中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(4): 利用人工 microrna 实现基因沉默 陈起振张志仙曹家树 * ( 浙江大学蔬菜研究所, 杭州 ) 摘要 MicroRN

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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(4): 利用人工 microrna 实现基因沉默 陈起振张志仙曹家树 * ( 浙江大学蔬菜研究所, 杭州 ) 摘要 MicroRNA 是一组长度约为 21 nt 的非编码蛋白质的短序列 RNA, 能通过碱基互补配对的方式指导降解靶基因 mrna 或抑制靶基因的翻译 MicroRNA 的主要功能是调控基因的表达, 在生物体的生长 发育及疾病发生中扮演着重要的角色 本文介绍了利用 microrna 实现基因沉默的作用原理, 人工合成 microrna, 构建转基因载体, 实现对目的基因的沉默及这种工具在生命科学领域的应用前景 关键词人工 microrna; RNAi; 基因沉默 MicroRNA 是一类由内源基因编码的长度约 为 21 nt 的非编码单链 RNA 分子, 它们在动植物中 参与转录后基因表达的调控 最早被确认的 microrna 是在线虫中首次发现的 lin-4 和 let-7 [1~3], 随 后多个研究小组在包括人类 果蝇 植物等多种 生物物种中鉴别出数百个 microrna microrna 能够降解靶基因 mrna 或抑制靶基因的翻译, 从而 调控基因的表达, 所以在真核生物中, microrna 也 能引起 RNA 干扰 (RNAi) 现象 [4] 近年来利用人工 microrna(artificial microrna, amirna) 的技术, 实 现特定基因的沉默, 特别是用于共同抑制几个相关 基因, 这种包含一个发卡结构前体的载体也被称作 第二代 RNAi 载体 [5] 这种技术以其特异性 高效 性受到了研究人员的关注, 在动植物抵抗外源病毒 生长发育调控方面起着重要的作用, 而且在功能基 因组研究 基因治疗方面有着广泛的应用前景 1 amirna 的作用原理 amirna 利用的是 microrna 抑制基因表达的 原理, 成熟的 microrna 形成后, 整合到 microrna 介 导的沉默复合体 (mirna-induced silencing complexes, mirisc) 中, 然后与靶基因 mrna 结合, 能够与靶 基因 mrna 完全互补或不完全互补的 microrna 可 能会导致靶基因的特异性剪切, RISC 中的 Argonaute (Ago) 蛋白能直接切开与 microrna 互补的靶 mrna 中的磷酸二酯键, 形成小片段并直接降解 另外一 种情况是, microrna 与目的基因 mrna 之间匹配程 度较低的时候会抑制 mrna 翻译, 在植物和动物中 这是 microrna 抑制基因表达的默认机制, 但是 microrna 具体是阻碍翻译起始, 还是阻碍翻译的延伸 还存在争议 [6] 由于 microrna 和靶基因 mrna 之间 不用完全匹配就可以实现调控, 所以一个 microrna 可以有多个靶基因, 几个 microrna 也可以共同调控 一个基因 大部分动物 microrna 是通过抑制靶基 因翻译进行调控的, 与此同时 mrna 会由于脱腺苷 化 去帽作用和外显子溶解消化等而降解, 但这种 现象并不是由 Ago 蛋白引起的切割造成的 [7], 并且有 证据证明 mrna 的降解和翻译的抑制是两条独立的 调控途径 [6] amirna 的原理就是将 pre-microrna 的 mirna 和 mirna*( 与 mirna 互补配对的序列 ) 置换为设计 好的序列后转入动植物中, 利用 microrna 的作用机 制来抑制特定靶基因的功能 [8,9] 2 amirna 的设计和载体构建 amirna 最初是在人类细胞系中应用的 [10], 随 后又用于拟南芥中 [11] 这些研究结果显示都能有效 抑制靶基因的表达, 而且 amirna 无论是组成型表达 还是特异型表达都能很好起到应有的作用, 组成型 表达的效果和内源 microrna 一样都具有高度的特 异性 [8,9,12] 用该方法抑制目的基因的表达, 首先要设计 针对于目的基因的 amirna, 设计的 amirna 在第一 收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 (No ) 资助项目 * 通讯作者 Tel: ,

2 434 综述 个碱基位置为尿嘧啶, 在第十个碱基的位置是腺 嘌呤, 因为内源 microrna 中大都是这样, 更利于 microrna 的抑制效率 [12] 用于植物的 amirna 可 以用 WMD(web microrna designer) 来设计, 只需 要将目的基因的序列输入, 就能够得到相应的候选 amirna, 目前已经有 100 多种植物可以通过这个网 站来设计 amirna ( 动 物方面 amirna 设计通常是通过 BLOCK-iT TM RNAi Designer/miR RNAi ( com) 完成的 之后要选择合适的 amirna 骨干, 也就是合适的 microrna 前体 (pre-mirna) 用于构建 amirna 载体的 pre-mirna 要符合以下几点 : 首先这个前体的序列不要太长 ; 预测的二级结构能形成一个短而简单的发卡结构 ; mirna* 和 mirna 能够完全互补, 而没有插入或缺失 ; 前体序列应在 EST 数据库中存在, [9] 或有和它相关的文献研究 现有的研究用过很多 microrna 前体, 拟南芥 mirna 前体经过修改后已经 [8,9,11,13,14] 成功地沉默了拟南芥 番茄 烟草中的基因 但是, 现在还没有研究表明拟南芥中的前体在所有植物中都能起作用, 所以也许用自身内源 microrna 前体作为骨干会更好, 特别是那些高效的 microrna 的前体 水稻中的 osa-mir528 已经用于水稻 amirna [15] 的构建, 莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii) 中的前体 cre-mir1157 和 cre-mir1162 也成功用于该物 [16~18] 种 mir30 [19~22] mir155 [23~29] 也在人类和动物细胞中得到了应用 但是选择了合适的 amirna 后, 必须将其连接到一个 mirna 前体上, 这一步通常用几次 PCR 来替代内源 mirna 的序列, 如图 1 所示, 引物 I~IV 用来替换 mirna 和 mirna*( 蓝色部分 ), 引物 A 和 B 是 mirna 前体上的序列, 首先分别以 A-IV II-III I-B 为引物扩增, 然后以它们的产物为模板,A 和 B 为引 [9] [27] 物扩增, 即可得到包含 amirna 的前体 Hu 等改进了这项技术, 可以用两对引物通过一次 PCR 克隆 amirna 构建高效的 amirna 载体是比较简单易行的 研究表明, 在组成型或诱导型强启动子下游插入 amirna 的前体是该载体的基本形式 现已有多种 [13] 载体用于植物的研究 Niu 等利用 Invitrogen 公司的 Gateway 重组克隆技术, 构建高通量基因沉默的载 [16] 体 pba-pre-amir 系列 Molnar 等根据 Gateway 技 [9] 图 1 amirna 的合成 ( 根据文献做适当修改 ) Fig.1 Engineering of amirnas using overlapping PCR (modified from [9] ) 术将 pcb740 改造成 pchlamirna1 和 pchlamirna2 两个载体, 这两个载体都由 HSP70A-RBCS2 组成 [30] 型串联启动子启动 Schwab 等设计了两种载体 : prs300 和 pnw55, 分别包含了 ath-mir319a 和 osa-mir528, 可以直接将设计好的 amirna 替换到这两个载体里面, 已有的研究也证明这两个载体 [31] 的高效 动物方面用过的载体有 Block-iT TM Pol II mir RNAi Expression Vector (Invitrogen) [23,32] pcdna6.2-gw/emgfp-mir(invitrogen) [24~26,28] pfbgr [33] pdsred [27] psm155 [29] 虽然这些载体有所差别, 但是都含有较强的启动子, 并且有 [34] EmGFP 等可以方便检测表达的标记基因 Hu 等研究了哺乳动物细胞中不同 amirna 载体的表达效果, 结果显示 9 个载体中有 3 个表达效果明显, 另外, 多 amirna 表达载体中 amirna 的数量最好不要超过 4 个, 而在多 amirna 表达载体中 amirna 的相对位置, 并不会明显影响其 RNA 干扰活动 3 amirna 转基因植株的检测和抑制效率对于转基因动植物, 通常要检测 amirna 的表 达效果和对目的基因的抑制效率, 一般用 Northern 杂交检测 amirna 的表达, 靶基因的表达量可以用 RT- PCR 来检测, 同时可以用 oligo 引物, 用改进的 RACE- [35] PCR 可以确定 amirna 的切割位点 由于 amirna 技术是近年刚应用的新技术, 所以还没有与其它 RNAi 方法相比 在动物中, 研究显示不论在体外还是小鼠体内, shrna(short hairpin [33] RNA) 载体的抑制效果都要比 amirna 的效果好,

3 陈起振等 : 利用人工 microrna 实现基因沉默 435 但是 shrnas 会影响 microrna 的生物合成和功能, [36] 而 amirna 就不会产生这种影响 Boudreau 等以 小鼠小脑为实验材料, 检测 shrna 和 amirna 载体 的安全性, 注入 shrna 载体使得小鼠浦肯雅细胞神 经中毒, 而 amirna 载体没有产生毒性, 而且抑制 [22] 效果也很好 ; McBride 等在研究用 RNAi 抑制小鼠 脑部 HDh 的表达时发现, 原本能够产生神经中毒的 shrna 序列, 用 amirna 载体表达的时候毒性就会变 小, 而且对目的基因进行了有效的抑制 这说明在 哺乳动物中 amirna 更适合用于 RNAi 现有研究表 明 amirna 的成功率大约在 90% 以上 [8,9,13,14,37,38], 在拟 南芥中, 不论是作用于一个基因还是多个基因, 这种 方法的抑制效率都可以达到 75% [30] 另外, 该方法在植物中的遗传稳定性也有一定 的保障, 现有的研究显示用 RT-PCR 或 Northern 杂交 的方法都能在转基因植株 T1 代中检测到 amirna 的 [9] [31] 表达 Schwab 等和 Park 等获得的拟南芥转基因 [14] 植株 T1 代有 90% 表现出了突变体的表型 Qu 等 利用 amirna 提高植物对烟草花叶病毒的抗性, 研 究结果显示 63.63% 的转基因 T1 代对 CMV 具有抗性, 获得 T2 代后, 发现具有抗性的植株比率达到了 82% Warthmann 等 [15] 在用该方法对水稻基因的研究过程 中发现, 转基因植株的 T1 代的表型出现了 3: 1 的分 [39] 离, 这也符合孟德尔的遗传学说 Zhang 等用该方 法构建了两个 amirna 载体以获得抗 CMV 的转基因 番茄, 结果分别有 85.7%~100% 和 92.9%~100% 转基 因植株 T2 代表现出对 CMV 的抗性 4 amirna 的应用 4.1 植物基因功能研究 随着拟南芥 水稻等植物基因组测序的完成, 获得了大量的功能未知的基因, 这些基因的功能验 证 基因的表达调控 改造及基因间的互作也成为 现在的研究重点 到目前为止, RNAi 已经成为研究 植物基因功能的重要工具, 而 amirna 作为一种实现 基因沉默的新方法, 在这方面也有一定的应用 Warthmann 等 [15] 研究了 amirna 在水稻中的抑 制效果, 靶基因是 Pds Spl11 CYP714D1 三个已 知突变体表型的基因, 对每个基因分别设计了两个 amirna, 结果显示各有一个 amirna 起到了抑制 作用, 其中 Pds 转基因植株中有 92.9% 表现出了突变 [16] 体的表型 Molnar 等用该方法对莱茵衣藻中的 COX90 PSY DCL1 三个基因进行了研究, 转基 因系大部分表现出了相应突变体的表型, 比率大约 [17] 为 72% Zhao 等研究了莱茵衣藻中另外两个基 因 : MAA7 和 RBCS1/2, 分别用 amirna 对它们进行 抑制, 效率分别为 95% 和 45%, 用两个 amirna 同时 抑制这两个基因时, 这两个基因的表达量只有原来 [18] 的 10% 和 15% Schmollinger 等研究了 amirna 对 莱茵衣藻 HSF1(heat shock factor 1) 的抑制效果, 作者 用了 NIT1 启动子, 该启动子被铵盐抑制, 被硝酸盐诱 导, 转基因材料从铵盐培养基转移到硝酸盐培养基 中 2 h 后, HSF1 转录本减少, HSF1 蛋白水平从 8 h 开 [31] 始降低, 到 24 h 蛋白水平才有严重降低 Park 等 研究了 amirna 对拟南芥中基因的抑制效果, 首先 抑制了 AP1, 转基因植株表现型同缺失突变体一样, 对于 AP1, 一个 amirna 的抑制效率为 48%, 而载体 中三个 amirna 的抑制效率为 78%, 当 amirna 和靶 基因之间没有错配的时候, 抑制效率竟达到了 98%, 这说明抑制效果可能和错配没有关系, 也可能是与 不同基因有关 ; 然后又构建包含两个 amirna 的载 体, 同时抑制 AP1 和 CAL1 这两个不相关的基因, 抑制 效率达到了 90% 以上, 但是很少表现强双突变体表 [40] 型 Khraiwesh 等构建 amirna 载体抑制了小立碗 藓 (Physcomitrella patens) 中的两个基因 PpFtsZ2-1 和 PpGNT1, 转基因植株中靶基因 mrna 的表达量都降 低了, 靶基因的 mrna 表达量都下降了 80%~98%, 抑 制效果明显, 并且表现出了缺失突变体的表型 4.2 增强动植物抗病性 病虫害是导致农作物减产的重要因素之一 随 着基因工程技术的发展, 利用 RNAi 技术培育抗病新 [13] 品种更是较为有效的防治方法 Niu 等利用 amir- NA 技术提高拟南芥对芜菁黄花叶病毒 (TYMV) 和芜 菁花叶病毒 (TuMV) 的抗性, amirna 的靶基因为编 码 TYMV 和 TuMV 的两种基因沉默抑制因子 ( 分别为 P69 和 HC-Pro) 的 mrna, 结果表明转基因植株分别 对这两种病毒有很好的抗性, 而且将这两个 amirna 同时连在一个载体上转入植株就能获得同时对这 [14] 两种病毒的抗性 Qu 等研究了用 amirna 提高植 物对烟草花叶病毒的抗性, 设计的 amirna 的靶基 因是编码 CMV 沉默抑制因子 2b 的 mrna, 转基因烟 草对 CMV 的抗性非常明显, 而且这种抗性的水平同 amirna 的表达量是成正比的 Kim 等 [29] 用 amirna 实现了对鱼细胞系中病毒外壳蛋白基因的抑制, 病

4 436 综述 毒外壳蛋白 53R 是从 RGV(Rana grylio virus) 中分离 的蛋白, 在病毒组装过程起重要的作用, RT-PCR 检 测表达结果显示有效率达到了 58%, 电镜观察表明 [41] 病毒组装能力降低甚至不能组装 Dmytro 等设计 了分别作用于 CI Nib 和 CP 基因的 amirna, 整合 入拟南芥 mir159 前体, 转入烟草中以后都能检测到 amirna 的表达, 而且转基因植株对不同马铃薯 Y 病 毒属病毒都有显著的抗性 4.3 amirna 与基因治疗 RNAi 可以作为一种基因治疗的手段用于一些 慢性病 ( 比如 HIV-AIDS) 的治疗 [42,43], 现在也有许多 科研工作者研究了用 amirna 这种新的工具治疗 [23] 肿瘤 HIV 肝炎等疾病的可行性 Liang 等用 amirna 方法抑制 CXCR4 的表达, 转染乳腺肿瘤细 胞后 CSCR4 的表达量明显降低, 另外, 将这些细胞 注射到小鼠体内后, 癌细胞向肺转移的数量也比对 [24] 照要少 Son 等利用 amirna 对于 HIV 的抑制效 果, 载体中包含了作用于 Tat 和 Vif 基因的 amirna, 转染细胞后都能有效地起到作用, 持续抑制 HIV 的 [25] 复制 Wang 等研究了用 amirna 抑制人类胃腺 癌细胞系 SGC7901 中 PRL-3 的表达量, 载体质粒的 转染效率达到了 53% 以上, RT-PCR 和 Western blot 结果显示对目的基因抑制效果非常明显, 转染成功 的 SGC7901 细胞抵抗感染的能力显著提高, 而且明 显抑制了 SGC7901 细胞的增殖, 减缓肿瘤的生长 Gao 等 [26] 利用 amirna 抑制 HepG 细胞系中 B 型 肝炎病毒 (HBV) 的作用, amirna 载体转染效率为 55%~60%, 转染 72 h 后, 对 HBV mrna 的抑制效率 达到了 40%~83%, 对 HBV DNA 的抑制效率达到了 40%~70%, 对两种肝炎病毒抗原 (HBsAg 与 HBeAg) 的最高抑制率分别达到了 81.5% 和 51.8% 此外, 该 [28] 方法也可用于治疗狂犬病, Israsena 等的研究表明 注射 amirna 载体 72 h 后, Neuro2A 细胞中狂犬病毒 [32] 核壳体的数量减少了 90% Baek 等将一种能够 表达作用于 NK1R(neurokinin-1 receptor) 的 amirna 的慢病毒载体注入小鼠脑部, 4 周后, 与对照相比, amirna 降低了小鼠乙醇的摄取量, 同时在海马体中 NK1R 的表达也降低了, 表明这种方法可能对于治疗 乙醇依赖有一定的作用 5 小结与展望 amirna 是根据 microrna 的作用原理而发明 的一种新的 RNAi 的工具, 近年来已经有许多关于这种方法的报道, 已经证明在植物和动物中都能取得良好的抑制效果, 可以用于基因功能研究 增强动植物抗病性和基因治疗肝炎 HIV 癌症等疾病 作为一种新方法, 它在应用中也存在一定的问题, 比如由于对植物 microrna 从前体到成熟的加工过程的了解较少, 所以设计的 amirna 可能不能够正常合成, 不能对目的基因进行有效的抑制 另外, 如果靶 mrna 存在高级结构, amirna 可能无法靠近靶标 针对以上几点, 已有的研究通常会对一个基因设计 [13~18,23~32] 两个或两个以上 amirna, 以提高成功率 另外, 在基因功能研究方面, 只是用功能已知的基因来验证 amirna 的可行性, 还没有得到广泛的应用 但是与其它方法相比, amirna 的序列更短, 所以其特异性更高, 而且允许和靶基因之间有错配, 所以可以同时干涉几个同源基因, 而且具有很好的遗传稳定性, 在动物实验中的毒性更小 相信随着研究的不断深入, amirna 一定能够成为生命科学领域不可忽视的力量 参考文献 (References) 1 Wightman B, Ha I, Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene Lin-14 by Lin-4 mediates temporal pattern-formation in C. elegans. Cell 1993; 75(5): Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene Lin-4 encodes small Rnas with antisense complementarity to Lin-14. Cell 1993; 75(5): Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M, Pasquinelli AE, Bettinger JC, Rougvie AE, et al. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature 2000; 403(6772): Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116(2): Tang GL, Galili G, Zhuang X. RNAi and microrna: breakthrough technologies for the improvement of plant nutritional value and metabolic engineering. Metabolomics 2007; 3(3): Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of mir- NAs and sirnas. Cell 2009; 136(4): Behm-Ansmant I, Rehwinkel J, Doerks T, Stark A, Bork P, Izaurralde E. MRNA degradation by mirnas and GW182 requires both CCR4 : NOT deadenylase and DCP1: DCP2 decapping complexes. Gene Dev 2006; 20(14): Alvarez JP, Pekker I, Goldshmidt A, Blum E, Amsellem Z, Eshed Y. Endogenous and synthetic micrornas stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cell 2006; 18(5):

5 陈起振等 : 利用人工 microrna 实现基因沉默 Schwab R, Ossowski S, Riester M, Warthmann N, Weigel D. Highly specific gene silencing by artificial micrornas in Arabidopsis. Plant Cell 2006; 18(5): Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR. Both natural and designed micrornas can inhibit the expression of cognate mrnas when expressed in human cells. Mol Cell 2002; 9(6): Parizotto EA, Dunoyer P, Rahm N, Himber C, Voinnet O. In vivo investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance of the spatial distribution of a plant mirna. Gene Dev 2004; 18(18): Schwab R, Palatnik JF, Riester M, Schommer C, Schmid M, Weigel D. Specific effects of micrornas on the plant transcriptome. Dev Cell 2005; 8(4): Niu QW, Lin SS, Reyes JL, Chen KC, Wu HW, Yeh SD, et al. Expression of artificial micrornas in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol 2006; 24(11): Qu J, Ye J, Fang RX. Artificial microrna-mediated virus resistance in plants. 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6 438 综述 duction in Arabidopsis. Curr Biol 2007; 17(12): Zhang X, Li H, Zhang J, Zhang C, Gong P, Ziaf K, et al. Expression of artificial micrornas in tomato confers efficient and stable virus resistance in a cell-autonomous manner. Transgenic Res 2010; doi: /s Online First. 40 Khraiwesh B, Ossowski S, Weigel D, Reski R, Frank W. Specific gene silencing by artificial micrornas in Physcomitrella patens: An alternative to targeted gene knockouts. Plant Physiol 2008; 14 (2): Dmytro U, Chen KC, Yeh SD. Construction of artificial mirna for generating transgenic resistance against potyviruses in plants. Plant Pathol Bull 2008; 17(1): Rossi JJ. RNAi as a treatment for HIV-1 infection. Biotechniques 2006; 40(4): Rossi JJ, June CH, Kohn DB. Genetic therapies against HIV. Nat Biotechnol 2007; 25(12): Specific Gene Silencing by Artificial MicroRNA Qi-Zhen Chen, Zhi-Xian Zhang, Jia-Shu Cao* (Institute of Vegetable Science, Zhejiang University, Hangzhou , China) Abstract MicroRNAs are post-transcriptional regulators, composed by approximately 21 ribonucleic acid (RNA) molecules. By binding to complementary sequences of target genes, they can cause degradation of the mrnas of target genes or inhibit their translation. MicroRNAs have been implicated in processes and pathways such as development, cell proliferation, apoptosis, metabolism and morphogenesis, and in diseases including cancer. This paper aimed to introduce achieving silencing of target gene by using artificial micrornas, and applications of this method in life science. Key words artificial micrornas; RNAi; gene silencing Received: September 18, 2010 Accepted: November 30, 2010 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No ) *Corresponding author. Tel: ,