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岂詹
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1 Code No. R076A 研究用 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 说明书 v201808da

2 目录内容页码制品说明 1 制品内容 1 保存 1 PCR 反应液组成 1 Primer 设计 2 PCR 反应条件设定 2 PCR 产物电泳 2 PCR 扩增产物的末端形状 2 Troubleshooting 3 实验例 3 关联产品 8

3 制品说明 MightyAmp DNA Polymerase 是追求高反应性能开发的 PCR 酶, 由于本酶具有很强的扩增性能, 对于使用普通 PCR 酶难以扩增的样品, 也显示出很好的扩增能力, 如含有大量 PCR 阻害物的生体粗提样品 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 是对 MightyAmp DNA Polymerase 进行了改良, 与 Ver.2 相比, 这种改良后的 PCR 酶和 Buffer 组合使用, 可进一步增强对 PCR 阻害物的抵抗性此外, 也提高了血液动植物组织等生物体样品直接加入到反应液中的 Direct PCR 的反应性能无论是 PCR 阻害物含量较多的粗提样品, 还是 GC Rich AT Rich 的模板均可在宽广的模板范围内进行有效扩增, 并根据需要将试剂盒中附带的 10 Additive for High Specificity 添加到 PCR 反应液中可提高 PCR 扩增的特异性和检测灵敏度本酶是使用单克隆抗体的 Hot Start 型 PCR 扩增用 DNA 聚合酶,98 高温加热前, 抗体与酶结合, 有效抑制聚合酶活性制品内容 (50 μl 反应,200 次量 ) MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(1.25 U/μl) 2 MightyAmp Buffer Ver.3(Mg 2+,dNTP plus) * 10 Additive for High Specificity 200 μl 1 ml μl 2 *:Mg 2+ 浓度是 4 mm(2 ), dntp 浓度是各 600 μm(2 ) 保存 : -20 PCR 反应液组成试剂使用量终浓度 2 MightyAmp Buffer Ver.3 25 μl 1 Primer 1 15 pmol 0.3 μm Primer 2 15 pmol 0.3 μm *1 生体 / 粗提样品适量 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 1 μl 1.25 U/50 μl (10 Additive for High Specificity 5 μl 1 ) *2 灭菌水 Total *1: 组织样品或者提取液的推荐使用量 EDTA 抗凝血, 肝素抗凝血 *3 柠檬酸抗凝血小鼠尾 up to 50 μl 10 μl 5 μl 1 mm 小鼠耳 1.5 mm 2 小鼠脏器脑 1.5 mm 3 植物叶片 ( 西红柿拟南芥菠菜 ) 生体样品粗提液 50 μl 直径 2 mm 5 μl *3: 使用柠檬酸抗凝的血液时反应性能有可能下降 *2: 先使用不含 10 Additive for High Specificity 的反应体系进行 PCR 扩增想进一步提高扩增特异性和检测灵敏度时再添加 10 Additive for High Specificity 进行 PCR 扩增 -1-

4 Primer 设计请使用引物设计软件 ( 如 :OLIGO Primer Analysis Software:Molecular Biology Insights, Inc.) 设计理想引物建议引物 Tm 值 ( 按以下公式进行计算 *) 设计在 60 以上 Tm 值 ( )=[(A T 数 ) 2]+[(C G 数 ) 4]+35-2 [ 总碱基数 ] PCR 反应条件设定标准反应条件为 3 Step PCR, 延伸温度设定为 68 扩增 GC Rich 模板时可以使用 2 Step PCR 进行反应 [3 Step PCR] 98 2 min * sec 30~40 cycles 68 *2 1 min/kb [2 Step PCR] 98 2 min * min/kb 30~40 cycles *1: 使用了抗性非常强的 Hot Start 酶, 在预变性时必须进行 98 2 min 的抗体变性步骤 *2:3 Step PCR 时, 延伸温度请设定在 68 PCR 产物电泳使用 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 扩增得到的 PCR 产物, 电泳时建议使用 TAE Buffer 使用 TBE Buffer 有时得不到好的电泳结果动物组织 ( 例 : 小鼠尾 ) 进行 Direct PCR 的扩增产物电泳时, 样品中有不溶物 ( 组织 ) 存在, 有时 DNA 片段电泳会产生挂孔现象, 在目的片段位置没有条带这种情况下建议在 Loading Buffer 中添加 Proteinase K 1. 6 loading Buffer(Code No. 9156) 和 Proteinase K(Code No. 9034) 按照 10:1(v/v) 比例混合 2. 电泳前用 1. 的混合液和 PCR 反应液按照 1:5(v/v) 比例混合 PCR 扩增产物的末端形状使用本制品扩增得到的 PCR 产物 3 端附有一个 A 碱基因此 PCR 扩增产物可直接克隆于 T-Vector (pmd20:code No pmd19 (Simple):Code No 等 ) 中此外, 利用 Mighty Cloning Reagent Set(Blunt End)( Code No. 6027) 进行末端平滑化和磷酸化后可克隆于平滑末端载体 -2-

5 Troubleshooting 现象问题点对策引物的 Tm 值请参考 Primer 设计部分的要求设计引物 2 Step PCR 方法请尝试 3 Step PCR 方法 3 Step PCR 方法请尝试 2 Step PCR 方法 (3 Step PCR 没有扩增, 有时使用 2 Step PCR 可以扩增 ) 无扩增产物生成, 扩增效率低退火温度循环圈数样品使用量或提取方法 PCR 反应液组成引物的 Tm 值每间隔 2 降低退火温度进行条件摸索循环圈数最大可以设定至 40 圈减少或增加样品的使用量研讨样品的提取方法在 PCR 反应液中添加 10 Additive for High Specificity * 请参考 Primer 设计部分的要求设计引物 3 Step PCR 方法请尝试 2 Step PCR 方法非特异性扩增片段明显循环圈数样品提取方法 PCR 反应液组成循环圈数在圈范围内进行研讨研讨样品的提取方法在 PCR 反应液中添加 10 Additive for High Specificity * 添加 10 Additive for High Specificity 可提高扩增特异性和检测灵敏度, 请参考下面的实验例实验例 1. 在高浓度腐殖酸中的 PCR 反应我们已知土壤中存在的腐殖酸对 PCR 反应有很强的阻害作用本制品的耐腐殖酸性明显高于已有的 PCR 酶, 可提高含有多量土壤成分粗提样品的 PCR 反应成功率模板 :E. coli genomic DNA( 相当于 copies) 目的基因 :16S rdna(173 bp) 10 Additive for High Specificity: 未添加 (-) 和添加 (+) 各种酶在推荐的反应条件下进行 PCR 反应 MightyAmp Ver.3 的 PCR 反应条件 : 98 2 min sec 30 cycles sec -3-

4 5 M 本公司 Taq 酶 M 1 2 3 4 5 Lane 1: 腐殖酸 0 μg 2: 0.1 μg 3: 0.2 μg 4: 0.3 μg 5: 0.

在高浓度 NaCl 中的 PCR 反应我们已知海水 ( 约含 500 mm NaCl) 等含高浓度盐的样品对 PCR 反应有阻害作用本制品的耐盐性明显高于已有的 PCR 酶,

6 MightyAmp Ver.3 10 Additive(-) 10 Additive(+) M M A 公司高成功率试剂 B 公司耐阻害物试剂 M M M 本公司 Taq 酶 M Lane 1: 腐殖酸 0 μg 2: 0.1 μg 3: 0.2 μg 4: 0.3 μg 5: 0.4 μg/25 μl 反应体系 M: 100 bp DNA Ladder(Code No. 3407A) ( 本公司比较结果 ) 2. 在高浓度 NaCl 中的 PCR 反应我们已知海水 ( 约含 500 mm NaCl) 等含高浓度盐的样品对 PCR 反应有阻害作用本制品的耐盐性明显高于已有的 PCR 酶, 可提高含盐多的粗提样品 PCR 反应成功率模板 :E. coli genomic DNA( 相当于 copies) 目的基因 : 全长 16S rdna(1,465 bp) 10 Additive for High Specificity: 未添加 (-) 和添加 (+) 各种酶在推荐的反应条件下进行 PCR 反应 MightyAmp Ver.3 的 PCR 反应条件 : 98 2 min sec 30 cycles sec -4-

10 Additive for High Specificity(-) 10 Additive for High

4 5 6 7 8 Lane 1:NaCl 浓度 0 mm 2: 50 mm 3: 75 mm 4: 100 mm 5: 125 mm

添加 10 Additive for High Specificity 可改善扩增特异性模板 :Human genomic DNA

(+) PCR 反应条件 98 2 min 60 15 sec 30 cycles 68 30 sec Specificity(+) M

7 10 Additive for High Specificity(-) 10 Additive for High Specificity(+) M M 本公司 Taq 酶 M Lane 1:NaCl 浓度 0 mm 2: 50 mm 3: 75 mm 4: 100 mm 5: 125 mm 6: 150 mm 7: 175 mm 8: 200 mm M: DL2,000 DNA Marker(Code No. 3427A) 3. 添加 10 Additive for High Specificity 可改善扩增特异性模板 :Human genomic DNA 目的基因 :APOE 基因 (520 bp) 10 Additive for High Specificity: 未添加 (-) 和添加 (+) PCR 反应条件 98 2 min sec 30 cycles sec 10 Additive for High Specificity(-) 10 Additive for High Specificity(+) M M M -5-

Lane 1:Human genomic DNA 100 pg 2: 1 ng 3: 10 ng 4: 100 ng 5: 500 ng/50μl 反应体系 M: DL2,000 DNA Marker(Code No.

添加 10 Additive for High Specificity 可改善对阻害物的抵抗性 ( 存在单宁酸时 ) 我们已知植物中富含的单宁酸对 PCR 反应有很强的阻害作用本制品的抗单宁酸性明显高于已有的 PCR 酶, 可提高富含植物成分粗提样品的 PCR

8 Lane 1:Human genomic DNA 100 pg 2: 1 ng 3: 10 ng 4: 100 ng 5: 500 ng/50μl 反应体系 M: DL2,000 DNA Marker(Code No. 3427A) ( 注 ) 以纯化的基因组 DNA 为模板时, 若模板的纯度较高, 建议反应时添加 10 Additive for High Specificity 4. 添加 10 Additive for High Specificity 可改善对阻害物的抵抗性 ( 存在单宁酸时 ) 我们已知植物中富含的单宁酸对 PCR 反应有很强的阻害作用本制品的抗单宁酸性明显高于已有的 PCR 酶, 可提高富含植物成分粗提样品的 PCR 反应成功率模板 : Human genomic DNA(100 ng) 目的基因 :Human DCLRE1A 基因 (1 kb) 10 Additive for High Specificity: 未添加 (-) 和添加 (+) 各种酶在推荐的反应条件下进行 PCR 反应 MightyAmp Ver.3 的 PCR 反应条件 : 98 2 min sec 30 cycles 68 1 min 10 Additive for High Specificity(-) 10 Additive for High Specificity(+) M M M M 本公司 Taq 酶 M M Lane1: 单宁酸浓度 0 ng/μl 2: 1 ng/μl 3: 5 ng/μl 4: 10 ng/μl 5: 50 ng/μl 6: 100 ng/μl 7: 250 ng/μl M: DL2,000 DNA Marker(Code No. 3427A) -6-

3 对小鼠血液 FTA Card 进行 Direct PCR, 可以很好地扩增目的基因 MightyAmp Ver.3 的 PCR 反应条件 : 98 2 min 60 15 sec 30 Cycles 68 30 sec M 1 2 3 4 M Lane 1:MightyAmp Ver.2(Code No. R071A) 2:MightyAmp Ver.

9 5. 各种生体样品的 Direct PCR 例 5-1. 小鼠血液 FTA Card 的 Direct PCR 方法将直径为 1.2 mm 打孔钳剪下的小鼠血液 FTA Card 添加到 25 μl 反应体系中, 扩增小鼠 Hbb-b1 基因 (542 bp)( 各种酶的推荐反应条件 : 采用 3 步法 30 cycles) PCR 产物各取 5 μl 进行电泳结果使用 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 对小鼠血液 FTA Card 进行 Direct PCR, 可以很好地扩增目的基因 MightyAmp Ver.3 的 PCR 反应条件 : 98 2 min sec 30 Cycles sec M M Lane 1:MightyAmp Ver.2(Code No. R071A) 2:MightyAmp Ver.3 10 Additive for High Specificity(-) 3:MightyAmp Ver.3 10 Additive for High Specificity(+) 4:B 公司耐抗阻害物试剂 M: 100 bp DNA Ladder(Code No. 3407A) ( 本公司比较结果 ) 5-2. 人 EDTA 抗凝血液和肝素抗凝血液的 Direct PCR 方法取人 EDTA 抗凝血液和肝素抗凝血液各 5 μl 添加到 25 μl 反应体系中, 扩增人的 DCLRE1A 基因 (1 kb)( 反应条件采用 3 步法,30 cycles), PCR 产物各取 5 μl 进行电泳结果使用 MightyAmp DNA Polymerase Ver.3 对人 EDTA 抗凝血液和肝素抗凝血液进行 Direct PCR, 可以很好地扩增目的基因 PCR 反应条件 : 98 2 min sec 30 cycles 68 1 min EDTA 抗凝血液肝素抗凝血液 M Lane1,4:MightyAmp Ver.2(Code No. R071A) 2,5:MightyAmp Ver.3 10 Additive for High Specificity(-) 3,6:MightyAmp Ver.3 10 Additive for High Specificity(+) M: DL2,000 DNA Marker(Code No. 3427A) -7-

10 关联产品 MightyAmp DNA Polymerase Ver.2(Code No. R071A/B) MightyAmp Genotyping Kit(Code No. R074A) Tks Gflex DNA Polymerase(Code No. R060A/B) TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch(Code No. TP350) TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient(Code No. TP600) Agarose L03 TAKARA (Code No. 5003/B) T-Vector pmd20(code No. 3270) T-Vector pmd19 (Simple)(Code No. 3271) Lysis Buffer for PCR(Code No. 9170A) Plant DNA Isolation Reagent(Code No. 9194) Proteinase K(Code No. 9034) 6 Loading Buffer(Code No. 9156) MightyAmp, Thermal Cycler Dice, and Tks Gflex are trademarks of Takara Bio Inc. 注意本产品仅供科学研究使用, 不能用于人动物的医疗或诊断程序, 不能使用本产品作为食品化妆品或家庭用品等未经 Takara Bio Inc. 书面许可授权或批准, 不得制造许诺销售销售进口 Takara 产品, 或者使用 Takara 产品所有的相关专利及相关商标如果您需要其他用途的许可授权, 请联络我们, 或访问我们网站您使用本产品必须遵守产品网页上适用的全部许可要求阅读了解并遵守此类声明的所有限制性条款是您的责任所有商标均属于各自商标所有者的财产某些商标并未在全部行政区注册本文件由宝日医生物技术 ( 北京 ) 有限公司翻译制作, 最新版本文件请参考 Takara Bio Inc. 网站为正确使用 Takara 产品, 您应当掌握本产品的相关知识和使用说明 -8-

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Cloned Code No. R010Q 研究用 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 说明书 v201702da 目录内容页码制品说明 1 制品内容 1 保存 1 特点 1 PCR 反应液组成 4 PCR 反应条件 4 参数优化 4 扩增产物的电泳克隆及测序 5 Troubeshooting 6 实验例 6 关联产品 6 制品说明 PrimeSTAR HS DNA Polymerase