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眠延潘
5 years ago
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1 國立交通大學材料科學與工程研究所碩士論文以電化學法檢測人類乳突病毒序列之研究 The Study of Electrochemical Detection for the Sequence of Human Papillomavirus 研究生 : 魏伸紘指導教授 : 涂肇嘉博士蔡明蒔博士中華民國九十四年七月

2 以電化學法檢測人類乳突病毒序列之研究研究生 : 魏伸紘指導教授 : 涂肇嘉博士蔡明蒔博士國立交通大學材料科學與工程研究所中文摘要以電化學法去偵測病毒至今已有不少文獻被發表, 這種方法具有不錯的敏感度操作方便容易得到訊號等優點若是配合修飾電極表面, 可使偵測的結果更加明確, 並可提高偵測極限本論文主要是利用 6-Mercapto-1-hexanol(MCH) 修飾電極, 並將此電極用於分析在僅差幾個 mismatch 病毒檢測之應用實驗設計為針對子宮頸癌之高危險性人類乳突病毒 (human Papillomavirus; HPV)16 型 (HPV type16) 與 18 型 (HPV type18) 分別設計 3 特定探針序列 Probe16 與 Probe18, 利用 Fe( CN 6 ) / KNO3 溶液為設定之 3 環境狀態, 利用電化學法偵測這兩種家族間在 Fe( CN 6 ) / KNO3 溶液中的氧化還原反應, 如分離氧化還原波峰電位兩波峰電流比值間比較等等在這實驗中, 利用脫氧核糖核酸本身骨幹或雜交完後所帶的負電 II

3 3 荷與存在水溶液中 Fe ( CN 離子產生靜電力排斥反應 ; 或加入 MB 使 6 ) 脫氧核糖核酸呈電中性, 配合其它的適當條件與方法, 反應在電化學訊號進行偵測實驗中探討電極清洗電解質種類電解質濃度電化學行為緩衝液 ph 值高低影響單股種的時間雜交時間 MB 插入時間等參數, 並探討如何去除非專一性吸附的干擾並提高雜交率對於 Probe16 及 Probe18 序列在本實驗分開討論第一部份探討 Probe16 配合三種不同雜交股, 分別為錯位 ; 本實驗所得之結果是利用含硫醇基單 / 雜交股種在金電極表面為工作電極, 配合插入 MB 放大訊號之不同來比較以循環伏安法從負電位的方向往正電位方向掃引, 電解質為 100mM 的 KNO 3, 搭配固定 DNA 種上去時間來探討脫氧核糖核酸在金電極上電化學行為第二部份探討 Probe18 配合三種不同雜交股, 分別為錯位, 本實驗所得之結果是利用含硫醇基單 /MCH/ 雜交股種在金電極表面為工作電極,, 配合插入 MB 放大訊號之不同來比較以循環伏安法從負電位的方向從正電位方向掃引電解質為 100mM 的 KNO 3, 搭配固定 DNA 種上去時間來探討脫氧核糖核酸在金電極上電化學行為, 並與第一部份實驗數據比較之 III

4 針對 DNA 感測器的結構進行各項檢測, 電化學檢測電子傳輸情形 (Cyclic Voltammetry);DNA 的覆蓋率與雜交率 (Quartz Crystal Microbalance); 接觸角量測 DNA 的堆疊密度 (Contact angle), 希望能藉此得到高鑑別率且穩定的鑑識技術, 而利用亞甲基藍達到定性的功用, 與 QCM 相互印證 DNA 覆蓋率由本研究之發現, 綜合言之可列舉如下 : 1. 金電極表面的乾淨度是影響 DNA 接和的最重要因素 2. DNA 緩衝液配置與種完單 / 雙股後清洗對於電化學訊號影響 3. 在此實驗中,DNA 之非特異性吸附會影響雙股間雜交率 4. 次甲基藍對於雜交股 DNA 會有放大訊號功能 5. 次甲基藍可放大效果可鑑別出同一家族中具有錯位之 DNA 6. 利用 MCH 當作單股 DNA 之間係物 (spacer), 可有效提升雙股間雜交率至 100% 且避免非特異性吸附 7. 經由 QCM 驗證, 與其電化學量測結果是相互配合 IV

5 The study of Electrochemical detection for the sequence of Human Papilloma Virus Student:Chih-Hao Lin Advisor: Dr. George C. Tu Institute of Materials Science and Engineering National Chiao Tung University Abstract Dr. Ming-Shih Tsai Many theses of electrochemical methods detecting DNA virus have been announced and the electrochemical methods have good sensitivity, convenient operation, easy to get the signals. After the modified electrode, we will get the result more explicit. This thesis mainly used the modified electrode with 6-Mercapto-1-hexanol (MCH) to detect the DNA viruses that are different from several of mismatches. There were two kinds of high risk sequences that we choose in this experiment between human papilloma viruses. After detecting women who had cervical cancer, Probe 16 and Probe 18 are two of the sequences that appear most often. In other words, it may imply that Peobe16 and Probe 18 could be applied to detect cervical cancer. We set up electrolytic environment that contains ferricyanide and potassium nitrate, and detect the redox reactions of two family types by electrochemical method. For example the separation redox peak potentials or the ratio of redox peak current. V

6 In this experiment, some reactions that we know just like the repulsive reaction between the negative charge backbone of nucleotide and ferricyanide anions in electrolytic solution;or nucleotide base pair intercalated Methylene blue is presented charge neutrality. If matching with appropriated methods, the signal of electrochemical reactions can be detected. We inquired into the items of electrode cleaning, electrolyte type, concentration of electrolyte, electrochemical behavior, ph effect of buffer solution, probe single-strand DNA in different time, hybridized time, intercalating MB in different time. We also inquired into how to rid of non-specific binding and increase the hybridization ratio. Peobe16 and Probe18 were discussed separately in this experiment. At part I, we inquired into type Probe 16 with three different hybridized DNA, including mismatch DNA sequences;the results of the experiment are following: The working electrode was modified a monolayer containing ssdna/dsdna, and then adding methylene blue to compare with each electrodes that get the increasing signals. The direction of sweep was from negative potential to positive potential by method of cyclic voltammetry. The electrolyte is 100M KNO3; ph value of buffer solution was 5.7. Parameters above were arranged to collocate different probing time to discuss the electrochemical behavior of gold electrode modified DNA. VI

7 At part II, we inquired into type Probe 18 with three different hybridized DNA, including mismatch DNA sequences;the results of the experiment are following: The working electrode was modified a monolayer containing ssdna/mch/dsdna, and then adding methylene blue to compare with each electrodes that get the increasing signals. The direction of sweep was from negative potential to positive potential by method of cyclic voltammetry. The electrolyte is 100M KNO3; ph value of buffer solution was 7.0. Parameters above were arranged to collocate different probing time to discuss the electrochemical behavior of gold electrode modified DNA, and use these data to compare with the data of part I. We use many methods and instruments to make sure that the DNA sensor is completely. For example, the electron transfer condition(cv), the coverage and the hybridization ratio of the DNA(QCM), and the packing density of the DNA(CA).We hope to develop more stable and reliable fabrication process to produce more accurate DNA sensor. In this study, several of results can be found: 1. The most important of the DNA coverage on the gold electrode is the gold surface cleaning. 2. The effect of DNA buffer solution and the cleaning step after immobilizing ssdna/dsdna on electrochemical signals. 3. The non-specific binding of DNA will decrease hybridization VII

8 ratio. 4. DNA intercalated Methylene Blue will increase signals. 5. We can identify mismatch DNA by adding Methylene Blue. 6. We can improve hybridization ratio and avoid non-specific binding by adding Mercaptohexanol. 7. The results from electrochemical measurements can be matched with that from QCM. VIII

9 致謝由衷感謝在我碩士兩年來給予我指導三位老師, 首先, 感謝指導教授涂肇嘉老師給予我優良學習空間及見解 ; 生科所林志生老師提供我 DNA 方面的資源與合成技術 ; 最後是國家奈米元件實驗室副主任蔡明蒔博士在這一年多來無私指導與付出, 在上下班之餘還要抽空線上或研討室與我們討論實驗進度, 給予我實驗正確方針真的非常感激以上三位老師無私的奉獻與教誨再來要向政煜學長旺申學長寶明學長秉緯學長說聲謝謝你們尤其是寶明政煜與志豪感謝你們適時的關心, 提供實驗研究上的建議與協助, 讓我這一路上走的更順利最後, 對於美儀姐在實驗上對我的關心, 使我永生難忘除此, 對別提出我的實驗上伙伴, 徐繹翔感謝你每次都要幫我置備 DNA 樣品, 不管是多晚, 只要一通電話, 你就會放下手邊的是, 義不容辭先幫我配好 ; 並可以陪我作實驗到半夜, 可以隨時討論實驗上所遇到問題並感謝林勝結謝逸凡學長處理實驗室大大小小的事務, 讓我在實驗中不用煩惱實驗室瑣碎繁雜的事當然, 除了在我學習歷程當中, 最最感謝是我家中爸爸, 辛苦工作一整天來提供我的花費與開銷, 再來感謝我敬愛的媽媽費心處理家中大小事務使我無須擔 IX

10 心, 還有我前女友 - 淑芬, 感謝你在我人生最失意時候給予我鼓勵與信心, 讓我相信我是最棒的 ; 最後, 特別感謝怡文及千容在我畢業前幾個月, 陪我度過這段悲傷日子, 給我關心與信心 X

11 總目錄中文摘要英文摘要致謝總目錄圖目錄 II V IX XI XV 表目錄 XVIII 第一章緒論研究動機與目的研究內容第二章文獻回顧生物檢測器簡介生物感測器之緣起與發展生物檢測器之定義與種類生物元件之修飾法電化學簡介電化學反應系統 XI

12 2.3.2 影響電化學反應系統的因素電極動力學 :Bulter-Volmer 方程式伏特安培法可逆與不可逆反應交流阻抗法分析法交流阻抗分析法之原理交流阻抗分析法之應用化學修飾電極的備製方法導電 DNA 簡介導電 DNA 歷史回顧去氧核醣核酸組成結構 DNA 導電機制催化 DNA 訊號放大機制第三章實驗材料設備與方法病毒 DNA 序列介紹實驗藥品緩衝液配置實驗設備 XII

13 3.4.1 電化學腐蝕量測系統石英晶體微量天平其他實驗裝置設備實驗方法金電極製作流程金電極清洗流程量測電化學前置作業單股 DNA 吸附金電極 S-Au 鍵結原理單股 DNA/MCH 修飾於金電極表面上 MCH 當間距物原因雙股 DNA 雜交雜交原理雙股 DNA/MB 作用亞甲基藍第四章結果與討論影響循環伏安法因素探討電解液對伏安電位與電流之影響 XIII

14 4.1.2 掃瞄速率對在金電極表面上伏安圖變化探討單股 DNA 覆蓋率影響之因素緩衝液對單股 DNA 覆蓋於金電極上之影響種植單股 DNA 時間對於覆蓋金電極上之影響電極表面經 DNA 修飾之循環伏安之定性測試嵌入劑在多聚陰離子雙股螺旋之電荷補償嵌入劑濃度對於完全互補股 DNA 之電化學訊號影響嵌入劑時間對於完全互補股 DNA 之電化學訊號影響嵌入劑分別在單 / 雙股 DNA 之插入之機制 MCH 在金電極表面之電化學訊號影響電化學檢測 V16 序列之病毒完全互補股 DNA 之電化學測試 mismatch DNA 之電化學測試 mismatch DNA 之電化學測試電化學檢測 V18 序列之病毒完全互補股 DNA 之電化學測試 mismatch DNA 之電化學測試 mismatch DNA 之電化學測試完全不互補 DNA 之電化學測試 XIV

15 4.7 利用接觸角測量在金電極上不同單 / 雙股之特性利用石英晶體微量天平量測單 / 雙 DNA 間質量變化 V16+T16 DNA 之微量天平圖 V16+ T6 DNA 之微量天平圖 V16+ * T16 DNA 之微量天平圖第五章結論參考文獻圖目錄圖 2-1 生物檢測器結構示意圖圖 2-2 不可逆電極反應之自由能外形圖 2-3 循環伏安法之電位施予形式示意圖圖 2-4 為理想之電化學介面的 (b) 阻抗圖譜與其 (a) 等效電路圖 2-5 (a) 等效電路中加入 Warburg 擴散阻抗元件與電荷轉移阻抗串聯 ;(b) Warburg 擴散阻抗在 Nyquist 圖譜中影響圖 2-6 去氧核醣核酸組成結構圖 2-7 核苷酸基本結構與鹽基鍵結示意圖 XV

16 圖 2-8 DNA 導電機制 (a) 超交換相互作用或穿遂效應作用於 DNA bridge 中 ;(b) 為電荷跳躍 ;(c)a-hopping 或 G-hopping 圖 2-9 描述當亞甲基藍加入在修飾過 DNA 金電極表面上對 Fe(CN)6 3- 之影響圖 3-1 製備金電極流程圖 3-2 MCH 在單股之間功用圖 3-2 亞甲基藍化學結構圖 3-3 亞甲基藍為一典型的次甲基藍吸收光譜圖 4-1 為電活化物 (Fe +3 ) 在不同濃度之下之循環伏安圖圖 4-2 為在 5mM KNO 3 濃度下改變 (Fe +3 ) 之循環伏安圖圖 4-3 為在 5mM (Fe +3 ) 濃度下改變 KNO 3 濃度之循環伏安伏安圖圖 4-4 為掃瞄速率對固定濃度電活化物 (Fe +3 ) 之循環伏安圖圖 4-5 為在掃瞄速率平方根 vs. 還原峰電流值圖 4-6 為單股 DNA 在緩衝液濃度為 0M 之循環伏安圖圖 4-7 為單股 DNA 在緩衝液濃度為 1M 之循環伏安圖圖 4-8 為單股 DNA 在金電極表面上不同時間之循環伏安圖圖 4-9 為金電極表面修飾過單雜交股 DNA 之循環伏安圖 XVI

17 圖 4-10 為改變金電極表面電荷和經表面修飾過後之電化學反應介於 Fe(CN 6 ) -3 和電極圖 4-11 為完全互補 DNA 在不同濃度之亞甲基藍 10 分鐘反應之循環伏安圖圖 4-12 為完全互補 DNA 在固定亞甲基藍濃度配合不同插入時間下之循環伏安圖圖 4-13 為亞甲基藍插入在完全互補 DNA 之循環伏安圖圖 4-14 為亞甲基藍插入在單股 DNA 之循環伏安圖圖 4-15 為 MCH 在在金電極之循環伏安圖圖 4-16 為亞甲基藍插入在完全互補股 DNA 之循環伏安圖圖 4-17 為亞甲基藍插入在 3 Mismatch DNA 之循環伏安圖圖 4-18 為亞甲基藍插入在 7 Mismatch DNA 之循環伏安圖圖 4-19 為亞甲基藍插入在完全互補 DNA 之循環伏安圖圖 4-20 為亞甲基藍插入在 4 Mismatch DNA 之循環伏安圖圖 4-21 為亞甲基藍插入在 6 Mismatch DNA 之循環伏安圖圖 4-22 為完全不互補 DNA 之循環伏安圖圖 4-23 為單股 DNA 隨種在金電極表面時間之角度變化圖 4-24 為 DI water 對單 / 雙股之接觸角度之變化圖 4-25 為 bare Au+V16+T16 之頻率變化圖 XVII

18 圖 4-26 為 bare Au+V16+T6 之頻率變化圖圖 4-27 為 bare Au+V16+ * T16 之頻率變化圖表目錄表 2-1 多種修飾法之原理優缺點比較表 3-1 病毒 DNA 序列表 4-1 電解液中濃度配置表表 4-2 Probe 16 與 Probe 18 加入不同雜交股之可逆反應 XVIII

全唐诗50

全唐诗50 ... 1... 1... 2... 2... 3... 3... 3... 4... 4... 5... 5... 6... 6... 6... 7... 7... 7... 8... 8... 8... 9 I II... 9...10...10...10...11...11...11...12...12...12...13...14...14...15...15...16...16...16...17,...17...18...18...19...19...19