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1 490 南方医科大学学报 J South Med Univ 基础研究小电导钙激活钾通道在人心房肌细胞中的表达及功能于涛 1 3 吴若彬 1 郭惠明 1 邓春玉 2 郑少忆 1 邝素娟 2 广东省心血管病研究所/广东省人民医院/广东省医学科学院 1 心外科 2 医学研究中心广东广州广州医学院第二附属医院心外科广东广州摘要目的探讨小电导钙激活钾通道在人心房肌细胞中的表达情况和功能意义方法收集行心内直视手术的窦性心律先心病患者8例取右心耳组织行免疫组化分析3种SK通道亚型 SK1 SK2和SK3 表达情况使用经典两步酶解法分离心房肌细胞应用穿孔膜片钳和传统电压钳技术分别记录心房肌细胞动作电位 APs 和全细胞的钙激活钾电流 IK,Ca 比较给予 SK 通道特异性阻断剂 apamin 100 nmol/l 前后动作电位时程 APD 变化结果 SK1 SK2 和 SK3 通道亚型在心房肌细胞中均呈阳性表达膜片钳记录证实 IK Ca 的存在且 apamin 明显延长复极化 90%的动作电位时程 APD90 而对APD50 无明显影响结论 3种SK通道亚型在人心房肌细胞中均有表达与SK通道在神经元细胞中介导动作电位后超极化过程的功能不同在心房肌细胞中 SK通道是参与APs复极末期过程的重要离子通道关键词小电导钙激活钾通道人心房肌细胞膜片钳中图分类号 R331.3 文献标志码 A 文章编号 Expression and functional role of small conductance Ca2+-activated K + channels in human atrial myocytes YU Tao1,3, WU Ruo-bin1, GUO Hui-ming1, DENG Chun-yu2, ZHENG Shao-yi1, KUANG Su-juan2 Department of Cardiac Sugery1, Medical Research Center2, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou , China; 3Department of Cardiac Surgery, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou , China Abstract: Objective To investigate the expression and functional role of the small conductance Ca2 +-activated K + channels in human atrial myocytes. Methods We collected the right atrial appendage tissues from 8 patients with congenital heart defect with sinus rhythm undergoing open-heart surgery. Immunohistochemistry was performed to identify the expression of 3 isoforms of SK channel (SK1, SK2 and SK3). Using the classical two-step enzymatic isolation method, perforated patch clamp and conventional voltage-clamp techniques were performed to record the action potentials (APs) and the whole-cell Ca2 +-activated K + current (IK, Ca) in the single atrial myocyte. We compared the changes in action potential duration (APD) before and after the application of a specific SK channels blocker apamin (100 nmol/l). Results Human atrial myocytes showed positivity for all the SK1, SK2 and SK3 isoform channels. Patch-clamp recording confirmed the presence of IK,Ca, and apamin significantly prolonged APD at 90% repolarization (APD90), but produced no obvious effect on APD50. Conclusion The three isoforms of SK channels are all expressed in human atrial myocytes. SK channels play a prominent role in the late phase of repolarization in human atrial myocytes, which is distinct from their functional roles in neurons where they mediate the process of afterhyperpolarization following APs. Key words small conductance Ca2+-activated K+ channels; human; atrial myocytes; patch-clamp technique 小电导钙激活钾 small conductance AF相关性离子通道 3 目前有关心肌细胞中SK通道功 Ca2+-activated-K + SK 通道包含 3 种亚型 SK1 SK2 和能意义的研究不多且基本上在小鼠兔等动物中进行 SK3 最近两项动物实验研究证实 SK 通道与心房结果亦存在明显争议 2, 4-5 在人心房肌细胞中仅有SK2 颤动 AF 发生有关提示 SK 通道可能是一种新型的通道表达的报道尚无有关 SK1 和 SK3 亚型存在的证 1-2 据本研究采用免疫组化和膜片钳技术探讨SK通道三收稿日期种亚型在人心房肌细胞中的表达情况及其功能意义基金项目广东省自然科学基金作者简介于涛在读博士研究生副主任医师电话 yutao7999@126.com 通讯作者吴若彬主任医师博士生导师电话 ruobinwu@hotmail.com 1 对象与方法 1.1 标本来源收集择期行心内直视手术的先天性脏病室间隔缺

2 第 3 期于涛, 等. 小电导钙激活钾通道在人心房肌细胞中的表达及功能 491 损患者 8 例, 其中男 4 例, 女 4 例, 平均年龄 15.3±3.2 岁, 均为窦性心律, 所有患者术前均签署知情同意书收集建立体外循环时切除的小量右心耳组织约 0.5 cm 3, 放入氧饱和的 4 心脏停搏液中,5 min 内送回实验室 1.2 免疫组化分析福尔马林固定石蜡包埋右心耳组织标本常规脱蜡至水,PBS 漂洗, 微波抗原修复, 室温冷却, 过氧化氢酶阻断, 分别加入一抗 : 抗 SK1 羊多克隆抗体 (1:500) 抗 SK2 和抗 SK3 兔多克隆抗体 (1:500)4 过夜, 加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗 (1:5000),DAB 显色, 苏木素复染, 封片 PBS 取代一抗作阴性对照光学显微镜下观察组织标本的染色情况注 : 抗 SK1 为 Santa Cruz 产品, 抗 SK2 和 SK3 为以色列 Alomone 产品, 二抗均为 Santa Cruz 产品 1.3 膜片钳全细胞记录心房肌细胞分离采用经典二步酶解法分离单个 [6] 心房肌细胞, 分离后的细胞保存在改良 KB 液中至少 1 h 后进行电生理记录全细胞钙激活钾电流 (Ca 2+ -activated K + current, I K,Ca) 记录选取纹理清晰杆状和大小适中的细胞在 24 C 条件下进行实验. 将适量细胞加入体积约 1.5 ml 平放于倒置显微镜 (OLPUS IX 70 型, 日本 ) 的细胞池中. 贴壁 8 min 后, 开始实验, 灌流速度约 1.5 ml/min 电极在电极拉制仪 (Narishige PP830 型, 日本 ) 分两部拉制电极, 灌电极液后电阻为 2~4 MW, 并置于推进器上, 通过三维操纵器 (Narishige, 日本 ) 驱动电极, 并轻压在细胞表面. 用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后, 用 ZAP 或给负压破膜, 给予电容及串联电阻补偿, 形成全细胞记录电流信号经 Ag/AgCl 电极引导, 由膜片钳 AXON 200B 放大器放大通过 AD/DA 转换板 (AX0N DigiDatal 200, 美国 ), 并存储于计算机硬盘中实验过程由 pclamp 9.0 软件程序 (AXON, 美国 ) 刺激发放和信号采集采用 pclamp9.0 软件对单个全细胞记录进行数据和图形转换,Prism 3.0 软件对数据进行曲线拟合及绘制离子通道电流密度 - 电压 (I-V) 曲线根据文献 [4-5], 本研究中将电极内液的游离 Ca 2+ 浓度 ([Ca 2+ ]i) 设定为 1000 nmol/l, 以最大限度地保证 SK 通道激活形成全细胞封接状态后, 将细胞钳制在 -55 mv, 给予指令电位从 -100 mv~+80 mv, 步长 20 mv, 波宽为 500 ms 的刺激记录用药前 (control) 电流后, 用含 SK 通道特异性阻断剂 apamin(100 nmol/l) 的电极外液灌流 3 min 后再次记录 (after apamin) 电流, 给 apamin 前后的电流相减获得 apamin 敏感性电流 (apamin-sensitive current), 此电流即 I K,Ca 记录每个细胞电容, 计算电流密度 (pa/ pf) = 电流 (pa) / 电容 (pf) 本实验中又采用双脉冲刺激法进一步证实 IK,Ca 的存在 : 形成全细胞封接状态后, 电压从钳制电压 -55 mv 到 0 mv,10ms 后再从 0 mv 至 +40 mv 以同样的方法分别记录给 apamin 前 (control) 3 min 后 (apamin) 和空白电极外液冲洗 3 min 后 (washout) 的电流变化动作电位 (action potentials,aps) 记录采用穿孔膜片钳技术 [7-8], 电极装填两性霉素 B(200 µg/ml), 校正液接电位, 记录模式调为电流钳, 波宽 5 ms 波幅 200 na, 刺激细胞产生动作电位 (action potentials, APs) 分别记录以含 100 nmol/l apamin 的电极外液灌流 5 min 前后的 APs, 计算复极化 50% 和 90% 时的动作电位时程 (APD 50, APD 90) [4-5] 溶液与试剂实验所用试剂中胶原酶 Ⅱ 蛋白酶 XXIV BSA HEPES K-glutamate N-methylglucamine (NMG) EGTA K-gluconate 两性霉素 B 均为 Sigma 公司产品,apamin 为 Merck 公司产品,E4031 为以色列 Alomone 公司产品, 其余为国产分析纯无钙 Tyrode s 液 (mmol/ L):NaCl 136, KCl 5.4, MgCl 2 1.0, NaH 2PO , Glucose 10, HEPES 10, 用 NaOH 调 ph 至 7.4 改良 KB 液 (mmol/ L):KCl 40,KH 2PO 4 20,K-glutamate 50,taurine 20,MgCl 2 3,Glucose 10,HEPES 10, EGTA 0.5,KOH 调 ph 至 7.4 记录 I K,Ca 的电极外液 (mmol/l) :Nmethylglucamine (NMG) 140,KCl 4,MgCl 2 1.0, glucose 5,HEPES 10,HCl 调 ph 至 7.4 电极内液 (mmol/l):k-gluconate 144,MgCl ,EGTA 5, HEPES 10, 加入 CaCl 2 至电极内液中游离钙离子浓度为 100 nmol/l,cacl 2 剂量由 Maxchelator Ca-EGTA Calculator v1.2 ( 软件计算得出双脉冲刺激法电极外液 (mmol/l):na-glutamate 10,4-AP 5,E4031 (10 μmol/l),kcl 1,NMG 120, niflumic acid 0.05,HEPES 10,glucose 10,CaCl 2 2, MgCl 2 1,glutamic acid 调 ph 至 7.4 电极内液 (mmol/ L):K-glutamate 15,NMG 120,K2(ATP) 2.5, EGTA 0.01,HEPES 10,glutamic acid 调 ph 至 7.4 记录 APs 的电极内液 (mmol/ L):K-glutamate 120,KCl 25,MgCl 2 1,CaCl 2 1,HEPES 10,KOH 调 ph 至 7.4 电极外液 :NaCl 138,KCl 4,MgCl 2 1,CaCl 2 2, NaH 2PO ,glucose 10,HEPES 10,NaOH 调 ph 至统计学处理所有数据均以均数 ± 标准误表示组间数据比较采用 Student s t 检验 P<0.05 认为有统计学差异本

492 南方医科大学学报 J South Med Univ 文中n表示细胞数组织切片显示 3 种亚型的 SK 通道在心房肌细胞中均有阳性表达且在细胞膜细胞质和细胞核周围均 2 结果有分布图1 2.

1 Immunohistochemistry for expressions of SK1, SK2 and SK3 isoform channels in atrial myocytes in right atrial appendage tissue section (Original magnification: 400).

全细胞IK,Ca电流图形和电流密度-电压 I-V 关系曲线 Fig.2 Whole-cell IK,Ca and current density-voltage (I-V) relation curve. A: Examples of whole-cell IK,Ca(i.e. apamin-sensitive current); B: Summary data for the IK,Ca density-voltage relationship.

转图3 符合SK通道介导的IK,Ca电流的特征 2.3 APs记录给予100 nmol/l apamin后心房肌细胞动作电位的 APD90 从 158.7±2.3 ms 延长至 295.5±20.3 ms P< 0.

3 492 南方医科大学学报 J South Med Univ 文中n表示细胞数组织切片显示 3 种亚型的 SK 通道在心房肌细胞中均有阳性表达且在细胞膜细胞质和细胞核周围均 2 结果有分布图1 2.1 SK1 SK2和SK3亚单位在心房组织中的表达 SK1 + SK2 + SK3 + 图1 右心耳组织切片中SK1 SK2和SK3通道亚型在心房肌细胞中的阳性表达 Fig.1 Immunohistochemistry for expressions of SK1, SK2 and SK3 isoform channels in atrial myocytes in right atrial appendage tissue section (Original magnification: 400). A B -55 mv After apamin -sensitine current 10 pa/pf 500 ms Current density (pa/pf) 对照 Potential (mv) 图2 全细胞IK,Ca电流图形和电流密度-电压 I-V 关系曲线 Fig.2 Whole-cell IK,Ca and current density-voltage (I-V) relation curve. A: Examples of whole-cell IK,Ca(i.e. apamin-sensitive current); B: Summary data for the IK,Ca density-voltage relationship. 2.2 IK,Ca记录 IK,Ca为一种非时间依赖性的兼有内向和外向性整流特征的电流图 2 所示为典型的 IK,Ca apamin-sensitive current 电流图形及电流密度-电压 I-V 关系曲线在 Washout 双脉冲刺激条件下该电流可被 SK 通道特异性阻断剂 apamin 抑制且这种抑制作用在洗脱 apamin 后可被逆转图3 符合SK通道介导的IK,Ca电流的特征 2.3 APs记录给予100 nmol/l apamin后心房肌细胞动作电位的 APD90 从 158.7±2.3 ms 延长至 295.5±20.3 ms P< 0.05 而APD50则无明显延长图4 100 pa 图 3 双脉冲刺激法记录给 apamin 前后和洗脱 apamin 后的 IK,Ca 变化情况 Fig.3 Changes in IK,Ca before (control) and after 100 nmol/l apamin application and at the washout using two-pulse voltage clamp protocol. 3 讨论本研究表明 SK1 SK2 和 SK3 在人心房肌细胞中均有分布 IK.Ca为兼有内向和外向性整流特征的电流特异性的阻断 SK 通道可以使 APD90 明显延长但对 APD50无明显影响本结果提示与SK通道在神经元细胞中介导 APs 后的后超极化过程不同在心肌细胞中 SK通道是参与APs复极末期过程重要离子通道

4 第 3 期于涛, 等. 小电导钙激活钾通道在人心房肌细胞中的表达及功能 mv Tims (ms) 钙激活钾通道家族是钾通道超家族中的重要成员, 根据电生理和药理学特性不同, 又分为大中小电导钙激活钾通道亚家族 SK 通道亚家族的特性是电压非依赖性仅由细胞内的 Ca 2+ 激活和可被蜂毒明肽 (apamin) 特异性阻断, 根据基因编码不同, 可分为三种亚型 (SK1 SK2 和 SK3) 对 SK 通道有高度选择性, 对其它离子通道则不敏感剂量 - 效应曲线显示 SK 通道各亚型对 apamin 的敏感性不同,apamin 阻断人 SK1(hSK1) 大鼠 SK2(rSK3) 和 SK3(rSK3) 的半数抑制浓度 IC 50 分别为 704 nmol/l 27 pmol/l 和 4 nmol/l [9] 考虑到过高浓度的 apamin 可能对细胞产生不可逆性的损伤, 以及参考既往的研究 [5], 本研究中使用 100 nmol/l 的 apamin, 该浓度虽然主要阻断 SK2 和 SK3 亚型通道, 但阳性结果并不影响判断 I K,Ca 存在与否的定性研究另外, 根据文献 [4] 等的研究, 本研究将电极内液的游离 Ca 2+ 浓度设定为 1000 nmol/l, 以保证 SK 通道被最大限度的激活 APD50 图 4 穿孔膜片钳技术记录给 apamin 前后的动作电位图形和 APD 50 APD 90 变化情况近年来发现 SK 通道在某些物种包括人类的心脏 [4] 中有表达 2003 年,Xu 等报道 SK 通道在小鼠和人的心脏中有表达, 且呈心房选择性分布, 即 SK2 通道在 [10] 心房中的表达水平要高于心室 2005 年,Tuteja 等报道在小鼠心房中 SK1 SK2 和 SK3 三种亚型均有表达, 其中 SK1 和 SK2 亚型呈心房选择性分布, 而 SK3 则在心房和心室表达水平无差异本研究首次提供了人心 20 mv Fig.4 APs profiles and changes of APD50 and APD90 before (control) and after application of 100 nmol/l apamin. * APD90 房肌细胞中存在另外两种亚型 (SK1 和 SK3) 的证据, 为今后进一步研究 SK 通道各亚型提供了理论依据在大多数神经元细胞中,SK 通道通过介导 APs 后的后超极化 (afterhyperpolarization, AHP) 过程对神经元细胞的兴奋节律和兴奋模式起重要调控作用 [11] 然而,SK 通道在心肌细胞中的功能意义目前还不甚清楚, 现有的研究结果亦存在很大争议几项来自同一研究小组的系列研究显示,SK2 通道参与心肌细胞 APs 复极 [2, 4] 化过程, 对复极末期有重要影响然而, 最近 Nagy [5] 报道的研究结果对前述的研究提出质疑, 他们的研究结果显示, 在大鼠犬和人类心室肌细胞中,SK 通道在正常生理状态下处于失活状态, 对 APs 复极化过程无影响从理论上推断, 根据其对高度 Ca 2+ 敏感性和非电压依赖的特性,SK 通道可能为心肌细胞内的钙调控和细胞膜的电活动之间提供重要功能链接为了验证 I K,Ca 电流的存在以及在动作电位复极化过程中究竟有无作用, 本研究使用传统电压膜片钳和穿孔膜片钳技术, 以 SK 通道特异性阻断剂 apamin 阻断全细胞 I K,Ca 电流以观察对心房肌细胞 APD 的影响本研究结果显示,apamin 可以明显延长心肌细胞的 APD 90, 但对 APD 50 无明显影 [4] 响该结果与 Xu 等的研究结果相符合, 证实了 SK 通道是参与人心房肌细胞 APs 复极末期的重要离子通道 [1] [2] 最近,Ozgen 等和 Li 等的两项动物实验研究表明 SK 通道与 AF 的发生有关, 提示 SK 通道可能是一种 [3] [4, 10] 新型的 AF 相关性离子通道既往的研究已经证实 SK1 和 SK2 通道呈心房选择性分布本研究又进一步证实,SK 通道的三种亚型在人心房肌细胞中均有分布, 且 SK 通道对人心房肌细胞的复极化过程有重要影响这些研究具有非常重要的临床意义, 因为它们预示着将来可能研发新型的药物, 即特异性针对 SK 通道的药物, 这种药物可以治疗或预防 AF 且无致室性心律失常的风险参考文献 : [1] Ozgen N, Dun W, Sosunov EA, et al. Early electrical remodeling in rabbit pulmonary vein results from trafficking of intracellular SK2 channels to membrane sites[j]. Cardiovasc Res, 2007, 75(4): [2] Li N, Timofeyev V, Tuteja D, et al. Ablation of a Ca 2 + -activated K + channel (SK2 channel) results in action potential prolongation in atrial myocytes and atrial fibrillation[j]. J Physiol, 2009, 587(Pt 5): [3] Nattel S. Calcium-activated potassium current: a novel ion channel candidate in atrial fibrillation[j]. J Physiol, 2009, 587(Pt 7): [4] Xu Y, Tuteja D, Zhang Z, et al. Molecular identification and functional roles of a Ca 2 + -activated K + channel in human and mouse hearts[j]. J Biol Chem, 2003, 278(49):

5 494 南方医科大学学报 (J South Med Univ) [5] Nagy N, Szuts V, Horváth Z, et al. Does small-conductance calcium-activated potassium channel contribute to cardiac repolarization?[j]. J Mol Cell Cardiol, 2009, 47(5): [6] Tian M, Dong MQ, Chiu SW, et al. Effects of the antifungal antibiotic clotrimazole on human cardiac repolarization potassium currents[j]. Br J Pharmacol, 2006, 147(3): [7] Ahmmed GU, Dong PH, Song G, et al. Changes in Ca(2+) cycling proteins underlie cardiac action potential prolongation in a pressure-overloaded guinea pig model with cardiac hypertrophy and failure[j]. Circ Res, 2000, 86(5): [8] 蔡芳, 曾晓荣, 杨艳, 等. 穿孔膜片钳记录猪冠状动脉平滑肌细胞 K + 电流技术初探 [J]. 四川生理科学杂志, 2005, 27(1): 3-6. [9] 张薇薇, 杨新春, 刘泰. 小电导钙激活钾通道分子结构及其电生理特性 [J]. 中国心脏起搏与心电生理杂志, 2007, 21(1): [10]Tuteja D, Xu D, Timofeyev V, et al. Differential expression of small-conductance Ca 2 + -activated K + channels SK1, SK2, and SK3 in mouse atrial and ventricular myocytes[j]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2005, 289(6): H [11] Bond CT, Maylie J, Adelman JP. SK channels in excitability, pacemaking and synaptic integration[j]. Curr Opin Neurobiol, 2005, 15(3): ( 编辑 : 陈望忠 )

第25章抗心律失常药.ppt

第25章抗心律失常药.ppt Antiarrthythmic Drugs Antiarrthythmic Drugs China Medical University > < > < 一心肌细胞膜电位１静息电位 resting membrane potential RMP 细胞在静息时膜电位呈外正内负的极化状态所测得的电位差为静息膜电位２动作电位ａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌＡＰ心肌细胞兴奋引起膜去心肌细胞兴奋引起膜去