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焱诰黄
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1 2012 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI: /SP.J 微流体芯片电泳技术对人血清蛋白的快速分离徐中其 * 刘慧青 ( 东华大学化学化工与生物工程学院, 上海 ) 摘要通过微流体芯片电泳技术分离人血清蛋白, 探讨了常见十字形微流体芯片上样品的电动进样与分离过程, 分析了在十字芯片上的进样时间和电压设置对后续样品检测和定量的影响采用的缓冲体系为 : 100 mmol/l H 3 BO 3, 50 mmol/l NaCl, 5% Dextran ( 以 NaOH 调至 ph 8.3), 该缓冲液能够有效分离人血清蛋白中的白蛋白 (Albumin) 和 4 种球蛋白 (α1-,α2-, β -, 和 γ-globulin), 并且给出了它们在该缓冲体系中的淌度估算范围为 5.15~ cm 2 /(V s) 在芯片上 2 min 之内可以完成进样和分离, 相比于常用的毛细管区带电泳, 提高了分析速度关键词微流体芯片电泳 ; 人血清蛋白 ; 淌度 ; 毛细管区带电泳 1 引言 20 世纪 90 年代初,Manz 和 Jacobson 等提出了在石英或塑料等基板上, 通过光电刻蚀技术制成储液池或微通道, 进行电泳分离的新技术 [1,2] 经过二十多年的发展, 在芯片上通过网络化的通道和储液池的集成设计, 可实现样品与试剂的混合反应分离检测等系列功能, 称作芯片实验室 (Laḇ oṉ chip) 相对于传统的毛细管电泳 (CE) 技术, 微流体芯片电泳 (Microchip electrophoresis, MCE) 的优势在于试剂和样品消耗量更少, 芯片面积大而拥有良好的散热性, 可以在管道上施加比一般毛细管电泳更高的电压, 生化样品分析速度得到了很大提高, 一般在 2~3 min 内就可以完成对样品的进样和分离 [3~ 5] 劣势在于微流体芯片上受到样品进样量的限制, 浓度灵敏度比较低因此, 在芯片上利用在柱浓缩技术, 如过渡等速电泳 (Transient isotachophoresis,titp), 或者超负荷电动供给 (Electrokinetic supercharging, EKS) 对生物样品 ( 如 DNA 和蛋白质 ) 进行浓缩后分离, 可以有效降低检出限 [6~ 8] 人血清中的各个蛋白组分的分离和定量在疾病的临床诊断过程中具有重要参考价值因此, 在临床研究领域, 实现人血清蛋白的更快速分离有很大的意义常用的醋酸纤维素或者琼脂糖平板凝胶电泳法操作繁琐 Jorgenson 和 Lukacs 首先采用 CE 技术实现对人血清蛋白的分离 [9], 后续利用 CE 技术分离人血清蛋白也有很多报道 [10~ 12], 但是采用更迅捷的 MCE 技术快速分离人血清蛋白的研究却不多原因在于, 与传统的 CE 技术相比, 电泳芯片的绝对进样量更少, 浓度灵敏度比较差另外, 电泳芯片的分离通道尺寸小, 分离度比较差, 人血清蛋白中低浓度成分的分离容易受到样品中高浓度成分的干扰目前, 只有 Coloyer 等报道了采用高灵敏的激光诱导荧光检测器, 在芯片上实现了对模拟合成人血清蛋白的快速分离 [13] 本研究阐述了在十字微流体芯片上样品的电动进样与分离过程, 同时以真实人血清蛋白为样品, 研究了进样时间对人血清中 5 组蛋白组分分离的影响在优化的时间和电压条件下,2 min 内就可以快速完成对人血清蛋白的分离, 并且估算了在所用缓冲体系下 5 组蛋白的有效淌度 2 实验部分 2.1 微流体芯片电泳仪及其芯片本研究采用的是 MCE-2010 微流体芯片电泳仪 ( 日本岛津公司 ) 其特点是 : 第一, 能够实现 96 个样品自动进样, 并且在对人血清蛋白的分离中, 每次样品测定前, 芯片的样品池和通道会依次自动用高收稿 ; 接受本文系中央高校基本科研业务费专项资金 (No.2011D10521) 资助 * chemxzq@ dhu.edu.cn

分析化学纯水和电泳缓冲液清洗, 保障分析的重现性 ; 第二, 该仪器的 UV 检测器由 1024 光电阵列管构成, 检测器设置在芯片分离通道正下方, 能够随时观测整个分离过程并记录对人血清蛋白的检测采用的 UV 波长在 214 nm 常用的电泳芯片一般是十字结构, 本研究采用的石英芯片 ( 岛津公司 ) 的内表面已经过涂渍处理, 能够有效抑制电渗流和对蛋白样品的吸附通道宽为 110 mm,

2 分析化学纯水和电泳缓冲液清洗, 保障分析的重现性 ; 第二, 该仪器的 UV 检测器由 1024 光电阵列管构成, 检测器设置在芯片分离通道正下方, 能够随时观测整个分离过程并记录对人血清蛋白的检测采用的 UV 波长在 214 nm 常用的电泳芯片一般是十字结构, 本研究采用的石英芯片 ( 岛津公司 ) 的内表面已经过涂渍处理, 能够有效抑制电渗流和对蛋白样品的吸附通道宽为 110 mm, 深为 50 mm, 有效分离长度为 25 mm; 芯片上的 4 个储液池可分别用作为样品池 (Port 1), 样品废液池 (Port 2), 缓冲溶液池 (Port 3) 和总废液池 (Port 4), 储液池的容量均为 3 ml Pt 电极已经被固定在芯片表面并部分延伸到储液池的侧 [12] 面 ( 图 1), 当储液池中充满缓冲溶液即能导电, 电极位置固定能够极大提高电动进样的重现性图 1 Fig.1 岛津 MCE-2010 所使用的十字形微流体芯片 Cross microchip applied for MCE-2010 chip system from Shimadzu 2.2 样品及其试剂冷冻人血清蛋白样品 (Product No. S-7023), 经解冻后, 不经过任何离心或者过滤处理, 用超纯水稀释 10 倍, 振荡均匀后直接在微流体芯片上分离测定通常, 人血清蛋白的分离都采用硼酸盐缓冲体系本研究所用的电泳分离缓冲液为 :100 mmol/l H 3 BO 3, 50 mmol/l NaCl, 5% (w/v) Dextran ( 用 NaOH 调至 ph 8.3) 其中,5% Dextran( 平均分子量为 2000 kda) 为蛋白组分的筛分介质, NaCl 用于增强缓冲液的离子强度, 有利于白蛋白和 α1- 球蛋白的分离所用试剂均购于 Sigma-Aldrich 公司实验用超纯水由 Milipore 纯水机制得 3 结果与讨论 3.1 微流体芯片电泳上电动进样过程对芯片电泳而言, 采用电动进样比压力进样更加方便和易于实现在十字芯片上的进样和分离模式较为常用, 如图 2 所示首先, 在 4 个储液池和芯片通道中注入分离缓冲液, 样品注入样品池 (Port 1), 电压加在进样通道两端的储液池 (Port 1 和 Port 2) 上, 样品从 Port 1 流向 Port 2; 持续一定时间之后, 转换电压施加在 Port 3 和 Port 4 上, 这样十字部分的样品就被导入了分离通道, 显然, 只有芯片十字部分的样品最后进入分离通道被检测, 与整个样品池的容量相比, 进样量非常小 ( 如岛津芯片十字交叉部分的体积约为 0.6 nl) 这个过程虽然简单, 但是影响因素很多 :(1) 在样品从 Port 1 流向 Port 2 的过程中 ( 图 2A), 由于样品池中样品是充足的, 因而在进样通道中电动进样过程遵循移动界面电泳 (Moving boundary electrophoresis, MBE) 规律假设有 3 种阴离子 m1,m2 和 m3, 它们的淌度关系为 m1<m2< m3 按照 MBE 规律, 最前面的区带是淌度最高的离子 m3, 其次是 m2+m3 的双组分混和区带, 最后是 m1+m2+m3 的三组分混合区带 ( 图 2B) 从十字部分被导入的样品( 如图 2C), 相对于原来在样品池 (Port 1) 中的最初样品, 各组分的浓度比例是不同的, 这表明了微流体芯片电泳在精确定量分析方面的 [7] 局限性 ;(2) 在电动进样过程中, 除 Port 1 和 Port 2 之外,Port 3 和 Port 4 上施加的电压, 对导入分离通道的样品塞的长短和形状也有很大的影响根据施加电压的不同, 进样的过程可以有 Floating, [15] Pinched,Dynamic3 种模式, 对最终的分离度和灵敏度有很大影响通过给出了一个简单的公式, 根据施加在 4 个储液池上的电压预估十字部分的电压, 比较储液池和十字部分的电压, 可判断进样模式和样

3 第期徐中其等 : 微流体芯片电泳技术对人血清蛋白的快速分离品塞的形态 [16] ;(3) 进样时间需要优化如果进样时间短, 可能检测不到淌度最小的成分 m1; 反之, 淌度高, 并且浓度低的成分 m3 很可能完全流到了 Port 2, 不会被导入到分离通道图 2 十字电泳芯片上的电动进样和分离过程 :(A) 通道中注入缓冲液,Port 1 中加入样品 ; (B) 在 Port 1 和 2 上施加电压, 样品从 Port 1 流向 Port 2;(C) 在 Port 3 和 4 上施加电压, 十字部分样品被导入分离通道 ;(D) 样品在分离通道被分离 Fig.2 Sample electrokinetic injection and separation on a cross microchip: (A) Buffer was introduced into channels and sample was injected in Port 1; (B) Sample was electrokinetically introduced by applying the voltages on Port 1 and 2; (C) The sample in cross part was injected into separation channel by switching the voltage on port 3 and 4; (D) Sample was separated in separation channel 3.2 进样时间的优化和人血清蛋白的分离人血清蛋白中有 5 大组蛋白成分 :α1-ἀ2-, β -,γ- 球蛋白 (Globulin) 和白蛋白 (Albumin) 与前面的 4 组球蛋白相比, 白蛋白的丰度最高, 淌度最低因此, 白蛋白会干扰与之相邻的球蛋白的分离在微流体芯片电泳过程中, 当蛋白样品从 Port 1 流向 Port 2 的电动过程中, 符合 MBE 规律, 进样时间的优化非常重要如果持续的时间过短或者过长, 图 3 显示的是人血清蛋白样品经 10 倍稀释后直接在芯片上分析, 所有的蛋白组分可能不会全部被导入分离通道实验中进样和分离时施加在 4 个储液池上的电压如表 1 所示由于电泳芯片的分离通道短, 如所用的芯片只有 25 mm, 分离时间也非常重要时间过短, 则分离度很差 ; 时间过长, 蛋白峰将流出检测区域本实验优化的分离时间为 50 s 由于电动进样时间的不同而得到的不同的电泳分离谱图当电动进样持续时间为 40 s 时 ( 图 3A), 被导入分离通道的样品只得到淌度高的 4 组球蛋白的谱图, 表明此时白蛋白还没有进入十字部分的有效样品导入区表 1 进样与分离时芯片上所施加的电压 Table 1 Voltages applied on the microchip for sample injection and separation Microchip electrophoresis 进样 Sample injection 施加电压 Voltage (V) Port 1 Port 2 Port 3 Port 分离 Separation 图 3 分析 Fig.3 人血清蛋白 ( 水中稀释 10 倍 ) 在十字芯片上的 Analysis of human serum (1/10-diluted in water) on the cross microchip (A) 和 (B) 分别代表电动进样时间为 40 和 60 s, 分离时间都为 50 s, 施加电压如表 1 所示缓冲液 :100 mmol/l H 3BO 3, 50 mmol/l NaCl, 5% dextran( 由 NaOH 调至 ph 8.3) 检测波长 :214 nm (A) and (B) represented the sample electrokinetic injection time at 40 and 60 s, respectively. The separation time was all 50 s. The applied voltages were as in Table 1. Background electrode: 100 mmol/l H 3BO 3, 50 mmol/l NaCl, 5% dextran, ph 8.3 adjusted by NaOH. Detection wavelength: 214 nm.

4 分析化学域如果进样时间为 60 s 时, 只能得到单一白蛋白峰的谱图 ( 图 3B) 前面的 4 组球蛋白由于淌度高, 浓度低, 基本上流向了废液池 (Port 2) 两实验过程中分离的电压和持续时间(50 s) 完全一致, 虽然进样时间差异只有 20 s, 但是很明显, 在人血清蛋白分离中, 高浓度白蛋白会对球蛋白有很大影响所以在十字芯片上要完全同时分离 5 组蛋白, 不仅要优化进样时间, 实验所采用 Pinched 进样模式, 即各储液池上的电压也需要进一步优化, 目前分离结果还不够理想根据图 3A 和图 3B, 分别计算出 4 种球蛋白的总面积和白蛋白的面积为和 , 球蛋白和白蛋白的浓度之比为在正常的人血清中, 球蛋白的正常值为 20~30 g/l, 白蛋白约为 45 g/l, 其浓度比例约为 1 1.3, 因此实验的定量结果与正常值还比较吻合 3.3 人血清中 5 组蛋白淌度的估算根据分离的电压时间和 5 组蛋白峰的位置, 按公式 (1) 估算 5 组蛋白在所使用缓冲液的有效淌度 : lef =v/e=(l L)/(tm V) (1) 式中,v 和 E 分别为速度和电场强度,l 为峰到十字部分的距离, 即峰的位置 (cm),l 为十字部分到 Port 4 的距离 (3.3 cm),tm 是分离时间 50 s,v 是施加在十字部分和 Port 4 之间的电压 (320 V) 经过估算, 白蛋白 ἀ1-,α2-, β -, 和 γ- 球蛋白可供参考的有效淌度分别为 5.15,12.6,16.4,24.6 及 cm 2 /(V s) 该淌度数据存在一定的误差, 因为十字部分和 Port 4 之间的电压的计算是基于通道中的电解溶液均一的假设, 而实际上, 样品和缓冲溶液的电导率不同, 真实数据应该大于该估算数值本研究在微流体芯片电泳上对真实人血清蛋白进行快速分离, 研究了电动进样时间对最后蛋白组分分离的影响, 并且粗略估算了在该缓冲溶液中 5 组蛋白组分的有效淌度采用芯片电泳技术和常用的 UV 检测器, 在 2 min 内可以完成从进样到分离的整个过程, 在将来临床快速诊断上有较大应用前景实验表明, 虽然可以分离蛋白样品, 并且由峰面积计算出样品中球蛋白和白蛋白的浓度比值与正常人血清中的比值也较吻合, 但高浓度的白蛋白会对低浓度的球蛋白的分离造成干扰在十字芯片上同时完全分离 5 组人血清蛋白的结果还不理想综上所述, 在十字型芯片上采用电动进样方式,MBE 进样规律 Pinched 模式及芯片的结构使得芯片上的准确定量分析存在限制微流体芯片电泳如采用一般的 UV 检测器, 浓度灵敏度也比较低, 后续的工作可集中在采用一些电泳的在柱浓缩技术 (Stacking 方法 ), 以提高分析的灵敏度, 从而开展对人血清蛋白中某些代谢物的分析 References 1 HarrisonDJ,FluriK,SeilerK,FanZ H,EfenhauserCS,ManzA.Science,1993,261:895~897 2 JacobsonSC,HergenrödeR,KoutnyLB,WarmackRJ,RamseyJM.Anal.Chem.,1994,66:1107~ YING Dong-Guang,LIU BiṉHu,ZHANG Li,XIE ChuṉJuan,ZHANG Le.ChineseJ.Anal.Chem.,2010, 38(8):1095~1099 尹东光, 刘斌虎, 张礼, 谢春娟, 张乐. 分析化学,2010,38(8):1095~ WANG XiṉYu,ZHU Ying,FANG Qun.ChineseJournalofChromatography,2011,29(2):99~104 王新珏, 祝莹, 方群. 色谱,2011,29(2):99~104 5 MALiang-Bo,XU Yi,LIANGJing,LIU Hai-Tao,GANJun,LIDong-Shun,PENGJiṉLan,WUShan.Chinese J.Anal.Chem.,2011,39(8):1123~1128 马亮波, 徐溢, 梁静, 刘海涛, 甘俊, 李栋顺, 彭金兰, 吴珊. 分析化学,2011,39(8):1123~ XuZQ,HirokawaT,NishineT,AraiA.J.Chromatogr.A,2003,990(1-2):53~61 7 XuZQ,AndoT,NishineT,AraiA,HirokawaT.Electrophoresis,2003,24(21):3821~ HuangH Q,XuF,DaiZP,LinBC.Electrophoresis,2005,26(11):2254~ JorgensonJW,LukacsK D.Science,1983,222:266~ Dolník,V.J.Chromatogr.A,1995,709(1):99~ ChenFT A,SternbergJC.Electrophoresis,1994,15(1):13~21 12 JenkinsM A,KulinskayaE,MartinH D,Guerim M D.J.Chromatogr.B,1995,672(2):241~ ColyerCL,MangruSD,HarrisonDJ.J.Chromatogr.A,1997,781(1-2):271~ XuZQ,KoshimidzuE,HirokawaT.Electrophoresis,2009,30(20):3534~3539

5 第期徐中其等 : 微流体芯片电泳技术对人血清蛋白的快速分离 15 BiasM,DelaunayN,RoccaJL.Electrophoresis,2008,29(1):20~32 16 XuZQ,NakamuraY,HirokawaT.Electrophoresis,2005,26(2):383~390 RapidSeparationofHumanSerum Proteinsby MicrochipElectrophoresis XUZhong-Qi *,LIU Hui-Qing (ColegeofChemistry,ChemicalEngineeringandBiotechnology,DonghuaUniversity,Shanghai201620,China) Abstract Thisstudyfocusedontheseparationofhumanserum proteinsby microchipelectrophoresis.itwasilustratedthesampleinjectiontimeandappliedvoltagessignificantlyafectedthefinal detectionandquantitativeanalysisonacrossmicrochip.thedevelopedbackgroundelectrolyte(bge) wasconsistedof100 mmol/l H3BO3,50 mmol/l NaCl,5% dextran (ph8.3adjustedbynaoh). Fiveproteinfractions,α1-,α2-, β -,γḡlobulinsandalbumininhumanserum,couldbeseparated, moreover,theirefectivemobilitieswereestimatedintherangeof5.15~ cm 2 V -1 s -1 inthis bufersystem.theinjectionandseparationwerefinishedwithin2 mininthechip,whichwasfaster thantraditionalcapilaryzoneelectrophoresis. Keywords Microchipelectrophoresis;Humanserumproteins;Mobility;Capilaryzoneelectrophoresis (Received25October2011;accepted29December2011)

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兽医临床诊断学实验指导兽医临床诊断学实验指导河北科技师范学院动物科学系临床兽医学实验室 2009 年 2 月目录学生实验守则... 3 实习一动物的接近保定和基本检查法...4 实习二临床基本检查法及一般检查...10 实习三循环系统的临床检查...15 实习四