研究报告 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2020, 36(6): 好氧反硝化菌 Achromobacter sp.l16 的脱氮特性 1 李思琦 1 杨静丹 1 刘琳 2 刘二佳 1 王晓慧 (1. 北京化工大学化学工程学院, 北京 ;2. 北

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1 研究报告 生物技术通报 IOTECHNOLOGY ULLETIN, 36(6):93- 好氧反硝化菌 chromobacter sp.l6 的脱氮特性 李思琦 杨静丹 刘琳 2 刘二佳 王晓慧 (. 北京化工大学化学工程学院, 北京 29 ;2. 北京航天宏图信息技术股份有限公司, 北京 95) 摘要 : 在垃圾渗滤液中分离出一株异养硝化 - 好氧反硝化菌 L6, 经过形态观察和 6S rdn 基因序列分析鉴定为 chromobacter sp.,l6 对氨氮和硝酸盐氮的去除率分别为 6.94% 和 98.4% 对菌株好氧反硝化和异养硝化培养条件进行优化结果表明 :L6 在以硝酸盐为氮源 柠檬酸钠为碳源 C/N 为 培养温度为 3 培养转速为 5 r/min 条件下硝酸盐氮去除率为 99.74%, 总氮去除率 58.9% L6 在以氨氮为氮源 柠檬酸钠为碳源 C/N 为 培养温度为 3 培养转速为 r/min 条件下氨氮去除率提高到 93.4%, 总氮去除率 86.33% 优化后 L6 具有高效的异养硝化 - 好氧反硝化能力, 可将氮素大部分转化为气体和菌体胞内氮, 具有潜在的实际废水应用价值 关键词 : 好氧反硝化 ; 异养硝化 ; 无色杆菌 DOI :.356/j.cnki.biotech.bull Denitrification Characteristics of erobic Denitrifying acteria chromobacter sp. L6 LI Si-qi YNG Jing-dan LIU Lin LIU Er-jia 2 WNG Xiao-hui (. College of Chemical Engineering,eijing University of Chemical Technology,eijing 29 ;2. eijing Piesat Information Technology Co. Ltd.,eijing 95) bstract: heterotrophic nitrification-aerobic denitrification strain L6 was isolated from landfill leachate and identified as chromobacter sp. by morphological observation and 6s rdn gene sequence analysis. The rate of removing ammonia nitrogen was 6.94% and that of removing nitrate nitrogen was 98.4%. The culture conditions of aerobic denitrification and heterotrophic denitrification of strain L6 was optimized by single factor experiment. The optimized results of aerobic denitrification and heterotrophic nitrification of strain L6 showed that L6 was cultured with nitrate as nitrogen source,sodium citrate as carbon source,c/n,culture temperature 3,rotate speed 5 r/min,and the degradation rate of nitrate nitrogen and the rate of removing total nitrogen was 99.74% and 58.9%, respectively. Under the conditions of ammonia nitrogen as nitrogen source,sodium citrate as carbon source,c /N,culture temperature 3 and rotate speed r/min,and the degradation rate of ammonia nitrogen increased to 93.4% and the removal rate of total nitrogen was 86.33%. The optimized strain L6 has high efficiency of heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,converts the most of the nitrogen into gas and intracellular nitrogen,and thus has potential value of practical application in wastewater treatment. Key words: erobic denitrification ;heterotrophic nitrification ;chromobacter sp. 异养硝化 - 好氧反硝化 (Heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,hn-d) 菌是一类能够在 有机物存在的条件下将氨氮氧化, 在溶解氧存在条 件下将亚硝态氮 硝态氮代谢为氮气的微生物 [], 不受传统反硝化菌厌氧条件的控制, 在单个反应器 中同时进行硝化和反硝化, 且异养菌与自养菌相比 收稿日期 :9--5 基金项目 : 国家重点研发计划项目 (6YFC5), 中央高校基本科研业务费 (JD9) 作者简介 : 李思琦, 女, 硕士研究生, 研究方向 : 污水生物处理 ; 通讯作者 : 王晓慧, 男, 博士, 教授, 研究方向 : 污水生物处理技术 ;

2 94 生物技术通报 iotechnology ulletin,vol.36,no.6 生长速率快, 繁殖周期短, 节约工艺处理时间及成本, 好氧反硝化菌的发现为生物脱氮技术提供了一种新 的思路和方法 [2] 长期以来厌养反硝化菌被认为是唯一能够进行 [3] 反硝化作用的细菌 98 年,Meiberg 等在研究 Hyphomicrobium X 菌对二甲胺的好氧厌氧降解机理过 程中发现其具有好氧反硝化能力,983 年 Robertson [4] 等在硫自养反硝化菌株分离实验中发现了好氧 反硝化菌的存在, 随后证实泛养硫球菌是一种好氧 反硝化菌, 打破了传统厌氧反硝化的壁垒 目前从 环境中分离出来的好氧反硝化菌主要有假单胞菌属 (Pseudomonas) [5-6] 不动杆菌属 (cinetobacter) [7] 芽孢杆菌属 (acillus) [8-9] 粪产碱菌 (lcaligenes faecalis) [] 硫杆菌属 (Thiobacillus) 等 [] 本研究从河北某垃圾处理厂的垃圾渗滤液中提 取出一株好氧反硝化菌 L6, 对其进行 6S rdn 分 析鉴定为无色杆菌, 填补了垃圾渗滤液中好氧反硝 化细菌较少的空缺, 系统地研究了碳源 C/N 温 度 转速等理化因素对该菌株反硝化和硝化能力的 影响, 以期为该菌株在渗滤液脱氮处理等应用方面 提供参考 材料与方法. 材料 菌源提取自河北某垃圾填埋场的垃圾渗滤液, 样品置于采样瓶中 4 保存, 用于后续实验 L 富集培养基 (g/l): 胰蛋白胨. g, 酵母提 取物 g, 硝酸钾 KNO 3 g T 溴百里酚蓝固体培养基 (g/l):kno 3. g, 琥珀酸钠 8.5 g,kh 2 PO 4. g,fecl 2 6H 2 O 5 g, CaCl 2.2 g,mgso 4 7H 2 O. g,% 的溴百里酚蓝 ml, 琼脂. g NI 异养硝化培养基 (g/l):nh 4 Cl.5 g, 琥珀 酸钠 g,mgso 4 7H 2 O. g,na 2 HPO 4 2H 2 O 6.7 g,kh 2 PO 4. g, 微量元素溶液 2 ml DM 好氧反硝化培养基 (g/l):kno 3 g, 琥 珀酸钠 3 g,kh 2 PO 4.5 g,mgso 4 7H 2 O. g, Na 2 HPO 4 2H 2 O 7.9 g, 微量元素溶液 2 ml 微量元素溶液 (g/l):edt 5 g,znso g,cacl g,mncl 2 4H 2 O 6 g,feso 4 7H 2 O 5. g,(nh 4 ) 6 Mo 7 O 2 7H 2 O. g,cuso 4 5H 2 O.57 g, CoCl 2 6H 2 O.6 g 培养基调节 ph 为 , 在 2 高压蒸汽灭菌 min.2 方法.2. 菌株筛选取垃圾渗滤液 ml 按 %(V/V) 接种在 L 培养基中,3,5 r/min 条件培养, 24 h 后取 ml 重新接种至新鲜 L 培养基, 连续富集培养 5 次, 用格利斯试剂定性检测硝酸盐是否转化为亚硝氮, 培养基变红, 垃圾渗滤液中的菌群有反硝化活性 富集菌液按倍比稀释, 取 -6 和 -7 浓度菌液涂布在 T 培养基,3 恒温培养 3 d 反硝化细菌消耗硝酸钾产生碱度, 使溴百里酚蓝变蓝, 挑取蓝色单菌落在 T 培养基上多次划线培养纯化作为初筛菌株 挑取初筛纯菌株接种于 L 培养基,3,5 r/min 条件下富集 24 h,4 r/min 离心 3 min, 弃去上清液加入无菌水制备菌悬液 将菌悬液以 2%(V/V) 接种至 DM 和 NI 培养基中培养 2 d, 复筛出降解硝氮 氨氮能力最强的菌株, 命名为 L6 富集培养保存在甘油管中, 在 - 冰箱里暂存 所有操作在无菌台上进行, 培养基及其他仪器事先灭菌.2.2 菌株鉴定将菌株 L6 富集培养制备菌悬液, 在 T 培养基划线培养 24 h, 挑取单菌落通过扫描电子显微镜 (JSM-7F 型 ) 观察菌体形态 将菌株 L6 富集培养制备菌悬液, 在 T 培养基划线培养, 通过 6S rdn 分析鉴定 过程为 : 利用 DN 提取试剂盒提取, 用 DN 通用引物进行 PCR 扩增, 上游引物 (27F)5'-GGTTTGTCCT- GGCTCG-3', 下游引物 (429R)5'-GGTTCCT- TGTTCGCTT-3',PCR 体系 : Ex Taq 缓冲液 5. μl, mmol/l dntp 混合物 4. μl, pmol/l 引物各. μl, 模板 μl,5 U/μL Taq DN 聚合酶 μl, 无菌水 36.5 μl, 共 5 μl, 扩增程序 :95 预变性 5 min,95 变性 3 s,54 退火 3 s,72 延伸 9 s, 经过 3 个循环,72 延伸 min,4 保温 将 PCR 产物经电泳检测条带单一 大小正确后, 经

3 李思琦等 好氧反硝化菌 chromobacter sp.l6 的脱氮特性,36(6) 切胶回收克隆后测序 测序结果在 EZbiocloud 网站 2.2 上进行同源性比对 构建系统发育树 S rdn序列及系统发育分析 对菌株 L6 测序得到 4 bp 长度的 6S rdn 菌株异养硝化 - 好氧反硝化性能研究 将菌 基因序列 在 EZbiocloud 网站上进行同源性比对 株 L6 富 集 制 备 菌 悬 液 以 2% V/V 分 别 接 种 至 菌 株 L6 与 chromobacter insuavis chromobacter ml DM NI 培养基 测定其好氧反硝化和异养 ruhlandii chromobacter xylosoxidans lcaligenes 硝化能力 控制单一变量 分别在不同碳源 乙酸钠 faecalis chromobacter denitrificans 及 chromobacter 葡萄糖 甘油 柠檬酸钠和琥珀酸钠 不同碳氮比 piechaudii 相似性均在 99% 以上 初步确定菌株 L6 5 5 和 25 不 同 温 度 3 和 为无色杆菌 chromobacter sp. 通过 MEG 7. 软件 37 不同转速 5 5 和 r/min 下 以 Neighbor-Joining 法构建系统发育树如图 2 菌株 3 5 r/min 培养 48 h 温度 转速实验除外 L6 与 chromobacter insuavis LMG26845 具 有 99.7% 每隔 2 h 检测菌株生长量 每隔 6 h 检测 DM 培养 同源性 目前分离出多种异养硝化 - 好氧反硝化菌 基中硝氮 亚硝氮浓度和 NI 培养基中氨氮浓度 并 无色杆菌较少 本研究分离的无色杆菌 L6 丰富了 测量总氮浓度变化 异养硝化 - 好氧反硝化细菌的多样性 也表明无色.2.4 杆菌在脱氮领域具有潜在的应用价值 测定方法 生长量 采用分光光度法 G/T 268- 氨氮采用纳氏试剂分光光度法 2.3 G HJ535-9 硝氮采用麝香草酚法分光光度 2.3. 菌株脱氮特性 好氧反硝化特性 菌 株 L6 的 生 长 曲 线 如 法 G HJ/T346-7 亚硝氮采用 N- - 萘基 - 图 3- 前 2 h 浊 度 由 3 增 长 到 72 硝 氮 乙二胺光度法 G 总氮采用碱性过硫酸 由 mg/l 降至 55 mg/l 均无明显变化 此 钾消解紫外分光光度法 G HJ636-2 阶段为菌体的适应期 从 2-36 h 培养基细胞生物 氨氮去除率 量迅速增加 细菌处于对数生长期 硝氮含量降至 ᇊ NH4 N ᓖ mg/l 亚硝氮含量增加到 mg/l 说明菌 + NH4+ N৫䲔 = ࡍ NH4+ N ᓖ % 硝氮 亚硝氮 总氮去除率计算公式同上 2 2. 结果 株 L6 的好氧反硝化过程是消耗硝氮产生亚氮进而 转化为氮气或自身生物量积累 此过程硝氮去除率 达 98.4% 菌株对硝氮的去除主要发生在对数生长 期 反硝化效果性能突出 36 h 后培养基各物质含 菌株形态特征 量变化不大 浊度基本稳定 且有减小的趋势 细 L6 菌落培养及扫描电镜图如图 菌落呈圆形 菌在 36 h 后处于稳定期并逐渐进入衰减期 边缘整齐 表面光滑 呈乳白色 透明 菌体大小约 μm.8 μm 培养基中相似 前 2 h 浊度由 5 增至 8 氨 异养硝化特性 菌株 L6 的生长曲线与 DM 氮由 34.6 mg/l 降至 mg/l 去除率 9.22% 为 细菌的适应期 从 2 h-36 h 培养基浊度迅速增加 氨氮浓度降至.6 mg/l 去除率 6.5% 此时处于 对数生长期 此后进入稳定期并逐渐进入衰减期 图 3- 菌株 L6 是兼具异养硝化 - 好氧反硝化能力 的菌株 其好氧反硝化能力更强 菌落形态 扫描电镜图 图 菌株 L6 的形态特征 环境因素对菌株L6好氧反硝化性能的影响 碳源对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响 碳 源对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响如图 4- 菌 株 L6 以乙酸钠 柠檬酸钠 琥珀酸钠为唯一碳源时

4 生物技术通报 iotechnology ulletin 96,Vol.36,No.6 chromobacter deleyi LMG chromobacter kerstersii LMG 344 chromobacter spanius LMG chromobacter marplatensis 2 45 chromobacter piechaudii TCC chromobacter pestifer LMG 343 chromobacter mucicolens LMG chromobacter animicus LMG chromobacter insolitus DSM 2387 L6 64 chromobacter insuavis LMG chromobacter aegrifaciens LMG chromobacter agilis LMG 34 chromobacter ruhlandii TCC 5749 chromobacter denitrificans DSM chromobacter dolens LMG chromobacter anxifer LMG chromobacter pulmonis LMG chromobacter xylosoxidans NRC 526 chromobacter aloeverae V- 图2 NO3--N, NO2--N ᓖ/ mg L- 6 NO3--N NO2--N 硝氮基本完全去除 去除率分别为 99.6% 99.5% 和 99.74% 总氮去除率分别为 28.79% 38.85% 和 29.% 培养基初始时总氮包括培养基的硝氮和细.5. 其 48 h 后总氮含量变化近似于转化为 N2 部分的氮 损失 菌株 L6 系统发育树 菌胞内氮 48 h 后硝氮一部分转化为亚硝氮 一部 分直接转化为 N2 排出 其余部分转化为细菌胞内氮 以甘油为唯一碳源时生长效果最好 对硝氮去 除率仅.6% 总氮的去除率 6.72% 说明菌株能 Time/h 够利用甘油生长但没有好氧反硝化能力 可能是因 NH4 -N 35 ᓖ/ mg L- 为碳源为微生物生长提供所需的能量和好氧反硝化 + 过程中的电子供体 碳源不同 细菌生长速率不同 硝酸盐的还原和中间产物的积累程度也不同 对反 3 25 图 Time/h 菌株 L6 异养硝化 - 好氧反硝化特性 硝化速率影响很大 本研究中无色杆菌 L6 在不同 碳源的培养基中脱氮效果由高向低依次为柠檬酸钠 琥珀酸钠 乙酸钠 葡萄糖 甘油 柠檬酸钠培养 基中硝氮去除率高 其总氮去除率最高 亚硝氮积 累量为 mg/l 剩余部分氮转化为细胞生物量 菌株 L6 以柠檬酸钠为碳源时好氧反硝化能力最好 C/N 对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响 碳

5 ,36(6) 李思琦等 : 好氧反硝化菌 chromobacter sp.l6 的脱氮特性 97 氮比对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响如图 4-, 固定 DM 培养基氮源含量, 使用 2.4. 中好氧反硝化能力最好的柠檬酸钠为碳源, 改变柠檬酸钠含量以改变碳氮比 在碳氮比达到 以上后, 对硝氮的去除能力基本稳定, 均在 97% 以上, 在碳氮比为 25 时总氮去除率最高分别为 58.9% 56.79%, 且亚硝氮积累量也相较于碳氮比为 5 时有所降低 在碳氮比为 5 时 OD 6 达 3.34, 菌株生长最好, 亚硝氮在碳氮比为 5 条件下积累量最高, 菌株 L6 在碳氮比为 5 时基本不生长, 说明菌株 L6 生长过程需要外加碳源, 是异养的反硝化菌 碳氮比对菌株生长情况有显著影响, 低的反硝化能力可能是碳源不足菌体生长不良导致 本研究中碳氮比为 的培养基中总氮去除率最高, 硝氮去除率为 97.2%, 亚硝氮积累量为 23.6 mg/l, 在碳氮比为 时 L6 的反硝化能力最好 温度对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响温度对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响如图 4-C, 在以柠檬酸钠为碳源, 碳氮比为 的 DM 培养基中实验, 培养温度为 3 37 的菌株基本将硝态氮降解完全, 去除率分别为 97.56% 96.97%,3 下的菌株生长及总氮去除能力都比 37 时要好, 可能是高温导致生物核酸或蛋白的变性, 细胞功能下降, 影响脱氮效果 菌株在 3 个培养温度下均能正常生长,3 37 时 OD 6 达到 和 62, 而 时为.52, 在 生长情况较其他温度稍差, 且基本不降解硝态氮, 同时也没有亚硝态氮的产生, 说明低温对于菌株 L6 的生长和好氧反硝化有明显的抑制作用, 可能是低温抑制了酶活性, 影响其脱氮效果 3 条件下总氮去除率为 43.87%, 亚硝氮积累 22 mg/l, 对菌株 L6 好氧反硝化能力较好的培养温度应在 3 左右 溶解氧对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响溶解氧对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响如图 4-D, 调整培养箱转速来改变溶解氧浓度, 图中表明溶解氧含量越高, 细菌生长状况越好, 验证了菌株 L6 为好氧菌 各培养基对于硝态氮的去除趋势一致, 且去除效果基本相同, 将氮转化为气体的能力与溶解氧含量成正比, 最后硝态氮都稳定在 mg/l 以下, 去除率分别为 97.79% 97.3% 99.83% 和 98.5%, 在培养后期均有降解亚硝酸盐的能力, 菌株 L6 在 5 r/min 下脱氮效果最好, 可能是因为 HN-D 菌株在好氧条件下进行反硝化, 但亚硝酸盐还原过程对氧极其敏感, 高浓度溶解氧会抑制亚硝酸盐的还原, 低浓度溶解氧又抑制异养菌株的生长, 过高过低的溶解氧量都会影响菌株的脱氮能力 其中 5 r/min 转速的培养基积累亚硝态氮含量少, 且硝态氮去除能力最强, 亚硝氮积累量为 mg/l, 总氮去除率 48.44%, 菌株 L6 最适的转速在 5 r/min 左右 环境因素对菌株 L6 异养硝化性能的影响. 碳源对菌株 L6 异养硝化能力的影响碳源对菌株 L6 异养硝化能力的影响如图 5-, 菌株 L6 以氨氮为氮源, 以柠檬酸钠为碳源时对氨氮和总氮去除率最高, 这与前面好氧反硝化性能影响实验一致, 可能是由于柠檬酸钠参与细胞三羧酸循环, 能够更加有效的被菌体利用 以葡萄糖为碳源的菌株生长最好, 但以甘油和葡萄糖为碳源的菌株去除氨氮的能力较差, 以乙酸钠 柠檬酸钠 琥珀酸钠为碳源的培养基中后期氨氮稳定在 35 mg/l 以下, 对氨氮的去除率分别为 62.33% 67.9% 和 62%, 菌株 L6 在不同碳源的培养基中脱氮效果由高向低依次为柠檬酸钠 乙酸钠 琥珀酸钠 葡萄糖和甘油, 在以柠檬酸钠为碳源的培养基中对氨氮去除率最高, 总氮去除率为 54.72%, 菌株 L6 以柠檬酸钠为碳源时异养硝化能力最好.2 C/N 对菌株 L6 异养硝化能力的影响 C/N 对菌株 L6 异养硝化能力的影响如图 5-, 培养基以柠檬酸钠为碳源, 随碳氮比的增加, 菌株生长情况越好, 且对氨氮和总氮去除率也逐渐升高, 说明碳氮比能够显著影响菌株的生长情况及其异养硝化能力 菌株 L6 在 C/N 为 5 时基本不生长, 氨氮去除能力也低, 可能是碳氮比小时碳源不充分, 细菌生长受限制, 异养硝化能力受影响 48 h 后, 碳氮比为 5 和 25 的培养基中氨氮的去除效果分别为 95.79% 96.3% 和 97.5%, 在 C/N 为 25 时

6 生物技术通报 iotechnology ulletin NO3---N NO2 -N T=37 图 䖜䙏r/min.5 8 ৫䲔 /% D 6 T=3 ᓖ 4 C/N= C/N=5 C/N= C/N=5C/N= C/N=25 6 T= C/N NO3 -N NO2--N. NO2--N ᓖ/ mg L- ৫䲔 /% Ḑ 䞨䫐 䞨䫐 NO3--N৫䲔 /% 6 C NO2--N ᓖ/ mg L- 䞨䫐 㪑㨴 NO3--N NO2--N NO2--N ᓖ/ mg L- 8 NO3--N৫䲔 /%,Vol.36,No.6 NO3--N৫䲔 /% ৫䲔 /% 8 ৫䲔 /% NO3---N NO2 -N NO2--N ᓖ/ mg L- NO3--N৫䲔 /% 98. 环境因素对菌株 L6 好氧反硝化能力的影响 达.477 菌株生长最好 且总氮去除率也最 最好的是转速 r/min 的培养基 总氮去除率为 高为 98% 考虑到实际应用中高碳氮比投加碳源 87.5% 其次是转速为 5 r/min 的培养基 总氮去 的成本以及可能造成水体化学需氧量的升高 可以 除率为 86.33% 菌株 L6 的异养硝化能力对溶解氧 取碳氮比为 作为菌株 L6 异养硝化能力的碳氮比 的要求不高 菌株 L6 异养硝化能力较好的转速可 其总氮去除率也可达到 86.79% 以在 5- r/min 左右.3 温度对菌株 L6 异养硝化能力的影响 温度 对菌株 L6 异养硝化能力的影响如图 5-C 取柠檬 酸钠为碳源 碳氮比为 菌株在 3 个培养温度下 均能正常生长 且 下生长情况最好 3 种温度 下 氨 氮 去 除 率 分 别 为 95.56% 97.9% 和 96.87% 低温对于菌株 L6 的硝化作用基本没有影响 其异 养硝化作用受温度影响小 其中培养温度为 3 时 的氨氮去除率最大 总氮去除率最高为 78.24% 对 菌株 L6 异养硝化能力较好的培养温度可以在 37 左右.4 转 速 对 菌 株 L6 异 养 硝 化 能 力 的 影 响 转 速 对 菌 株 L6 异 养 硝 化 能 力 的 影 响 如 图 5-D 各 2.6 菌株L6好氧反硝化-异养硝化性能的优化 以单因素实验中脱氮能力最强的环境因子作为 实验条件 即以硝酸盐为氮源 柠檬酸钠为碳源 C/N 为 培养温度为 3 培养转速为 5 r/min 条 件下培养 48 h 优化环境因素影响后 L6 对硝酸盐 去除率 99.74% 总氮去除率为 58.9% L6 在以氨氮为氮源 柠檬酸钠为碳源 C/N 为 培养温度为 3 培养转速为 r/min 条 件下氨氮去除率提高到 93.4% 总氮去除率 86.33% 图 6 3 讨论 培养基对于氨氮去除效果基本相同 去除率分别 在探究环境因素对菌株 L6 的异养硝化 - 好氧 为 9.87% 83.23% 89.87% 和 93.4% 转 速 对 菌 反硝化性能的影响实验中 L6 在碳源为柠檬酸钠 株 L6 的硝化作用没有太大影响 异养硝化能力 的培养基中脱氮效果最好 这与 Enterobacter asburiae

7 李思琦等 好氧反硝化菌 chromobacter sp.l6 的脱氮特性 Ḑ 䞨䫐бҼ䞨䫐 4 4. C/N= C/N=5 C/N= C/N=5 C/N= C/N= ৫䲔 /% D ৫䲔 /% ৫䲔 /%.5 C/N 8 C.5.. T= T=3 ᓖ T=37 图5 5 5 䖜䙏/r/min.5. ᓖ/ mg L- NO3--N, NO2--N ᓖ/ mg L- NO3--N 环境因素对菌株 L6 异养硝化能力的影响 NO2--N 䞨䫐 㪑㨴 ৫䲔 /% ৫䲔 /% 8 ৫䲔 /% 99 ৫䲔 /% ৫䲔 /%,36(6) Time/h Time/h 图6 菌株 L6 好氧反硝化 - 异养硝化性能的优化 YT 2 和 cinetobacter sp. T 3 结果一致 其他研 分离的醋酸钙不动杆菌 N7 与克雷伯氏菌 y5 和 究也有以丁二酸钠 4 琥珀酸钠 5 葡萄糖 6 y6 8 结果相似 目前有些研究中分离在低碳氮比 为唯一碳源时效果最好 说明碳源为微生物生长提 5- 下进行好氧反硝化的菌株 9-24 有效解决 供所需的能量和好氧反硝化过程中的电子供体 对 生物法处理低 C/N 比废水存在碳源不足 脱氮效率 微生物的生长和脱氮能力影响很大 L6 在碳氮比 不高的问题 L6 在 3 下培养脱氮效果最好 在 为 的培养基中脱氮效果最好 低于田雪雪等 7 大部分好氧反硝化菌生长最适温度范围内

8 生物技术通报 iotechnology ulletin,vol.36,no.6 也有学者在从低温环境下提取出嗜冷菌株 [3-34], 能 耐 -5 低温 L6 异养硝化 - 好氧反硝化最适 转速分别在 r/min 和 5 r/min 左右, 与假单胞 菌 WUST-7 [6] 和发光细菌 NN4 [35] 结果相似, 转速 对细菌脱氮能力的影响可能是由于亚硝酸盐还原过 程对氧敏感, 高浓度溶解氧会抑制亚硝酸盐的还原, 低浓度溶解氧又抑制异养菌株的生长, 过高过低的 溶解氧量都会影响菌株的脱氮能力 [] 以最佳环境 因子作为培养条件优化 L6 的脱氮能力, 硝酸盐氮 去除率 99.74%, 氨氮去除率提高到 93.4%, 说明环 境因素显著影响 L6 的异养硝化 - 好氧反硝化能力 4 结论 () 从垃圾渗滤液中提取出一株 HN-D 菌, 对其进行 6S rdn 同源性分析, 结果为无色杆菌 (chromobacter insuavis LMG26845) 对其好氧反硝 化下硝氮去除率达 98.4%, 同时具有异养硝化能力, 异养硝化的氨氮去除率为 6.5% (2) 对菌株 L6 的好氧反硝化能力进行影响因 素分析, 在以乙酸钠 柠檬酸钠 琥珀酸钠为碳源, C/N 为 5-5, 培养温度为 3-37, 培养转速为 r/min- r/min, 其中以柠檬酸钠为碳源,C/N 为, 培养温度为 3, 培养转速为 r/min 时的脱 氮能力最强 (3) 对菌株 L6 的异养硝化能力进行影响因素 分析, 在以乙酸钠 柠檬酸钠和琥珀酸钠为碳源, C/N 为 5-25, 培养温度为 -37, 培养转速为 5 r/min- r/min, 其中以柠檬酸钠为碳源,C/N 为 25, 培养温度为 3, 培养转速为 r/min 时的脱 氮能力最强 (4) 对菌株 L6 异养硝化 - 好氧反硝化能力 优化, 在脱氮能力最佳的环境因素下,L6 的好 氧反硝化硝酸盐氮去除率为 99.74%, 总氮去除率 58.9% L6 异养硝化的氨氮去除率提高到 93.4%, 总氮去除率 86.33% 参考文献 [] 孙庆花, 于德爽, 张培玉, 等. 株海洋异养硝化 - 好氧反硝化 菌的分离鉴定及其脱氮特性 [J]. 环境科学, 6, 37(2): [2] 司圆圆, 陈兴汉, 许瑞雯, 等. 好氧反硝化细菌脱氮研究进展 [J]. 山东化工, 8, 47(4): [3]Meiberg JM, ruinenberg PM, Harder W. Effect of dissolved oxygen tension on the metabolism of methylated amines in Hyphomicrobium X in the absence and presence of nitrate :evidence for erobic denitrification[j]. Microbiology, 98, (2): [4]Robertson L, Kuenen JG. Thiosphaera pantotropha gen. nov. sp. nov., a facultatively anaerobic, facultatively autotrophic sulphur bacterium[j]. J Gen Microbiol, 983, 29(9): [5]He T, Li Z, Sun Q, et al. Heterotrophic nitrification and aerobic denitrification by Pseudomonas tolaasii Y- without nitrite accumulation during nitrogen conversion[j]. ioresource Technology, 6, : [6] 胡杰, 颜家保, 霍晓琼, 等. 低 C/N 比异养硝化 - 好氧反硝化菌筛选及硝化特性 [J]. 化工进展, 9(3): [7] 颜薇芝, 张汉强, 余从田, 等. 株异养硝化好氧反硝化不动杆菌的分离及脱氮性能 [J]. 环境工程学报, 7, (7): [8]Huang F, Pan L, Lv N, et al. Characterization of novel acillus strain N3 from mariculture water capable of halophilic heterotrophic nitrification-aerobic denitrification[j]. Journal of ioscience and ioengineering, 7, 24(5): [9] 康鹏亮, 张海涵, 黄廷林, 等. 湖库沉积物好氧反硝化菌群脱氮特性及种群结构 [J]. 环境科学, 8, 39(5): [] 李贵珍, 赖其良, 邵宗泽, 等. 异养硝化 - 好氧反硝化细菌的研究进展 [J]. 生物资源, 8, 4(5): [] 丁钰, 张婷月, 黄民生, 等. 好氧反硝化菌及其在污水处理和环境修复中的研究进展 [J]. 华东师范大学学报 : 自然科学版, 8(6):-. [2] 林而舒, 陶欣, 胡开辉, 等. 株肠杆菌脱氮性能及其同步硝化反硝化机制初探 [J]. 工业水处理, 8, 38():2-26. [3]Chen S, He S, Wu C, et al. Characteristics of heterotrophic nitrification and aerobic denitrification bacterium cinetobacter sp. T and its application for pig farm wastewater treatment[j]. Journal of ioscience and ioengineering, 9, 27(2):- 5. [4] 白洁, 陈琳, 黄潇, 等. 株耐盐异养硝化 - 好氧反硝化菌 Zobellella sp. 37 的分离及脱氮特性 [J]. 环境科学, 8, 39(): [5] 王田野, 魏荷芬, 胡子全, 等. 一株异养硝化好氧反硝化菌的

9 ,36(6) 李思琦等 : 好氧反硝化菌 chromobacter sp.l6 的脱氮特性 筛选鉴定及其脱氮特性 [J]. 环境科学学报, 7, 37(3): [6] 邹艳艳, 张宇, 李明智, 等. 一株异养硝化 - 好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮活性研究 [J]. 中国环境科学, 6, 36(3): [7] 田雪雪, 程玉立, 张圆圆, 等. 一株异养硝化 - 好氧反硝化功能菌的分离鉴定及其脱氮特性 [J]. 环境工程学报, 7, (2): [8] 王骁静, 于德爽, 李津, 等. 海洋异养硝化 - 好氧反硝化菌 y6 同步脱氮除碳特性 [J]. 中国环境科学, 7, 37(2): [9]Yang M, Lu D, Qin, et al. Highly efficient nitrogen removal of a coldness-resistant and low nutrient needed bacterium, Janthinobacterium sp. M-[J]. ioresource Technology, 8, 256 : [] 张峥, 黄家富, 覃华静, 等. 一株好氧反硝化菌的筛选及其脱氮性能研究 [J]. 广西科技大学学报, 8, 29(4): [2] 李雪, 刘思彤, 陈倩. 一株好氧反硝化菌的鉴定及脱氮特性研究 [J]. 北京大学学报 : 自然科学版, 8, 54(6): [22] 许涛, 王国英, 岳秀萍. Diaphorobacter sp. PD3 菌好氧反硝化脱氮特性 [J]. 中国环境科学, 8, 38(6): [23] 魏荷芬, 韩保安, 王田野, 等. 一株荧光假单胞杆菌的分离鉴定与反硝化特性 [J]. 微生物学通报, 6, 43(8): [24] 甘美君, 曾庆鹏, 王海蓉, 等. 脱氮菌 Flavobacterium sp. FL2T 的筛选与硝化特性研究 [J]. 环境保护与循环经济, 7, 37():6-2. [25]Yang L, Ren YX, Liang X, et al. Nitrogen removal characteristics of a heterotrophic nitrifier cinetobacter junii Y and its potential application for the treatment of high-strength nitrogenous wastewater[j]. ioresource Technology, 5, 93 : [26]Wen G, Wang T, Li K, et al. erobic denitrification performance of strain cinetobacter johnsonii WGX-9 using different natural organic matter as carbon source :Effect of molecular weight[j]. Water Research, 9, 64. [27] 白洁, 郭晓旭, 康兆颜, 等. 一株异养硝化 - 好氧反硝化菌 Pseudomonas sp. GK- 的筛选及脱氮能力研究 [J]. 中国海洋大学学报 : 自然科学版, 9, 49(S): [28] 孙将, 李建章, 袁月祥, 等. 高效除氨氮异养硝化细菌的分离鉴定及其脱氮条件优化 [J]. 农业工程学报, 8, 34(S): [29]Yang J, Wang Y, Chen H, et al. mmonium removal characteristics of an acid-resistant bacterium cinetobacter sp. JR from pharmaceutical wastewater capable of heterotrophic nitrificationaerobic denitrification[j]. ioresource Technology, 9, 274 : [3] 冶青, 何腾霞, 李振轮, 等. 株耐冷耐碱好氧反硝化菌的鉴定及其脱氮特性 [J]. 环境污染与防治, 8, 4(9):997-. [3] 刘勇波, 曲丹, 任何军. 一株低温苯胺降解菌的好氧反硝化性能 [J]. 河南水利与南水北调, 8, 47(5): [32] 蔡茜, 何腾霞, 冶青, 等. 耐冷嗜碱蒙氏假单胞菌 H97 的鉴定及其好氧反硝化特性 [J]. 环境科学, 8, 39(7): [33] 魏荷芬, 王田野, 张宏才, 等. 一株多重耐受性高效反硝化细菌的分离鉴定及特性 [J]. 环境工程学报, 6, (2): [34] 向书迪, 冶青, 冯密, 等. 一株耐冷好氧反硝化菌的同时硝化反硝化特性 [J]. 农业生物技术学报, 9, 27(7): [35]Liu Y, i G, Wu M, et al. Photobacterium sp. NN4, an efficient hydroxylamine-transforming heterotrophic nitrifier/aerobic denitrifier[j]. Journal of ioscience and ioengineering, 9, 28():64-7. ( 责任编辑狄艳红 )

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