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1 第 29 卷 第 11 期 年 1 1 月 材料研究学报 CHINESE JOURNAL OF MATERIALS RESEARCH Vol. 29 No. 11 November 掺镁羟基磷灰石涂层在碳 / 碳复合材料表面的制备 * 1, 2, 3 倪昕晔 1 李爱军 1 白瑞成 3 熊信柏 2 周栋 1. 上海大学材料科学与工程学院上海 南京医科大学附属常州第二人民医院常州 深圳大学材料学院深圳 摘要用电磁感应法在碳 / 碳复合材料表面制备与人骨镁含量相当的羟基磷灰石涂层, 镁占涂层的重量百分含量分别为 % 0.32% 0.49% 用 SEM EDS XRD FT-IR 等手段对涂层进行了评价, 结果表明 : 镁离子能进入羟基磷灰石晶格内部, 不同镁含量涂层的物相有微小差异 在人骨镁含量的范围内, 涂层的镁含量越高体外大鼠成骨细胞 (MC3T3-E1) 的粘附 增殖以及分化能力越强 关键词复合材料, 碳 / 碳复合材料, 镁, 羟基磷灰石分类号 TB332 文章编号 (2015) Preparation of Magnesium Doped Hydroxyapatite Coating on Carbon/Carbon Composites NI Xinye 1, 2, 3 LI Aijun 1 BAI Ruicheng 1 XIONG Xinbo 3 ZHOU Dong 2** 1. School of Materials Science and Engineering, Shanghai University, Shanghai , China 2. Second People s Hospital of Changzhou, Nanjing Medical University, Changzhou , China 3. College of Materials Science and Engineering, Shenzhen University, Shenzhen , China *Supported by Postdoctoral Science Foundation of China No. 2014M560323, the municipal social development project of the Changzhou City No. CJ and Natural Science Foundation of Jiangsu Province No. BK Manuscript received January 14, 2015; in revised form March 25, **To whom correspondence should be addressed, Tel: (0519) , ABSTRACT Mg doped hydroxyapatite coatings with 0, 0.28%, 0.32%, 0.49% Mg respectively, as artificial human bones were prepared on carbon / carbon composites by means of electromagnetic induction method. Then they were characterized by SEM, EDS, X- ray diffraction and Fourier transform- infrared spectroscopy etc. The results show that Mg ions entered the hydroxyapatite lattice and these coatings have only a little difference in constituents. Within the range Mg content of human bone, Mg ions can enhance the adhesion, multiplication, and differentiation of external osteoblasts. KEY WORDS composites, carbon/carbon composites, magnesium, hydroxyapatite [1] 碳是构成人体的重要元素 碳/ 碳复合材料具有高强度 高韧性 耐腐蚀 耐高温以及弹性模量与 [2] 人骨相当等优点 医用碳/ 碳复合材料是一种以碳纤维增强碳基体的新型生物医用复合材料, 可用于 制造有良好应用前景的人工关节和骨假体 [3] 未经 处理的碳 / 碳复合材料表面是疏水性的, 属于生物惰 * 中国博士后基金 2014M560323, 常州市社会发展项目 CJ 和江苏省自然科学基金 BK 资助 2015 年 1 月 14 日收到初稿 ; 2015 年 3 月 22 日收到修改稿 本文联系人 : 周栋 [4] 性材料, 与骨组织表面仅仅是机械结合, 没有传导或诱导骨组织再生功能 同时, 其界面形成的周期 [5] 长, 不能与人体产生化学键结合, 植入固定的周期 [6] 也比较长, 影响碳 / 碳复合材料的应用 同时, 碳 / [4] 碳复合材料的颗粒易脱落, 因此需要对其进行表 [7] 面处理 羟基磷灰石 (hydroxyapatite, HA, 其化学式为 Ca 10(PO 4) 6(OH) 2) 存在于动物的骨组织和牙齿中, 是一种生物活性材料 羟基磷灰石与骨有比较强的结合强度, 但是强度和韧性的不足使其不能单独作为骨材料使用 将碳 / 碳复合材料与羟基磷灰石的优

2 854 材料研究学报 29 卷 点结合起来可满足人体对骨替换材料的要求, 即以 碳 / 碳复合材料为基体以 HA 为表面涂层 [8, 9] 纯 HA 在生理环境中易溶解产生不稳定性, 导 [10], 致植入的失败而且纯 HA 的生物活性不如真正的 骨矿物 [11] 自然骨除了含有磷灰石, 还含有 Mg 2+ ( 镁 离子 ) Na + ( 钠离子 ) F - ( 氟离子 ) 等成份 其中 Mg2 + 浓度直接影响人体骨质的钙化过程, 从钙化的开始 到完成, Mg 离子的浓度由高变低 Mg 在自然骨中 的质量百分含量为 0.26%-0.55%, 在成年人体内大 约含 Mg1000 mmol(~24g) 大约 60% 的 Mg 存在于 [12] 骨骼, 39% 在细胞内, 只有 1% 在细胞的外环境 [13] Jasminka 等发现 Mg 可以调控骨质的生长和重塑, 其机理是 Mg 参与了骨矿表面反应 Mg 参与正常 细胞的繁殖, 刺激 DNA 和蛋白质的合成 [14] Yamasaki 等在分子生物水平证明, Mg 离子进入磷灰石晶体 有助于加速成骨细胞粘附于和促进骨形成 [15] 含 Mg 2 mol% 的 Mg-HA( 镁 - 羟基磷灰石 ) 比纯 HA 能显 著提高成骨细胞的贴附 [16] Serre 等研究证明, 添加 20% 的 Mg 会降低磷灰石材料的骨传导性, 过多掺杂 功能性元素反而降低材料的生物功能性 [17] 由此可 见, 掺 Mg 浓度合理的 HA 涂层是极有临床意义的一 类改性材料, Mg 与 HA 复合可克服传统生物陶瓷缺 乏骨诱导能力的缺陷 [18] [19-21] 目前的研究致力于掺 Mg HA 的制备和在 金属表面制备掺 Mg 的 HA 涂层 在金属表面制备 掺 Mg 的 HA 涂层, 常用的方法有溶胶凝胶法 电化 学法 等离子喷涂法等 [22, 23, 9] 但是, 这些方法都不 能解决纯 HA 涂层与碳 / 碳复合材料的结合强度较 弱的问题 [9, 24, 25] 同时, Mg 离子渗入引起晶格扭曲, 使涂层的制备比纯 HA 涂层更难 本文作者用电 磁感应法 (15KHz) 在碳 / 碳复合材料表面制备了三 斜磷钙石 HA 涂层, 划痕实验的临界载荷达到 18 N [26], 满足临床要求 本文用电磁感应法在碳 / 碳复 合材料表面制备与人骨镁含量相当的羟基磷灰石 涂层 1.1 碳 / 碳复合材料的制备 1 实验方法 试验用碳 / 碳复合材料为 2.5 维 PAN 基碳 / 碳复合 材料, 弯曲强度为 MPa, 弯曲模量为 90.4 GPa, 弹性模量为 35.0 Gpa, 制成直径 1.2 cm 高度 0.6 cm 的圆柱体 为了增加涂层与碳 / 碳复合材料基体的 结合力, 把碳 / 碳复合材料放入装有 40 ml 的 2 mol 浓 度双氧水的高压釜中 [26], 加热温度为 150, 时间为 2 h 调整电磁感应加热工作频率为 15 KHz 把 Ca (NO 3) 2 Mg(NO 3) 2 NH 4H 2PO 4 混合在蒸馏水中, Ca P 离子的浓度分别为 mol/l, Mg 离子浓度分别为 mol/l, 相应方法记作 Mg0M Mg0.04M Mg0.08M Mg0.16M, 并调节 ph 值为 4.5 沉积实验在室温 (20 ) 下进行, 电流为 650 A, 沉积时间为 2 h 沉积实验完成后, 用蒸馏水冲洗样品, 得到掺 Mg 磷酸钙涂层 然后将样品浸入含有 20% 氨水的高压釜中, 加热时间为 8 h, 温度为 130, 得到掺 Mg 的 HA 涂层 再用去离子水对样品涂层进行浸泡 冲洗 最后用 180 的高温对涂层进行加热 0.5 h, 以去除涂层中的水 1.2 材料的表征用 X 射线衍射 (XRD) SEM 以及红外光谱 (FT- IR) 表征 HA 涂层, 用 D8 型 X 射线衍射仪进行 XRD 测试, 衍射仪的测试条件为管电压 40 kv, 管电流 40 ma, 步长 0. 01, 扫描范围 用 SUPRA55 型扫描电镜进行 SEM EDS 测试, 加速电压为 15 kv 用 NEXU670 型傅里叶变换红外 / 拉曼光谱仪进行 FT- IR 表征 1.3 大鼠成骨细胞 (MC3T3-E1) 黏附与增值将涂层样品放入 24 孔板中, 每孔加入含有 个 /ml 的大鼠颅骨成骨细胞 (MC3T3-E1) 的培养基 1 ml, 培养基为 RPMI1640 和 DMEM 液, DMEM 是含有 10% 胎牛血清 100 μg/ml 链霉素和 100 units/ml 青霉素的细胞培养液, 置于 37 5% CO 2 的培养箱中, 让细胞自然沉落在掺 Mg 的 HA 涂层和纯的 HA 涂层表面, 5 h 后吸取培养基, 将 PBS 加入每孔中, 并清洗样品涂层表面, 再把表面粘附有成骨细胞的碳 / 碳复合材料移到新的 24 孔细胞培养板中, 加培养基继续培养 具体实验内容有 : (1) 经过 24 h 后用 PBS 清洗材料表面, 用 2.5% 的戊二醛固定 2 h, 再依次用浓度为 30% 50% 70% 90% 95% 的乙醇脱水 20 min, 再用醋酸异戊酯兑换乙醇 用扫描电镜观察大鼠成骨细胞黏附特性 (2)2 d 后进行荧光显微镜观察增值效应, 先使用 PBS 清洗材料表面, 用体积分数为 10% 的甲醛室温固定 15 min, 再用 5 ug/ml 的碘化丙啶 (PI, SIGMA 公司 ) 进行荧光染色 15 min, 用抗荧光淬灭液封片, 最后用 OLYMLUSIX71 型倒置荧光显微镜进行观察并拍摄照片 (3) 分 3 个时间段进行细胞增殖实验观察, 依次为 d, 以便比较 每个试验材料每个时间段有 5 块碳 / 碳复合材料样品, 用胰酶将细胞从材料表面冲洗下来, 并在 PBS 中重悬, 采用九宫格细胞计数, 测量每小格中的细胞

3 11 期 倪昕晔等: 掺镁羟基磷灰石涂层在碳/碳复合材料表面的制备 855 数, 再换算成每块材料表面总的细胞数, 取其平均 和掺 Mg 的 HA 的数据, 表明掺 Mg 的 HA 由小尺寸 值, 使用 SPSS 11.0 软件多组均数比较的方差分析各 晶粒和 Mg 离子合成(图 2) 掺 Mg 后 (102) 组细胞数之间的差异 直径约为 50 nm 的棒状晶体构成, 十余根棒构成一 和 (210) 处的主 XRD 峰相互靠拢, Mg0.08M 和 Mg0M 相 比 间 距 缩 小 了 0.14, (112) 和 (300) 处的主 XRD 峰逐渐靠拢, Mg0.08M 和 Mg0M 相比间距缩小了 0.12 其原因是, Mg2 + 半径 为 0.078nm 的 Mg2 + 取代半径为 0.106nm 的 Ca2 +, 使 晶面间距变小 束, 棒状晶体之间有明显的空隙存在; 由图 1b 可见, 2.3 红外分析结果(FTIR) Mg 0.04 M 时涂层由长约 350 nm 直径约为 50 nm 的 状晶体构成的束状结构继续增加, 呈 头尖根粗 状, 对掺 Mg 的 HA 涂层的红外分析结果, 在图 4b c d 中给出 可以看出, 磷酸根的伸缩振动吸收峰在 1091 cm cm cm-1 处, 弯曲振动吸收峰在 603 cm cm cm-1 处 1654 cm-1 和 3447 cm-1 为羟基的吸收峰 [28, 29], 而在 638 cm-1 为 HA 的特征吸 棒状晶体之间空隙渐渐缩小; 由图 1d 可见, 涂层由 收峰, 3582 cm-1ha 的特征吸收峰可能被羟基吸收 棒状晶体组成的致密结构形成, 棒状晶体呈圆柱体 峰掩盖 [30] 这些结果说明, 与纯 HA 涂层相比(图 状 有研究者认为, 一定尺寸的微孔存在有利于细 4a)引入 Mg 离子后掺 Mg 涂层的成份没有发生根本 2 结果和讨论 2.1 涂层的形貌(SEM 和 EDS) 由图1a可见, 纯HA涂层(Mg0M)由长约500 nm 棒状晶体构成, 5-10 根棒构成一束; 由图 1c 可见, Mg 0.08 M 时涂层由长约 400 nm 的棒状晶体束状构 成, 棒状晶体之间有约为 150 nm-400 nm 的空隙, 棒 [27] 胞的黏附和生物代谢的吸收 对 Mg0.02M Mg0.04M Mg0.08M 的 EDS 图(图 2) 分 析 结 果 表 明, Mg 占 涂 层 的 质 量 分 数 分 别 为 的改变 2.4 黏附特性 24 h 后 MC3T3-E1 细胞在不同涂层表面的形 0.28% 0.32% 0.49%, 与 人 骨 的 Mg 含 量 相 当 貌, 如图 5 所示 由图 5 可见, Mg0M 涂层表面细胞 Mg0M 的涂层为纯 HA 涂层, 即 Mg 占涂层的重量百 呈球形, 细胞不能很好的贴附在涂层表面, Mg0.04M 分含量为 0 涂层表面细胞稍展开, Mg0.08M 涂层表面细胞与材 2.2 XRD 分析结果 料粘附紧密, Mg0.16M 涂层表面细胞充分舒展开, 图 3 给出了 X 射线衍射(XRD) 检测到的纯 HA 伸出伪足附着在涂层表面 图 1 不同含镁量涂层 SEM 照片的对比 Fig.1 SEM comparison of the coatings of different magnesium content (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M

4 856 材 料 研 究 学 报 29 卷 细胞的黏附状态, 可能与外界环境有关 在 HA 表面掺杂 Mg 离子使细胞外部环境更接近于真实环 境, 有利于细胞的黏附 生长细胞的黏附状态, 间接 反映成骨细胞在植入物材料表面的活力 细胞的伸 图 2 不同镁含量涂层的 EDS 对比 Fig.2 EDS comparison of the coatings of different magnesium content (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M 图 3 不同含镁量涂层 XRD 衍射图谱的对比 Fig.3 XRD comparison of the coatings of different magnesium content (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M 图 4 不同含镁量涂层 FTIR 的对比 Fig.4 FTIR comparison of the coatings of different magnesium content (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M 图 5 不同含镁量涂层表面的 MC3T3-E1 细胞粘附的对 比 Fig.5 Osteoblast (MC3T3- E1) morphologies on the coatings of different magnesium content (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M

5 11 期 倪昕晔等: 掺镁羟基磷灰石涂层在碳/碳复合材料表面的制备 857 展而使细胞铺展开, 使其表面积随着扩大, 增加了与 之间的距离更近 [32] 已有学者证实, 掺低浓度 Mg 培养液之间的接触面积, 有利于营养的吸收, 促进了 ( 5%)的 HA 涂层能提高生物效应的[33, 34] 与 HA 涂 细胞的生长和增殖 层相比, 在掺 Mg 的 HA 涂层表面成骨细胞增值快, 2.5 细胞的增殖 可能与掺 Mg 的 HA 涂层和真实骨都含有一定量的 图 6 给出了所培养的 MC3T3-E1 细胞分别接种 Mg 离子有关 d 后的增值曲线图 从图 6 中可以看出, 含 Mg 的 HA 涂层细胞增殖能力明显高于用感应加热 法制备的涂层 经 SPSS11.0 软件多组均数比较的 方 差 分 析, Mg0.04M Mg0.08M Mg0.16M 涂 层 比 Mg0M 涂层相比, 2 d 的 P 值分别为 , 4 d 的 P 值分别为 , 6 d 的 P 值分别为 , 均小于 增值差异具有统计学意义 2.6 在荧光显微镜下观察细胞增殖 2 d 后 进 行 倒 置 荧 光 显 微 镜 观 察, 发 现 在 纯 HA 涂层(Mg0M)表面 MC3T3-E1 细胞数量明显小 于 Mg0.04M Mg0.08M Mg0.16M 涂 层 表 面 细 胞, 其 中 以 Mg0.08M 和 Mg0.16M 涂 层 表 面 细 胞 数 量 多 荧光显微镜观察增殖结果与细胞计数结果 (图 7)一致 根据感应加热原理, 当电源通过线圈输出交变 电流时, 处于其中的碳/碳复合材料基体会产生感应 电动势, 引起导体内部产生涡流 在涡流焦耳热的 作用下导体发热, 导体温度的上升使周围液体的温 度随之上升 其化学反应方程式为 (10 - a)ca2 + + amg PO OH1 - Ca10 - a Mg(PO 4) 6 (OH) 2 Mg2+ 替换到 Ca2+ 的位置使 HA 的晶体结构发生 扭曲和降低结晶度, 因此 Mg 离子替代 Ca 钙离子是 有限的 Mg 离子替换的是 Ca(I)和 Ca(II)位, 且优先 替换沿着单一 OH 通道的 Ca(II)位[31] Bigi 等甚至认 为, Mg 只替换与氢氧根相邻的 Ca 原子, 因为它与氧 图 6 不同含镁量涂层表面的 MC3T3-E1 细胞增值的对比 Fig.6 Cell quantities of coatings of different magnesium content at different times (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M 图 7 不同含镁量涂层表面的 MC3T3-E1 细胞荧光电镜 照片对比(2d) Fig.7 Fluorescence microscopy map of coatings of different magnesium content (a) Mg0M, (b) Mg0.04M, (c) Mg0.08M, (d) Mg0.16M

6 858 材料研究学报 29 卷 3 结论用电磁感应法制备的掺镁羟基磷灰石涂层, 其镁含量与人骨相当 掺镁羟基磷灰石涂层的物相与纯羟基磷灰石涂层有微小的差异 在人骨的镁含量范围内, 涂层中镁含量越高体外成骨细胞的粘附 增殖 分化能力越强 参考文献 1 Gott VL, Whiffen JD, Dutten RC, Heparin bonding colloidal graphite surfaces, Science, 142(3597), 1279(1963) 2 NI Xinye, TANG Xiaobin, GENG Changran, CHEN Da, The prospect of carbon fiber implants in radiotherapy, J Appl Clin Med Phys, 13(4), 152(2012) 3 Meier R, Schulz M, Krimmer H, Stütz N, Lanz U, Proximal interphalangeal joint replacement with pyrolytic carbon prostheses, Oper Orthopade Traum, 19(1), 1(2007) 4 Shimmin A, Beaulé PE, Campbell P, Metal-on-metal hip resurfacing arthroplasty, J Bone Joint Surg Am, 90(3), 637(2008) 5 Adams D, Williams DF, The response of bone to carbon- carbon composites, Biomaterials, 5(2), 59(1984) 6 Gwyn M J, Francisco X C, Biomedical applications of carbon fiber reinforced carbon in implanted prostheses, Carbon, 15(1), 33(1977) 7 NI Xinye, LI Aijun, XIONG Xinbo, BAI RuiCheng, ZHOU Dong, Effect of electromagnetic induction deposition's heating time of magnesium- hydroxyapatite coating on carbon / carbon composites, Journal of Biobased Materials and Bioenergy, 8(6), 603(2014) 8 NI Xinye, CHU Cencen, XIONG Xinbo, LI Aijun, BAI Ruicheng, Preparation of hydroxyapatite coating using chemical liquid vaporization deposition on carbon/carbon composites, RSC Advances, 4 (77), 41129(2014) 9 NI Xinye, TANG Xiaobin, LIN Tao, ZHAO Quandi, GENG Changran, CAI Leiming, GU Weidong, MIAO YunLiang, CHEN Da, Properties of plasma-spray coated hydroxyapatite on carbon/carbon composites pretreated by an argon plasma, New Carbon Material, 28(3), 215(2013) ( 倪昕晔, 汤晓斌, 赵全娣, 耿长冉, 蔡雷铭, 顾卫东, 缪云良, 陈达, 离子预处理的碳 / 碳复合材料等离子喷涂制备羟基磷灰石涂层, 新型炭材料, 28(3), 215(2013)) 10 Zhang S, Xianting Z, Yongsheng W, Kui C, Wenjian W. 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