中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2017, 39(5): DOI: /cjcb mir133a 通过下调 Gdnf 基因表达抑制输尿管芽的发育吕中石毛昭敏翁亚光周钦 * ( 重庆医科大学检

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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 217, 39(5): DOI: /cjcb 通过下调 Gdnf 基因表达抑制输尿管芽的发育吕中石毛昭敏翁亚光周钦 ( 重庆医科大学检验医学院, 重庆 416) 摘要该研究预测并验证了在后肾间充质细胞中对输尿管芽发育关键因子 Gdnf(glial cell line derived neurotrophic factor) 基因表达的调控作用, 探讨了其抑制输尿管芽发育的作用通过生物信息学分析发现, Gdnf mrna 非翻译区 ( untranslated regions, UTR) 在不同物种间高度保守, 并且存在等的结合位点双荧光素酶报告基因实验显示, 可以结合在 Gdnf mrna UTR 上 Real-time PCR 和 Western blot 结果证实, 显著地抑制 Gdnf 的 mrna 水平和蛋白质水平解离重聚胚肾离体培养实验结果显示, 抑制输尿管芽的发育该研究结果表明, 通过靶向结合于 Gdnf mrna 的 UTR, 下调 Gdnf 基因的表达, 从而抑制输尿管芽的发育关键词微 RNA; ; Gdnf; 输尿管芽发育 Down-Regulates the Expression of Gdnf Gene to Inhibit the Development of Ureteric Bud Lü Zhongshi, Mao Zhaomin, Weng Yaguang, Zhou Qin (The School of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongiqng 416, China) Abstract The present study predicted and testified that could regulate glial cell line derived neurotrophic factor (Gdnf), a protein generated by metanephrogenic mesenchyme (MM), which is of great importance in the development of ureteric bud (UB) and investigated inhibitory effect of towards the development of UB. Bioinformatics analysis displayed the high conservation of the Gdnf mrna untranslated regions (UTR) between different species and predicted that could probably bind to it. The results of luciferase assay confirmed that could directly target Gdnf mrna UTR. The results of Real-time PCR and Western blot revealed that down-regulated the expression of Gdnf both at mrna and protein levels. Furthermore, we found significant reduction in the ability of treated cells to contribute to ureteric bud formation in embryonic kidney rudiments culture system. Taken together, our results suggest that might inhibit the formation of ureteric bud through its binding to complementary sequences in the Gdnf mrna UTR. Keywords microrna; ; Gdnf; ureteric bud development 微 RNA(microRNA, mirna) 是一类内源性的小分子 ( 至多 22 nt)rna, 属于非编码基因家族 mirna 通过碱基互补结合在编码基因的 mrna 非翻译区 ( untranslated regions, UTR) 在多种细胞过程中发挥重要的调控作用 mirna 最为熟知的功能就是通过转录后调控方式调控编码基因的表达据收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 ( 批准号 : ) 资助的课题通讯作者 Tel: , zhouqin@cqmu.edu.cn Received: February 15, 217 Accepted: March 2, 217 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No , ) Corresponding author. Tel: , zhouqin@cqmu.edu.cn 网络出版时间 : :55:38 URL:

2 582 研究论文前人研究报道, 绝大多数的编码基因都可被 mirna 通过靶向结合在 mrna UTR 所调控, 导致其蛋白质合成受到抑制或者 mrna 的降解 [1] mirna 的作用很广泛, 参与了很多发育和细胞过程, 例如细胞增殖分化和凋亡等 [2] 尽管最开始 Gdnf(glial cell line derived neurotrophic factor) 被认为是神经分子, 但是在胚肾发育过程中, 作为关键因子, 由肾单位祖先细胞肾帽状间充质细胞旁分泌, 在调控输尿管芽形成及其之后的分支等形态发育过程中发挥重要作用 [3-4] Gdnf 基因敲除的小鼠导致一系列的肾脏表型, 如输尿管芽不能形成肾发育不全肾体积严重减小等 [5-8] Gdnf 在胚肾发育 ( 尤其是输尿管发育 ) 过程中发挥至关重要的作用, 但其是否能被 mirna 调控目前报道很少本研究首次报告 Gdnf mrna UTR 上存在 mirna 结合位点, 并研究 mirna 对 Gdnf 基因表达的调控作用及其对输尿管芽发育的作用 1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂人胚肾 293 细胞 (HEK293T) 购自 ATCC 细胞库后肾帽状间充质细胞 mk3 细胞系由美国儿童医学中心 (Children s Hospital Medical Center, Ohio) 的 S. Steven Potter 教授赠送 DMEM 培养基胎牛血清 Trizol 总 RNA 提取试剂盒逆转录试剂蛋白质定量试剂盒山羊抗兔和抗鼠荧光二抗脂质体转染试剂 (Lipofectamine 2) 购自 Thermo 公司 UltraSYBR Mixture Real-time PCR 试剂购自 TaKaRa 公司 CalbindinD28K 鼠单克隆抗体购自武汉博士德公司羊抗兔多克隆抗体层黏连蛋白 (laminin) 购自 Sigma 公司羊抗兔多克隆抗体 Gdnf 购自于 Santa 公司辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 抗体购自 Proteintech 公司电化学发光试剂 (ECL) 购自 Millipore 公司双荧光素酶报告基因实验试剂购自 Promega 公司 mimic 由广州锐博公司合成 C57 小鼠购买并饲养于重庆医科大学动物中心 1.2 质粒构建 Gdnf 基因的 UTR 通过 PCR 克隆自 C57 小鼠基因组, 该 PCR 产物连接入 pcdna3.1-luc 质粒 Gdnf 基因的编码序列 (coding sequences, CDS) 克隆自小鼠肾脏 cdna, 并被连接入 pdsaav-cb-egfp 载体 mirna 的种子序列克隆自 C57 小鼠基因组, 接入 pdsaav-cb-egfp 质粒突变载体的方法参考已发表的文献 [9] 1.3 细胞培养和细胞转染 HEK293T 和 mk3 细胞用含有 1% 胎牛血清和 1% 的青链霉素的 DMEM 培养基, 在 37 C 5% 二氧化碳的孵箱中培养 pcdna3.1-luc 和 pdsaavmirna 通过磷酸钙转染法转染进入 HEK293T 细胞 pdsaav-cb-egfp 载体和 mirna mimic 通过脂质体 (Lipofectamine 2) 转染法转染入 mk3 细胞, 具体方法按照 Lipofectamine 2 转染试剂说明书进行 1.4 双荧光素酶报告基因实验在 HEK293T 细胞中共转染 pdsaav-mirna 和 pcdna3.1-luc 质粒 [ 野生型 Gdnf 和突变型 Gdnf (UTR)] 转染 48 h 后, 用 1 PBS 缓冲液润洗细胞, 用 1 μl 1 裂解液裂解细胞, 通过 Promega 公司配套的荧光检测仪器检测荧光素酶活性, 具体步骤根据 Promega 双荧光素酶报告基因实验试剂说明书所得各组样品对应的荧光素酶活性, 以海肾荧光素酶活性为内参照, 即相对活性设置为萤火虫荧光素酶 / 海肾荧光素酶比值, 统计分析 mirna 对荧光素酶活性的影响, 判断 mirna 对 Gdnf 的调控能力 1.5 免疫荧光将离体培养的胚肾组织用 4% 多聚甲醛 4 C 固定过夜, 加入 5 μl 1 PBS 清洗 1 次, 以去除残留多聚甲醛, 用组织冰冻切片 OCT 包埋剂 (Tissue OCT- Freeze Medium) 包埋, 冷冻固定后切片 ( 厚度 5 μm), 将切片放入培养皿, 用 5 μl 1 PBS 室温静置漂洗 15 min 加入 5 μl 封闭液 (1 PBS 溶液中加入终浓度为 3% 牛血清白蛋白和.1% Triton X-1), 室温静置 2 h 在 4 C 条件下, 一抗 (CalbindinD28K 和层黏连蛋白, CalbindinD28K 为胚肾中输尿管芽的标志物, 层黏连蛋白是胚肾发育中后肾帽状间充质细胞 [1] 发育形成的肾小囊的标志物 ) ( 1 孵育过夜(1 取出切片放到 24 孔板中, 轻轻加入 5 μl 1 PBS, 漂洗 15 min 3 次室温荧光二抗孵育 2 h, 轻轻加入 5 μl 1 PBS 漂洗 15 min 3 次 5 μg/ml DAPI 染色 15 min, 轻轻加入 5 μl 1 PBS, 漂洗 15 min 3 次荧光显微镜观察 1.6 Real-time PCR 转染 mirna 48 h 后收集细胞, 弃去培养基, 用 1 PBS 润洗 3 次, 加入 5 μl Trizol(Invitrogen 公司 ), 提取 mk3 细胞总 RNA, 将 1 μg 总 RNA 用逆转录试剂

3 吕中石等 : 通过下调 Gdnf 基因表达抑制输尿管芽的发育 583 盒 (Thermo Scientific 公司 ) 合成 cdna, 18S 作为内参, 用 Real-time PCR 检测 Gdnf mrna 水平, 反应条件参照 Real-time PCR 试剂盒 [UltraSYBR Mixture(TaKaRa 公司 )] 说明书各引物见表免疫印迹转染 mirna 48 h 后收集细胞, 用 1 PBS 洗涤细胞 3 次, 加入 3 μl 细胞裂解液裂解细胞, 将裂解液转移至 EP 管中, 煮沸 1 min 将样品进行 SDS-PAGE 电泳, 转膜 9 min, 封闭 1 h, 一抗 4 C 孵育过夜, 二抗常温孵育 2 h, 再进行化学发光显像, 检测 Gdnf 蛋白质水平的变化 1.8 解离重聚胚肾体外培养将 E12.5 天的 C57 小鼠胚胎肾脏分离出来, 用胶原酶将其酶解成单个细胞, 再用脂质体法将和阴性对照分别转染到两组解离的胚肾细胞中, 做好标记, 再将其重聚形成胚肾组织, 培养在培养基上漂浮的滤膜上 ( 提供其生长的张力 ) 并让其继续 [1] 分化发育, 48 h 后用 4% 多聚甲醛固定, 包埋切片 1.9 数据统计采用 GraphPad Prism 5 统计学软件进行数据分析, 组间差异通过 One-Way ANOVA 比较分析, 所有的实验至少独立重复 3 次, 统计结果以平均值 ± 标准差表示, P<.5 认为差异有统计学意义 2 结果 2.1 生物信息学预测靶向 Gdnf mrna 的 UTR 为了探究 Gdnf 的 mrna UTR 的保守性, 我们利用在线生物信息学工具 UCSC(University of California Santa Cruz genome database) 对比了不同物种间的序列 Gdnf mrna UTR 全长共 bp, 在人恒河猴眼镜猴狗等不同物种间高度保守 ( 图 1) 随后, 我们试图找出能结合在 Gdnf mrna UTR 潜在的 mirnas 我们利用三个 mirna 预测网站 (mirwalk microrna.org 和 TargetScan) 综合分析, 找到共同预测的 mirna( 图 2A), 包括 mirna133a mirna133b 和 mirna96 其中, 的种子序列与 Gdnf mrna UTR 的结合序列, 在不同物种之间是保守的 ( 图 2B) 这些结果表明, Gdnf mrna UTR 高度保守, 而且有可能靶向结合 Gdnf mrna UTR 2.2 靶向结合于 Gdnf mrna 的 UTR 为了研究是否能够直接靶向 Gdnf mrna 的 UTR, 我们使用磷酸钙转染方法共转染 pcdna3.1-luciferase-utr prl-sv4( 内参质粒 ) 和 pdsaav--cb-egfp 或 pdsaav-cb-egfp 质粒 ( 图 3A) 到 HEK293T 细胞与对照组比较, 过表基因名称 Gene name mir133b mir96 mir9-3 Gdnf-UTR-WT Gdnf-UTR-Mut1 Gdnf-UTR-Mut2 Gdnf-Real-time 18S-Real-time 表 1 引物列表 Table 1 The list of the primers 引物序列 Primer sequence Upstream primer: -ATT TCA GGT CCC GGA AGC TCT GTG AGA GGT TAG TC- Downstream primer: -TGC ACC ACC ACC GGA TGT TGA GCA TGT GAC CTG TG- Upstream primer: -ATT TCA GGT CCC GGA GTC TGA ATG TAC ATG TGA CC- Downstream primer: -TGC ACC ACC ACC GGA TTC TTG GAT CTG ACC ATT GC- Upstream primer: -ATT TCA GGT CCC GGA AAC AGA GCA GAG ACA GAT CC- Downstream primer: -TGC ACC ACC ACC GGA CAG GCA GTG AAA GGT GAT CT- Upstream primer: -ATT TCA GGT CCC GGA GTG TGT CTG TGT GTC TGT CG- Downstream primer: -TGC ACC ACC ACC GGA AGG AGG AGG TGA AGG GAA TG- Upstream primer: -CTT GGT ACC GAG CTC CGG TGT GGA TGT ATC TGA CC- Downstream primer: -TGC TGG ATA TCT GCA CGA CCG AGA CAT CAG AGA GG - Upstream primer: -TGC TAC AGT GCG AAG AAA GCG TGC TAC GTT CCC AGG AAA TGT- Downstream primer: -GCA AAC ATT TCC TGG GAA CGT AGC ACG CTT TCT TCG CAC TGT- Upstream primer: -TGC CCA GAG TGG AAG ATA ACG TGC TAC ATG GCG GAG GCA GAG- Downstream primer: -CTG CCT CTG CCT CCG CCA TGT AGC ACG TTA TCT TCC ACT CTG- Upstream primer: -CGG AGG CAG AGG CAG AAG AA- Downstream primer: -GCC ACC CTG AAG TGC TCA GA- Upstream primer: -GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT- Downstream primer: -CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG-

584 研究论文 Chr15(qA1) 15qA1 15qA2 15qB1 B2 15qB3,1 B3,3 qc 15qD1 D215qD3 15qE1 E2 15qE3 15qF1 Gdnf UTR Rat Rabbit Human Tree-shrew Dog Shrew Elephant Opossum Platpus Chicken Zebrafish 2 743 bp Shade

4 584 研究论文 Chr15(qA1) 15qA1 15qA2 15qB1 B2 15qB3,1 B3,3 qc 15qD1 D215qD3 15qE1 E2 15qE3 15qF1 Gdnf UTR Rat Rabbit Human Tree-shrew Dog Shrew Elephant Opossum Platpus Chicken Zebrafish bp Shade Score in range 图 1 生物信息学分析 Gdnf mrna UTR 在不同物种间的保守性 Fig.1 Bioinformatic analysis of the conservation of Gdnf mrna UTR mir298 mir24 mir23b mir142 mir145 mirwalk mir484 mir211 mir34c mir182 mir3c mir3e mir33 mir363 mir9 mir25 mir129 mir133b mir96 mir3a mir3b mir3d mir3f mir133c mir57 mir384 mir1271 TargetScan microrna.org mir32 mir28 mir7b mir145 mir7a mir33 mir195 mir146a mir143 mir15a mir34 mir216b mir2a mir542 mir92b mir326 mir1192 mir216a mir361 mir125a mir495 mir367 mir146b mir346 mir78 mir92a Gdnf Seed 1 (54 bp) Seed 2 (97 bp) - - Human Chimpanzee Mouse Cow Conserved sequence A: 三个生物信息学网站预测 Gdnf mrna UTR 上结合的潜在 mirna; B: 在 Gdnf mrna UTR 上可能的结合位点 A: the prediction of the potential mirnas which can target the UTR of Gdnf mrna through three bioinformatics websites; B: the potential binding sites of towards the UTR of Gdnf mrna. 图 2 生物信息学预测 Gdnf mrna UTR 上结合的 mirna 及与其结合位点 Fig.2 Bioinformatic analysis of the putative mirnas binding on Gdnf mrna UTR and putative target sites for

5 吕中石等 : 通过下调 Gdnf 基因表达抑制输尿管芽的发育 585 pcdna3.1-gndf SV4-Promoter Luciferase Gndf UTR (C) Luciferase activity (ratio) pdsaav WT Mut1 Mut2 Mut2+Mut2 CB Promoter mirna EGFP mir133b mir96 A: 荧光素酶报告试验所用质粒示意图 ; B: 用荧光素酶报告实验检测在转染了不同的 mirna 的质粒 ( 对照 mirna mir133b mir96 mir9-3) 之后, 正常 Gdnf 报告载体荧光素酶活性的变化, P.5, 与对照组比较 ; C: 用荧光素酶报告试验检测在转染了对照 mirna 或后, 正常 Gdnf 报告载体和三个 Gdnf 种子序列突变载体的荧光素酶活性的变化, P.5 A: The schematic diagram of the plasmids used in the luciferase report assay; B: the luciferase activity of the wild type Gdnf reporter vector after the transfection of different plasmids of mirna (control mirna, mir133b,, mir96, mir9-3), P.5 vs control group; C: the luciferase activity of the wild type and the mutant type Gdnf reporter vector after the transfection of control mirna or, P.5. 图 3 靶向结合于 Gdnf mrna 的 UTR mir9-3 Luciferase activity (ratio) Fig.3 targets mrna UTR of Gdnf WT Mut1 Mut2 Mut1+Mut2 达的实验组荧光比值显著下降 (P<.5), 而其他潜在 mirna 的荧光比值变化无统计学差异 ( 图 3B) 将 UTR 上的的结合序列突变后 ( 图 3A), 实验组和对照组差异无统计学意义 ( 图 3C) 综上所述, 这些数据表明, 能直接结合于 Gdnf mrna 的 UTR 2.3 下调 Gdnf 的 mrna 和蛋白质随后, 我们探究了是否能够功能性调控内源性 Gdnf 基因的表达将 mimic 和阴性对照 (1 nmol/l) 分别转染到后肾帽状间充质细胞 mk3 细胞转染后, Gdnf mrna 水平 (P<.5) 和蛋白质水平明显下降 ( 图 4A 和图 4B) 此结果提示, 能功能性下调 Gdnf 的表达 2.4 抑制胚肾输尿管芽的发育根据前人研究, 在胚肾发育过程中 Gdnf 由后肾帽状间充质细胞分泌到帽状间充质细胞与输尿管芽 [5-8] 的间隙, 诱导输尿管芽的生成和发育由于上述研究发现, 抑制 Gdnf 的表达, 我们接着检测了对输尿管芽发育调控的影响采用解离 [1] 重聚的方法体外培养胚肾组织, 并在重聚之前将和阴性对照分别转染到离体培养的胚肾组织中结果显示, 与对照组相比, 处理组的输尿管芽数量显著减少 (P<.5)( 图 5A 和图 5B) 以上结果表明, 能够抑制胚肾发育过程中的输尿管芽的发育 3 讨论哺乳动物胚胎肾脏发育主要是后肾帽状间充质细胞与输尿管芽相互诱导共同发育的过程, 前者最终分化发育成为肾单位, 而后者发育为输尿管两者在发育过程中的相互诱导主要依赖各自旁分泌的因子, 比如 Gdnf 就是已知的由后肾帽状间充质细胞分泌并调控输尿管芽发育的最重要的因子之一研究 Gdnf 的调控网络对研究胚肾发育, 尤其是输尿管的发育过程尤为重要已有报道称, Gdnf 在哺乳动物的后肾发育过程中主要表达在后肾帽状间充质细胞中作为分泌因子, 其能结合在输尿管芽细胞上的 Ret 酪氨酸激酶受体, 激活 PI3K(phosphatidyl inositol-3-kinase) 和 EKR(extracellular signal-related kinase) 信号通路, 进而促进输尿管芽细胞的迁移和

研究论文 586 Relative expression of Gdnf 1.5 1. Gdnf 24 kda β-tubulin 55 kda.5 A: Real-time PCR检测转染对照miRNA或后对Gdnf的mRNA水平的影响, P.

6 研究论文 586 Relative expression of Gdnf Gdnf 24 kda β-tubulin 55 kda.5 A: Real-time PCR检测转染对照miRNA或后对Gdnf的mRNA水平的影响, P.5, 与对照组比较; B: 免疫蛋白印迹法检测转染对照 mirna或后对gdnf蛋白水平的影响 A: the mrna level of Gdnf after the transfection of control mirna or measured by Real-time PCR, P.5 vs control group; B: the protein level of Gdnf after the transfection of control mirna or measured by Western blot. 图4 抑制Gdnf的mRNA和蛋白质水平 Fig.4 decreases the mrna and protein level of Gdnf CalbindinD28K Laminin Merge 2 μm 2 μm 2 μm 2 μm 2 μm 2 μm CalbindinD28K/laminin A: 免疫荧光检测胚肾在解离重聚过程中转染对照miRNA或后肾脏的发育情况, CalbindinD28K为胚肾中输尿管芽的标志物, laminin(层黏连蛋白)是胚肾发育中后肾帽状间充质细胞发育形成的肾小囊的标志物; B: 免疫荧光结果的定量分析图, CalbindinD28K与laminin二者的比率代表输尿管芽的发育情况, P.5, 与对照组比较 A: the immunofluorescence detection of embryo kidney after the transfecction of control mirna or in the process of dissociation and reaggregation, CalbindinD28K is the marker of ureteric bud, laminin is the marker of renal vesicles generated from the cap mesenchymal during the embryo kidney development; B: Histogram shows the semi-quantitive analysis of the immunoﬂuorescence results, the ratio between CalbindinD28K and laminin represents the the development of ureteric bud, P.5 vs control group. 图5 对输尿管芽发育的影响 Fig.5 The effect of on the development of ureteric bud

7 吕中石等 : 通过下调 Gdnf 基因表达抑制输尿管芽的发育 587 [8] 增殖, 这对输尿管的发育至关重要前人的研究主要集中在研究 Gdnf/Ret 通路激活下游靶基因, 促进输尿管芽的发育, 而 Gdnf 的上游调控鲜有报道本研究主要关注 mirna 这一作用广泛的调控因子, 尤其是通过调控 Gdnf 基因表达, 参与输尿管芽发育的 mirna 前人的研究结果和本课题的前期研究结果都显示, mirna 能够通过靶向调控胚肾发育的关键因子从而参与胚肾发育但以往的研究大多集中于调控肾单位发育的 mirna, 而对调控输尿管芽发育的 mirna 关注较少本研究首次通过生物信息学方法分析了 Gdnf mrna 的 UTR, 并预测了能与其靶向结合的 mirna 我们发现, 多个网站共同预测到, 并且获知能结合的 Gdnf mrna UTR 序列在多个物种中高度保守这提示了在靶向结合 Gdnf mrna UTR 并参与输尿管芽发育的潜在可能性前人关于的研究主要集中于其对癌症的调控作用, 例如恶性神经胶质瘤肝细胞癌子 [14-16] 宫内膜癌等而我们的研究发现, Gdnf mrna UTR 存在的结合位点在双荧光素酶报告基因系统中, 过表达能够显著抑制 Gdnf 荧光素酶报告基因载体的荧光酶活性同时, 能下调 Gdnf mrna 和蛋白质水平在离体胚肾培养实验中, 还能够抑制输尿管芽的发育这些数据, 不仅很好吻合了前人关于 mirna 和 [5-8,11-13] Gdnf 作用的研究结果, 而且证实了能够靶向 Gdnf mrna, 下调 Gdnf 表达, 并参与胚肾输尿管芽的发育, 为进一步理解胚肾发育的复杂分子机制提供了实验基础 Gdnf mrna UTR 是否结合其他 mirna? 是否能够在体内调控 Gdnf 基因表达及输尿管芽发育? 这些都需要在基因敲除小鼠模型上作深入的研究参考文献 (References) 1 Pillai RS, Bhattacharyya SN, Filipowicz W. Repression of protein synthesis by mirnas: How many mechanisms? Trends Cell Biol 27; 17(3): Garofalo M, Condorelli GL, Croce CM, Condorelli G. MicroRNAs as regulators of death receptors signaling. Cell Death Differ 21; 17(2): Yosypiv IV. Renin-angiotensin system-growth factor cross-talk: A novel mechanism for ureteric bud morphogenesis. Pediatr Nephrol 29; 24(6): Basson MA, Watson-Johnson J, Shakya R, Akbulut S, Hyink D, Costantini FD, et al. Branching morphogenesis of the ureteric epithelium during kidney development is coordinated by the opposing functions of GDNF and Sprouty1. Dev Biol 26; 299(2): Pichel JG, Shen L, Sheng HZ, Granholm AC, Drago J, Grinberg A, et al. Defects in enteric innervation and kidney development in mice lacking GDNF. Nature 1996; 382(6586): Moore MW, Klein RD, Farinas I, Sauer H, Armanini M, Phillips H, et al. Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nature 1996; 382(6586): Costantini F. Renal branching morphogenesis: Concepts, questions, and recent advances. Differentiation 26; 74(7): Costantini F, Shakya R. GDNF/Ret signaling and the development of the kidney. Bioessays 26; 28(2): Bryksin AV, Matsumura I. Overlap extension PCR cloning: A simple and reliable way to create recombinant plasmids. Biotechniques 21; 48(6): Unbekandt M, Davies JA. Dissociation of embryonic kidneys followed by reaggregation allows the formation of renal tissues. Kidney Int 21; 77(5): Sakr M, Takino T, Sabit H, Nakada M, Li Z, Sato H. mir-15-5p and mir-133a suppress glioma cell proliferation and migration through targeting membrane-type-1 matrix metalloproteinase. Gene 216; 587(2): Tao J, Wu D, Xu B, Qian W, Li P, Lu Q, et al. microrna-133 inhibits cell proliferation, migration and invasion in prostate cancer cells by targeting the epidermal growth factor receptor. Oncol Rep 212; 27(6): Suzuki S, Yokobori T, Tanaka N, Sakai M, Sano A, Inose T, et al. CD47 expression regulated by the mir-133a tumor suppressor is a novel prognostic marker in esophageal squamous cell carcinoma. Oncol Rep 212; 28(2): Wang J, Li J, Guo F, Yan Y. MicroRNA-133a inhibits the malignant behavior of glioma via downregulation of matrix metallopeptidase 9. Mol Med Rep 216; 13(4): Ma J, Wang T, Guo R, Yang X, Yin J, Yu J, et al. MicroRNA133a and microrna326 cocontribute to hepatocellular carcinoma 5fluorouracil and cisplatin sensitivity by directly targeting Bcell lymphomaextra large. Mol Med Rep 215; 12(4): Yamamoto N, Nishikawa R, Chiyomaru T, Goto Y, Fukumoto I, Usui H, et al. The tumor-suppressive microrna-1/133a cluster targets PDE7A and inhibits cancer cell migration and invasion in endometrial cancer. Int J Oncol 215; 47(1):

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