二甲基甲酰胺 (DMF) 中, 室温,12h; [0098] c) 三氟乙酸, 二氯甲烷,0 - 室温,6h; [0099] d) 三乙胺 (Et3N), 二氯甲烷,0 - 室温,30min; [0100] e) 抗坏血酸钠, 硫酸铜, t BuOH/H2O/DMF(1/1/1), 室温,3h [0101] 其具体制备步骤如下 : [0102] 步骤 a: 化合物 15 的合成 : [0103] 冰浴下, 将 (S)- 哌嗪 -2- 羧酸盐酸盐 14(1g,5mmol) 溶于氢氧化钠 (0.7g,20mmol) 水溶液中, 随后加入二碳酸叔丁酯 [(Boc)2O,2.2g,10mmol] 的二氧六环 (10mL) 溶液, 室温反应 12 小时 ; 随后向反应体系中加入 1M 盐酸将反应液 ph 值调制 4 左右, 用乙酸乙酯萃取 (3* 20mL), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得白色固体的化合物 15(1.15g, 3.5mmol,70%), 直接用一下一部反应 ;ESI-HRMS Calculated for C15H27N2O6[M+H] + : ,Found: [0104] 步骤 b: 化合物 16 的合成 : 11

12 9/13 页 [0105] 将化合物 15(1.15g,3.5mmol), 炔丙胺 (578mg,10.5mmol),HATU(1.9g,5.0mmol), N N- 二异丙基乙胺 (2.2g,17mmol) 溶于 N N- 二甲基甲酰胺 (12mL) 中, 在室温下搅拌反应 12 小时 ; 用 100mL 水稀释反应液后, 乙酸乙酯萃取 (3*20mL), 合并有机相, 无水硫酸钠干燥, 减压旋转蒸除溶剂后得粗品, 加入 15mL 乙酸乙酯和 1g 目硅胶, 拌匀旋干粗品经硅胶柱层析 ( 石油醚 : 乙酸乙酯 =3:10) 得无色油状物的化合物 16(830mg,2.26mmol,65%); 1 H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.46(s,1H),4.32(d,J=68.7Hz,1H), (m,1H), (m,4h),3.23(d,j=13.2hz,1h),3.13(s,1h),2.86(t,j=64.5hz,1h),1.35(d,j=6.7hz, 19H). 13 C NMR(126MHz,CDCl3)δ171.19,169.17,154.66,81.45,80.45,79.32,77.41,77.16, 76.90,71.77,60.42,56.44,54.19,43.43,42.66,42.16,29.31,28.77,28.35,28.31, 27.89,21.07,14.22,1.91,0.03.ESI-HRMS Calculated for C18H30N3O5[M+H] + : , Found: [0106] 步骤 c: 化合物 17 的合成 : [0107] 将化合物 16(830mg,2.26mmol) 溶于二氯甲烷 (3mL) 中, 冰浴下加入三氟乙酸 (1.5mL), 冰浴下反应 6h, 减压旋转蒸除溶液后得黄色油状物的化合物 17(378mg,2.26mmol, 100%), 直接用于下一步 ;ESI-HRMS calcd for C8H14N3O[(M+H) + ]: ,found: [0108] 步骤 d: 化合物 18 的合成 : [0109] 化合物 17(378mg,2.26mmol) 和 Et3N(2.28g,22.6mmol) 溶于 DCM(10mL) 中, 冰浴下冷却至 0 后缓慢加入 2- 氯乙烷磺酰氯 (1.474g,9.04mmol), 室温下反应 20min, 加入水 (30mL), 产物用 DCM(3x 15mL) 萃取, 合并后的有机相用饱和 NaCl(10mL) 洗后用无水 Na2SO4 干燥, 减压旋蒸除去溶剂, 加入 10mL CH2Cl2 和 0.4g 目硅胶, 拌匀旋干采用乙酸乙酯 / 石油醚 =1/1 作洗脱剂, 快速柱层析得到产物淡黄色固体 18(541mg,1.56mmol), 产率 69%; 1 H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.75(t,J=5.4Hz,1H),6.64(dd,J=16.5,9.8Hz,1H), 6.46(dd,J=16.5,9.9Hz,1H),6.30(dd,J=16.5,14.5Hz,2H),6.07(dd,J=9.9,8.1Hz, 2H),4.49(dt,J=3.7,1.6Hz,1H),4.22(dt,J=12.8,1.8Hz,1H), (m,3H),3.67 (dddt,j=60.2,12.4,3.6,1.7hz,2h),3.28(ddd,j=13.6,12.0,3.5hz,1h),2.96(dd,j= 12.8,4.0Hz,1H),2.83(td,J=12.1,3.4Hz,1H),2.26(t,J=2.5Hz,1H). 13 C NMR(126MHz, CDCl3)δ167.22,135.14,132.90,129.73,128.77,78.92,77.41,77.16,76.91,72.17, 55.69,45.58,44.24,42.35,29.78.ESI-HRMS calcd for C12H18N3O5S2[(M+H) + ]: , found: [0110] 步骤 e: 化合物 19 的合成 : [0111] 化合物 18(18mg,0.052mmol) 化合物 6(48mg,0.052mmol) 抗坏血酸钠 (20mg, 0.105mmol) 和硫酸铜 (18mg,0.105mmol) 溶于 3mL t BuOH/H2O/DMF(1/1/1) 中, 室温下反应 3h, 然后用制备 HPLC( 固定相为 C-18 硅胶柱, 流动相为 CH3CN/H2O=10~100%,30 分钟 ) 分离得到产物白色固体 19(18mg,0.014mmol), 产率 27% 1 H NMR(500MHz,Methanol-d4)δ8.00(d,J= 11.8Hz,1H), (m,5H), (m,2H), (m,4H), (m,7H), (m,6H), (m,3H), (m,13H),3.41(ddd,J=12.2,9.4,5.8Hz, 1H),3.35(dd,J=4.1,1.7Hz,5H),3.29(d,J=3.4Hz,2H), (m,2H), (m, 4H), (m,1H),2.51(d,J=27.5Hz,2H), (m,11H), (m,27H). 13 C 12

13 10/13 页 NMR(126MHz,MeOD)δ174.03,170.49,169.11,142.70,135.48,132.41,128.94,128.15, ,127.24,127.06,126.85,126.71,126.55,89.72,85.27,82.05,77.48,75.91, 70.35,70.07,70.00,69.21,68.75,60.59,60.18,59.45,59.19,57.21,56.93,56.08, 55.26,55.04,54.74,50.27,49.91,48.12,48.06,47.95,47.89,47.81,47.78,47.74, 47.72,47.66,47.60,47.55,47.43,47.31,47.26,47.22,47.09,46.68,44.74,44.45, 44.12,42.07,34.47,30.46,29.00,26.26,25.59,25.19,24.46,24.21,23.06,18.36, 17.76,17.36,15.59,14.66,14.55,14.42,13.71,9.51.ESI-HRMS Calculated for C59H98N11O16S2[M+H] + : ,Found: [0112] 实施例 2: 抗体药物偶联物的制备 [0113] 如图 13 所示, 本实施例提供了抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19 的制备方法 [0114] 具体反应条件为 : [0115] a) 三 (2- 羧乙基 ) 膦室温 (TCEP), 磷酸盐缓冲液 (PBS), 室温,2h; [0116] b) 化合物 7 或者 13 或者 19,PBS/ 二甲亚砜, 室温,12h [0117] 将化合物 7,13,19 分别溶于 DMSO 配成 10mM 的溶液 ; 曲妥珠单抗 (Trastuzumab)( 上海环耀生物科技有限公司, 货号 : ) 溶于 PBS(pH=7.4) 缓冲溶液配成 2.5mg/mL 的溶液,TCEP 溶于纯水配成 10mM 的溶液 ( 用 NaOH/H3PO4 调节 PH 为 7.0) [0118] 在微孔板 (330uL LABTIDE 96Round Well) 的四个孔中分别加入 100uL 的曲妥珠单抗溶液,0.83uL 的 TCEP 溶液, 然后放在微孔板振荡器上室温反应 2 小时随后加入 1.67uL (10eq.) 化合物 7 或者 13 或者 19 的 DMSO 溶液, 然后放在微孔板振荡器上室温下反应 12 小时后 ; 通过 Zeba 脱盐柱 (Zeba TM Spin Desalting Columns,7K MWCO,0.5mL) 除去过量的小分子化合物, 得到抗体抗体 - 药物偶联物, 分别命名为抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19 用 UPLC-MS( 型号 ABsciex 4600) 分析反应结果 [0119] 图 1 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物的 SDS-PAGE 跑胶图 ; [0120] 其中,MW:molecular weight marker,lane 1:Trastuzumab,Lane 2:Reduced Trastuzumab,Lane 3: 抗体 - 药物偶联物 7,Lane 4: 抗体 - 药物偶联物 13,Lane5: 抗体 - 药物偶联物 19; [0121] 图 2 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物的 HR-ESI-MS 谱图 ; 其中,A: 抗体 - 药物偶联物 7,B: 抗体 - 药物偶联物 13,C: 抗体 - 药物偶联物 19; [0122] 图 3 显示了本发明中涉及的抗体药物偶联物的 SEC-HPLC 谱图 ; [0123] 如图 1~3 所示, 本发明中所制备得到的抗体 - 药物偶联物均一性高 [0124] 实施例 3: 抗体 - 药物偶联物的亲和力测定 [0125] 在本实施例中, 研究了曲妥珠单抗 (Trastuzumab) 抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19 对肿瘤细胞系的亲和作用 [0126] 以下实验中所用的试剂及耗材来源于 :Goat Anti-Human IgG H&L 购置于 Abcam 公司,DAPI 购置于 Cell Signaling 公司,face 清洗液 (PBS+1%BSA), 人乳腺癌细胞 SK-BR-3 和 MCF-7 细胞来自美国模式培养物集存库 ATCC 本实施例中使用流式细胞术 (flow cytometry,fcm) 来分析抗体及 ADC 对肿瘤细胞系的亲和作用 FCM 是利用流式细胞仪在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞进行多参数快速的定量分析分选的技术 13

14 11/13 页 Trastuzumab 可以特异性结合在靶细胞的 Her-2 抗原位点, 然后用特异的荧光二抗标记 Trastuzumab, 利用 FCM 检测荧光二抗的荧光强度可以间接指示 Trastuzumab 与靶细胞的抗原位点的结合能力 [0127] 分别收集 SK-BR-3 MCF-7 细胞至 15mL 离心管, 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 弃上清 ; 用 face 洗液洗涤细胞 1 次, 分装到 1.5mL 离心管 ( 每个管大于个细胞 ) 中, 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 去上清 [0128] 每个样品管内分别加入 200μLTrastuzumab 单抗抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19( 浓度分别设置为 : nM), 在冰上孵育 30min [0129] 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 去上清, 用 face 洗液洗涤细胞 3 次 ; 每个样品管内加入 200μL Goat Anti-Human IgG H&L 抗体 (1:200), 在冰上孵育 30min [0130] 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 去上清, 用 face 洗液洗涤细胞 3 次 ; 每个样品管内加入 200μL DAPI(0.1μg/mL), 冰上孵育 15min 后在 CytoFLEX(Beckman Coulter) 流式细胞仪上进行检测分析 [0131] 如图 4 所示, 本发明中涉及 Trastuzumab 单抗抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19 在 Her-2 高表达细胞株 SK-BR-3 细胞中的亲和力, 在 100nM 浓度下, Trastuzumab 抗体药物偶联物与 SK-BR-3 细胞亲和力和曲妥珠单抗与 SK-BR-3 细胞亲和力相同 [0132] 图 5 显示了本发明中涉及的不同浓度梯度的 Trastuzumab 抗体药物偶联物及曲妥珠单抗在 SK-BR-3 细胞的亲和力,Trastuzumab 抗体药物偶联物和曲妥珠单抗与 SK- BR-3 细胞亲和力拟合曲线具有高度一致性 [0133] 图 6 显示了本发明中涉及的 Trastuzumab 抗体药物偶联物及曲妥珠单抗在 Her-2 低表达细胞株 MCF-7 细胞的亲和力, 在 100nM 浓度下, 抗体 - 药物偶联物和曲妥珠单抗与 MCF-7 细胞具有相同的亲和力, 并且显著低于 SK-BR-3 细胞因此对曲妥珠单抗的上述改造没有影响其在靶细胞中的亲和力 [0134] 实施例 4: 抗体 - 药物偶联物的内吞作用测定 [0135] 在本实施例中, 研究了肿瘤细胞系对曲妥珠单抗 (Trastuzumab) 抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19 的内吞作用 [0136] 以下实验中所用的试剂及耗材来源于 :Goat Anti-Human IgG H&L 购置于 Abcam 公司,DAPI 购置于 Cell Signaling 公司,face 清洗液 (PBS+1%BSA), 人乳腺癌细胞 SK-BR-3 和 MCF-7 细胞来自美国模式培养物集存库 ATCC 本实施例中使用流式细胞术 (flow cytometry,fcm) 来分析肿瘤细胞系对抗体及 ADC 的内吞作用 [0137] Trastuzumab 抗体结合在靶细胞的 Her-2 抗原位点后会发生內吞作用进入细胞内细胞在 3 7 可以正常內吞, 在 4 细胞绝大多数生理活动受到抑制, 视为不內吞 Trastuzumab 抗体与肿瘤细胞分别在 4 和 37 孵育一段时间, 该时间段内的內吞量 =(4 细胞表面抗体量 -37 细胞表面抗体量 )/4 细胞表面抗体量 100% [0138] 分别收集 SK-BR-3 和 MCF-7 细胞至 15mL 离心管, 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 弃上清 ; 用 face 洗液洗涤细胞 1 次, 分装到 1.5mL 离心管 ( 每个管大于个细胞 ) 中, 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 去上清 14

15 12/13 页 [0139] 每个样品管内加入 200μLTrastuzumab 抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19( 浓度为均 10nM), 在 4 孵育 30min [0140] 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 去上清, 用 face 洗液洗涤细胞 3 次 ; 将其中每个样品管内加入 200μL Goat Anti-Human IgG H&L 抗体 (1:200), 在冰上孵育 30min [0141] 在 4 下 1200rpm 离心 3min, 去上清, 用 face 洗液洗涤细胞 3 次 ; 每个样品管内加入 200μL DAPI(0.1μg/mL), 冰上孵育 15min 后在 CytoFLEX(Beckman Coulter) 流式细胞仪上进行检测分析, 结果如图 8 所示 [0142] 图 8 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物及曲妥珠单抗在 Her-2 高表达细胞株 SK-BR-3 细胞的内吞效应 10nM 的抗体 - 药物偶联物及曲妥珠单抗在 SK- BR-3 细胞中经过 3 小时的內吞效率分别为 32.77% 34.39% 32.22% 及 35.64% 因此, 对曲妥珠单抗的上述改造没有影响其在靶细胞中的內吞效率 [0143] 实施例 5: 抗体 - 药物偶联物的体外细胞增殖生物活性测定 [0144] 在本实施例中, 研究了 Trastuzumab 抗体 - 药物偶联物 7 抗体 - 药物偶联物 13 抗体 - 药物偶联物 19 T-DM1(Roche,100mg) MMAE(ChemShuttle,2.5g) 对肿瘤细胞系增殖的作用 [0145] 以下实验中所用的试剂及耗材来源于 :RPMI1640 培养基 DMEM 培养基 MEM 培养基 0.25% 胰蛋白酶 -EDTA 胎牛血清重组人胰岛素 100 青链霉素 1 PBS(pH 7.4) CCK8 显色试剂购置于 Gibco 公司 ; 人肿瘤细胞系 SK-BR-3 NCI-N87 MCF7 MDA-MB-231 MDA-MB-468 来自美国模式培养物集存库 ATCC;10cm 培养皿 (Corning) 及 96 孔细胞培养板 (Corning); 多功能酶标仪 (SpectraMax i3) [0146] 本实施例使用 CCK8 比色法来评价待测物的抗增殖作用 Cell Counting Kit-8( 简称 CCK-8) 试剂中含有 WST-8 化学名 :2-(2- 甲氧基 -4- 硝基苯基 )-3-(4- 硝基苯基 )-5-(2,4- 二磺酸苯 )-2H- 四唑单钠盐它在电子载体 1- 甲氧基 -5- 甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯 (1- Methoxy PMS) 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物 (Formazan dye) 生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比, 在 450nm 波长下产生最大吸收峰因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析 [0147] 本实例选用的细胞系有 :SK-BR-3 NCI-N87 MCF-7 MDA-MB-231 MDA-MB-468 [0148] SK-BR-3 MDA-MB-231 MDA-MB-468 细胞在含有 10% 胎牛血清和 1% 青链霉素的 DMEM 培养基中,MCF7 细胞在含有 10% 胎牛血清 1% 青链霉素 1%NEAA 和 10μg/L 胰岛素的 MEM 培养基中,NCI-N87 细胞在含有 10% 胎牛血清和 1% 青链霉素的 RPMI1640 培养基中, 所有细胞于 37 5% 二氧化碳培养箱中培养至对数生长期, 将处于对数生长期的上述细胞以 2 ~ 个细胞每孔的密度接种至 96 孔培养板, 每孔 100μL, 培养 24 小时后加入不同浓度的药物处理 72 小时, 药物原始浓度为 500nM, 以 5 倍稀释制备 10 个浓度, 每个浓度设置 3 个复孔, 并设相应浓度的溶媒对照及无细胞培养基孔作用结束后, 每孔加入 10μL CCK8 试剂, 在于 37,5% 二氧化碳培养箱中继续培养一段 1~4 小时然后在 450nm 波长下测定吸光度 (OD 值 ) [0149] 抑制率 (%)=(OD 对照 -OD 给药 )/(OD 对照 -OD 空白 ) 100% [0150] 图 8~12 显示了本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物 , 曲妥珠单抗, 上市的抗体 - 药物偶联物的阳性对照 T-DM1 以及小分子毒性药物 MMAE 对在 SK-BR-3 NCI-N87 MCF-7 15

16 13/13 页 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 细胞的体外增殖抑制作用 [0151] 表 1 本发明中涉及的曲妥珠单抗, 抗体 - 药物偶联物 ,T-DM1 及 MMAE 在 SK- BR-3 NCI-N87 MCF-7 MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 细胞中的 IC50(nM) [0152] [0153] 结果显示, 本发明提供的方法制备所得抗体 - 药物偶联物本与上市药物 T- DM1 具有相似的肿瘤细胞杀伤作用, 但是它们在 Her-2 低表达细胞中的细胞毒性显著小于 T- DM1 因此, 本发明中涉及的抗体 - 药物偶联物具有更好的安全性 16

17 附图 1/8 页图 1 图 2 17

18 附图 2/8 页 18

19 附图 3/8 页图 3 图 4 19

20 附图 4/8 页图 5 图 6 20

21 附图 5/8 页图 7 图 8 21

22 附图 6/8 页图 9 图 10 22

23 附图 7/8 页图 11 图 12 23

24 附图 8/8 页图 13 24

+

~ 1 ~ ~ 2 ~ 1-1 UHPLC-SEC 法对治疗性抗体的分析 TSKgel UP-SW3 UHPLC HPLC A TSKgel UP-SW3 2 μm (4.6 mm ID. 15 cm B UHPLC-SEC 1.7 μm (4.6 mm ID. 15 cm mmol/l (ph 6.7 + 2SO4 mmol/l Na +.5 % NaN3.35 ml/ 25 UV 28 nm 5

(19) 中华人民共和国国家知识产权局 (12) 发明专利申请 (21) 申请号 (22) 申请日 (71) 申请人上海科技大学地址 上海市浦东新区华夏中路 393 号 (10) 申请公布号 CN A (43) 申

(19) 中华人民共和国国家知识产权局 (12) 发明专利申请 (21) 申请号 (22) 申请日 (71) 申请人上海科技大学地址上海市浦东新区华夏中路 393 号 (10) 申请公布号 CN A (43) 申