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1 分析检测食品科学 0, Vol., No.0 REP-PCR 及 ERIC-PCR 法对分离自海产品副溶血性弧菌分型分析, 马月姣, 孙晓红 *, 赵勇, 卢瑛, 吴启华, 潘迎捷 (. 上海海洋大学食品学院, 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心, 上海 00;. 缅因大学食品科学与人类营养系, 美国欧洛诺 0) 摘要 : 目的 : 采用细菌基因外重复回文序列扩增 (REP-PCR) 和肠道细菌基因间重复序列扩增 (ERIC-PCR) 两种方法对副溶血性弧菌 株标准株, 株实验室保存菌株和 株分离菌株共 株进行分子分型 方法 : 通过 REP 和 ERIC- PCR 指纹图谱扩增, 利用 NTsys-pc 软件采用 Dice 系数对指纹图谱进行聚类结果分析 结果 : 所有供试菌株可通过此两种方法进行分型得到清晰的指纹图谱, 并反映出副溶血性弧菌具有丰富的遗传多样性,REP-PCR 扩增出 ~ 条分布在 0~00bp 之间的条带, 可将副溶血性弧菌分为 个群 类型, 分辨指数达 0., 其中 tdh + 株在相似系数 0. 时可聚类在第 Ⅰ 群 ;ERIC-PCR 扩增出 ~ 条分布在 00~bp 之间的条带, 将副溶血性弧菌分为 个群 个类型, 分辨指数为 0., 其中 tdh + 株在相似系数 0. 时可聚类在第 Ⅰ 群 结论 : 两种方法均显现出很好的分型能力, 能够很好地将环境分离 tdh + 菌株和标准菌株聚类在一起, 其中 REP-PCR 较 ERIC-PCR 重复性更好 关键词 : 副溶血性弧菌 ;tdh; 肠内细菌基因组间重复序列分析 ; 细菌基因外重复回文序列扩增 ; 分型 REP-PCR and ERIC-PCR Analysis for the Typing of Vibrio parahaemolyticus Isolated from Sea Products Marketed in Shanghai MA Yue-jiao,SUN Xiao-hong, *,ZHAO Yong,LU Ying,Vivian Chi-Hua WU,PAN Ying-jie (. Aquatic Products Processing and Storage Engineering Technology Research Center in Shanghai, College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 00, China;. Department of Food Science and Human Nutrition, the University of Maine, Orono 0, USA) Abstract:Objective: The enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-polymerase chain reaction (ERIC-PCR) and repetitive extragenic palindromic element-polymerase chain reaction (REP-PCR) were used to analyze the types of Vibrio parahaemolyticus including standard strains, laboratory strains and isolated strains. Methods: REP and ERIC primers were used to amplify the repeated sequences. NTsys-pc software was used to calculate the discriminative index of REP- and ERIC-PCR with Dice coefficients. Results: All tested V. parahamolyticus could be typed by REP- and ERIC- PCR clearly and revealed abundant genetic diversity in V. parahamolyticus. According to the results of REP-PCR-amplified bands within 0 00 bp, V. parahamolyticus was typed into groups and types with discrimination index of 0., and the tdh + strains with resolving index of 0. could be classified in Group I. According to ERIC-PCR-amplified bands within 00 bp, V. parahamolyticus was typed into groups and types with discrimination index of 0., and the tdh + strains with discrimination index of 0. could be classified in group I. Conclusion: The isolated tdh + strains are clustered together with standard strains using the two methods. Although both methods exhibit good typing capability, REP- PCR is more repeatable and stable than ERIC-PCR. Key words:vibrio parahaemolyticus;tdh;enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-polymerase chain reaction (ERIC-PCR);repetitive extragenic palindromic-polymerase chain reaction (REP-PCR);typingg 中图分类号 :TS0. 文献标志码 :A 文章编号 :00-0(0)0-0-0 doi:0.0/spkx 收稿日期 :0-0-0 基金项目 : 霍英东教育基金会第十一届高等院校优选课题 (0); 上海市科学技术委员会部分地方院校能力建设项目 (0000); 上海市教育委员会重点学科建设项目 (J00) 作者简介 : 马月姣 ( ), 女, 硕士, 研究方向为食品微生物安全检测 * 通信作者 : 孙晓红 ( ), 女, 副教授, 博士, 研究方向为食品安全和食品微生物检测

2 0, Vol., No.0 食品科学 分析检测 副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 是一种革兰氏阴性嗜盐细菌, 广泛分布于近海岸的海水, 海底泥沙, 浮游生物和鱼 虾 贝类等海产品中, 是引起食源性疾病的重要病原之一 [], 尤其在夏秋季节的沿海地区常常引起暴发性食物中毒事件 [] 0 年副溶血性弧菌首次于日本一起食物中毒事件的食物中分离得到 [], 年出现 O:K 大流行菌群 [], 年由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件已超过沙门氏菌引起中毒事件 [], 副溶血性弧菌成为主要的食源性致病菌 快速 准确地对副溶血性弧菌进行细致分型及比较菌株间亲缘关系, 对副溶血性弧菌流行病学调查 预防和控制具有重要意义 传统上采用以表型特征为特点的生化鉴定和血清型分析方法对副溶血性弧菌进行分类 鉴定研究, 但表型易因环境的变化而发生变异 [], 给菌株鉴定带来困难, 血清分型对不同来源的菌鉴别能力有限, 且这两种检测方法操作复杂 耗时长 从基因水平进行分型可从根本上区分菌株的差异, 且结果比传统的方法更具可信性 [] 基于聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction,pcr) 技术的快速扩增方法 (rapid PCR) 包括随机扩增多态性 DNA 分析 (random amplified polymorphic DNA,RAPD) 或随机引物 PCR (arbitrarily primed-pcr,ap-pcr) 肠内细菌基因组间重复序列分析 (enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-pcr,eric-pcr) 和细菌基因外重复回文序列扩增 (repetitive extragenic palindromic-pcr,rep-pcr) 等较多用于微生物的鉴定 分类和分型研究 [], 由于 ERIC- PCR REP-PCR 扩增引物较长 ( 个寡聚核苷酸 ), 因此相对于 RAPD( 引物为 0 个寡聚核苷酸 ) 可产生较高重复性和一定特异性的 DNA 指纹图谱 [] 其中 REP 家族由长 bp 序列构成, 含有 个保守位点 ;ERIC 是广泛存在于肠道细菌中的重复序列, 长约 ~bp, 其中心存在高度保守长约 0bp 的核心序列 [0], 两个重复序列在肠道细菌基因组中存在着属 种 菌株水平上的分布和拷贝数量的差异 [], 这些重复序列本身在进化过程中具有较强的保守性, 且由于此两种方法具有快速 简单 分辨率高和使用设备简单等优点, 已经广泛用于病原菌的分型中 [] 因此本实验采用 REP-PCR 和 ERIC-PCR 两种分型方法鉴定上海市水产品分离副溶血性弧菌菌株的聚类特点及 tdh + 株与 tdh - 株的关系, 旨在为副溶血性弧菌的分类及其疾病监控方面的研究提供数据基础 材料与方法. 材料与试剂供试菌株 : 株副溶血性弧菌, 其中 株标准株 ATCC( 编号,tdh +, 下同 ) ATCC(,tdh + ) 中 国科学院微生物研究所 ; 株实验室保存菌株 (~, 和 为 tdh + ) 于 00 年海产品中分离得到 ; 株分离菌株 (~, 其中 为 tdh + ) 于 0 年海产品中分离得到 培养基 :TSB 培养基 ( 含 % NaCl) TSA 培养基 ( 含 % NaCl) TCBS 培养基 弧菌显色培养基北京路桥技术有限公司 ;DNA 提取试剂盒 DNA iso Reagent PCR 扩增体系 Agarose D- LE 琼脂糖凝胶粉宝生物工程 ( 大连 ) 公司 ;kb-plus DNA Maker 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 REP-PCR 及 ERIC-PC 扩增引物 [] : REP: -IIIICGICGICATCIGGC- REP: - ICGICTTATCIGGCCTAC- (I 为次黄嘌呤 ) Eric: -ATGTAAGCTCCTGGGATTCAC- Eric: -AAGTAAGTGACTGGGGT GAGCG- 上海生工生物工程有限公司. 仪器与设备 Mastercycler epgradient S PCR 仪德国 Eppendorf 公司 ; 凝胶电泳仪 凝胶自动成像系统美国 Bio-Rad 公司 ;Nanodrop 000 微量分光光度计美国 Thermo 公司. 方法.. DNA 的提取取经活化纯化后过夜培养的副溶血性弧菌菌液, 按照微生物 DNA 提取试剂盒说明提取副溶血性弧菌基因组 DNA.. DNA 的质量检测及质量浓度测定测定所提取的副溶血性弧菌基因组 DNA 在 0nm 和 0nm 波长处的吸光度及其比值, 同时测定 DNA 质量浓度.. REP-PCR 体系.μL 0 PCR 缓冲液 ( 含 Mg + ) μl dntp, 引物 (0μmol/L) 各 μl 0.μL Taq 酶 (U/μL) 0ng DNA 模板, 以灭菌双蒸水补齐 μl PCR 扩增条件 : 预变性 min 0 变性 0s 0 退火 min 延伸 min 总延伸 min,0 个循环,0 保存 使用.% 的琼脂糖凝胶进行电泳, 缓冲液为 TAE,0V 恒压电泳, 电泳约 0min 后使用溴化乙锭染色 min 后进行成像观察并保存.. ERIC-PCR 体系.μL 的 0 PCR 缓冲液 μl dntp 引物(0μmol/L) 各 μl 0.μL Taq 酶 (U/μL) 0ng DNA 模板, 用经灭菌的去双蒸水补齐 μl PCR 扩增条件 : 预变性 min 变性 min 退火 min 剩余操作同.. 节 0 退火 min 之后操作.. 重复性及稳定性实验在相同试剂 仪器及操作条件下随机抽取 0 个样品重复 次, 以验证 REP-PCR 和 ERIC-PCR 扩增的可重复性及稳定性

3 .. 0, Vol., No.0 食品科学 分析检测 数据处理 取μL的扩增产物 利用琼脂糖凝胶电泳检测其基因 图谱条带 以分子质量大小相同的条带作为相同性状 阳性结果记为 阴性结果记为0 使用Gel-pro.软件分 析 条带强弱统一定义为. 将输出的结果以Dice为系 数采用非加权平均法(UPGMA)利用SLT-NTsys-.0e软件 进行聚类分析 和00bp这条条带 通过NTSYS-pc软件 根据非加权 平均法(UPGMA)计算得到聚类树状图(图)分析指纹图 谱 聚类图结果显示株副溶血性弧菌在相似指数为0.0 处分为个群个类型(表) 区分指数达0. 其中遗传 多样性优势群I占菌株数量的.%(/) 可细分为个 类型 株tdh+株于相似系数为0.时即可聚类在第I群的 类型中 表 Table 结果与分析. 群 类 DNA质量及定量 通过测定 基因组DNA在0nm和0nm波长处的吸 光度的比值介于. 之间 DNA纯度达到要求 将DNA 质量浓度统一调整至0ng/μL 方便PCR体系加样操作. REP-PCR扩增结果 M bp 00bp 00bp 000bp 00bp 000bp 0 I II III IV V. 副溶血性弧菌REP-PCR分型分布情况 REP-PCR type distribution of Vibrio parahaemolyticus 菌株 比例/% ERIC-PCR扩增结果 0bp 00bp M 0 0 图 Fig. bp 000bp 副溶血性弧菌REP-PCR结果图 00bp bp 000bp REP-PCR fingerprint of Vibrio parahaemolyticus bp 000bp 00bp 图 Fig. 副溶血性弧菌ERIC-PCR结果图 ERIC-PCR figureprint of Vibrio parahaemolyticus ĉ ĉ Ċ ċ Č č 䎱 图 Fig. Ċ 副溶血性弧菌REP-PCR聚类图 Cluster analysis based on REP-PCR fingerprint of Vibrio parahaemolyticus REP-PCR的扩增图谱结果显示 株副溶血性弧菌 基因组DNA通过REP-PCR扩增 供试菌株能扩增出 扩增出0bp大小的条带 0%以上均携带00 00bp 䎱 条大小在0 00bp之间的条带呈现不同程度的基因多 态性(部分菌株指纹图谱扩增结果见图) 指纹图谱中都 0. 0 图 Fig. 副溶血性弧菌ERIC-PCR聚类图 Cluster analysis based on ERIC-PCR fingerprint of Vibrio parahaemolyticus ċ Č č Ď ď

4 0, Vol., No.0 表 Table 群 I II III 类 食品科学 分析检测 凝胶电泳[-] 但就设备要求简单 操作简单快速方面和 副溶血性弧菌ERIC-PCR分型分布情况 ERIC-PCR type distribution of Vibrio parahaemolyticus 广泛实用性是脉冲场凝胶电泳无法相比的 本实验结果 比例/% 菌株 行多次重复实验进行分析来提高分辨率 这样一来则不 0 0. 适合大量菌株的分类分析 因此REP-PCR用来对环境分 离大量副溶血性弧菌进行分型更为可靠实用 0.. 表明ERIC-PCR可重复性相对REP-PCR较差 即同一株菌 指纹图谱前后可能不一致而造成分型误差 因此需要进 本实验还发现REP-PCR和ERIC-PCR两种方法分别.. 在相似系数0.和0.处均可将株均为分离的tdh +菌株 IV 0 0 V. VI VII 0.. 对株副溶血性弧菌进行ERIC-PCR扩增 供试菌 和株标准菌株聚类到同一个群中 显示了很好的聚类能 力 而在此之前的研究中 Zhao Feng等[]从个贝类样 品中分离得到的株副溶血性弧菌中株为tdh+菌株 通 过RAPD分型发现此株tdh+菌株与株临床分离菌株中的 株即编号为.和.显示出一致的RAPD基因谱图 株能扩增出 条大小在00 bp之间的条带(部分 而聚类在同一群中 Hara-Kudo等[]在对日本海域和海产 菌株指纹图谱扩增结果见图) 指纹图谱中都可扩增出 品中副溶血性弧菌的调查过程中 通过AP-PCR即RAPD bp和bp大小的条带 0%以上菌株携带 分型同样发现株tdh +菌株与大流行克隆菌株显示了一 00bp大小条带 通过聚类分析结果显示在相似系数为 0.0处分为个群个类型(表) 其鉴别指数为0. 其 致的基因谱图 且发现血清型同为O:K的tdh - 菌株与 tdh+菌株通过分型聚类分析 结果显示其亲缘关系仍比较 中遗传多样性优势群II占.%(/) 株tdh+株在相似 远 Yang Zhenquan等[]同样在研究中发现通过RAPD分 系数0.时可聚类在第I群的 类型中 同REP-PCR分 型 株tdh+分离菌株中除一株编号为JRZCX0外 其他 株在遗传水平上与临床分离tdh+菌株高度相似 同时株 型相比鉴别指数类似 但重复实验结果表明ERIC-PCR其 重复性较REP-PCR差 trh+分离株基因谱图与临床分离菌株atcc0基因图谱 一致即聚类在一起 以上研究均是以RAPD技术进行分型 结论与讨论 传统微生物分类一般采用以表型特征为特点的生化 鉴定和血清分型方法 表型易受环境变化的影响发生变 异[] 给菌株鉴定带来困难 随着分子分型技术的发展 传统方法的不足得到弥补 且分子分型技术操作简单快 捷 区分指数较高 本实验采用ERIC-PCR和REP-PCR两种方法对上海 聚类 存在个别或一些菌株未能很好的聚类 说明RAPD 分型方法对tdh+ tdh-菌株的分型聚类存在不足 而本实 验所采用的REP-PCR和ERIC-PCR分型方法则将株分离 的tdh+菌株与标准菌株很好的聚类在同一个群里 进一步 证明REP-PCR和ERIC-PCR方法较RAPD方法具有可靠性 和更好的分型能力 这可以为大量环境分离副溶血性弧 菌的致病株检测 调查和追踪提供有利的基础依据 也 可为副溶血性弧菌的流行病学研究提供相关资料 总之 REP-PCR和ERIC-PCR两种方法具有有效性 市海产品分离副溶血性弧菌分型均可得到清晰的基因指 纹图谱 在一定范围内 DNA 条带的大小和多少代表着 此重复序列间的距离和重复次数 株副溶血性弧菌的 REP-PCR指纹图谱中都扩增出0bp大小的条带 0%以 上均携带00 00bp和00bp这条条带 ERIC-PCR 指纹图谱中都可扩增出 bp和bp大小的条 带 0%以上菌株携带00bp大小条带 这些普遍扩增 出的条带所携带的信息与副溶血性弧菌的种属特性关系 操作简易性 快速性和结果的可靠性 均可扩增出清晰 的多态性条带 可对副溶血性弧菌进行分类分析 [0-] 两种方法均在较高的辨别指数下对环境分离tdh+副溶血性 弧菌进行快速分型聚类研究[-] 且对发现新的菌株及对 已知菌株作进一步的分析有很重要的现实意义 能成为 副溶血性弧菌鉴别和分类的分子遗传分析的有力工具 参考文献 值得进一步分析 聚类结果显示 ERIC-PCR 的区分指数为 0. 与 Bhowmick等 []的研究结果一致 REP-PCR区分指数为 0. 二者辨别指数基本相当 这与Maluping等[]报道的 对菲律宾副溶血弧菌分离株的分型结果类似 另有研究 指出此两种快速PCR扩增方法的区分指数仅次于脉冲场 [] [] [] 赵富喜, 姜国枢. 医学微生物学[M]. 上海: 上海医科大学出版社, 000:. 周庭银, 赵虎, 马于行. 秋季腹泻中弧菌属及气单胞菌属的分离与 鉴定[J]. 中国医学检验杂志,, (): -. HONDA T, IIDA T. The pathogenicity of Vibrio parahaemolyticus and the role of the thermostable direct haemolysin and related haemolysins[j]. Rev Med Microbiol,, (): 0-.

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