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1 热点讨论 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2018, 34(8): 食源性致病菌安全事故处置与警示 以 2011 年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情 为例汤初美朱龙佼郭顺堂苗敬许文涛 ( 中国农业大学, 北京 ) 摘要 : 在全球范围内, 随着生活水平的提高, 食品安全问题受到了越来越多的关注 而在当今世界的食品安全事件中, 由食源性致病菌引起的安全事故以其广泛性 频发性和强致病性成为突出的食品安全问题 首先, 概述了食源性致病菌的特点, 以及历史上几例食源性致病菌导致的食品安全事件来简介食源性致病菌与食品安全之间的关系 ; 接着, 以 2011 年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情为示例, 详细展开介绍食源性致病菌的致病特点 检测技术及溯源方法, 并总结防控措施 政府应对及消费者应对指南 ; 最后, 在案例基础上探讨了食源性致病菌安全案例同时实现教学与科普任务的可能性 通过对案例的多角度分析, 旨在为食源性致病菌安全事故处置与警示起到推动作用 关键词 : 食品安全 ; 食源性致病菌 ; 德国 ; 肠出血性大肠杆菌 ; 警示 ; 案例 DOI : /j.cnki.biotech.bull Safety Accident Disposal and Warning of Foodborne Pathogenic Bacteria :Taking the Outbreak of Enterohemorrhagic Escherichia coli Infection in Germany in 2011 as a Case TANG Chu-mei ZHU Long-jiao GUO Shun-tang MIAO Jing XU Wen-tao (China Agricultural University,Beijing ) Abstract: With the improvement of living standard,issues on food safety are drawing a growing concern worldwide. In regards to all food safety incidents in the world,those caused by foodborne pathogens are becoming highlighted due to their universality,frequency and severe pathogenicity. This article is organized in the following order :First it gives an overview of the characteristics of foodborne pathogens and their connections with food safety by several historic food safety incidents ;then it takes the outbreak of enterohemorrhagic Escherichia coli(ehec) infection in Germany,2011 as a case,introducing pathogenic characteristics,detection techniques,tracing methods of foodborne pathogens in detail,and summarizing control measures and guides to government and consumer response. At last,based on the case,the article discusses the possibilities of its role both played in teaching and popularization in science. In sum,this article gives multi-angle analysis on the case,aiming at promoting effect on the disposal and warning of foodborne pathogenic food safety accident. Key words: food safety ;foodborne pathogen ;Germany ;enterohemorrhagic Escherichia coli ;caution ;case 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ), 农业硕士专业学位 食品加工与安全领域教学案例库 基础建设合同 (201609) 作者简介 : 汤初美, 女, 研究方向 : 食品安全 ; 通讯作者 : 许文涛, 男, 副教授, 博士生导师, 研究方向 : 功能核酸生物传感器检测技术 ;

2 2018,34(8) 汤初美等 : 食源性致病菌安全事故处置与警示 食源性致病菌的特点及食品安全事故 虽然全球医疗水平日渐提高, 但频发的食品安 全事故却对人们的生命健康造成了巨大的威胁 因此, 国际社会给予食品质量安全越来越高的关注度 其中, 由食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病是目前首要的食品安全问题之一 根据世界卫生组织 (WHO) 的定义, 食源性疾病为 凡是通过摄食而进入人体的病原体, 使人体患感染性或中毒性疾病, 统称为食源性疾病, 如常见的食物中毒 肠道传染病 寄生虫病及人畜共患传染病 另外, 一些由化学性有毒有害物质所引起的疾病也属于此列 由于来源多 分布广 污染原因多样 接触机会丰富 防范难度较大等原因, 由食源性致病菌引起的食物中毒事故频发, 致病人数在所有中毒种类中最多, 达到数亿人 故食源性致病菌已成为全球范围内最突出的污染源 1.1 食源性致病菌的特点 致病性强, 分布范围广食源性致病菌数量繁多, 大量分布在人类可接触的自然环境中, 无处不在 同时, 人类食用的食品本身是微生物的天然培养基, 又为感染食源性致病菌增加了可能 常见的食源性致病菌有沙门氏菌 (Salmonella) 肠出血性大肠杆菌 (Enteroheamorrhagic E.coli,EHEC) 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 和副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) [1] 沙门氏菌主要存在于肉 禽 蛋等食用动物性食品中 因未煮熟煮透或储存场所发生交叉污染等可导致中毒者出现胃肠炎 伤寒和副伤寒等症状 [2] 大肠菌群在自然界中广泛存在, 在人类以及其他恒温动物活动或粪便污染的场所更为密集 其主要致病菌株肠出血性大肠杆菌能引起人类出现出血性结肠炎 溶血性尿毒综合症 血栓性血小板减少性紫癜 [3] 金黄色葡萄球菌在空气 水 灰尘及人和动物的排泄物中都可找到 可能引发中毒的食品种类较多, 除了常见的奶 肉 蛋 鱼及其制品外, 剩饭 油煎蛋 糯米糕及凉粉也有致毒的可能性 由于这是一种能产生毒素的侵袭性细菌, 能较大程度地破 坏肠道, 故引发的肠炎多为急性, 且中毒症状严重 [4] 单增李斯特菌是高病死率疾病如菌血症 脑膜炎 流产的病原, 对极端自然条件的适应性好 - 可耐受较高的温度和渗透压 土壤 地表水及植物烂菜中的单增李斯特菌易被动物摄入, 以口腔 - 粪便的路径传播 食用海产品时烧煮不彻底或二次污染容易引发 [5] 副溶血性弧菌中毒, 导致感染性腹泻等症状 这种嗜盐性海洋性细菌常见于近海水域 海水冲积物和鱼虾贝壳类产品中, 人类接触食用的几率较大, 食物中毒案例逐年增多, 是恶性影响最大的食源性病原菌之一 与加工 贮存和流通环境密切相关在食品加工 储存 流通到食用的一系列环节中, 每一个过程都可能被生物源污染 以细菌污染为例 食品原料可能存放在适合细菌生长和繁殖的环境中从而易被侵染 ; 加工和贮存过程中流程的欠秩序性可能导致原料和成品的交叉污染, 车间设备的卫生不达标或者加工人员个人不良的卫生习惯也是细菌潜在的污染原因 ; 不专业的运输操作或者与运输过有害化工原料的运输工具先后运输 混合运输等也是细菌污染的隐患 ; 另外, 对于包装食品 包装封口破损或者使用隔离 杀灭细菌效果欠佳的包装材料, 在分装过程中也可能发生不同程度的再次污染 除此之外, 任何食品包装杀菌加工方式都只是暂时性的 严格管控的食品加工 贮存和流通可以控制和降低污染程度, 但无法完全避免和杜绝上述过程中的污染情况 1.2 历史上由食源性致病菌引起的安全事故本节以食品种类为线索, 介绍一些历史上的食源性致病菌安全事故, 对食源性致病菌与食品安全事故的关系及背景进行概括性阐述 海产品 2011 年 9 月, 华盛顿州有 5 人因食用问题生蚝感染弧菌病 美国食品药物管理局 (FDA) 和华盛顿卫生部于当月发布了公告, 并将所有去过华盛顿州和接触过问题生蚝的人包括在危险人群之内 [6] 国内方面,2011 年 9 月, 江阴市某公司食堂相继有 58 人出现呕吐 腹痛 腹泻等症状 经调查为一起受副溶血性弧菌污染的过期海鲜引起的细菌

3 206 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2018,Vol.34,No.8 性食物中毒 [7] 初级农产品 1996 年 5 月下旬,O157 H7 型大肠杆菌肆虐日本群岛, 从冈山 广岛到大坂 东京, 共有 44 个都道府县发生了集体食物中毒事件, 造成万余人中毒 近千人住院 100 多所中小学停课, 且有若干例死亡 [8] 日本厚生县及大坂政府建立联合调查组, 经调查发现, 此次食物中毒所感染的大肠杆菌 O157 H7 来自萝卜苗 加工农产品 2000 年夏天, 日本关西地区大阪市发生了新世纪以来最大规模的食物中毒事件 6 月 27 日, 大阪市政府和雪印乳业公司接到报告, 有人饮用雪印乳业公司大阪工厂制造的低脂奶后发生呕吐 腹泻和腹痛等食物中毒症状 [9-10] 至 7 月 10 日, 半个月内出现中毒症状者达到了 人 经过调查, 雪印公司北海道大树工厂在生产大阪工厂使用的脱脂奶粉原料时因停电物料滞留了约 4 h, 存储剩余脱脂乳和浓缩工序中进行回收的奶罐也因停电未被冷却, 其中的物料被放置了 9 h 以上, 由此导致了金黄色葡萄球菌的繁殖, 生成大量 A 型肠毒素 该工厂在生产过程中发生的以上不符合脱脂奶粉活性菌相关标准要求的违规行为, 最终酿成了这起特大食品安全事故 年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情事件介绍 2.1 概述 2011 年 5-7 月 [11], 德国北部出现肠出血性大肠杆菌感染疫情, 截至 5 月 26 日, 德国已出现 276 例相关的溶血性尿毒综合征病例,2 例死亡 截至 6 月 30 日全球共报告了 例 EHEC 感染和溶血性尿毒综合征 (Hemolytic uremic syndrome,hus) 病例, 50 例死亡 本次疫情席卷整个德国, 欧盟的其他国家也受到不同程度的影响, 并波及至美国和加拿大, 共计 16 个国家 这是迄今为止德国国内乃至全世界范围内最大规模的肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情 经过调查, 最终世界卫生组织在丹麦的合作实验室发布公告 : 造成此次疫情的是一种罕见的大肠杆菌菌株 O104 H4, 人体中曾有发现, 但此菌株导致溶血性尿毒综合征的暴发并无先例 [12-13] 2.2 事件发现及蔓延情况 2011 年 5 月 25 日起, 在第一例感染大肠杆菌的报告病例 德国西北部一位 83 岁的老妇感染大肠杆菌死亡之后的一周内, 陆续有超过 400 人确认或疑似被肠出血性大肠杆菌感染, 其中 40 人病情严重 德国以外的丹麦 瑞典 英国和荷兰也发现疑似病例约 300 个 疫情以每天 200 人左右的速度蔓延, 截至 6 月 3 日, 德国肠出血性大肠杆菌感染者的数目达到 人, 死亡 17 人,520 人出现危及生命的严重溶血性尿毒综合征 3 致病性大肠杆菌的传播途径大肠杆菌 (Escherichia coli) 又称大肠埃希氏菌, 主要生活在人和动物的大肠内, 由 Escherich 在 1885 年发现 由于大肠杆菌是肠道中数量最多的一种主要细菌, 人们在很长一段时间内都认为它没有致病性, 属于正常肠道菌群 直到 20 世纪中叶, 人们才获得部分特殊血清型的大肠杆菌具有病原性的认识 致病性大肠杆菌按照生物学特性的差异可分为以下 6 类 : 肠出血性大肠杆菌 (EHEC) 肠产毒性大肠杆菌 (ETEC) 弥散黏附性大肠杆菌(DAEC) 肠侵袭性大肠杆菌 (EIEC) 肠致病性大肠杆菌 (EPEC) 和肠黏附性大肠杆菌 (EAEC) 动物传染源在肠出血性大肠杆菌感染过程中扮演主要的角色 以带菌牛 带菌鸡为来源的动物性食品如牛肉 牛奶 鸡肉 鸡蛋等均可以成为肠出血性大肠杆菌污染链上的一环 而带菌动物活动 排泄造成的草场 水体等场所污染, 更能带来严重的危害 另外, 在此类人畜共患病中, 卫生欠佳情况下的人与人密切接触也可促进病原体的传播 除带菌体为根源的传播外, 其他方式污染水源或食物导致的肠出血性大肠杆菌中毒也有记录 主要是水体中大肠杆菌超标或食物未烧熟煮透 未消毒所造成 4 肠出血性大肠杆菌的中毒症状及危害被肠出血性大肠杆菌感染之后, 潜伏期为 1-14 d, 常见为 4-8 d 轻者不出现任何异常体征, 或仅出现轻度腹泻 部分患者出现发热或上感, 一般 3 d 内可消退 多数患者 5-10 d 内痊愈 中毒严重者则

4 2018,34(8) 汤初美等 : 食源性致病菌安全事故处置与警示 207 可引发出血性肠炎, 其中, 老人和儿童等免疫力较弱者可能在发病 2 周内出现并发症如溶血性尿毒综合征或血栓性血小板减少性紫癜等 4.1 出血性肠炎出血性肠炎是肠出血性大肠杆菌感染中较为普遍的症状 早期发生右下腹剧烈疼痛 腹泻, 依次为水样便和鲜血便, 常伴低热或不发热, 病程 7-10 d, 有时可延长达 12 d 在乙状结肠镜检查中见肠黏膜充血 水肿 肠壁张力低下 ; 钡灌肠 X 线检查中见升结肠 横结肠黏膜下水肿, 也是出血性肠炎的典型表现 4.2 肾溶血性尿毒综合症溶血性尿毒综合征的病原体种类繁多, 肠出血性大肠杆菌仅为其中一种 以急性肾衰 血小板减少症和微血管异常溶血性贫血为主要表现 血尿 少尿 无尿 皮下黏膜出血等为主要临床症状, 肾溶血性尿毒综合症的危害显著 儿童和老人作为肠出血性大肠杆菌感染中的最易感人群, 病死率高达 10%-30% 4.3 血栓性血小板减少性紫癜症状表现类似于肾溶血性尿毒综合症, 但神经系统症状 ( 头痛 轻瘫 昏迷 间歇性谵妄 ) 及发热程度更为显著 并发的血小板减少症 微血管异常溶血性贫血 肾功能异常 ( 血尿 蛋白尿 急性肾衰 ) 等使患者病情以极快的速度恶化,70% 的病人在 90 d 内死亡 5 肠出血性大肠杆菌的致病机理肠出血性大肠杆菌分为 血清型 其中,O157 H7 是肠出血性大肠杆菌感染疫情中的主要病原菌 经动物实验研究,O157 H7 能产生 VT 毒素, 进入人体后主要入侵小肠远端和结肠 肾脏 肺 脾脏和大脑, 通过抑制真核细胞合成蛋白质 聚集血小板造成对内皮细胞的损害, 造成肠黏膜水肿 出血, 肠细胞坏死, 严重者引起肾脏 脾脏和大脑的病变 [14] 而大肠杆菌产生溶血素和黏附上皮细胞的机制, 相关理论还没有得到实验的有力证明, 故具体致病原理尚不清楚 6 大肠杆菌检测诊断技术 6.1 大肠杆菌传统检测方法根据国家标准 (GB ) 规定, 传统的大肠杆菌检测方法主要有两种 : 大肠菌群稀释培养计数法 (Most probable number,mpn) 和大肠菌群平板计数法 在 MPN 检测法中, 第一步将待检菌通入月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤 (LST) 管中, 不产气则判断为大肠杆菌阴性, 产气的继续在选择性培养基进行进一步观察 若后续培养中仍产气则判断为大肠杆菌阳性, 否则判断为阴性, 最后查稀释培养技术表计算数量 平板计数法是将制备得到的菌液, 首先进行 10 倍梯度稀释, 然后将稀释好的菌液接种于大肠杆菌选择性培养基,37 培养一定时间后, 查取可疑菌落数, 并将可疑菌落接种在肉汤培养基中, 报告实验结果 [15] 滤膜法也是我国检测食品中大肠杆菌的一种常用方法, 该法主要利用滤膜对菌进行富集, 通过培养在 24 h 左右观察是否出现蓝色或蓝绿色, 判定有无大肠菌群 如果存在大肠杆菌, 则需进一步对其进行计数, 进而得到检测结果 由上可知, 传统的大肠杆菌检测方法操作简单, 但检测周期长 ( 多需要一天以上的检测时间 ), 且对检测温度和检测人员也有一定的要求 6.2 免疫学检测技术随着免疫学检测技术的发展, 针对大肠杆菌也出现了一系列相应的检测方法, 像经典的酶联免疫吸附技术 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 免疫层析技术 量子点免疫荧光技术 其中, 基于抗原抗体特异性结合反应的 ELISA 技术, 通过偶联高效的辣根过氧化物酶, 在有大肠杆菌存在时, 反应生成有颜色的产物, 从而对大肠杆菌进行定性和定量的分析 另外在 ELISA 基础上, 将辣根过氧化物酶替代为核酸链, 搭载成 PCR- ELISA 技术, 可以高灵敏 高特异性的检测 O157 H7 及产 [16] 生 VT 毒素的大肠杆菌 Galikowska 等还利用噬菌体代替抗体, 建立了既简单 快速又经济的新型 ELISA 技术 免疫层析技术仍是依赖于抗原与抗体的相互作

5 208 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2018,Vol.34,No.8 用, 不同的是免疫层析技术是通过毛细管或纸层析作用使抗原或抗体与固定在微孔滤膜载体上抗体或抗原相作用, 再通过信号标记物进行定性检测 免疫层析技术快速简便, 适用于多种微生物检测 信 [17] 号稳定易判断, 但不易于定量分析 Park 等应用该技术对 O157 H7 鼠伤寒沙门氏菌 [18] 金黄色葡萄球菌等致病微生物实现了检测 其中大肠杆菌 O157 H7 的检测范围是 CFU/ [19] ml Cui 等利用免疫磁分离技术结合胶体金免疫层析法快速检测大肠杆菌 O157 H7, 该方法可以特异性检测 10 CFU/g 浓度以上的大肠杆菌 量子点免疫荧光技术, 则是将量子点标记在抗体上, 与目标菌, 夹心相互作用形成荧光复合物, 然后根据荧光强度测定目标菌浓度 该方法标记 [20] 效率高 荧光稳定性好且灵敏度高 Mitchell 等通过免疫磁珠 -DNA- 量子点复合物, 对大肠杆菌 O157 :H7 的 Eae A 基因进行了特异性检测, 由于菌浓度与荧光强度成正比而实现检测, 该方法最低检测限为 [21] mol/ L Sanvicens 等建立了一种基于量子点的荧光抗体阵列检测大肠杆菌, 最低检测限可达 10 CFU/ ml, 这种方法比传统的 ELISA 方法相比, 可将检测限提高 3 个数量级 6.3 基于分子生物学的微生物检测技术聚合酶链反应技术 (Polym erase chain reaction, PCR) 是借助热启动 DNA 聚合酶的作用, 通过变性 - 延伸 - 复性的循环操作, 在体外迅速将 DNA 模板扩增 倍的一种体外扩增技术, 因此可以用来快速检测或鉴定微生物的含量 [22] 传统的 PCR 产物一般通过琼脂糖凝胶电泳的方式进行检测 [23] 后期的发展过程中又发展出一系列通过荧光值对 PCR 产物进行定量的技术, 实时荧光定量 PCR 和免疫 PCR 等 陈苏红和王升启 [24] 等通过设计复合探针建立实时荧光 PCR 可以对 10 CFU/mL 大肠杆菌进行快速准确定量分析 史云 [25] 等建立了一种用于检测肉及肉制品中大肠杆菌的两重 PCR 检测方法 该方法可在 8-17 h 之间, 同时特异性检测大肠杆菌的微绒毛粘连基因 (eae) 和 [26] 菌毛束形成编码基因 (bfp) 朱水荣等将单一 PCR 和多重 PCR 相结合, 对待检菌株的毒力基因进 行检测 这种组合方法相较于血清分型技术, 可以有效确定大肠杆菌致病性 但这种方法需要进行较长的时间的样品纯化处理, 且对操作人员的专业知 [27] 识的要求也较高 郑桂丽等可在 3-4 h 之内, 通过单一 PCR 将特异性序列 rfb 高度扩增, 实现对 60 CFU/g 大肠杆菌 O157 的高灵敏检测 目前, 随着技术的日趋发展, 出现了商业化的致病菌检测 PCR 试剂盒, 使得该技术走出专业的科研实验室, 在普通的实验室中, 也可以完成对大肠杆菌的检测 6.4 新型检测技术 红外光谱技术红外光谱技术 (FTIR) 能够通过反映微生物细胞的分子振动信息特点鉴定微生物的种类及状态, 并且检测过程快速 高效 准确 通过获得微生物的傅里叶变换红外光谱, 解析微生 [28] 物及其生物大分子结构的信息 王建明等利用傅里叶变换近红外技术实现了乳制品微生物的鉴别 [29] 慈云祥等利用红外光谱技术对不同培养时间下的大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 酵母菌及谷氨酸菌进行了测定, 发现培养时间导致的微生物含量不同对 FTIR 图谱没有明显影响, 并且测定出大肠杆菌的特征吸收带为 1080 和 1238 cm -1 [30] Siripatrawan 等则将近红外光谱技术与化学统计学方法结合定性 定量地对大肠杆菌 ATCC25922 及大肠杆菌 K12 两种菌株进行检测 生物传感器技术目前用于微生物快速检测的生物传感器主要有电化学传感器 光学传感器等 [31] Varshney 等构建了一种电阻生物传感器, 这种方法是通过细菌生长会产生电阻从而实现对具有活性的大肠杆菌 O157 H7 的检测 [32] [33] Chang 等构造了一种微流控平台来检测大肠杆菌有无活性, 该方法利用纳米金探针监测细胞的活性, 具有生物活性的细胞得以扩增, 从而实现检测 [34] 此外,Li [35] 等构建出了一种由二茂铁与抗菌肽相组成的薄膜的新型电阻抗传感器, 用于检测大肠杆菌 O157 H7, 其中薄膜上的马加宁抗菌肽为生物识别元件 侧向层析传感器 (Lateral flow sensor,lfs) 是一种基于纸基的光学生物传感器, 通常被胶体金 乳胶 碳 磷 单链核酸等标记来检测菌中核酸或

6 2018,34(8) 汤初美等 : 食源性致病菌安全事故处置与警示 209 者直接检测菌 该技术简单 准确 快速 廉价, 不需要复杂的仪器设备 目前,LFS 被广泛应用于病原菌的快速检测, 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 李斯特菌等都可以用这种试纸条进行快速检测 由上可以看出生物传感器具有敏感性 专一性, 可以进行实时测定, 具有时效性, 可用于测定核酸 酶 抗体 噬菌体甚至整个细胞 基于适配体的分析技术适配体是通过指数富集配体进化技术从体外筛选得到的一类单链寡核苷酸, 适配体因其单链结构和空间结构的多样性特异性与靶分子结合, 且具有高亲和性和特异性 人们利用基于细胞层面的 SELEX 技术发现了一种仅结合于 E. coli O157 H7 血清型菌株细胞表面的一种 RNA 适配体, 可用于大肠杆菌 O157 H7 菌株的 [36] 特异性鉴别 吴文鹤等通过适配体序列进行编辑及酰胺化反应, 将适配体功能化修饰到 PDA 纳米囊泡的表面, 构建一种可以比色适配体生物传感器, 由于快速检测肠致病性大肠埃希菌 该传感器识别元件是适配体, 靶标是脂多糖, 二者特异性合可引起 PDA 纳米囊泡的颜色变化和比色响应值 (CR) 变化, 从而实现检测溶液中的肠致病性大肠埃希菌的定性或定量分析 该生物传感器只需 30 min, 便可检出 10 5 CFU/mL 的大肠埃希菌, 方法的线性检测范围为 CFU/mL ATP 生物发光检测技术 ATP 生物发光技术是一种新型的微生物快速检测方法 由于 ATP 是活细胞中普遍存在的一种能量代谢物, 在生物体内含量是相对稳定的, 因此可以通过检测的 ATP 含量来确定微生物的量 ATP 含量的检测一般是通过荧光光度计法进行测定, 测定原理是在有氧的条件下, 利用虫荧光素酶催化 ATP 形成氧化荧光素发出荧光, 由于荧光是与 ATP 的量成正比例关系, 因此可以定量分析 ATP 的量 在一个生物细胞中, 其 ATP 的数量越多, 发出的荧光就越多, 因此, 可以通过荧光信号强度判定样品被微生物的污染程度 基因芯片技术基因芯片技术是指将设计好的核酸探针或者寡核苷酸片段按照特定的顺序修饰在芯片上, 预先标记荧光的核酸探针通过 PCR 扩增标记到微生物样品的 DNA 上, 然后将 PCR 扩增产物和芯片上的核酸探针点杂交, 洗涤后, 放到荧光 扫描仪检测阵列点上的荧光分布, 最后通过软件分析荧光强度将待检样品的含量分析出来 运用基因芯片技术对食品中的大肠杆菌进行检测, 其灵敏度可达 2 pg 7 食源性致病菌安全事故的溯源方法食品溯源是指从食品生产 加工 配送 销售到食用的全过程中, 实现生产源头和消费终端的双向追踪, 有效监控食品的经营产业链 目前的食品溯源技术主要分为物理方法溯源 化学方法溯源和生物方法溯源 其中, 物理方法包括近红外光谱溯源 物联网及标签溯源等 ; 化学方法包括同位素溯源 矿物元素溯源和有机成分溯源等 ; 生物方法包括 DNA 溯源和虹膜特征技术等 [37] 在食源性疾病爆发案例中, 溯源调查具体指对可能导致该食源性疾病的食物载体进行反向追踪, 确定其分布, 沿着生产链追溯到其来源 下面以 2011 年 5-7 月德国肠出血性大肠杆菌暴发疫情为例, 介绍在该安全事故中运用的溯源调查方法 7.1 针对性拟定溯源调查策略为查明德国暴发疫情和法国聚集病例暴露来源, 欧洲食品安全局 (European food safety authority, EFSA) 开发了相应的数据收集和处理系统, 以回溯和追踪调查可疑的同源暴露芽苗 收集消费终端信息, 了解并记录处理方式和预期用途 ; 反向追溯供销链, 沿商家 企业 供应商环节确定其名称 产品识别号 产品数量及上一步来源 在溯源的过程中, 快速锁定与疫情相关的供应链, 核实可疑芽苗运输路径上与时间表的一致性, 以便获得可靠性较高的原因分析和溯源推测 EFSA 工作小组在德国和欧盟各国按照统一的方法开展溯源调查, 如图 1 所示 7.2 疫情涉及国的平行溯源调查 德国展开的溯源调查根据初步的流行性病学分析发现, 德国下萨克森的一家芽苗生产公司 A 与国内 41 起聚集病例相关, 最有可能是污染了 EHEC O104 H4 芽苗菜的来源 经过 EHEC 小组对该公司的水样 员工和种子的深入调查, 并未发现员工与食物污染的直接联系, 对水样和种子的实验室检验也成阴性 随后,EHEC 小组从 A 公司出发, 回溯芽苗菜种子在此次疫情爆发时段内的全部来源

7 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 210 䘋ਓ୶ ӗ୶/䘋ਓ୶ 䘋ਓ୶ ᓄ୶ ᗧഭ㓿䬰୶ 㤡ഭ ᆀ ᓄ୶/䟽ᯠव㻵 ӗաъ ഭ㓿䬰୶ ഭ12 㚊䳶 2011ᒤ6ᴸ 图1 2018,Vol.34,No.8 ᗧഭ䉶㣭 ӗ୶a ޜ ਨ 䴦 ୶/ 䬰୶/ ୶ 䍩㓸ㄟ 䍩㘵/㓸ㄟ/Ҡ㘵 ᗧഭ41䎧㚊䳶 2011ᒤ4/5ᴸ 德国 EHEC 感染暴发疫情溯源与追踪调查图 和去向 具体到生产链 运输链的每一环节 纵向 相互核实和补充之后 将材料通过 RASFF 递交给 收集产品信息 特征性数据 如名称 批号 收发 EFSA 工作小组 日期等 横向比较原料接收与产出的总量 并调查 7.3 缺失部分 最终将 EHEC O104 H4 的可疑来源范围 同源追踪调查 由于在德国 法国和欧盟其他国家的调查结果 缩小至 A 公司提供的 5 种芽苗种子 苜蓿 葫芦巴 共同显示从埃及进口的批号 的种子极有可能 豆 2 种扁豆 赤豆及萝卜 由于仅有葫芦巴豆种 是本次疫情传播的来源 故对其进行追踪 发现 子为德国和法国聚集病例中共同的可疑食物 故将 德国共有 1 家大型的独立经销商 9 家公司是该批 检测目标锁定为 A 公司售出的葫芦巴豆种子 通过 次产品的配送终点 另外 英国 西班牙和奥地利 获得该葫芦巴豆种子的销售批号 确认有 75 kg 属 各有 1 家公司也是该批种子的配送点 共计 于 2009 年 11 月 24 日德国一进口商从埃及一种子 kg 德国联邦消费者保护和食品安全办公室 The 出口商购进的同批种子 批号 年至 Federal Office for Consumer Protection and Food Safety 2011 年 A 公司又接受了从埃及同一出口商购进的 BVL 对所有可疑批次种子的调查显示 批次 批号为 8266 的 75 kg 种子 葫芦巴豆种子售出至 70 家不同的公司 其中德国有 法国展开的溯源调查 对法国聚集病例的调 查确定了 3 种可能与疫情有关的豆芽种子 作为和 德国进行的调查共同的可疑食源 葫芦巴豆芽成为 54 家 16 家分布在其他 11 个欧洲国家 7.4 芽苗种子的实验室检测 开展溯源调查期间 配合进行可疑批次芽苗种 主要的调查对象 欧盟食品和饲料快速预警系统 子的微生物学分析 由于食品分析的样本量较大 Rapid alert system for food and feed RASFF 通告报 耗时耗力的逐一检测与迅速排查以控制病情的要求 告 于集体活动时主办方自行发制的种子 其英国 产生矛盾 且检测结果在短时间内会受到采样方法 供应商在 2010 年 1 月 13 日从一家德国进口商进口 和检测手段的影响 故本次疫情爆发的实验室检测 并运送至法国 同样来源于 批次 受到限制 成 员 国 和 其 他 国 家 开 展 的 溯 源 调 查 2011 在 2011 年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情 年 约有 t 的葫芦巴豆种子从不同国家进入欧 中 从聚集病例的分析到供销链的回溯 尽管缺乏 盟 因此 除德国 法国以外 包括奥地利等 8 个 可靠的实验室检测信息 但仍然成功将感染源追溯 国家在内的专家 在 EFSA 的协调和 ECDC WHO 至由埃及进口的葫芦巴豆种子 联 合 国 粮 农 组 织 Food and agriculture organization 对于食源性生物菌中毒 最有效的溯源方法通 FAO 的协助下开展溯源调查 各国根据 RASFF 系 常是化学溯源 对可疑致毒物进行微生物学分析 统提供的初始信息 查询配送链上的供应商和产 有利于确定菌种血清类型 为污染的控制与疫情的 品 公司和客户 对包装方式也进行了详实的调查 治疗提供依据 德国肠出血性大肠杆菌感染事故爆

8 2018,34(8) 汤初美等 : 食源性致病菌安全事故处置与警示 211 发突然, 前期缺乏对病原菌的实验室检测信息, 中后期也难以做到证据完备 在保证及时 快速的前提下, 样品采集数量难以做到大量 完整, 但其各部门协调合作, 有序高效地展开工作的解决方法还是值得相关科学管理部门借鉴和学习 8 食源性致病菌与中西方膳食结构的关系食源性致病菌引发的安全事故在人类的工业化历史上是一个遗留问题 中西方工业化进程的差异和饮食习惯的不同使得双方受到食源性致病菌侵害的程度不同, 主要体现在对致病菌的杀灭效果上 西方发达国家的膳食结构多为 三高 型, 即高脂肪 高蛋白 高热量 颇高的蛋白质和脂肪摄入使得西方人的肠道菌群易失调, 增加肠道通透性, 造成全身慢性 低水平炎症, 对胰岛素的信号传导也有一定程度的破坏, 使患糖尿病 肥胖症等代谢综合征的几率升高 西方人食用的食品多为加工 合成类食品, 科学的膳食结构和安全的加工制造条件均有待完善 中国传统饮食特点为低脂肪 低蛋白 高碳水化合物, 辅以蔬菜 水果 ; 烹饪方法有蒸 煮 炖 熬等 [39] 虽然近 10 年来中国的膳食结构发生较大变化, 但长期保留的饮食习惯和多样的烹调方法与西方常见的生食 半生食习惯有明显的不同, 对有害微生物的杀灭作用更加有效 我国也密切监控常食用食物中的致病菌 目前, 我国 6 种质控考核菌株包括大肠埃希菌 单核细胞增生李斯特菌 金黄色葡萄球菌 沙门菌 坂崎肠杆菌 以及蜡样芽胞杆菌 [40] 从结果上来看, 中国的食源性致病菌安全事故发生几率低于西方 [41] 9 食源性致病菌安全事故的防控措施 9.1 防止食源性致病菌污染如前文所述, 在食品的生产 加工 运输等供销链上, 每一个环节都有可能被致病菌污染, 虽很难做到完全杜绝, 但是积极措施的实施也十分必要 例如, 应重点关注肉类 蛋类 奶类和海产品等已成为致病菌寄生体的食品, 加强各个环节的卫生管理 另外, 家畜的粪便也应严格按照规定处理, 防止水体 草场等被污染 9.2 控制食源性致病菌繁殖杀灭食源性致病菌的有效方法之一是破坏最适温度 大多数情况下, 温度在 5-46 时, 适于食源性致病菌的生长和繁殖, 详见表 1 表 1 主要食源性致病菌生长温度范围 食源性致病菌 生长范围 / 沙门氏菌 5-46 大肠杆菌 O157 H 金黄色葡萄球菌 7-50 单增李斯特菌 副溶血性弧菌 5-44 对于大多数常见的食源性致病菌, 对食品进行冷藏能有效控制其中的微生物生长繁殖, 广泛适用于市场上许多食品的保鲜和贮存, 可行性较高 但是, 个别特例如单增李斯特菌, 低温下仍可以繁殖, 需采取其他特殊的预防和监测手段 9.3 健全法律法规, 优化检测系统设置食品安全应急管理制度, 进一步加强食品安全质量, 实施有效的食品质量安全监督措施, 监管部门应该加大监督的执行力和处罚力度, 严格要求经销商遵守 食品卫生法 进行规范的加工制造 同时, 强化对工厂员工食品安全和卫生知识的培训, 定期组织体检, 对预防食源性致病菌污染多管齐下 9.4 养成良好的卫生习惯在消费者中普及食品安全健康教育, 增强其主观能动性和社会责任感 减少生食 生饮, 对于常暴露在空气中的仪器和皮肤应该常用肥皂或酒精清洗 ; 在家庭饮食环境里, 改良不健康的烹饪 储存方式, 矫正不良的饮食习惯, 多对食品流通大的场所如冰箱等消毒, 将生食和原料煮透以达到最大程度杀灭食源性致病菌的效果 9.5 避免交叉污染, 防治疾病扩散发现被污染的食品 确定污染源之后, 应该根据其被污染的实际情况尽快采取最有效的处理措施 或覆盖式消毒或直接销毁, 防止污染范围扩大 污染程度加剧 对于食源性致病菌中毒的患者, 应及时诊断并治疗, 控制疾病的进一步传播 [42]

9 212 生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2018,Vol.34,No.8 10 政府应对措施 10.1 加强国内外各机构组织协作 2011 年德国肠出血性大肠杆菌疫情爆发持续时间长 波及范围广 调查部门涉及医疗机构 各级卫生部门 各级实验室 联邦食品安全部门等 德国政府第一时间聚集各方资源, 同时与欧盟各国和美国疾病预防控制中心等机构协同收集病例 多方积极合作促成了本次调查的有序进行 10.2 信息公开透明德国政府在解决此次疫情爆发情况的过程中, 及时在网站更新疫情信息, 发布公告, 引导公众采取健康保护措施和预防措施 另一方面, 和欧盟与 WHO 信息互换, 使得 WHO 能快速评估公告卫生风险, 告知疫情范围之外的群体, 对当时的人口 贸易出入境进行指导和限制, 最大程度地平息公众的恐慌, 将由此带来的损失降到最低 10.3 实施疫情监测德国从 2001 年起实施防止感染保护法案, 详细规定了从实验室 医疗部门到地方及州卫生部门, 再到 RKI 的各级信息流动传递过程中的时间限制, 这一法案监督着相关负责人的工作效率在 24 h 之内, 卫生部门必须要收到当地实验室和医疗部门的病例报告 地方卫生部门须使用电子化设备记录接收并核实的病例信息, 在第二周的第三个工作日前将符合 RKI 规定的监测病例标准的人员信息通过匿名方式报送到州卫生部门, 经州卫生部门对信息再次核实无误之后, 在接下来的一周内报送到 RKI 10.4 加强症状监测工作在疫情爆发初期, 需要数天甚至长达 16 d 才能将信息从基层部门上报到国家级机构, 严重降低了政府评估疫情的高效性 因此, 德国政府采用信息集中交换, 加快了报送速度 同时, 德国对肠出血性大肠杆菌 O104 H4 感染肠炎有明确的定义和症状标准, 加强了对重症病例的有效监测 [43] 11 食源性致病菌安全事故法案例教学法科普教育中对青年学生的教育不可忽视, 食品安全相关课程也已深入高校 食源性致病菌安全事故不时爆发, 说明公众对其了解不足 预防意识及 措施不够, 因此在全民尤其是大学中开展科普实践的案例教学是必要的 下面以 2011 年德国肠出血性大肠杆菌感染暴发疫情为例, 探讨案例教学方法在教学中的作用, 希望通过全国教学案例的推广, 让更多的学生认识到食源性致病菌是可识 可防 可控 可治 可预警的一类广泛存在的食品安全公共事件, 既不能谈之色变, 又要引起全社会的足够重视 本节内容以德国大肠杆菌事件为例就如何将食品安全案例编撰成教学案例进行举例展示 11.1 案例教学课程目标案例教学准备时, 首先要明确课程目标, 以德国大肠杆菌事件为例, 进行案例教学时的课程的核心目标应是通过介绍德国大肠杆菌事件的发生 发展及调查 处理情况对德国大肠杆菌事件进行重现, 帮助学生掌握食源性致病菌的危害, 及造成食源性致病菌安全事故的关键点, 让学生对食源性疫情爆发的原因及控制措施有基本认识了解, 从而起到情景再现式的科普实践作用 11.2 案例课前准备案例教学的特点是发挥学生的主观能动性, 让授课方式不再是教师一言堂式的填鸭讲授 且案例教学, 多是对案例的情景再现, 提供背景及内容有限, 因此, 需要在案例教学实施前, 让学生提前阅读并了解本案例的相关背景知识, 通过期刊文献 新闻通告, 多方面查阅, 对案例进行较全面的的了解, 积极做好课前准备 本阶段教师应做好学生的引导工作, 以德国大肠杆菌为例, 引导学生做以下工作 资料查阅 : 查阅新闻报道 疾病预防控制中心 食品药品监督管理局的报告 新闻通告等, 了解大肠杆菌污染食品安全事件在全球的发生情况 关于蔬菜特别是有机蔬菜的相关法律法规文件, 查阅 查阅德国肠出血大肠杆菌的其他报道, 对案例进行更全面的了解 另外教师还需要精心以案例为基础, 准备 5-8 个问题清单, 为学生做更进一步的知识准备引导 问题建议包括开放式的 争议式的及知识点式的, 尽量种类丰富 11.3 案例分析要点案例教学过程中, 帮助学生明确案例分析要点是案例教学的重要作用 首先, 需要学生识别的关

10 2018,34(8) 汤初美等 : 食源性致病菌安全事故处置与警示 213 键问题, 如德国大肠杆菌事件中关键问题是如何紧急排查确定大肠杆菌疫源, 如何找到疫情关键形成点控制疫情 其次, 需要帮助学生明确案例调查过程中采用的方法分析, 体现了哪些科学思想, 哪些方法存在一定的局限性, 如果重新调查, 应采用哪些方法, 如何进行调查研究 11.4 案例课堂讨论案例教学中学生的自主学习性, 主要体现充分的课堂讨论上 这可以使得学生在已查阅资料的基础上深入思考, 建议以小组讨论方式为主, 可采用 PPT 展示或者角色扮演的方式, 对事件进行分析或者情景模拟, 组长最后总结发言 ; 各小组确定汇报内容后, 在工作汇报结束后会接受其他组 5-10 min 质询, 并予以解答, 允许以辩论的方式回答 11.5 案例课后拓展案例教学是集中式的知识点学习, 更多的是一种能力及观念的学习 一个案例包括的知识点很多, 为了全面了解一个案例及对课堂授课知识点强化理解, 课后拓展阅读十分重要 案例教学结束后应布置学生课后继续了解其他食源性致病菌安全事故案例, 与本案例进行异同比较, 通过对同类案例的横向对比, 使学生自主优化处理食源性致病菌安全事故的手段和方法, 在历史案例的基础上有所借鉴和创新 参考文献 [1]Cuttance EL. A case definition for Salmonella Brandenburg infection in dairy heifers[j]. N Z Vet J, 2018, 66(1):52. [2]Eaton KA, Fontaine C, Friedman DI, et al. Pathogenesis of colitis in germ-free mice infected with EHEC O157 H7[J]. Vet Pathol, 2017, 54(4): [3]Peacock SJ, Paterson GK. Mechanisms of methicillin resistance in Staphylococcus aureus[j]. Annu Rev Biochem, 2015, 84 : [4]Redfern J, Verran J. Effect of humidity and temperature on the survival of Listeria monocytogenes on surfaces[j]. Lett Appl Microbiol, 2017, 64(4): [5]Lin CS, Lin TS, Yu DY, et al. Identification of Vibrio parahaemolyticus in seafood by multiplex PCR[J]. Journal of Aquatic Food Product Technology, 2016, 25(8): [6] 段梅红. 李斯特菌来袭 [J]. 中国消费者, 2011, 11 :21. [7] 缪国忠. 江阴市 年食物中毒流行病学分析 [J]. 医学动物防制, 2011, 27(3): [8] 任士明. 日本出血性大肠杆菌感染 [J]. 疾病监测杂志, 1996, 11(10): [9] 黄俊, 姜雯, 安文弘, 贾煜. 日本雪印乳业集团食品安全事件及企业社会责任体系重构的追踪研究 [J]. 食品工业科技, 2015, 37(9): [10] 辛暨梅. 以质量监管为基础的企业危机防范 基于 日本雪印牛奶中毒 事件的思考 [J]. 战略决策研究, 2011, 2(4): [11]Tsou TP, Mu JJ, Huang JJ, et al. Review and response of enterohaemorrhagic Escherichia coli infection[j]. Epidemiology Bulletin, 2011, 27(12): [12] 李婵. 人与大肠杆菌 : 两个世纪的孽缘 [J]. 现代养生, 2011 (12): [13] 黄永明. 谜一样的大肠杆菌 [N]. 南方周末, (A03) [14] 刘变芳. 肠出血性大肠杆菌 (EHEC O157 H7)VT2 毒素致病机理研究 [D]. 杨凌 : 西北农林科技大学, [15] 毛祥瑞. 食品中大肠杆菌的检测方法分析 [J]. 食品安全导刊, 2015, 18 :053. [16]Galikowska E, Kunikowska D, Tokarska-Pietrzak E, et al. Specific detection of Salmonella enterica and Escherichia coli strains by using ELISA with bacteriophages as recognition agents[j]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011, 30(9): [17]Park S, Kim H, Paek SH, et al. Enzyme-linked immunostrip biosensor to detect Escherichia coli O157 H7[J]. μltramicroscopy, 2008, 108(10): [18]Park J, Park S, Kim YK. Multiplex detection of pathogens using an immunochromatographic assay strip[j]. BioChip Journal, 2010, 4(4): [19]Cui X, Xiong QR, Xiong YH, et al. Establishing of a method combined immunomagnetic separation with colloidal gold lateral flow assay and its application in rapid detection of Escherichia coli O157 H7[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(12): [20]Mitchell KA, Chua B, Son A. Development of first generation insitu pathogen detection system(gen1-ipds)based on NanoGene assay for near real time E. coli O157 :H7 detection[j].

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