殏 檪檪 殏 研究报告 殏 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 殏 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2016,36(11):1 6 DOI: /j.cb Myocardin 调控心肌 H9C2 细胞 Ca 2+ 通道机制研究 1.2 代玉环

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1 檪檪 研究报告 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,206,36(): 6 DOI: /j.cb.2060 Myocardin 调控心肌 H9C2 细胞 Ca 2+ 通道机制研究.2 代玉环 徐 尧 罗 颖 代 洋 石伟林 徐 瑶 ( 武汉科技大学生物医学研究院武汉 武汉市普仁医院武汉 ) 摘要 目的 : 研究同样在维持心脏正常结构和功能过程中发挥着重要作用的转录因子心肌素 Myocardin 对 L 型 Ca 2+ 通道 Cav.2 的转录调控作用及分子机制 方法 : 全细胞膜片钳技术记录心肌细胞膜 Ca 2+ 电流, 慢病毒包装技术制备 Myocardin GFP 慢病毒用于感染心肌细胞以过表达 Myocardin,Real timepcr 定量检测 Cav.2 基因 mrna 水平,Westernbloting 检测 Cav.2 蛋白表达水平 PCR 介导的定点突变技术得到 Ca 2+ 通道启动子区特定 CarGbox 位点突变的突变体 荧光素酶报告系统检测野生型 WT 和突变体 MU 启动子活性, 以确定 Myocardin 在 Cav.2 基因启动子区的作用位点 结果 : 全细胞膜片钳技术表明 Myocardin 激活 Cav.2 而增加心肌细胞膜 Ca 2+ 电流,real timepcr 和 Westernbloting 结果表明,Myocardin 激活 Cav.2 基因的转录和表达, 荧光素酶报告系统检测突变体启动子活性, 发现 Myocardin 激活 Cav.2 基因的转录依赖其启动子区的 CarGbox 结论:Myocardin 通过与 Cav.2 基因启动子区 CarGbox 结合进而激活其转录和表达, 促进 Ca 2+ 通道蛋白装配到心肌细胞膜上, 加强 Ca 2+ 内流, 增强膜电流 关键词转录调控 Myocardin 钙离子通道定点突变慢病毒包装 中图分类号 Q786 钙离子 (Ca 2+ ) 通道参与神经 肌肉 分泌 生殖等重要的生理过程, 广泛存在于机体可兴奋细胞的细胞膜上, 已发现 Ca 2+ 通道基因突变可引发多种疾病 [] 其中 L 型电压依赖性钙通道 (LTCC) 具有高电压激活 电导大 开放时间长, 能与多种拮抗剂作用等特点, 是 Ca 2+ 进入细胞内的主要通道 [2] 由 α α2 β γ δ5 个亚单位构成, 其中 α 是跨膜的亲水通道, 是构成 LTCC 的主要亚单位, 是大多数药物的结合位点 编码 LTCC α 亚基的基因有 4 种,αS αc αd αf 只有 αlc(cav.2 基因 ) 在心肌中高表达 [3] 但迄今为止, 有关 Cav.2 转录调控机制仍然不清楚 收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金资助项目 ( ) 通讯作者, 电子信箱 Myocardin 是血清应答因子 (SRF) 的辅助因子, 通过 Q rich 功能区与 SRF 结合然后绑定在相关基因启动子区 CarGbox[CC(A/T)6GGbox] 上形成稳定的三元络合物, 进而激活心脏发育相关基因, 如结构基因和应激诱导的肥厚特异性基因等 [4] 敲除 Myocardin 的小鼠, 胚胎早期 E0.5 天发育迟缓并出现心包积液及心脏血管机能不全, 最终导致早期胚胎致死 [5] ; 小鼠心脏过表达 Myocardin, 表现出心肌肥厚和心律失常, 如 Q T 间隙缩短 [6] ; 成体小鼠 Myocardin 仍然在心脏和血管平滑肌中特异性高度表达 心肌细胞分化功能的维持及 成熟过程都需要 Myocardin 的参与 [7 8] Myocardin 和 Cav.2 在维持心脏正常结构和功能过程中都发挥着重要作用 那么 Myocardin 作为一种心肌细胞重要的转录因子能否调控 Cav.2, 如何调控以及 Myocardin 调控对心肌 Ca 2+ 通道的功能会有怎样

2 2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.206 的影响, 这些问题目前尚不清楚 本文围绕以上几个问题展开研究, 进一步阐明心肌细胞电生理活动的分子基础, 为先天性心脏病 心力衰竭 心肌肥厚等心脏相关疾病的病因学研究提供线索, 并为针对其病理机制的新药开发及临床防治提供理论基础 材料与方法. 实验材料.. 细胞和质粒 H9C2 大鼠心肌细胞系购买于武汉博士德生物工程有限公司,pMD 8 TVector 载体质粒购自 TaKaRa 公司 ;293T 细胞 pcdna3. 质粒 pgl3 Basic 质粒和心肌素 Myocardin 质粒为天津科技大学分子生物学国家重点实验室赠送 ; 大鼠 Cav.2 启动子和 Myocardin 慢病毒质粒为本实验室构建并经全基因组测序确认..2 主要试剂质粒中量提取试剂盒和琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自 AXYGEN 公司 ;T4DNA 连接酶 pfudna 聚合酶 dntps DNAMarker 均购自 Thermo 公司 ; 限制性内切核酸酶 KpnⅠ 和 HindⅢ 等酶购自 NEB 公司 荧光素酶底物 luciferin 购自 Promega 公司 ; Lenti Pac TM 慢病毒浓缩试剂盒和 Lenti Pac TM HIV 慢病毒颗粒滴度检测试剂盒购自 GeneCopoeia 公司 ;DMEM 高糖培养基和胎牛血清购自 Gibco 公司.2 实验方法.2. 慢病毒包装及细胞感染 293 T 细胞长至 70% ~ 80% 用于转染 转染质粒 : 目标慢病毒质粒 Ad Myocardin2μg 包膜蛋白 VSVG4μg 和结构蛋白 NRF 8μg 加 48μlTurbo 转染试剂, 涡旋振荡混匀, 室温孵育 20min 转圈加入 293 T 细胞,37 5% CO 2 培养箱培养 6~7h 换成完全培养基 继续培养 72h, 观察绿色荧光强度, 经 0.45μm 微孔滤膜过滤收集病毒,-80 保存备用 病毒浓缩后测定病毒滴度以此确定病毒包装是否成功 用包装成功的病毒感染心肌细胞系 H9C2:6cm 皿 H9C2 心肌细胞, 加约 5μl 慢病毒浓缩液,48h 后提取 RNA 或蛋白质, 通过 qpcr 或 Western bloting 检测过表达效果.2.2 电生理膜片钳技术全细胞记录钙电流实验在室温 (22~24 ) 下进行 取出感染慢病毒 48h 后的心肌细胞 H9C2 的细胞爬片于灌流槽中, 放置在倒置显微镜 (Nikon) 工作台上, 用 00% O 2 饱和的正常细胞灌流液灌流 灌流液成分 (mmol/l):nacl35 KCl5.4 MgCl CaCl 2.8 NaH 2 PO HEPES0 Glucose 0(pH7.4) 利用三维电动微操纵仪(MP285,Suter, 美国 ) 移动玻璃微电极至细胞表面负压吸引形成高阻封接 ( 电阻为 ~.5MΩ), 再以负压吸破细胞膜, 给予一定电压刺激 (-80~40mV 持续 200ms), 电流信号经 Ag/AgCl 电极引导, 经 EP0 膜片钳放大器 (HEKA Electronic,Lambrecht,PfalzGermany) 放大和滤波 (2kHz), 以及双激发荧光光电倍增管系统进一步放大和转换电流信号后储存在计算机, 以实现全细胞记录 L 型钙电流 玻璃微电极由两步玻璃微电极拉制仪 (PP 83,Narishige, 日本 ) 拉制, 并经热抛光 电极内液的主要成分 (mmol/l):cscl80 CsOH 60 天冬氨酸 40 CaCl HEPES5 EGTA0 MgATP5, 其中磷酸肌酸二钠盐和 TTX(pH7.2) 用于阻断钠电流.2.3 Real timepcr 法检测 Myocadin,Cav.2 在转录水平的表达应用 primerprimer5 软件设计定量引物, 检测 Myocardin 和 Cav.2 的表达 引物序列为 : GAPDH(F ATTCAACGGCACAGTCAAGG,R GCAG AAGGGGCGGAGATGA) Myocardin(F AGCCACCAGTCAGATGCG,R TGGC GTTGAAGAAGAGTTTG) Cav.2(F GATGAAAGGTGGGATACGAA,R CCAA GAGCAAGTTAGGAGCAA) Trizol 法提总 RNA,TaKaRa 公司反转录试剂盒, 两步法反转录得到 cdna, 以 cdna 为模板, 应用 TaKaRa 公司的 Real timepcr 试剂盒 PCR, 加入过量 SYBR Green 荧光染料, 然后于 CFX96Real timesystem 检测目的基因 mrna 的表达.2.4 Westernbloting 检测 Myocadin 和 Cav.2 蛋白的表达 RIPA 细胞裂解液 4 裂解 H9C2 细胞 h, 收集裂解液,00 金属浴 5~7min,G250 蛋白定量以确定上样量 80V 恒压电泳 2~3h, 按滤纸 凝胶 NC 膜 滤纸的顺序, 胶负膜正 200mA 转膜 90~20min 室温封闭.5h, 2000 稀释一抗 (Santa 公司 GADPH Myocardin L type Ca 2+ CPαC)4 过夜孵育 5000 稀释二抗, 室温孵育 2h ECL 化学发光, 用 QuantityOne 凝胶成像系统对 NC 膜进行扫描和定量分析, 以 GADPH 为内参, 测定 Myocardin CAV.2 的蛋白质表达量.2.5 PCR 介导的定点突变 UCSC 查询 LTCC 编码基因启动子序列, 分析发现启动子 -2500bp 区域内有 3 个 Myocardin 的结合位点 (CarGbox), 应用 primer primer5 软件, 根据 CarGbox 位点, 从启动子区 -2300~42bp 设计定点突变引物, 序列见表

3 206,36() 代玉环等 :Myocardin 调控心肌 H9C2 细胞 Ca 2+ 通道机制研究 3 表 PCR 介导的定点突变引物序列 Table ThesequenceofPCRmediatedmutagenesis Primer Mc3 R Cav.2 P F Mc3 R Cav.2 P R Mc2 R Cav.2 P F Mc2 R Cav.2 P R Mc R Cav.2 P F Mc R Cav.2 P R Sequence(5 3 ) TGAAAAATTGGCTATGTATTATTAGGATAGGAAAC GTTTCCTATCCTAATAATACATAGCCAATTTTTCA TAAATCCCGAACCAATTTTTAGTGCTATTTTAAGCA CTGCTTAAAATAGCACTAAAAATTGGTTCGGGATTTA CTCAGTGAAAACTGTATTCTAAAATGGCAGGTCA TGACCTGCCATTTTAGAATACAGTTTTCACTGAG Note:Mc3 R Cav.2 P FisusedtosynthesizetheThirdCarGboxmutant PCR 介导的定点突变 :20μl 体系加 μl 高保真 DNA 聚合酶 pfu, 以事先构建好的 WT Cav.2 pgl3 Basic 为模板, 用上述定点突变引物反向 PCR PCR 产物 20μl 体系加 μldpnⅠ 消化 2~3h 后转化, 第二天挑取单个菌落, 小量培养后测序 PCR 介导的定点突变质粒, 经擎科生物技术有限公司目的基因全序列测序, 测序结果用 DNAMAN 软件比对分析 将测序正确的克隆中量提取质粒, 用于后续荧光素酶报告系统检测启动子活性.2.6 荧光素酶活性检测 24 孔板接种 293 T 细胞, 60% ~70% 融合后转染 Control 组 :0.8μgpcDNA μgCav.2 luci;myocardin 组 :0.8μgMyocardin + 0.2μgCav.2 luci, 每孔加 2μlturbo 转染试剂,8h 后更换新鲜培养基, 继续培养 48h,4 预冷 PBS 清洗细胞, 加 00μl PasiveLysisBufer4 裂解细胞 5min 收集裂解液,0000r/min 离心 0min 取上清液 取 50μl 蛋白质上清液加入 00μlluciferin 于 BIO RAID 多功能酶标仪中检测荧光强度 取 20μl 蛋白质上清液加 200μl G250 检测 595nm 处的吸光度, 蛋白质定量.2.7 统计学处理本次研究所有实验均至少重复 3 次 用 SPSS20.0 软件进行数据处理, 计量资料以 x±s 表示, 组间比较均采用 F 检验,P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2. Myocardin 对心肌细胞膜 Ca 2+ 电流的影响包装 Myocardin GFP 慢病毒之后的 293T 细胞在荧光倒置显微镜下观察其细胞形态和荧光强度, 如图 所示 包装病毒后,293T 细胞膨胀变圆,70% 细胞可观察到绿色荧光, 病毒经浓缩滴度检测后感染大鼠心肌细胞系 H9C2 细胞 分两组 : 对照组 ( 感染 PTK642 空载体病毒 ) Myocardin 组 ( 感染 Myocardin 慢病毒 ) 细胞感染 48h 后, 用电生理膜片钳技术全细胞记录细胞膜 Ca 2+ 电流 如图 2 所示,Control 组与 Myocardin 组细胞大小相当,Control 组无法检测到明显钙电流, 过表达 Myocardin 组钙电流为 54pA, 细胞大小 5.pF, 电流密度 = 钙电流 / 细胞大小 =0.6pA/pF 与 Control 组相比, 过表达 Myocardin 后电流密度显著上调 (n=6;p<0.0) 由此表明,Myocardin 激活 LTCC 的表达影响了心肌细胞膜 L 型 Ca 2+ 电流 图 慢病毒包装荧光效果图 Fig. Lentiviruspackagingfluorescenceefect (a)control (b)florescencegroup

4 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.206 图 2 膜片钳检测证明 Myocardin 过表达增加心肌细胞膜 L 型 Ca 2+ 电流 Fig.2 CardiomyocytemembraneL typeca 2+ currentwasdetected byelectrophysiologicalpatchclamptechnique 2.2 Myocardin 促进 Cav.2 基因的表达大鼠心肌细胞系 H9C2 分两组 : 对照组 ( 顺转空质粒 pcdna3.) Myocardin 组 ( 顺转过表达 Myocardin) 48h 后, 用 Trizol 法提取总 RNA, 反转录成 cdna, 以 GAPDH 为内参, 通过 Real timepcr 检测各组 Cav.2 mrna 的表达水平 ;RIPA 裂解液裂解细胞, 收集蛋白质, Westernbloting 检测各组 GAPDH Myocardin Cav.2 蛋白表达水平 如图 3 所示, 过表达 Myocardin 组 Cav.2 mrna[ 图 3(a)] 和蛋白质 [ 图 3(b)] 表达量较对照组显著上升 (P<0.05), 以此表明 Myocardin 可激活 Cav.2 基因的表达 图 3 Myocardin 促进 Cav.2 基因的表达 Fig.3 MyocardinactivatetheexerpresionofCav.2 (a)real timepcrdetectthemrnaexerpresionofcav.2 (b)westernblotingdetecttheproteinexerpresionofcav Myocardin 激活 LTCCCav.2 基因的转录 293T 细胞 turbo 脂质体法转染质粒 实验组 :WT Cav.2 luci+myocardin 对照组 WT Cav.2 luci+ pcdna3,48h 后检测荧光素酶报告基因活性, 以此来判断 Myocardin 是否可以激活 LTCCCav.2 基因的转录 如图 4 所示, 加入特定的荧光素酶底物后, 过表达 Myocardin 组发出的荧光强度明显高于对照组 (P< 0.0), 表明 Myocardin 可激活 Cav.2 启动子活性, 从而激活其表达 2.4 Myocardin 激活 LTCCCav.2 基因依赖其启动子上的 CarGbox 启动子活性检测结果如图 5 所示, 所有启动子相对于其 Control 组均有显著活性 (P<0.0),CarGbox 突变之后相对 WT 活性均降低 将位于 -282bp 处的 CarGbox(C3) 单独突变之后, 报告基因活性降低不显著, 而将 -995bp 或 -56bp 处的 CarGbox(C 或 C2) 突变之后, 相对于 WT 报告基因活性显著降低 (P< 0.05) 将 -995bp 和 -56bp 处的两个 CarGbox (mc2) 同时突变之后, 报告基因活性降低极显著 (P<

5 206,36() 代玉环等 :Myocardin 调控心肌 H9C2 细胞 Ca 2+ 通道机制研究 5 图 4 过表达 Myocardin 可激活 Cav.2 luci 活性 Fig.4 MyocardincanactivateCav.2 0.0) 同样将 3 个 CarGbox(mc23) 同时突变之后, 报告基因活性仍显著降低 (P<0.0) 表明 Myocardin 激活 LTCC Cav.2 基因的转录依赖其启动子上的 CarGbox,Myocardin 可能与靠近转录起始位点的 C 和 / 或 C2CarGbox 结合进而启动下游基因的表达 图 5 启动子区 CarGbox 突变后报告基因活性显著降低 Fig.5 CarGboxmutationsignificantly downgradegeneactivity (a)themutationofcargboxoncav.2promoter (b)luciferase reportergeneasaydetecttheactivityofcargboxmutant 3 讨论 目前 LTCC 转录调控研究较少, 特别是有关 Myocardin 对其转录调控目前尚无报道, 对此开展探索性研究, 具有较好的创新性 本课题通过 Myocardin 对钙离子通道 Cav.2 基因转录调控的研究, 证实 Myocardin 可以激活 Cav.2 基因的表达, 进而增强心肌细胞膜钙电流 ; 发现 Myocardin 在 Cav.2 基因启动子区的作用靶点为 C 和 C2CarGbox 然而心血管疾病的发生发展是个多因素多因子参与并相互作用的复杂过程,Myocardin 对 Ca 2+ 通道的调控只是心肌细胞 Ca 2+ 信号介导的信号转导通路中的很小一部分, 以下就心肌细胞 Ca 2+ 信号介导的信号转导通路加以讨论 Ca 2+ 诱导心肌肥厚研究过程中, 发现过表达 Myocardin 的心肌细胞胞质内的 Ca 2+ 浓度升高 沉默 Myocardin 表达后, 细胞质内的 Ca 2+ 浓度也有所下降 [9] 在进一步对 Ca 2+ 下游的 NFAT 与 Myocardin 相互关系研究中, 我们也发现 NFATc4 可较强的激活 Myocardin 的转录和表达 [0], 这些结果促使我们思考 Myocardin 是否与心肌细胞膜上的钙通道相关,Ca 2+ 和 Myocardin 之间是否存在正反馈环路联系, 其机制是否涉及钙通道蛋白表达及 NFATc4 此外, 已有报道,microRNA 是内源性非编码的 6~ 22bp 的小分子 RNA, 在肌肉中特异性表达的 mir 33 能够与 SRFmRNA3 UTR 结合, 沉默 SRFmRNA 并抑制 Myocarin SRF CarG 对心肌相关基因的激活 [] 此外, 已有报道 mir 33 过度表达将导致 Q T 间期延长综合征 [2], 这意味着动作电位时程延长, 而 Ca 2+ 内流对动作电位 2 时相影响最为明显, 这提示我们,miR 33 可能通过沉默 SRF, 进而影响 Myocardin 对 Cav.2 的转录激活, 形成负反馈调节 对以上心肌细胞 Ca 2+ 信号介导的信号转导通路进行研究, 将揭示 Myocardin 对 LTCC 组件 Cav.2 转录调控的确切机制和反馈联系 总之, 可揭示 Myocardin 对心肌 LTCC 转录调控机制, 为心脏电生理调控提供新的理论基础, 并为针对其病理机制的新药开发及临床防治提供理论基础 4 结语 本文通过 Myocardin 对 Ca 2+ 通道 Cav.2 基因转录调控的研究, 发现 Myocardin 与 Cav.2 基因启动子区的 C 和 C2CarGbox 结合, 激活 Cav.2 基因转录和表达, 进而增强心肌细胞膜钙电流 然而心血管疾病的

6 6 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.36No.206 发生发展是个多因素多因子参与并相互作用的复杂过程,Myocardin 对于其他离子通道 ( 如 Na + K + 等 ) 的转录调控作用及其机制 Myocardin 能否通过自身的组蛋白乙酰转移酶活性影响 LTCC 启动子的乙酰化并促进其转录, 以及 Myocardin 是否与其他转录因子 ( 如 NFAT 和 mir 33) 之间存在相互作用进而影响其对 Ca 2+ 通道的转录调控, 以上过程仍然不清楚, 有待进一步研究 参考文献 [] RichardS,LeclercqF,LemaireS,etal.Ca 2+ curentsin compensated hypertrophy and heart failure. Cardiovascular Research,998,37(2): [2]ChengH,WangSQ.Calcium signalingbetweensarcolemmal calciumchannelsandryanodinereceptorsinheartcels.frontiers inbiosciencea Journal& VirtualLibrary,2002,7( 3): d [3]WangSQ,SongLS,LakataE G,etal.Ca 2+ signaling betweensinglel typeca 2+ channelsandryanodinereceptorsin heartcels.nature,200,40(6828): [4]WangD,ChangPS,WangZ,etal.Activationofcardiacgene expresionbymyocardin,atranscriptionalcofactorforserum responsefactor.cel,200,05(7): [5]HuangJ,ParmacekMS.Myocardinisrequiredforcardiomyocyte survivalandmaintenanceofheartfunction.proceedingsofthe NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica, 2009,06(44): [6] LutfulinIY,Kim Z F,BilalovaR R,etal.A 24 hour ambulatoryecgmonitoringinasesmentofqtintervalduration and dispersion in rowers with physiological myocardial hypertrophy.biologyofsport,203,30(4): [7] XingW, ZhangT C, CaoD, etal. Myocardin induces cardiomyocyte hypertrophy. Circulation Research, 2006, 98 (8): [8] Liao X H, WangN, Liu Q X, etal. Myocardin related transcriptionfactor Ainducescardiomyocytehypertrophy.Iubmb Life,20,63():54 6. [9]YanX,GaoS,MingT,etal.Adenylylcyclase/cAMP PKA mediated phosphorylation ofbasall typeca 2+,channelsin mouseembryonicventricularmyocytes.celcalcium,20,50 (50): [0]ChikCL,LiB,OgiwaraT,etal.PACAPmodulatesL type Ca 2+ channel curents in vascular smooth muscle cels: involvementofpkcandpka.fasebjournaloficialpublication ofthefederationofamericansocietiesforexperimentalbiology, 996,0(): [] ChenJF,MandelE M,ThomsonJM,etal.Theroleof microrna andmicrorna 33inskeletalmuscleproliferation anddiferentiation.naturegenetics,2006,38(2): [2]MatsaE,DixonJE,MedwayC,etal.Alele specificrna interferencerescuesthelong QTsyndromephenotypeinhuman inducedpluripotencystem celcardiomyocytes.europeanheart Journal,204,35(6): TheTranscriptionalRegulationofCa 2+ ChannelMediated bymyocardininh9c2cel DAIYu huan.2 XUYao LUOYing DAIYang SHIWei lin XUYao (BiomedicalInstitute,WuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan ,China) (2WuhanPurenHospital,Wuhan ,China) Abstract Objective:ToinvestigatetheefectoftranscriptionfactorMyocardinonthetranscriptional regulationoflcalcium channelcav.2anditsmolecularmechanism intheprocesofmaintainingnormal structureand function ofthe heart. Methods: Cardiomyocyte membrane Ca 2+ curentis detected by electrophysiologicalpatchclamptechnique.real timepcrisusedtodetecttheleveloftheltccmrna,the proteinexpresionlevelofltccisdetectedbywesternbloting,usingluciferaseasaytodetectthepromoter activityofcav.2andthebindingsiteofmyocardinoncav.2genepromoter.results:theactivationofltcc Cav.2genemediatedbyMyocardinup regulatethecardiomyocytemembraneca 2+ curent.myocardinactivates LTCCCav.2genetranscriptionandexpresiondependingonitsCarGboxonthepromoter.Conclusions: MyocardinactivatesLTCCCav.2genetranscriptionandexpresionbybindingontheCarGboxofitspromoter, whichpromotethetransportionofcalcium ionchannelproteinfrom nucleustomembrane,enhancetheflowof Ca 2+,andup regulatethecardiomyocytemembraneca 2+ curent. Keywords Epigeneticregulation Myocardin LTCC Mutagenesis Lentiviruspackage

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