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鼎赖
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1 第 4 卷第 2 期食品安全质量检测学报 Vol. 4 No 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr., 2013 MALDI-TOF-MS 龚艳清, 陈信忠 *, 郭书林, 杨俊萍, 叶妍妍 ( 厦门出入境检验检疫局, 厦门 ) 摘要 : 目的建立快速检测和鉴定副溶血性弧菌的基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 分析方法方法采用副溶血性弧菌标准菌株, 在不同的培养基或不同的培养时间下进行 MALDI-TOF-MS 检测, 同时对长时间冷冻保存的菌株进行检测, 以验证该方法的稳定性和重复性对不同来源的菌株进行检测, 以确认方法的准确性结果用 PW TCBS 琼脂和弧菌显色培养基等 3 种培养基, 分别培养 h 时, 对该菌的蛋白质谱图影响很小 ; 保存 2 年的菌株, 其 MALDI-TOF-MS 鉴定分值保持稳定 ; 对来自不同国家和地区的菌株都可以得到同样准确的结果结论 MALDI-TOF-MS 方法可以快速准确地鉴定副溶血性弧菌因其具有很好的稳定性和重复性, 可用于副溶血性弧菌的日常检测关键词 : MALDI-TOF-MS; 副溶血性弧菌 ; 检测 ; 鉴定 Detection and identification of Vibrio parahaemolyticus by matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry GONG Yan-Qing, CHEN Xin-Zhong *, GUO Shu-Lin, YANG Jun-Ping, YE Yan-Yan (Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen , China) ABSTRACT: Objective To establish a rapid method for the detection and identification of Vibrio parahaemolyticus by matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). Methods In order to verify the stability and repeatability, the reference strain V. parahaemolyticus cultured in different medium or different time and the isolates which had been cryopreserved for a long time were detected by MALDI-TOF-MS. The strains from different sources had also been tested to confirm the accuracy of this method. Results Different medium such as PW, TCBS and Vibrio colored medium and different culturing time interval of 18, 42 or 72 h had little impact for the mass spectrometry of the bacteria. There were no changes for the identification scores of the bacteria which had been preserved for two years using MALDI- TOF-MS. The strains from different countries and regions get the same accurate results. Conclusion MALDI- TOF-MS is a fast and accurate method for the identification of V. parahaemolyticus by MALDI-TOF-MS, and it can be used for routine detection because of its good stability and repeatability. 基金项目 : 国家质量监督检验检疫总局公益项目 ( ) 福建省重点科技项目(2010Y0049) Fund: Supported by General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People s Republic of China ( ) and Livelihood Improvement Key Project of Fujian Province of China (2010Y0049) * 通讯作者 : 陈信忠, 博士, 研究员, 硕士生导师, 主要研究方向为动物传染病学 chenxz@xmciq.gov.cn *Corresponding author: CHEN Xin-Zhong, Professor, Technology Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, No.2165, Hai-cang Jian-gang Road, Xiamen, , P.R.China. chenxz@xmciq.gov.cn

2 522 食品安全质量检测学报第 4 卷 KEY WORDS: matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF- MS); Vibrio parahaemolyticus; detection; identification 1 引言副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus, VP) 广泛存在于近海岸的海水海洋沉积物和鱼类贝类等海洋动物中, 可导致鱼虾蟹以及贝类发病, 是海洋 [1, 动物的主要致病菌之一 2] 该菌在鲜活的海洋水产品中感染率很高, 我国东部沿海贝类的感染率达 43.6%~59.7% [3, 4] 近两年来对福建沿海捕捞的鱼虾蟹等水产品的调查发现, 夏秋季节 VP 的感染率高达 75% 人类因食用被污染的水产品而引起急性食物中毒, 表现为腹痛呕吐腹泻及水样便等症状根据国家食源性疾病监测网数据显示, 近年来由 VP 引起的食物中毒, 其暴发规模呈明显上升趋势, 已经高居细菌性食物中毒的首位 [5], 其危害程度仅次于沙门氏菌大肠杆菌葡萄球菌和肉毒梭菌 [6] 因此, 建立快速准确的 VP 检测方法对防控食物中毒以及水产养殖中的病害防治具有重要意义传统的细菌培养鉴定方法结果准确可靠, 但耗时长, 不适合高通量检测目前自动微生物检测仪常用的细菌鉴定卡是基于细菌的生化反应, 对很多海洋弧菌的鉴定还存在易出现假阳性假阴性和没有结果等方面的不足, 常常无法准确鉴定一些学者应用免疫学方法检测 VP, [7] 如张星等采用自制的高效价和特异性的 VP 单克隆抗体, 结合 ELISA 方法对水产品中的 VP 进行快速检测但总体来说免疫学方法因其特异性和灵敏度高而存在易出现假阳性的不足近年来很多学者应用分子生物学技术取得一定的进展, 应用 PCR 和荧光定量 PCR 方法可以对 VP 进行快速检测, 敏感性高, 特异性强 [8,9] 应用流式液相芯片方法检测食物中毒病例中的 VP, 具有较好的特异性, 灵敏度达 50~100 copies/ml [10] 以细菌表面蛋白为检测对象的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术 (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) 是近年来发展起来的一种全新的微生物检测技术, 因其快速准确等特点, 成为临床诊断环境监测以及食品加工质量控制的重要方法近年来国内外已经有很多学者应用 MALDI- TOF-MS 技术, 分别对阪崎肠杆菌 (Enterobacter sakazakii) 宋内志贺氏菌(Shigella sonnei) 大肠埃希氏菌 (Escherichia coli) 大肠埃希氏菌 O157:H7 沙门氏菌 (Salmonella sp.) 以及单增李斯特菌 (Listeria monocytogenes) 等食品和动物病原菌进行了检测和鉴定, 都得到准确的结果 [11-17] 本研究旨在采用 MALDI-TOF-MS 技术对不同来源的 VP 进行检测和鉴定, 以建立新的 VP 快速检测方法 2 材料与方法 2.1 实验材料标准菌株 : 副溶血性弧菌 ATCC12309 由福建省疾病预防控制中心提供试剂 : 基质为 - 氰基 -4- 羟基肉桂酸 (acyano-4- hydroxycinnamic acid, CHCA)( 美国 Sigma 公司 ); 在多肽标准品管 (Peptide standard) 中加入 500 µl 50% 乙腈 ( 含 0.1% TFA), 配成终浓度为 1 pmol/µl; 在蛋白 I 标准品管 (Protein standard I) 中加入 125 µl 50% 乙腈 ( 含 0.1% TFA), 配成终浓度为 4 pmol/µl 细菌鉴定标准溶液为则取上述两种标准品等体积混匀碱性蛋白胨水 (PW) TCBS 琼脂弧菌显色培养基等细菌培养基 ( 北京陆桥技术有限公司 ) 2.2 仪器 MALDI Biotyper 高通量微生物鉴定系统 ( 德国布鲁克公司 ); 恒温培养箱 ( 美国热电公司 ); 高速离心机 ( 美国贝克曼库尔特公司 ) 2.3 实验方法菌株的复苏标准菌株 VP 用碱性蛋白胨水, 37 培养 18~24 h 复苏后, 接种于 TCBS 平板上, 37 再培养 18~24 h, 挑取圆形半透明表面光滑的绿色菌落进行 MALDI-TOF-MS 检测细菌的洗涤挑取单个菌落于 1.5 ml 的离心管中, 加入 1 ml 生理盐水稀释并充分混匀或取 1 ml 细菌培养液于 1.5 ml 的离心管中 r/min 离心 2 min, 弃上清, 加入 1 ml 灭菌生理盐水, 充分混匀 r/min 再离心 2 min, 弃上清, 重复洗涤一次

第 2 期龚艳清, 等 : MALDI-TOF-MS 方法检测鉴定副溶血性弧菌 523 2.3.3 细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入 300 µl 纯净水, 混匀后加入 900 µl 无水乙醇, 混匀, 室温固定 3~4 min, 10000 r/min 离心 2 min, 弃上清 2.3.4 点靶向沉淀中加入 50 µl 70% 甲酸, 混匀后再加入 50 µl 乙腈, 混匀室温放置 3~4 min, 10000 r/min 高速离心 2 min, 吸取上清点靶先点 1 µl 上清于样品靶盘上, 同时点 1 µl 标准溶液 ( 校准 ), 待液体干后立即点 1 µl 基质溶剂 2.

3 第 2 期龚艳清, 等 : MALDI-TOF-MS 方法检测鉴定副溶血性弧菌细菌的固定灭活将清洗干净的细菌加入 300 µl 纯净水, 混匀后加入 900 µl 无水乙醇, 混匀, 室温固定 3~4 min, r/min 离心 2 min, 弃上清点靶向沉淀中加入 50 µl 70% 甲酸, 混匀后再加入 50 µl 乙腈, 混匀室温放置 3~4 min, r/min 高速离心 2 min, 吸取上清点靶先点 1 µl 上清于样品靶盘上, 同时点 1 µl 标准溶液 ( 校准 ), 待液体干后立即点 1 µl 基质溶剂质谱图的采集和分析用 MALDI Biotyper 仪器进行检测, 用标准品对仪器进行校准后, 采集样品质谱图应用 BioTyper 软件对质谱图进行分析和鉴定 2.4 样品的测定国内分离 VP 菌株的鉴定 VP 菌株主要来自福建海南等地海水养殖鱼类及其他水产品中分离的致病性菌株, 以及福建省疾病预防控制中心从食品和食物中毒病例分离的菌株细菌的分离和鉴定按 GB/T 食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验方法进行这些菌株复活后按 2.3 节进行实验国外进口水产品分离 VP 菌株的鉴定实验样本主要为菲律宾越南印度尼西亚马来西亚以及我国台湾进境的螃蟹龙虾玫瑰毒鲉 (Synanceia verrucosa) 四丝马鲅(Eleutheronema tetradactylum) 鳗鱼等细菌的分离和鉴定方法同国内菌株鉴定方法 3 结果与讨论 3.1 标准菌株检测结果 MALDI-TOF-MS 鉴定细菌的判断标准用鉴定分值表示, 分值愈高, 说明待测菌株的谱图同质谱库中某一标准菌株的谱图愈相近分值在 2.300~3.000 之间, 可完全确认菌株鉴定结果 ; 分值在 2.000~2.299 之间, 可基本确认菌株鉴定结果 ; 分值在 1.700~1.999 之间, 该菌株鉴定为不确定结果 ; 分值在 0.000~1.699 之间, 可判断不是该种细菌本实验所用 VP 标准菌株 ATCC12309 的蛋白指纹图谱和鉴定分值见图 1 该菌与 Biotyper 数据库中最匹配的菌株 V. parahaemolyticus 4a ISB 的鉴定分值达 2.458, 与菌株 V. parahaemolyticus CCM5937 的鉴定分值也达 2.349, 而与菌株 V. parahaemolyticus 7a ISB 的鉴定分值只有说明不同来源的同一种细菌蛋白质谱图存在一定的差异, 鉴定分值也有所不同 3.2 重现性按照 2.3 节所述方法, 重复测定 10 次, 用 MALDI-TOF-MS 技术检测同一个菌株, 其质谱图变化很小, 表现出很好的重复性与 Biotyper 数据库中的菌株 V. parahaemolyticus 4a ISB 的鉴定分值分别为和 2.421, 鉴定分值也很接近, 说明 MALDI-TOF-MS 鉴定 VP 具有很好的重现性 Fig.1 图 1 标准菌株 (ATCC12309) 质谱图及鉴定结果 Mass spectrum and identification results of standard strain (ATCC12309)

4 524 食品安全质量检测学报第 4 卷 3.3 不同培养基培养的 VP 检测结果将标准菌株分别接种于 PW TCBS 琼脂弧菌显色培养基中, 37 培养 18~24 h 后进行检测, 比较不同培养基对检测结果的影响结果表明, PW TCBS 琼脂和弧菌显色培养基 3 种培养基培养的 VP 经 MALDI-TOF-MS 检测得到的鉴定结果与 V. parahaemolyticus 4a ISB 的鉴定分值分别为和 2.394, 表明 3 种培养基培养的细菌均能得到良好的匹配分值, 比较其蛋白质指纹图谱没有明显的差异 ( 图 2), 说明这些细菌在不同的培养基中培养, 其蛋白组成没有明显改变, 用 MALDI-TOF-MS 检测具有良好的稳定性用 PW 培养的细菌不仅样品处理比较简单, 而且得到的质谱图与数据库中的相应参考菌株匹配效果最好 3.4 培养不同时间的 VP 检测结果将标准菌株于 PW 37 培养, 分别在 18 h 42 h 和 72 h 对菌株进行 MALDI-TOF-MS 检测和鉴定, 比较培养时间对 VP 蛋白质谱图的影响培养 h 时 VP 检测得到的鉴定结果与 V. parahaemolyticus 4a ISB 的匹配分值分别为和表明不同生长阶段的 VP 用于 MALDI-TOF- MS 检测得到的蛋白质谱图基本保持不变, 可以得到准确的鉴定结果并且至少 72 h 内, 其蛋白质谱图没有明显的变化 ( 图 3) 说明这些细菌在不同的生长阶段, 其蛋白质组成十分稳定, 适合用 MALDI-TOF- MS 检测图 2 不同培养基培养的副溶血性弧菌鉴定质谱图 Fig. 2 Mass spectrum of V. parahaemolyticus strains in different culture medium 图 3 不同培养时间培养的副溶血性弧菌鉴定质谱图 Fig.3 Mass spectrum of V. parahaemolyticus strains cultured during different time 3.5 不同保存时间的副溶血性弧菌质谱检测结果将 VP 菌株保存在 70 50% 甘油肉汤中, 分别保存和 24 个月取出, 用 PW 37 培养 18~24 h, 进行 MALDI-TOF-MS 检测和鉴定, 考察保存时间对 VP 蛋白质谱图的影响经过和 24 个月保存的 VP, 进行 MALDI-TOF-MS 检测得到的鉴定结果与 V. parahaemolyticus 4a ISB 的匹配分值分别为和 2.427, 表明经过长时间保存的 VP, 其蛋白质组成没有发生明显改变, 用 MALDI- TOF-MS 检测都可以得到准确结果, 其蛋白质指纹图谱见图不同来源的 VP 菌株鉴定结果 133 株不同来源的 VP 菌株的 MALDI-TOF-MS 鉴定结果, 与数据库中 VP 的匹配分值均大于 2.0, 都可以进行准确的判定其中国内分离菌株 72 株, 15 株菌株的鉴定分值 2.4, 52 株菌株的鉴定分值在 2.3~2.4 之间, 3 株菌株的鉴定分值在 2.0~2.3 之间 ; 从国外进口水生动物分离的菌株为 61 株, 25 株菌株

5 第 2 期龚艳清, 等 : MALDI-TOF-MS 方法检测鉴定副溶血性弧菌 525 的鉴定分值 2.4, 34 株菌株的鉴定分值在 2.3~2.4 之间, 2 株菌株的鉴定分值在 2.0~2.3 之间分别对分离自印尼的玫瑰毒鲉菲律宾的螃蟹越南的日本鳗 (Anguilla japonica) 中国台湾的四丝马鲅以及中国大陆的花蛤 (Ruditapes philippinarum) 的 VP 菌株的蛋白质指纹图谱进行比较, 结果如图 5 所示, 表明不同国家或地区的 VP 其蛋白质指纹图谱存在一定的差异, 表现为鉴定分值存在细小的差别可能因为不同来源的 VP 存在一定的地域差异或寄主差异, 或者存在不同的血清型, 但体现在蛋白质组成方面, 差异很小因此, 采用 MALDI-TOF-MS 鉴定不同来源的 VP 菌株均能得到良好的鉴定结果图 4 不同保存时间的副溶血性弧菌鉴定质谱图 Fig.4 Mass spectrum of V. parahaemolyticus strains preserved during different time 图 5 不同国家和地区分离的副溶血性弧菌质谱图 Fig.5 Mass spectrum of V. parahaemolyticus strains from different countries and regions 4 讨论 VP 为多血清型细菌, 该菌可感染多种海洋动物, 因此, 不同来源的 VP 不仅可能存在一定的地域差异, 而且还可能存在宿主差异, 其蛋白组成也存在一定的差异, 表现在蛋白质谱指纹图谱上, 也有一定的差异, 但通过对国内外 133 株不同来源的 VP 鉴定, 结果表明应用 MALDI-TOF-MS 技术都可以得到准确的鉴定结果影响 MALDI-TOF-MS 鉴定结果的主要因素包括

6 526 食品安全质量检测学报第 4 卷基质培养条件样品的处理方式以及数据库资源的更新和补充等 [18] MALDI-TOF-MS 鉴定获得的质谱图需要与数据库中已有的资料进行比对, 找到最匹配的质谱图, 然后才能给出鉴定结果因此, 充足的数据库资源是保证鉴定结果真实可靠的前提但目前各种质谱仪所提供的数据库资源都有一定的局限性本实验应用的 MALDI Biotyper 数据库中还没有霍乱弧菌和志贺氏菌等常见病原菌的资料只有通过已知标准菌株补充数据库, 尤其是补充本地分离并经过鉴定确认的菌株的图谱, 才能使 MALDI-TOF-MS 技术的鉴定结果更加准确本实验结果表明 MALDI-TOF-MS 方法检测和鉴定 VP 具有很好的重复性和稳定性, 可以快速准确地鉴定不同来源的 VP 该技术比传统的生化鉴定方法更加准确快速, 而且可以进行高通量检测, 可同时检测 95 个样品因此, 该技术可用于 VP 的日常检测和鉴定参考文献 [1] 阎斌伦, 秦国民, 暴增海, 等. 三疣梭子蟹病原副溶血弧菌的分离与鉴定 [J]. 海洋通报, 2010, 29(5): Yan BL, Qin GM, Bao ZH, et al. Isolation and identification of Vibrio parahaemolyticus from diseased Portunus trituberculatus L [J]. Mar Sci Bull, 2010, 29(5): [2] 李毅财, 赵峰, 朱兰兰, 等. 黄渤海区域贝类中副溶血弧菌污染调查及血清学分型 [J]. 南方农业学报, 2012, 43(2): LI YC, Zhao F, Zhu LL, et al. Investigations on contamination and serotype of Vibrio parahaemolyticus in shellfish obtained from Yellow Sea and Bohai Sea areas [J]. J Southern Agr, 2012, 43(2): [3] 赵峰, 周德庆, 于维森, 等. 东部沿海贝类中副溶血弧菌的分布及特征 [J]. 食品与生物技术学报, 2011, 30(3): Zhao F, Zhou DQ, Yu WS, et al. Distribution and Characterization of Vibrio parahaemolyticus in Shellfish from Eastern Coast of China [J]. J Food Sci Biotechnol, 2011, 30(3): [4] 梅玲玲, 潘雪霞, 朱敏, 等. 浙江省副溶血性弧菌污染水平及贝类海产品风险评估 [J]. 中国人兽共患病学报, 2012, 28 (7): , 717. Mei LL, Pan XX, Zhu M, et al. Contamination of Vibrio parahaemol yticus in Zhejiang Province and its risk assessment in shellfish [J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28 (7): , 717. [5] 刘秀梅. 食源性疾病监控技术的研究 [J]. 中国食品卫生杂志, 2004, 16(1): 3-9. Liu XM. Studies on the techniques for the monitoring and controlling foodborne illnes [J]. Chin J Food Hyg, 2004, 16(1): 3-9. [6] 马光刚, 郭福生, 王娟, 等. 海产品中 VP 的分离和鉴定 [J]. 中国动物检疫, 2002, 19(9): Ma GG, Guo FS, Wang J, et al. Isolation and identification of Vibrio parahaemolyticus from marine product [J]. China J Anim Quarantine, 2002, 19(9): [7] 张星, 赵锋, 金晓航, 等. 副溶血弧菌单克隆抗体的制备和鉴定 [J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2011, 27(11): Zhang X, Zhao Feng, Wang Xiaohang, et al. Preparation and identification of monoclonal antibodies against Vibrio parahaemolyticus [J]. J Cell Mol Immunol, 2011, 27(11): [8] 李正义, 贾俊涛, 梁成珠, 等. 基因扩增技术对水产品中副溶血弧菌的分离鉴定 [J]. 海洋科学进展, 2011, 29: Lin Q, Li NQ, Fu XZ, et al. Development and application of a real-time PCR assay for detection of Vibrio parahaemolyticuss in oyster [J]. J Fish Sci China, 2011, 29: [9] 林强, 李宁求, 付小哲, 等. 牡蛎中副溶血弧菌荧光定量 PCR 检测方法的建立及其应用 [J]. 中国水产科学, 2011, 18(1): Lin Q, Li NQ, Fu XZ, et al. Development and application of a real-time PCR assay for detection of Vibrio parahaemolyticuss in oyster [J]. J Fish Sci China, 2011, 18(1): [10] 邱杨, 肖性龙, 吴晖, 等. 五种致病菌流式液相芯片检测方法的建立 [J]. 现代食品科技, 2010, 26(8): , 909. Qiu Y, Xiao XL, Wu H, et al.development of A Suspension Array Method for Detection of Five Pathogen [J]. Mod Food Sci Technol, 2010, 26(8): , 909. [11] 杨捷琳, 魏黎明, 顾鸣. 阪崎肠杆菌蛋白质组学研究及特征蛋白的质谱分析 [J]. 复旦学报, 2008, 47(5): 620. Yang JL, Wei LM, Gu M. Two-dimensional Electrophoresis and MALDI-TOF/MS Analysis for Enterobacter sakazakii Specific Protein [J]. J Fudan Univ(Natural Science), 2008, 47(5): 620. [12] 鲍春梅, 崔恩博, 陈鹏, 等. MALDI-TOF-MS 鉴定宋内志贺菌的初步应用研究 [J]. 传染病信息, 2012, 25(1): Bao CM, Cui EB, Chen P, et al. Preliminary study on Application of MALDI-TOF-MS identification of Shigella sonnei [J]. Infect Dis Inform, 2012, 25(1): [13] 王晔茹, 崔生辉, 李凤琴. 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在沙门菌检测和鉴定分型中的应用研究 [J]. 卫生研究, 2008, 37(6): Wang YR, Cui SH, Li FQ, et al. Study on detection and identification of Salmonella species by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry [J]. Health Res, 2008, 37(6): [14] Johanna EC, Faith AH.Discrimination between wild type and

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福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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