ND617-VAHTSTM Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina®

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1 VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina ND617 Vazyme Biotech Co., Ltd. Web: Tel: Sales: Support: Service: Vazyme biotech co., ltd. 使用说明书 Version 9.1

2 目 录 Contents 01/产品概述 VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina 是针对Illumina 高通量测序平台定向开 发的DNA文库构建试剂盒 本试剂盒将DNA片段化 末端修复以及末端加dA尾合并为一步 产 物无需纯化 直接进行接头连接 文库富集和分选 可将100 pg - 1 μg模板dna转换成illumina 高 通量测序平台专用文库 无需对基因组进行机械打断 简化了建库流程 缩短了操作时间 适用 于PCR和PCR-Free文库的构建 本试剂盒可完美兼容不同来源和不同投入量的DNA 仅需根据 目标插入片段大小调整片段化时间即可得到所需片段大小文库 试剂盒中提供的所有试剂都经过 了严格的质量控制和功能验证 最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性 02/产品组分 组分 ND (24 rxn) ND (96 rxn) 480 FEA Buffer 1 FEA Enzyme Mix Rapid Ligation Buffer Rapid DNA Ligase VAHTS HiFi Amplification Mix PCR Primer Mix 3 for Illumina Neutralization Buffer Control DNA (/) Control DNA为鲑鱼基因组DNA 01/产品概述 /产品组分 /保存条件 /适用范围 /自备材料 /注意事项 /关于Input DNA和Fragmentation /关于Adapter /关于Adapter Ligation产物纯化 /关于磁珠的使用 /关于长度分选 /关于Library Amplification /关于文库的质量控制 /其他注意事项 /实验原理与流程概要 /标准实验方案 附一 双轮磁珠分选...15 附二 实验实例 附三 多样本片段化方案 /保存条件 -30 ~ -15 保存 - ~ 0 运输 04/适用范围 适用于制备Illumina 高通量测序平台专用文库 兼容起始投入量为100 pg - 1 µg 适用于动物 植物 微生物等不同物种来源基因组DNA (Genomic DNA) 石蜡切片DNA (FFPE DNA)等 可 应用于 全基因组测序 全外显子或其他靶向捕获测序(配合IDT xgen Lockdown Probes Roche NimbleGen SeqCap EZ或其他杂交捕获系统) 宏基因组测序 甲基化测序(配合Phanta UC Super-Fidelity DNA Polymerase for Library Amplification Vazyme #P507) 01/ 02

3 05/自备材料 06-2/关于DNA Adapter 针对Illumina 测序平台 Vazyme提供四套Indexed Adapters 可根据不同使用需要和Pooling 纯化磁珠 VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411) DNA质控 Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品 的样本数量选择 Equalbit dsdna HS Assay Kit (Vazyme #EQ111) #N331/N332/N333/N334 提供96种含10 bp UMI序列的不重复双端8 bp Indexed Adapters 各24种 VAHTS Library Quantification Kit for Illumina (Vazyme #NQ ) #N321/N322为双端各8 bp Indexed接头引物组合 可构建多至384种不同接头组合文库 DNA Adapter #N801/N802 提供24种单端6 bp Indexed Adapters 各12种 VAHTS Dual Index UMI DNA Adapters for Illumina (Vazyme #N331/332/333/334) #N805/N806/N807/N808 提供96种单端8 bp Indexed Adapters 各24种 #N331-N334为双端各8 bp Unique Indexed接头 并包含10 bp UMI VAHTS Multiplex Oligoes Set 4/5 for Illumina (Vazyme #N321/N322) #N321/N322为双端各8 bp Indexed接头引物组合 可构建多至384种不同接头组合文库 VAHTS DNA Adapters set 1-6 for Illumina (Vazyme #N801/N802或N805/N806/N807/N808) #N801/N802为24种单端6 bp Indexed Adapters 各12种 #N805/N806/N807/N808为96种单端8 bp Indexed Adapters 各24种 同时 VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina 也可以兼容诸如Illumina TruSeq等常规体系中使用到的各种Non-indexed 单端Indexed及双端Indexed Adapters DNA Adapter的质量和用量直接影响建库效率和文库的质量 Adapter投入量过高可能会导 致Adapter或Adapter Dimer残留 投入量不足又会影响连接效率进而导致文库产出降低 Table 2列举了不同Input DNA量推荐的Adapter使用量 Table pg - 1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度 其他材料 无水乙醇 灭菌超纯水 0.1 TE 洗脱液(10 mm Tris-HCl ph ph 8.5) 低吸附EP管 PCR管 磁力架 PCR仪等 Input DNA 06/注意事项 受样本 方案 设备 操作等诸多因素影响 文库构建流程参数可能需要根据实际情况进行 调整 为了能够获得高质量的测序文库 请务必仔细阅读下述注意事项 使用过程中如遇任 何问题 可联系Vazyme技术支持获取帮助 500 ng - 1 μg ng 25 ng - 5 ng - 25 ng 100 pg - 5 ng Adapter Input DNA 摩尔比 10:1 - :1 :1-100:1 50:1-0:1 40:1-0:1 60:1-3000:1 其他来源Adapter 工作浓度 10 μm 10 μm 5 μm 1 μm μm Vazyme Adapter 预稀释倍数 不稀释 不稀释 1:2 1:10 1:30-1:0 Input DNA摩尔数可根据下述公式粗略计算 Input DNA摩尔数(pmol) Input DNA质量(ng)/[0.66 Input DNA平均长度(bp)] 推荐根据表中的浓度值或Vazyme Adapter的稀释倍数使用0.1 TE预先稀释Adapter 保证建库过程 06-1/关于Input DNA和Fragmentation 中Adapter的使用体积为固定数值(5 ) 避免加样体积错误 试剂盒兼容的Input DNA量范围为100 pg - 1 μg 应尽可能使用A260/A280 = 的 高质量Input DNA Table 1中列举了常见应用中推荐的Input DNA量 Table 1. 常见应用中推荐Input DNA量 应用 样本类型 全基因组测序 靶向捕获测序 全基因组/靶向捕获测序 全基因组测序 复杂基因组 复杂基因组 FFPE DNA 微生物基因组 全基因组测序(PCR-Free文库) 复杂/简单基因组 推荐Input DNA量 50 ng - 1 μg 10 ng - 1 μg 50 ng 1 ng - 1 μg 50 ng (不进行长度分选) 0 ng (进行长度分选) 上表为使用高质量DNA时推荐的Input DNA量 当Input DNA质量较差时 应适当上调使用量 推荐使用灭菌超纯水溶解DNA样品 FEA Enzyme Mix对EDTA敏感 请确认DNA样品 中EDTA浓度 如打断末修反应体系中EDTA终浓度大于0.1 mm 请按照08-1操作说明对 DNA样本进行预处理 Adapter的质量会直接影响Adapter与Input DNA的摩尔比 进而影响连接效率和文库产出 应选用优质 的Adapter 使用0.1 TE稀释和保存Adapter溶液 尽量避免反复冻融 提高Adapter的使用量可以在一定程度上提高文库产出 尤其当Input DNA 25 ng时 当需要优化建 库效率时 可在上表推荐条件下额外尝试几个更高的Adapter使用量(推荐2-10倍范围内) 如Adapter 原液浓度限制无法提高使用量 可通过提高Adapter使用体积来尝试 如 默认Adapter使用体积为 5 当Input DNA为500 ng - 1 μg时可提高vazyme Adapter使用量至10 以增加5% - 15%的文库产 出 但需注意提高接头浓度可能会增加文库中接头残留 造成测序数据浪费 06-3/关于Adapter Ligation产物纯化 Adapter Ligation产物需先去除过剩的Adapter 再进行后续文库扩增(PCR文库)或直接上机 测序(PCR-Free文库) 默认纯化条件0.6 (产物100 磁珠60 )适用于绝大多数情况 如需获得Insert Size更长的文库 可通过适当降低磁珠使用量以减少小片段文库的含量 但 这种调整只能粗略改变文库主峰的位置 如需要准确控制文库长度分布 可在此步纯化之后 进行长度分选 如之后进行文库长度分选 推荐洗脱体积为105 否则 推荐洗脱体积为 / 04

4 如数据显示纯化产物中Adapter或Adapter Dimer污染严重 可对其再进行一次磁珠纯 长度分选执行位置有多种选择 可置于End Preparation之前 Adapter Ligation之后或Library 化 使用灭菌超纯水将第一次纯化产物体积补至50 加入50 磁珠(1 )进行第二次 Amplification之后 标准实验方案中不包含长度分选步骤 如需进行 请参考附一 双轮磁 纯化 这样可以显著降低Adapter或Adapter Dimer的残留水平 尤其是当构建PCR-Free 珠分选 文库时 有时可能还需要降低Adapter的使用量才能完全消除Adapter或Adapter Dimer的 残留 进行长度分选 DNA损失量较大 有时需要在文库长度分布(进行长度分选)和文库复杂度 (不进行长度分选)之间进行选择 当Input DNA量较低时 应保证长度分选执行位置的唯一 性 进行两次或者两次以上的长度分选会导致文库复杂度和产出严重下降 06-4/关于磁珠的使用 试剂盒推荐使用VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411)进行磁珠纯化 注意 如使用其他来源磁珠 纯化条件可能需要更改 磁珠操作通用注意事项 磁珠使用量常用乘数 进行标识 表示相对于原始样品体积而言使用多少倍体积的 磁珠 如样品原始体积为100 1 纯化时磁珠使用体积为1 100 = / 0.2 分选时第一轮磁珠用量为 = 60 第二轮磁珠用量 = 磁珠使用量直接影响可纯化的DNA长度下限 乘数越高 可纯化的DNA长度下限越 短 反之 则越长 例如 1 磁珠只能高效纯化长于250 bp的dna 更短的DNA会 在纯化过程中大量丢失 提高至1.8 后 150 bp的dna也可进行高效纯化 磁珠使用前应先平衡至室温(室温放置30 min) 否则会导致得率下降 分选效果不佳 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀 过度扩增的文库进行长度分布检测时 常见高分子量位置出现拖带或尾峰 对应产物多为非 互补链交叉退火产物(参考06-6/关于Library Amplification) 推荐解决方案为调整扩增循环数 避免过度扩增 不建议通过长度分选去除拖带或尾峰 Rapid Ligation Buffer 3中包含的高浓度PEG会对双轮磁珠分选和切胶纯化产生显著影响 因此 如在Adapter Ligation之后进行长度分选 Adapter Ligation产物纯化步骤(08/标准方 案/步骤二/6.使用VAHTS DNA Clean Beads对反应产物进行纯化)不可省略 将纯化产物洗 脱至合适体积的洗脱液中 再进行双轮磁珠分选或切胶纯化 如确需在Adapter Ligation之后 分选 分选条件需另行摸索 如在Library Amplification之后进行长度分选 可将原处纯化步 骤直接替换为双轮磁珠分选或切胶纯化 06-6/关于Library Amplification PCR Primer Mix 3适用于扩增含完整长度Adapter的Illumina 高通量测序平台文库 非完整长 度Adapter或者其他平台文库需自行更换扩增引物 推荐每条引物的终浓度为5 - μm PCR反应后期 引物通常会比dNTP比被耗尽 此时 过多的循环会造成扩增产物解链后进 样品与磁珠充分混匀后置于磁力架上进行分离时 请于溶液彻底澄清后再吸取上 行非特异性退火 产生非互补链交叉退火产物 这些产物在依赖电泳的检测方式中迁移速率 清 吸取上清时应余留2-3 若不慎吸到磁珠 会造成得率下降 分选效果不佳甚 比较慢 在高分子量区域呈现弥散分布 它们是由正确长度的单链文库构成 在变性后能够 至影响后续酶促反应 此时可将磁珠混匀重新置于磁力架上再次分离即可 由于磁 与Flow Cell正常结合并被测序 因此 其存在与否对测序而言并无显著影响 然而 这种产 力架吸力不同等原因 默认分离时间有时可能需要延长 以彻底分离磁珠和液体 物的存在对于文库定量方式的选择会产生决定性影响 因产物不是完整的双链结构 当使用 磁珠漂洗应使用新鲜配制并平衡至室温的80%乙醇 漂洗过程中EP管应始终置于磁 力架中 请勿扰动磁珠 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥 干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反 应 过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率 通常情况下 室温干燥5-10 min 足以让磁珠充分干燥 请勿加热干燥(如置于37 烘箱干燥) 通常情况下 推荐使用洗脱液(10 mm Tris-HCl ph )进行产物洗脱 这样更 有利于产物的稳定保存 然而 当后续需对文库进行靶向捕获时 为了利于捕获前 文库干燥浓缩且避免对后续捕获反应产生影响 应使用灭菌超纯水进行产物洗脱 基于识别双链DNA的荧光染料(Equalbit dsdna HS Assay Kit, Vazyme #EQ111等)来进行 文库定量时 定量结果会比实际值偏低 但基于qPCR的文库定量体系(如VAHTS Library Quantification Kit for Illumina Vazyme #NQ101 - NQ106)在定量过程中包含变性过程 仍 然可以准确定量这种过度扩增的文库 Library Amplification步骤需要严格控制扩增循环数 循环数不足 会导致文库产出不足 循 环数过多 又会导致过度扩增 偏好性增加 重复度增加 嵌合产物增加 扩增突变积累等 多种不良后果 Table 3列举了当使用100 pg - 1 μg高质量input DNA时 获得或1 μg 文库推荐的扩增循环数 06-5/关于长度分选 如Input DNA分布范围较宽 建库过程中通常需要进行长度分选以控制最终文库长度分 布范围 推荐使用双轮磁珠分选方案 也可通过切胶纯化的方式进行分选 05/ 06

5 Table pg - 1 μg Input DNA扩增循环数推荐表 Input DNA 100 pg 1 ng 10 ng 50 ng 250 ng 500 ng 1 μg Number of cycles required to generate 1 μg 上表为使用高质量的小鼠gDNA 37 片段化15 min构建文库测得的循环数参数 当DNA质量较差 或者片段化时间不同时 需适当调整循环数以获取足量文库 若连接接头后进行长度分选 则参照较高循环数进行Library Amplification 若不需对文库进行分 选 参照较低循环数即可 当进行Adapter Ligation时使用完整长度的Adapter (如Vazyme #N801/N802或N331/N332/ N333/N334) 且文库产出能够满足应用需要 可不进行Library Amplification步骤 从而 获得PCR-Free文库 当Adapter Ligation步骤中使用非完整长度Adapter (如Vazyme #N321/N322)时 须至 少扩增2个循环以补全文库末端Adapter序列 文库浓度检测: 常用文库浓度检测方法有两种 基于双链DNA荧光染料的方法 如Equalbit dsdna HS Assay Kit (Vazyme #EQ111) Qubit PicoGreen 等 基于qPCR绝对定量的方法 如VAHTS Library Quantification Kit for Illumina (Vazyme #NQ101 - NQ106) 虽然前者简单易行 但 由于下述原因 推荐使用基于qPCR绝对定量的方法进行文库浓度测定 当使用完整长度Adapter 且完成Adapter Ligation步骤之后 任何一个步骤产物都可以使 用基于qPCR绝对定量的方法进行浓度测定 可以明确监控接头连接 磁珠纯化/分选 Library Amplification各步骤效率 进而能为体系优化和建库异常原因分析提供依据 因PCR-Free文库缺少Library Amplification步骤 构建好的文库中包含一定比例的单端连 接Adapter的产物和两端都未连接Adapter的产物 当使用Qubit PicoGreen 等基于双 链DNA荧光染料的浓度测定方法时 无法有效区分这些产物 但qPCR绝对定量基于 PCR扩增原理 只定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序文库) 可以排除单端或 双端都未连接Adapter的不可测序文库的干扰 因此 PCR-Free文库只能使用基于 qpcr绝对定量的方法进行浓度测定 过度扩增的文库因包含大量不完整双链结构 不能使用Qubit PicoGreen 等基于双链 DNA荧光染料的浓度测定方法 但基于qPCR绝对定量的方法不受过度扩增影响(参考 06-6/关于Library Amplification) 06-8/其他注意事项 06-7/关于文库的质量控制 通常情况下 构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价 文库长度分布检测: 文库长度分布可通过LabChip GX GXII GX Touch (PerkinElmer) Bioanalyzer DNA片段化产物的大小和分布范围是由时间依赖的酶促反应决定的 因此配制片段化反应 体系时应在冰上操作 使用前请将试剂盒各组分置于室温解冻 解冻后上下颠倒数次充分混匀 短暂离心后置于冰 上待用 Tapestation (Agilent Technologies) Fragment Analyzer (Advanced Analytical)等 为避免样品交叉污染 推荐使用带滤芯的枪头 吸取不同样品时请更换枪头 基于电泳分离原理的设备进行检测 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应 使用前应预热PCR仪至反应温度附近 常规适用于Illumina 平台的Adapter均为 Y 型Adapter 末端存在单链分叉区域 因 PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染 进而影响实验结果准确性 因此 我们推荐 此 Adapter Ligation之后未经扩增的PCR-Free文库两端都存在单链分叉区域 当进 将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离 使用专用的移液器 行文库长度分布检测时 这种单链的分叉结构会造成文库迁移速率变慢 进而导致 等设备 并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理) 以 检测结果偏长 分布范围变宽 峰型异常等问题 为了准确检测文库长度分布 可 保证实验环境的洁净度 取少量PCR-Free文库进行适度PCR扩增 取扩增产物进行检测以反映PCR-Free文 库的长度分布情况 也可通过检测VAHTS Library Quantification Kit for Illumina (Vazyme #NQ101 - NQ106)扩增产物来反映PCR-Free文库的长度分布情况 07/ 08

6 07/实验原理与流程概要 Input DNA 常见应用中推荐的Input DNA量参 考Table 1 (Page.03) dsdna Fragmentation, End Preparation & da-tailing (50 ) min min Fragmentation,End Preparation and da-tailing Adapter Ligation 不同Input DNA量推荐Adapter用量 参考Table 2 (Page.04) Adapter Ligation (100 ) 15 min Cleanup (160 ) 0.6 DNA Clean Beads PCR-Free Library ends here Library Amplification P5 IX P7 可分选位置 1 分选条件参考Table 5 (Page.15) 可进行文库长度分布与有效浓 度检测 不同Input DNA量推荐扩增Cycle数 参考Table 3 (Page.07) Library Amplification (50 ) 可分选位置 2 分选条件参见Table 5 (Page.15) Cleanup (95 ) 0.9 DNA Clean Beads VAHTS DNA Adapter Phosphate for Illumina da Tail Compatible with: dt Tail - DNA IX, Index - ChIP-DNA P5 sequence - RNA (non-small RNA) P7 sequence VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina 建库原理 Safe Stopping Point 1 PCR-Free文库构建至此结束 (此处推荐浓度测定方案 VAHTS Library Quantification Kit for Illumina ) Safe Stopping Point 2 可进行文库长度分布与有效浓 度检测 (此处推荐浓度测定方案 靶向捕获或测序 Equalbit / VAHTS Library Quantification Kit for Illumina ) VAHTS Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina 建库流程概要 09/ 10

7 08/标准实验方案 步骤一 Fragmentation, End Preparation & da-tailing 这一步骤对Input DNA进行片段化的同时将片段化DNA末端补平 并在端进行磷酸化和 端加dA尾 温度 热盖 时间 On 参照下表* 30 min Hold * 片段化时间需依据Input DNA质量及目标片段大小而定 1. 实验开始前 请确认模板DNA溶解于何种溶剂(推荐使用灭菌超纯水) 该溶剂是否含有 EDTA 如不含EDTA 直接进行步骤3 如含有EDTA则按照步骤2对样品进行预处理 2. 如含有EDTA 可使用2.2 磁珠对模板DNA进行纯化 灭菌超纯水洗脱 或根据片段化 体系中EDTA的终浓度 加入相应体积的Neutralization Buffer将EDTA中和 片段化体系EDTA终浓度=DNA溶液中EDTA浓度 DNA使用体积/ 50 例如DNA溶于含有1 mm EDTA的TE中 一次建库使用10 则EDTA终浓度为1 mm 10 / 50 = 0.2 mm Neutralization buffer加入体积 将FEA Buffer FEA Enzyme Mix取出 解冻并混匀 短暂离心收集至管底 置于冰上 备用 以下所有步骤操作均在冰上操作 时 在推荐投入量范围内(100 pg - 1 μg) 不同投入量相同反应时间 片段化产物分布范围差异不大(分 议以2-5 min的幅度上下调整片段化时间 FFPE DNA可根据其完整度 相应减少片段化时间 附二提 供了两个实验实例可供参考(Page.17/18) 步骤二 Adapter Ligation 这一步骤将在上一步片段化末修产物末端连接Adapter 1. 根据Input DNA量按Table 2 (Page.04)稀释Adapter至合适浓度 2. 将Rapid Ligation Buffer 3 Rapid DNA Ligase从- 取出 解冻并混匀 短暂离心收集至 3. 按照下表配制反应体系 体积 x y 5 To 40 如溶剂中不含EDTA 则无需额外添加Neutralization Buffer Neutralization Buffer加入过多会导 致片段化反应过度 当样本数量较多 且样本中含有EDTA时 需要计算加入不同体积的Neutralization Buffer 实际操 作中较为复杂 可参考附三 多样本片段化方案 5. 向每个样品中加入10 FEA Enzyme Mix 使用移液器吹打或振荡混匀 并短暂离心将 反应液收集至管底 立即置于PCR仪中进行反应 片段化反应为时间依赖的酶促反应 片段化产物大小取决于反应时间 因此推荐最后单独向反应 体系中加入FEA Enzyme Mix 加入后立即混匀并进行后续反应 片段化反应体系对氧化敏感 因此反应体系配制结束后应尽快将FEA Buffer和FEA Enzyme Mix 管盖拧紧 置于- 保存 以上推荐时间 为使用高质量的人胎盘gDNA为模板测试所得 当使用高质量人胎盘gDNA进行建库 管底 置于冰上备用 4. 于灭菌PCR管中配制如下反应 组分 Input DNA Neutralization Buffer FEA Buffer ddh2o 片段化时间 - 30 min 15 - min min 6-10 min 布范围基本一致 但主峰位置可能会略有差异) 如Input DNA质量不佳或片段化大小不在预期范围 建 Neutralization Buffer加入体积参考下表 片段化体系EDTA终浓度 1 mm 0.8 mm 0.6 mm 0.5 mm 0.4 mm 0.2 mm 0.1 mm 0.1 mm 预期插入片段大小 150 bp 250 bp 350 bp 550 bp 组分 上一步产物 Rapid Ligation Buffer 3 Rapid DNA Ligase DNA Adapter X ddh2o 体积 若使用VAHTS Multiplex Oligos Set 4/5 for Illumina (Vazyme #N321/N322) 则接头需使用其中配套 DNA adapter-s for Illumina 使用量仍为5 4. 使用移液器轻轻吹打混匀 并短暂离心将反应液收集至管底 5. 将PCR管置于PCR仪中 进行下述反应 温度 热盖105 4 时间 On 15 min Hold 当Input DNA量较低时 可尝试将连接时间延长一倍 但延长反应时间可能会导致Adapter Dimer增加 必要时需同时调整Adapter使用浓度 6. 将PCR管置于PCR仪中 运行如下程序 11/ 12

8 6. 使用VAHTS DNA Clean Beads对反应产物进行纯化 若使用Vazyme #N321/N322接头引物组合 则引物需使用其中配套i5 PCR Primer DM5XX和i7 PCR 1/ 磁珠平衡至室温后 涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads 2/ 吸取60 VAHTS DNA Clean Beads至100 Adapter Ligation产物中 涡旋振荡或 使用移液器轻轻吹打10次充分混匀 Primer DM7XX 每种引物使用量为 使用移液器轻轻吹打混匀(请勿振荡混匀) 并短暂离心将反应液收集至管底 3. 将PCR管置于PCR仪中 进行下述反应 3/ 室温孵育5 min 温度 / 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体 待溶液澄清后(约5 min) 小心 移除上清 5/ 保持PCR管始终置于磁力架中 加入0 新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠 室温孵育 30 sec 小心移除上清 时间 3 min sec 15 sec 30 sec 5 min Hold 循环数 1 循环数选择参照Table 3 (Page.07) 1 4. 如需进行长度分选 参考附一 双轮磁珠分选进行 如不需要进行长度分选 使用VAHTS 6/ 重复步骤5 总计漂洗两次 7/ 保持PCR管始终置于磁力架中 开盖空气干燥磁珠5-10 min至无乙醇残留 8/ 将PCR管从磁力架中取出 进行洗脱 如纯化产物不进行双轮磁珠分选 加入22.5 洗脱液(10 mm Tris-HCl ph ph 8.5)或灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀 于室温放置 2 min 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后(约5 min) 小心移 取 上清至新EP管中 切勿触碰磁珠 DNA Clean Beads对反应产物进行纯化 1/ 磁珠平衡至室温后 涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads 2/ 吸取45 VAHTS DNA Clean Beads至50 Library Amplification产物中 涡旋振荡或使 用移液器轻轻吹打10次充分混匀 3/ 室温孵育5 min 4/ 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体 待溶液澄清后(约5 min) 小心移除上 如纯化产物需进行双轮磁珠分选 加入105 洗脱液(10 mm Tris-HCl ph ph 8.5)或灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀 于室温放置 2 min 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后(约5 min) 小心移 取100 上清至新EP管中 切勿触碰磁珠 根据Table 5 (Page.15)双轮磁珠分选 条件进行长度分选 此处样品可于4 稳定保存一周 长期保存置于- 避免不必要的反复冻融 清 5/ 保持PCR管始终置于磁力架中 加入0 新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠 室温孵育30 sec 小心移除上清 6/ 重复步骤5 总计漂洗两次 7/ 保持PCR管始终置于磁力架中 开盖空气干燥磁珠5-10 min至无乙醇残留 8/ 将PCR管从磁力架中取出 进行洗脱 如后续不进行靶向捕获 加入22.5 洗脱液(10 mm Tris-HCl ph ph 8.5)或灭菌超 步骤三 Library Amplification 这一步骤将对纯化或长度分选后的Adapter Ligation产物进行PCR扩增 是否需要进行这一步 骤取决于Input DNA量 Adapter是否为完整长度以及下游应用需要等因素 如使用非完整长 度Adapter (如Vazyme #N321/N322) 必须进行这一步骤 如使用完整长度Adapter 当Input DNA 50 ng时 推荐进行Library Amplification 当Input DNA 50 ng或者不需要进行文库 扩增富集时 此步骤可不进行 直接进入步骤四 1. 将PCR Primer Mix 3 VAHTS HiFi Amplification Mix 解冻后颠倒混匀 短暂离心收集 至管底 于灭菌PCR管中配制如下反应 组分 纯化或分选过的Adapter Ligation产物 PCR Primer Mix 3 for Illumina VAHTS HiFi Amplification Mix 总计 体积 纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀 于室温放置2 min 将PCR管短暂 离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后(约5 min) 小心移取 上清至新EP管中 切 勿触碰磁珠 如后续需进行靶向捕获 加入22.5 灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打 充分混匀 于室温放置2 min 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后 (约5 min ) 小心移取 上清至新EP管中 切勿触碰磁珠 此处样品可于4 稳定保存一周 长期保存置于- 避免不必要的反复冻融 步骤四 文库质量控制 参考06-7/关于文库的质量控制 13/ 14

9 当使用非完整长度Adapter (如Vazyme #N321/N322)时 连接之后的分选方案执行条件与全 附一 双轮磁珠分选 为了满足不同应用的需要 建库过程中通常需要进行双轮磁珠分选以控制文库Insert Size的分布范围 分选方案执行位置的选择和优缺点参见Table 4 应保证分选方案执 行位置的唯一性 进行两次或者两次以上的分选会导致文库复杂度和产出严重下降 Table 4. 分选方案执行位置选择 分选方案执行位置 适用情况 优点 长Adapter不同 此时可根据下表选择最适分选参数 预期文库Insert Size (bp) 分选方案执行位置与条件 Adapter Ligation之后 分选(样品体积100 ) 磁珠轮数 一轮X () 二轮Y () 18 使用磁珠进行长度分选时 Insert Size越大最终产物分布越宽 当Insert Size 700 bp时 双轮磁珠几 缺点 适用样本举例 乎不具有分选效果 此时建议通过切胶纯化的方案进行长度分选 样品和磁珠的体积比对于分选效果至关重要 应尽可能保持样本初始体积和移液体积的准确性 Adapter Ligation 之后 Library Amplification 之后 建库过程中 不进行分选 Input DNA分布 范围适合且量 充足** 减少短片段DNA 丢失 Input DNA 量少** 减少建库过程中 Input DNA的损失 提高文库复杂度 文库分布 范围略宽 Input DNA分布 范围已满足建库 要求 Input DNA 量少 减少建库过程中 Input DNA的损失 提高文库复杂度 无法控制文库 Insert Size 不能准确 评价文库 分布范围* Fragmentation较 宽的基因组DNA 或分布范围较宽 的FFPE DNA 样品预处理(重要 ) 如在Adapter Ligation产物纯化之后进行长度分选 样品体积应为100 不足时使用灭菌 超纯水补齐 如在Library Amplification之后进行长度分选 样品体积应为100 不足时使用灭菌超纯 水补齐 Fragmentation适 合的基因组DNA 如不对样品进行体积预处理 也可按样品实际体积等比例调整磁珠用量 但样品体积太小 会导致移液误差增大 进而影响分选的准确性 因此 不推荐对体积 50 的样品直接进 行分选 * 双轮磁珠分选效果受DNA末端情况影响 Input DNA末端的单链部分以及 Y 型Adapter的单链非 互补区域会导致分选产物长度分布范围变宽或变大 ** 推荐当Input DNA量 时 选择在Adapter Ligation之后进行分选 当Input DNA量 或样品拷贝数有限时 将分选置于Library Amplification之后 双轮磁珠分选是通过控制磁珠的使用量来进行DNA长度选择的 其基本原理为 第一轮 磁珠结合分子量较大的DNA 通过丢弃磁珠去除这部分产物 第二轮磁珠结合剩余产物 分选方案[参考Table 5 (Page.15)确定X和Y的值] 1/ 磁珠平衡至室温后 涡旋振荡混匀VAHTS DNA Clean Beads 2/ 吸取X VAHTS DNA Clean Beads至上述100 产物中 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹 打10次充分混匀 如产物不足100 则需使用灭菌超纯水补足至100 中分子量较大的DNA 通过丢弃上清去除分子量较小的DNA 初始样品中的很多组分都 3/ 室温孵育5 min 会干扰双轮磁珠分选效果 因此 当分选方案执行位置不同时 双轮磁珠使用量也不尽 4/ 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体 待溶液澄清后(约5 min) 小心转移上 相同 可根据预期文库Insert Size和分选方案执行位置在Table 5中选择最适分选参数 Table 5. 文库长度分选 分选方案执行位置与条件 Adapter Ligation之后 分选(样品体积100 ) Library Amplification之后 分选(样品体积补至100 ) 磁珠轮数 一轮X () 二轮Y () 一轮X () 二轮Y () 预期文库Insert Size (bp) 清至新PCR管中 丢弃磁珠 5/ 吸取Y VAHTS DNA Clean Beads至上清中 用移液器轻轻吹打10次充分混匀 / 室温孵育5 min 7/ 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体 待溶液澄清后(约5 min) 小心移除 上清 8/ 保持PCR管始终置于磁力架中 加入0 新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠 室温孵育30 sec 小心移除上清 9/ 重复步骤8 总计漂洗两次 10/ 保持PCR管始终置于磁力架中 开盖空气干燥磁珠5-10 min至无乙醇残留 11/ 将PCR管从磁力架中取出 进行洗脱 15/ 16

10 如后续不进行靶向捕获 加入22.5 洗脱液(10 mm Tris-HCl ph )或灭菌 超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀 于室温放置2 min 将PCR 管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶液澄清后(约5 min) 小心移取 上清至 新EP管中 切勿触碰磁珠 如后续需进行靶向捕获 加入22.5 灭菌超纯水洗脱 涡旋振荡或使用移液器轻轻 吹打充分混匀 于室温放置2 min 将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置 待溶 液澄清后(约5 min) 小心移取 上清至新EP管中 切勿触碰磁珠 附二 实验实例 1. FFPE样本实验实例 不同质量等级的FFPE DNA样本(如图A所示) 使用本试剂盒 按照表格中对应的反应条 件进行文库构建 各样本最终文库峰型如图B所示 编号 样本类型 质量等级 起始量 片段化时间 扩增循环 Sample 1 新鲜组织gDNA A 15 min 3 附三 多样本片段化方案 Sample 2 FFPE DNA B 10 min 6 当样本数量较多 且样本中含有EDTA时 需要通过计算加入不同体积的Neutralization Buffer Sample 3 FFPE DNA C1 8 min 6 实际操作中较为复杂 此时可尝试将样本使用同样的溶剂稀释到相同的浓度 保证多个样本加入 Sample 4 FFPE DNA C2 8 min 6 的体积相同 即可加入等体积的Neutralization Buffer 以下表为例 配制反应体系混合液 混匀 Sample 5 FFPE DNA D 6 min 7 分装合适体积到各管中后 使用排枪或自动化工作站在尽量短的时间内完成DNA加样 然后立即 置于PCR仪中进行反应 防止由于加样时间过长导致不同样本之间片段差异大 Sample 1 5 Sample 2 1. 例如 通过计算和稀释 每个DNA样品均需加入10 Neutralization Buffer均需加入2.5 按照计算所得结果稀释DNA样品 并在8连管或96孔板中按顺序排布 2. 将FEA Buffer FEA Enzyme Mix Neutralization buffer取出 解冻并混匀 短暂离心收集 至管底 置于冰上备用 以下所有步骤操作均在冰上操作 5 kb 2 kb Sample 3 Sample 4 1 kb 500 bp 250 bp 组分 Neutralization Buffer FEA Buffer FEA Enzyme Mix ddh2o Sample 5 单个反应体积 次反应混合液体积 配制多个反应混合液时 建议以实际所需次数多几个反应配制 以保证分装时有足够的量 本试剂盒在 生产时已考虑到混样损失 并有足够加量 片段化反应混合液应现用现配 不宜长时间存放 3. 使用移液器轻轻吹打混匀或振荡混匀反应混合液 并短暂离心将反应液收集至管底 图A FFPE样本琼脂糖凝胶电泳 图B FFPE样本最终文库2100峰型分布 2. 不同片段化时间实验实例 起始投入500 ng人胎盘基因组gdna 使用本试剂盒构建文库 片段化条件分别为37 5/10/15//25/30/35/40 min PCR扩增2个循环 最终文库分布如下图所示 4. 将反应混合液分装到反应管或96孔板中 每孔40 5. 使用排枪或自动化工作站 将DNA样品各10 在尽量短的时间内加入到各个反应孔中 吹打 混匀数次 短暂离心将反应液收集至管底 立即置于PCR仪中进行反应 片段化反应为时间依赖的酶促反应 片段化产物大小取决于反应时间 因此多个样本操作应尽量缩短前 后时间差异 加入后立即混匀并进行后续反应 17/ 18

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