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1 ISSN CN /R Shijie Huaren Xiaohua Zazhi ( ) 名誉总编辑 总编辑 世界华人消化杂志 对所有来稿均进行同行评议, 是一份被 中国科技论文统计源期刊 和 中文核心期刊要目总览 收录的学术类期刊. 世界华人消化杂志 的英文摘要被美国 化学文摘, 荷兰 医学文摘库 / 医学文摘, 俄罗斯 文摘杂志 收录.

2 总顾问 名誉总编辑 社长 / 总编辑 副总编辑 常务编委 编委 编辑委员会 / wcjd@wjgnet.com

3 编辑委员会 伊力亚尔 夏合丁教授 赪 玝

4 世界华人消化杂志 Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 目次 2007 年 6 月 8 日第 15 卷第 16 期 ( 总第 204 期 ) 述 评 1775 DNA 基础研究临床研究文献综述研究快报临床经验 TNF-α 1794 PAP 1800 OPN Syndecan PARP-1 PJ34 HepG CT P4502E PET/CT 1835 HBV 1841 Crohn TBC Meta

5 致 谢 1872 消 息 (2006) 封面故事 Xin-Pu Miao, Jian-Sheng Li, Hui-Yan Li, Shi-Ping Zeng, Ye Zhao, Jiang-Zheng Zeng Expression of ornithine decarboxylase in percancerous and cancerous gastric lesions. World J Gastroenterol 2007;13(20): 国际会议 Meeting Falk Symposium 161: Future Perspectives in Gastroenterology October 2007 Dresden symposia@falkfoundation.de Meeting The Liver Meeting th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases 2 6 November 2007 Boston - MA 编辑 Shijie Huaren Xiaohua Zazhi wcjd@wjgnet.com 出版 创刊 wcjd@wjgnet.com 改刊 出版 原刊名 印刷 发行 名誉总编辑 总编辑 编辑部主任 英文编辑 特别声明中文编辑 订购 电子编辑 邮购 责任编辑 期刊名称 主管单位 主办单位 2007 年版权归世界华人消化杂志所有 ISSN CN /R M

6 World Chinese Journal of Digestology June 2007 Contents in Brief Volume 15 Number 16 EDITORIAL 1775 DNA damage and liver cancer Zhu DQ, Huang ZY BASIC RESEARCH 1781 In vivo and in vitro study on liver fibrosis reversion effect by therapy of strengthening healthy qi combined with draining dampness and relieving toxin He JY, Fu LD, Deng WD, Zhou YY 1788 Effect of tumor necrosis factor-α on protein expression of tight junction protein in intestinal epithelial cells Cui W, Liu DY, Ma L, Liu P 1794 Influence of somatostatin anologue on pancreatitis-associated protein in rats with acute pancreatitis Tong BF, Zhou HX, Zou XM, Peng H, Zhou WX, Yang WL 1800 Study on the expression of Osteopontin and Syndecan-1 and their correlations with the clinical pathological characteristics of hepatocellular carcinoma by tissue microarray technique Liu XF, Shi RH, Zhang GX, Wang XH, Gao HJ, Qin SK 1806 Suppressive effect of poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor PJ34 on human hepatoma cell line HepG2 Zhou X, Huang ZY, Chen XP, Huang SH 1810 Effects of metformin on hepatic steatosis induced in rats fed a high fat diet Chen SQ, Li H, Liu Q CLINICAL RESEARCH 1815 Correlative analysis of colorectal cancer stage between multi-slice spiral computed tomography and operative pathology Zhao XM, Ma M, Zhang ZM, Zhu JP, Bai Y 1820 Assessment on life quality of patients with chronic hepatitis B after three types of antiviral treatment Wang Y, Yu YY, Si CW, Chen XY, Han ZH, Chen YP 1825 Association of CYP2E1 enzymes and susceptibility for non-alcoholic liver disease Guo YM, Wang Q, Qi Z REVIEW 1830 Progress in the clinical application of Positron emission tomography-computed tomography in patients with pancreatic cancer Wang RF 1835 Immunotherapy for chronic hepatitis B virus infections Yu XJ, Wang GQ 1841 Video capsule endoscopy for diagnosis of small bowel Crohn s disease Wang J, Jia H RAPID COMMUNICATION 1845 Improvement effect of Tongfu particles on gut function in the process of enteral nutrition following intestinal ischemia and reperfusion in dogs Hu S, Wang HB, Xia B, Yu Y, Li JY, Zou XF, Zhou GY, Che JW

7 1850 Therapeutic effects of Bacillus coagulans on the dextran sodium sulfate-induced ulcerative colitis in rats Wan FC, Cui YL, Yan SC 1855 Optimization of cultivation and preservation of Helicobacter pylori using self-made microaerophilic pot Zhou H, Xu F, Li P, Chu GW, Wang GC CLINICAL PRACTICE 1859 Relationship between the histology and genotype of hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients Zhong CF, Hao W, Li Z, Meng X, Yan Y, Niu JQ, Yin JM 1865 Analysis on accelerated hepatitis B immunization schedule Chen SZ, Zhang JH, Ren JX, Wen FL, Liu ZX, Ren XL 1868 Gemcitabine plus capecitabine as a front-line therapy for advanced pancreatic cancer: a metaanalysis Xie DR, Liang HL, Yang Q, Guo SS, Jiang ZM, Chen DL ACKNOWLEDG- MENT COVER 1872 Acknowledgments to reviewers of World Chinese Journal of Digestology Miao XP, Li JS, Li HY, Zeng SP, Zhao Y, Zeng JZ. Expression of ornithine decarboxylase in percancerous and cancerous gastric lesions. World J Gastroenterol 2007;13(20): INTERNATIONAL MEETINGS Meeting Falk Symposium 161: Future Perspectives in Gastroenterology October 2007 Dresden symposia@falkfoundation.de Meeting The Liver Meeting th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases 2 6 November 2007 Boston - MA Indexed/Abstracted by Chemical Abstracts, EMBASE/ Excerpta Medica and Abstract Journals Shijie Huaren Xiaohua Zazhi Founded on January 15, 1993 Renamed on January 25, 1998 Publication date June 8, 2007 NAME OF JOURNAL World Chinese Journal of Digestology RESPONSIBLE INSTITUTION Department of Science and Technology of Shanxi Province SPONSOR Taiyuan Research and Treatment Center for Digestive Diseases, 77 Shuangta Xijie, Taiyuan , Shanxi Province, China EDITING Editorial Board of World Chinese Journal of Digestology, 77 Shuangta Xijie, Taiyuan , Shanxi Province, China Telephone: wcjd@wcjdnet.com PRINTING Beijing Kexin Printing House PUBLISHING Editorial Department of World Chinese Journal of Digestology, 77 Shuangta Xijie, Taiyuan , Shanxi Province, China Telephone: wcjd@wcjdnet.com OVERSEAS DISTRIBUTOR Beijing Bureau for Distribution of Newspapers and Journals (Code No ) China International Book Trading Corporation PO Box 399, Beijing, China (Code No. M4481) HONORARY-EDITOR-IN-CHIEF Bo-Rong Pan EDITOR-IN-CHIEF Lian-Sheng Ma SCIENCE EDITORS Deputy Director: Hai-Ning Zhang SUBSCRIPTION RMB 24 Yuan for each issue, RMB 864 Yuan for one year CSSN ISSN CN /R COPYRIGHT 2007 Published by WCJD. All rights reserved; no part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise without the prior permission of WCJD. Authors are required to grant WCJD an exclusive licence to publish. SPECIAL STATEMENT All articles published in this journal represent the viewpoints of the authors except where indicated otherwise. INSTRUCTIONS TO AUTHORS Full instructions are available online at / /tgxz.asp. If you do not have web access please contact the editorial office. Copyright 2007 by Editorial Department of World Chinese Journal of Digestology

8 EDITORIAL ; 15(16): ISSN CN /R DNA 损伤与肝癌发生 carcinogenesis of HCC. Further studies should lay a foundation for research into treatments for HCC. Key Words: DNA damage; DNA repair; Hepatocel- lular carcinoma Zhu DQ, Huang ZY. DNA damage and liver cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): DNA damage and liver cancer De-Qiang Zhu, Zhi-Yong Huang De-Qiang Zhu, Zhi-Yong Huang, Hepatic Surgery Center, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan , Hubei Province, China Supported by The New Centaury Excellent Talent Foundation from Ministry of Education, No. NCET Correspondence to: Dr. Zhi-Yong Huang, Center of Hepatic Surgery, Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan , Hubei Province, China. zyhuang@medmail.com.cn Received: Accepted: Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignant tumors. Carcinogenesis of HCC involves complex biological processes for which the mechanism/s remains to be completely clarified. Research has shown that hepatitis B and C virus infections, aflatoxin contamination, alcohol abuse, ionizing radiation and human metabolic products toxic to the human genome can induce HCC. Most of these cause DNA damage by having direct impacts on the genetic materials of hepatocytes. This constitutes an important molecular basis for the carcinogenesis of HCC. DNA damage causes a series of cell responses, including injury signal transduction, damage repair, and induction of cell death. The factors involved in DNA damage can also affect some aspects of the DNA injury repair system, preventing the damage from being repaired or correctly repaired, leading to malignant transformations. Therefore, the accumulation of damaged DNA becomes an important molecular mechanism underlying the,,.,,,,,, DNA,. DNA,,,., DNA,., DNA,. 关键词 0 引言人体细胞经常受到多种体内外因子的损伤, 如电离辐射 (IR), 紫外线 (UV) 等物理因素, 烷化剂, 亚硝胺类等各种化学因素, 病毒感染等生物因素. 这些因素中具有遗传毒性的物质会造成各种各样的 DNA 损伤, 如单 双链缺口 (SSB, DSB), 碱基突变, 碱基氧化损伤等. 如果损伤被正确修复, 细胞存活, 如果修复过程中出现缺失 插入等不正确的修复, 这些异常碱基的累积就可能导致癌症的发生. 如果损伤严重不能修复, 细胞就会启动凋亡程序, 诱导细胞死, (HBV, HCV),,,, DNA.,, DNA..

9 1776 ISSN CN /R 亡, 这条通路也被认为是阻止细胞恶性转化的 X (HBX) HBV 最后一道屏障. 由此, 信号传导 损伤修复和诱 导凋亡就形成了一个密切联系, 相互影响的复, 杂网络, 使细胞作为一个整体对 DNA 损伤作出 HBX 反应, 因此, 任何一个系统功能的障碍都会降低, HBV DNA 的稳定性, 为癌症发生奠定基础. 目前肝., 癌的发生机制尚未完全阐明, 但其发生与 DNA HBV 的损伤密切相关. 诱发肝癌的主要危险因素包 括乙 丙型肝炎病毒 (HBV, HCV), 黄曲霉毒素 PARP-1, B1(AFB1), 亚硝胺等. 这些诱因不仅能够引起肝. 细胞 DNA 的损伤, 而且能直接或间接影响损伤 修复系统, 使 DNA 修复障碍, 从而导致肝癌的 发生. 1 DNA 损伤与修复机制 DNA 损伤后首先是具有信号传导作用的酶或蛋 白质识别并结合到损伤位点, 起信号传导作用的 分子有 : 运动失调性毛细血管扩张症基因突变 体 (ataxia telangiectasia mutated, ATM)/ 运动失调 性毛细血管扩张症基因突变体和 Rad3 相关基因 (ATM- and Rad3-related gene, ATR), 依赖 DNA 的 蛋白激酶 (DNA-PK), 聚腺苷酸二磷酸核糖转移 酶 -1(PARP-1) 等. DNA 损伤激活 ATM/ATR 后引 起细胞周期停滞在 G1, S, 或 G2 期, 以便细胞对损 伤进行修复. DNA-PK 作为最初的 DNA 损伤感受 器, 介导细胞对损伤进行修复, 而不是损伤信号 诱导的下游效应器 [1]. PARP-1 已被证明在许多修 复通路包括碱基切除修复 (BER) 同源重组 (HR) 中起重要作用 [2], 因此, PARP-1 迅速识别并结合 DNA 损伤位点一是为了防止缺口处的核苷酸受 核酶分解和同源基因在局部发生错误重组 ; 二是 募集各种修复蛋白对损伤进行修复 [2]. 各信号传 导系统构成复杂的信号传导网, 将 DNA 损伤信号 传导给下游的修复蛋白和酶, 对损伤迅速修复. 哺乳动物细胞内主要有四种修复方式 : 同源重组 修复 (homologous recombination, HR), 非同源末 端连接 (nonhomologous end-joining, NHEJ), 核苷 酸切除修复 (nucleotide-excision repair, NER), 碱 基切除修复 (base-excision repair, BER) [3], 但是没 有哪种修复通路能够修复所有的损伤, 机体通过 这四种主要的修复方式完成了大部分 ( 但不是全 部 ) 的 DNA 损伤. DSB 是严重的 DNA 损伤, 主要由 HR 和 NHEJ 修复完成, 但多数致癌因子不会直接 引起 DSB, 而是 SSB, DNA 氧化损伤, 各种 DNA 赘 合物 (DNA adducts) 等相对较轻的损伤, 由 NER 和 BER 完成修复. 在 NER 和 BER 功能障碍时, 这些 损伤变为 DSB, 因此 NER 和 BER 是抵抗致癌因子 的损伤 维持 DNA 稳定性的关键. NER 主要修复 外源性损伤物质介导的 DNA 损伤, 如 UV, AFB1 以及内源性的氧化损伤, 并且修复过程依赖 ATP 供能 ; BER 主要修复内源性损伤物质如 HBV 感染 引起的免疫反应导致的 DNA 微小损伤, 以及各种 DNA- 致癌因子赘合物等, 这些损伤可能不会阻 滞细胞转录或复制的进行, 也不会引起细胞周期 停滞 [4], 这可能就是损伤 DNA 累积的机制. 已证 明, PARP-1 在 BER 中起重要作用, 而 NER 需要的 应急能量也主要由 PARP-1 产生 [5], 因此, PARP-1 对维持肝细胞 DNA 稳定性有重要作用. 实验证 明, PARP-1 -/-, Ku80 -/- 的小鼠在胚胎期 8.5 d 前 即发生生长停滞, 并于 9.5 d 死亡, 提示 PARP-1 和 Ku80 双缺失对小鼠是致命的. PARP-1 -/-, Ku80 -/+ 的小鼠肝腺瘤和肝癌的发生率明显增高 [6], 并 且 Nomura et al [7] 发现, 人肝癌组织中 PARP-1 比邻 近非瘤组织表达增高且活性增强. 如果损伤不能修复或细胞周期停滞过长, 细胞就会启动 P53 介导的凋亡通路, 诱导细胞凋 亡, 因此, P53 介导的细胞凋亡被认为是防止细 胞恶性转化的重要机制. 正常情况下, 鼠双微蛋 白 2(MDM2) 紧密结合在 P53 的 N- 末端, 使 P53 失 活并诱导其降解, MDM2 受多种激酶磷酸化的调 控, 如 ATM/ATR, DNA-PK 等, 磷酸化后的 MDM2 从 P53 脱落, P53 恢复活性 [8]. 如果细胞周期停滞 过长, 也会激活 ATM/ATR 磷酸化 MDM2 使 P53 活 性恢复并介导细胞凋亡 [9]. Oren [10] 认为, 在 DNA 损伤后, 细胞是进行修复还是诱导凋亡, 这取决 于细胞内生存信号和凋亡信号的强弱对比, 而这 又主要取决于 DNA 的损伤程度. 据研究, PARP-1 在这一过程中起到重要作用, 轻度的 DNA 损伤, PARP-1 被激活, 传导损伤信号并参与修复, 细胞 存活 ; 中重度的 DNA 损伤, DNA 修复失败, 导致 不能正常的转录或复制, 引起细胞周期停滞时间 过长, 诱发 P53 介导的细胞凋亡, 同时, P53 介导 PARP-1 的降解, 以保证凋亡的能量需求 ; 严重的 DNA 损伤, PARP-1 被大量激活, 引起能量耗竭, 导致细胞坏死 [11]. 2 乙肝病毒 (HBV) 与肝癌的发生 HBV 引起肝癌发生的机制可能是通过病毒 DNA 整合到宿主 DNA 中, 引起基因重排和 / 或部分基 因缺失 [12]. 研究发现, 几乎所有 HBV 诱导的肝癌 中, 都能发现整合的病毒 DNA [13]. Hytiroglou et al [14] 发现, 病毒 DNA 整合到宿主肝细胞 DNA

10 1777 中时, 引起整合位点处的碱基缺失, 整合还可能 发生在编码信号传导蛋白的基因 细胞增生调 控基因序列中, 从而影响这些基因的表达. 通常 情况下, 病毒 DNA 整合效率很低 ( 每个细胞中约 有 个可以整合的基因组 ), 但有 DSB 时, 整 合效率明显提高 [15]. 另据研究, DNA 氧化损伤能 增加病毒基因的整合效率 [16], 而 Choudhury et al [17] 发现, 在 LEV 鼠系细胞中, HBV 急性感染期, 宿 主细胞修复碱基氧化损伤的 BER 功能降低, 在 慢性炎症期, 修复功能恢复到正常水平. 修复能 力的降低导致 DNA 氧化损伤的增加, 这样, HBV 感染和细胞 DNA 的氧化损伤就形成恶性循环, 其机制可能是损伤的 DNA 不能阻滞细胞周期和 转录复制的进行, 当细胞转录或复制到损伤位 点时, 复制叉激发损伤位点处 SSB 变为 DSB, 在 DSB 存在下, 病毒 DNA 整合效率明显提高. 整合 的病毒基因能在宿主细胞中稳定表达, 引发机 体持续的免疫反应导致 DNA 氧化损伤, 这时机 体 BER 功能的恢复可使已感染的细胞免遭氧化 损伤诱导的细胞凋亡, 为细胞的恶性转化提供 条件. 此外, 病毒 DNA 还能编码乙肝病毒 X 蛋白 (HBX), HBX 能够干涉信号转导系统某些分子 ( 如 AP-1, PKC 等 ), 涉及细胞周期 增生及凋亡 基因的表达 [18]. 但也有实验表明, HBX 并不影响 细胞的凋亡及增生, 但能降低 UV 诱导的 DNA 损 伤修复能力, 增加宿主 DNA 对 UV 的敏感性 [19], 表达 HBX 的 HepG2 细胞在没有经过 UV 处理时, 能表现和正常细胞相同的细胞周期和细胞凋亡 过程, 也能修复 DNA 损伤, 这说明在 HBV 感染早 期, 病毒数不足以引发病毒繁殖时, HBX 能帮助 病毒在细胞中存活. 经过 UV 处理后, 正常细胞会 转导生存信号对损伤进行修复, 而表达 HBX 的 HepG2 细胞则倾向于转导凋亡信号, 表现出很强 的 G 2 /M 期停滞反应和很高的细胞凋亡率, 这种 作用可能是通过 HBX 和 P53 的相互作用增加 P21 的表达实现的. 此外, HBX 能与 P53 直接作用, 改 变但不阻滞 P53 的功能 [20], 使 P53 在细胞中累积 并稳定存在, 这主要通过 HBX 与 P53 的结合阻碍 MDM2 导致的 P53 降解, P53 在细胞中累积导致 肝细胞较高的凋亡率, 使感染后期大量增殖的 病毒从宿主细胞中释放, 引起 HBV 的扩散. HBX 损坏 DNA 修复系统和诱导细胞凋亡导致宿主细 胞损伤 DNA 的累积和抗凋亡突变, 最终引起细 胞恶性转化. 另据研究, 同时接受 HBV 和 AFB1 处理的树鼩与只用 HBV 处理或只用 AFB1 处理 的树鼩相比, 前者肝癌的发生率 (58.9%) 明显高 于 HBV 处理组 (3.6%) 和 AFB1 处理组 (20.7%), 并且癌症发生的平均时间和恶性程度都要高于后两组, 说明 HBV 和 AFB1 在肝癌的发生中存在协同作用 [21]. 这种作用可能是由于 AFB1 导致 DNA 氧化损伤和 DSB 的形成, 增加 HBV 整合效率. 而 HBV 感染使细胞对 AFB1 的敏感性增高, 这种作用可能通过 HBX 实现 : HBX 能够调节代谢 AFB1 的酶活性, 在 HBV 转染的肝细胞中, 谷光甘肽 (GST) 的活性明显降低, 而 GST 是催化灭活 AFB1 的主要物质 [22] ; HBX 还可以通过与蛋白质或蛋白质复合体的相互作用阻止损伤 DNA 的修复, 如前面提到的 HBX 能抑制 NER 修复通路, 导致化学致癌物如 AFB1 引起的 DNA 损伤累积 ; HBX 还能诱导细胞增生和下调细胞周期停滞反应, 使诱变剂改变的肝细胞增生并发生恶性转化. 3 丙肝病毒 (HCV) 与肝癌的发生 HCV 是 RNA 病毒, 不像 HBV 一样能整合到宿主 DNA 中直接引起 DNA 损伤, 但 HCV 能编码多种病毒蛋白, 如非结构蛋白 5A, 2(NS5A, NS2), 核心蛋白等. 这些病毒蛋白能直接或间接影响宿主 DNA 的稳定性. 研究表明 [23], NS5A 能作用于中心粒和纺锤体, 引起延迟分裂和错误分裂, 导致染色体畸变. 核心蛋白和 HBX 一样, 能使宿主细胞抵抗氧化损伤, 使 HCV 感染的细胞逃脱免疫损伤, 也使癌变细胞得以存活 [24]. 此外, HCV 能直接引起细胞的氧化应激 [25], 并能引发细胞持续的炎症反应和免疫反应, 直接或间接产生活性氧簇 (ROS), 导致细胞 DNA 的氧化损伤, 包括嘌呤和嘧啶碱基化学性质的改变, 产生 2- 脱氧核糖, 碱基缺失和 S S B, 形成 8- 羟基脱氧鸟苷 (8-OHdG) 赘合物等, 其中 8-OHdG 赘合物是最常见的致 DNA 氧化损伤物 ( 每个细胞每天大约能产生 200 个此类赘合物 ) [26]. 体外研究证明, 8-OHdG 能导致 DNA 聚合酶读码错误, 诱导基因突变, 并在 DNA 复制时诱导 G: C T: A 突变, 这种突变在癌基因和抑癌基因中发生率较高 [27], 这可能是 HCV 诱发肝癌的一种机制. 另外, 病毒蛋白导致的 DNA 氧化损伤主要由 PARP-1 介导的 BER 完成修复 [28], 可以推测, HCV 导致肝癌的机制可能是病毒蛋白引起 BER 修复功能障碍, 使 DNA 损伤累积, 引起细胞癌变, 其作用的主要分子可能就是 PARP-1. 4 AFB1 与肝癌发生 AFB1 是另一种诱导肝癌发生的危险因素, AFB1 在体内转化为活性 AFB1-8, 9- 环氧化物, 此化合 HBV HCV,, DNA,. DNA,. (HBV,HCV),,,, D N A,,.

11 1778 ISSN CN /R 物能高亲合力结合 DNA 鸟嘌呤的 N7 位点, 形成 AFB1-N7-Gua 复合物, AFB1-N7-Gua 能自发变为 更稳定的 AFB1-FAPY, 这两种物质都能引起结, 合位点的 G T 突变和 5' 端突变 [29], AFB1 在体内 主要与谷胱甘肽 (GST) 结合成共价化合物而灭. 活. 实验证明, 经过 AFB1 处理的小鼠肺细胞, UV 诱导的 DNA 损伤修复被抑制, 说明 AFB1 能下调 或抑制在 NER 中起限速作用的酶或蛋白质的活 性 [30]. 由于 AFB1 引起的 DNA 不能被 NER 修复, 导致损伤 DNA 累积, 引起细胞恶性转化. 因此, 不同生物对 AFB1 的灭活能力以及对损伤的修 复能力是决定生物对 AFB1 敏感性的重要机制. 另外, 新生小鼠和 P53 缺乏的成年鼠的肝细胞对 AFB1 的敏感性要高于正常成年鼠 [31], 这两种小 鼠都有肝细胞的增生, 因此, 增生的不成熟肝细 胞也是导致小鼠对化学致癌物敏感的重要机制. 还有实验证明, AFB1 能诱导 P53 基因第 249 位密 码子的点突变 (AGG AGT), 导致 P53 蛋白中丝 氨酸替代原来的精氨酸, 突变的 P53 蛋白可能阻 止细胞从 G1 期进入 S 期 [32]. 也有实验表明, P53 第 249 位密码子的点突变与 P53+/- 在诱导肝癌发生 的效果上是相同的 [31]. 5 其他因素与肝癌的发生 研究表明, 过量饮酒以及各种化学物质如亚硝 胺等也能导致肝癌的发生. 过量饮酒能导致脂 肪肝的形成, 引起肝细胞脂质过氧化反应 (LPO) 和脂肪变性. LPO 的代谢产物如反式 4- 羟基 -2 壬烯醇 (HNE), 丙二醛 (MDA) 等能与 DNA 形成 赘合物引起细胞 DNA 的损伤 [33]. HNE- 脱氧鸟苷 (HNE-dG) 赘合物能结合 P53 基因第 249 位密码子 的第 3 个碱基, 引起碱基突变 [34]. Feng et al [35] 发 现, 接受 HNE 处理的人体细胞不能修复 UV 介导 的 DNA 损伤, 说明 HNE 能抑制 NER 的修复通路, 而 NER 也是修复 HNE 导致的 DNA 损伤的主要通 路. 这样, 损伤 DNA 的累积就成为 HNE 等 LPO 产物诱导肝癌发生的重要机制. 实验证明 [36], 单 纯患有脂肪肝的 FLS 鼠系可自发肝癌, 这与肝细 胞脂肪变性有关, 这可能是非酒精性脂肪肝引 发肝癌的重要机制. 此外, 过量饮酒还能导致机 体的氧化应激, 引起细胞 DNA 的氧化损伤 [26]. 化学 致癌物如亚硝胺能形成 DNA- 致癌因子赘合物, 还能诱导 DNA 双链改变, 如碱基氧化损伤, SSB, DSB, 染色体畸变, DAN- 蛋白质交连等, 这是致 癌物如二乙基亚硝胺 (DEN) 导致 DNA 损伤的最 初形式 [37]. DEN 在体内氧化代谢并分解为高活性 的烷化剂, 这些亲电子体能攻击 DNA 链的亲质 子中心如鸟嘌呤的 N7 和 O6 位点, 形成烷化 DNA 赘合物, 复制这种烷化 DNA 能引起位点处的 G: C 突变, 激活原癌基因 [38]. Iwai et al [39] 研究表明, 经过 DEN 处理的 FLS 鼠系肝癌发生率要明显高 于 C3H 和 C57 鼠系, 说明 FLS 鼠系对 DEN 的致癌 敏感性要高于 C3H 和 C57 鼠系, 其机制可能是脂 肪肝引起的 LPO 消耗了大量的 GSH, 产生的代谢 物如 HNE 又抑制 NER 修复系统, 脂肪变性引起 许多细胞器如内质网 线粒体的功能障碍, 这 些都加重了 DEN 引起的 DNA 损伤, 使损伤累积 导致细胞恶性转化. 图 1 HBV, HCV, ABF1 等各种损伤物质诱导肝癌发生机制. 总之, 各种诱因如 HBV, HCV, AFB1 等都可 能引起肝细胞 DNA 损伤, DNA 损伤后引发机体 一系列的反应, 包括损伤信号转导, 损伤修复和 P53 介导的细胞凋亡. 这些诱因诱导肝癌发生的 机制就是作用于此系统中的某些环节, 或影响 信号转导, 或影响损伤修复, 或影响 P53 介导的 细胞凋亡通路 ( 图 1). 如 HBV, HBV 整合到宿主 细胞时, 会引起整合处的基因重排和 / 或碱基缺 失, 以及 HBV 感染引发机体持续的免疫反应都 会导致 DNA 损伤 ; 而 HBV 编码的 HBX 蛋白则会 影响信号转导系统, 降低 DNA 损伤修复功能, 同 时 HBX 还可以与 P53 相互作用, 影响 P53 的一系 列功能, 最终会导致 DNA 损伤的累积和细胞的 恶性转化. 但是, 仍有许多问题未得到完全阐明, 如已证明 HBX 在 HBV 诱导的肝癌中起重要作 用, 而 HBV 引起的 DNA 损伤主要由 PARP-1 介导 的 BER 修复通路完成. 因此, 可以推测作为致癌 因素的 HBX 和抗癌因素的 PARP-1 之间是否存在 相互作用, 以及这种作用在 HBV 诱导肝癌发生 的重要性. 随着各种先进技术的应用以及更多 动物模型的建立, 肝癌发生的确切机制将会被 完全阐明. 针对肝癌发生机制重要分子的靶向 治疗, 也会使治疗更有效, 更安全, 细胞特异性

12 1779 也会更强, 如 PAPR-1 抑制剂作为抗肿瘤药物的 研究取得显著效果, 目前已投入临床试用, 相信 随着肝癌的研究进展, 以后还会应用更多的靶 向治疗达到完全治愈肝癌的效果. 6 参考文献 1 Yang J, Yu Y, Hamrick HE, Duerksen-Hughes PJ. ATM, ATR and DNA-PK: initiators of the cellular genotoxic stress responses. Carcinogenesis 2003; 24: Masutani M, Nakagama H, Sugimura T. Poly (ADPribose) and carcinogenesis. Genes Chromosomes Cancer 2003; 38: Lindahl T, Wood RD. Quality control by DNA repair. Science 1999; 286: Hoeijmakers JH. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature 2001; 411: Oei SL, Ziegler M. ATP for the DNA ligation step in base excision repair is generated from poly (ADPribose). J Biol Chem 2000; 275: Tong WM, Cortes U, Hande MP, Ohgaki H, Cavalli LR, Lansdorp PM, Haddad BR, Wang ZQ. Synergistic role of Ku80 and poly (ADPribose) polymerase in suppressing chromosomal aberrations and liver cancer formation. Cancer Res 2002; 62: Nomura F, Yaguchi M, Togawa A, Miyazaki M, Isobe K, Miyake M, Noda M, Nakai T. Enhancement of poly-adenosine diphosphate-ribosylation in human hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 2000; 15: Deb SP. Function and dysfunction of the human oncoprotein MDM2. Front Biosci 2002; 7: d235-d243 9 Dasika GK, Lin SC, Zhao S, Sung P, Tomkinson A, Lee EY. DNA damage-induced cell cycle checkpoints and DNA strand break repair in development and tumorigenesis. Oncogene 1999; 18: Oren M. Decision making by p53: life, death and cancer. Cell Death Differ 2003; 10: Virag L, Szabo C. The therapeutic potential of poly (ADP-ribose) polymerase inhibitors. Pharmacol Rev 2002; 54: T h o r g e i r s s o n S S, G r i s h a m J W. M o l e c u l a r pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nat Genet 2002; 31: Paterlini-Brechot P, Saigo K, Murakami Y, Chami M, Gozuacik D, Mugnier C, Lagorce D, Brechot C. Hepatitis B virus-related insertional mutagenesis occurs frequently in human liver cancers and recurrently targets human telomerase gene. 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14 ; 15(16): ISSN CN /R BASIC RESEARCH 扶正利湿解毒法体内外逆转肝纤维化 METHODS: Rat model of liver fibrosis was induced by dimethylnitrosamine (DMN). All the rats were randomly divided into 6 groups, named group A (control, n = 10), B (model, n = 10), C (colchicine, n = 10), D (with the basic herb complex, high dose, n = 10), E (with the basic herb complex, middle dose, n = 10) and F (with the basic herb complex, low dose, n = 10). The content of liver hydroxyproline and the serum alanine aminotransferase (ALT) were tested. HE and Masson staining were conducted for patho- logical examination. HSC-T6 cell line was used as an in vitro model. After 24 hours of drug administration, the inhibitory effect was observed under an optical microscope. Cell proliferation was detected by MTT assay. Additionally, HSC-T6 cells were observed by electron microscopy after they were treated with the basic herb complex and control drug at the concentration of 2 g/l.,. In vivo and in vitro study on liver fibrosis reversion effect by therapy of strengthening healthy qi combined with draining dampness and relieving toxin Jin-Yang He, Lu-Di Fu, Wen-Di Deng, Ying-Yun Zhou Jin-Yang He, Wen-Di Deng, Ying-Yun Zhou, Tropical Medical Institute, Guangzhou university of Chinese Medicine, Guangzhou , Guangdong Province, China Lu-Di Fu, Laboratory Animal Center, Guangzhou university of Chinese Medicine, Guangzhou , Guangdong Province, China Correspondence to: Jin-Yang He, Tropical Medical Institute, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, 12 Jichang Road, Guangzhou , Guangdong Province, China. sunny _89@yahoo.com.cn Received: Accepted: Abstract AIM: To observe the reversing effect on liver fibrosis by the therapy of strengthening healthy qi combined with draining dampness and relieving toxin (SHQDDRT). RESULTS: The content of liver hydroxyproline and the serum ALT in group D and E were significantly lower than those in group B (hydroxyproline: ± μg/g, ± μg/g vs ± μg/g, P < 0.01, P < 0.05; ALT: ± 8.16 ku/l, ± ku/l vs 58 ± ku/l, P < 0.01, P < 0.05). Masson staining showed that the fibrotic degrees were significantly decreased in group D and E in contrast with those in group B (2.33 ± 0.87, 2.63 ± 0.74 vs 3.70 ± 0.67, both P < 0.01), and the fiber deposition, inflammation and hemorrhage were also improved. Light endoscopy and MTT assay demonstrated that the basic herb complex inhibited the growth of HSC-T6 cells in a dosedependent manner. Electron microscopy exhibited typical apoptosis features in HSC-T6 cells. CONCLUSION: The basic herb complex shows significant reversing effect on liver fibrosis in vitro and in vivo. Key Words: Liver fibrosis; Reversing effect; The basic herb complex; Cell apoptosis; Masson staining He JY, Fu LD, Deng WD, Zhou YY. In vivo and in vitro study on liver fibrosis reversion effect by therapy of strengthening healthy qi combined with draining dampness and relieving toxin. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : ( ). 方法 : DMN,,,,

15 1782 ISSN CN /R,.,. 3 wk Hyp, ALT ; HE, Masson. HSC-T6, 24 h, 2 g/l. 结果 : Hyp, ALT (Hyp: ±58.05 μg/g, ±67.70 μg/g vs ±42.06 μg/g, P <0.01, P <0.05; ALT: 33.56±8.16 ku/l, 42.38±14.99 ku/l vs 58±10.32 ku/l, P <0.01, P <0.05); Masson,, (2.33±0.87, 2.63±0.74 vs 3.70±0.67, P <0.01, P <0.01), ; HSC-T6. H S C-T6. 结论 : 造模方法为 : 用生理盐水配制 (V/V) 的. DMN 稀释溶液, 每周前 3 d 对大鼠进行腹腔注射, DMN 10 μl/kg 体质量 ; 空白对照组同时腹腔注关键词 射生理盐水 ; 共注射 4 wk. 第 4 周注射结束后随 机分为模型对照组 秋水仙碱组 基本方高剂 0 引言 肝纤维化 (liver fibrosis, LF) 是肝病进展的中间阶 段, 对于 LF 的治疗可以减少严重肝病及因肝病 而死亡的发生, 因此对于 LF 的研究一直备受重 视. 近年的实验研究证实了 LF 甚至肝硬化 (liver cirrhosis, LC) 是可以逆转的 [1]. 而目前尚未见有 疗效确切的能够经得起检验的逆转 LF 的公认方 法. 我们多年运用扶正利湿解毒法治疗慢乙肝 (hepatitis B), 观察到坚持运用该法治疗的患者可 能具有较好的远期疗效. 推测该治法可能逆转 LF, 我们对该法的基本方 - 扶正利湿解毒复方进 行了体内外实验研究, 现予以报道. 1 材料和方法 1.1 SPF 级 SD 大鼠 80 只, 雌雄各半, 体质 量 g, 购于广州中医药大学实验动物中 心 饲养于广州中医药大学实验动物中心清洁 级动物房, 按照中国实验动物学会规定的大鼠 喂饲标准进行喂养. 扶正利湿解毒法基本方 ( 以下简称基本方 ): 主要由白花蛇舌草 丹参 山药 旱莲草等 8 味药组成, 购于广州采芝林医药连锁店. 购回 后以蒸馏水 500 ml 煎煮 2 次, 每次烧开后 30 min 收集药液, 将 2 次所得药液合并, 浓缩为 1 kg/l 浓度, 冷藏后尽快使用. 丹参注射液 : 江苏神 龙制药厂生产. 秋水仙碱 (colchicine): Sigma 分 装, 购自广州威佳科技有限公司. 二甲基亚硝胺 (N-Nitrosodimethylamine, DMN): 购自天津化学 试剂研究所. 谷丙转氨酶 (ALT) 羟脯胺酸 (Hyp) 检测试剂盒 : 购自南京建成生物工程研究所. HSC-T6 细胞系由北京佑安医院汪晓军博士惠 赠 ; DMEM 高糖培养基 Hepes MTT 胎牛血 清 胰酶 双抗 细胞培养板 细胞培养瓶均 购于广州威佳科技公司 大鼠适应性喂养 3 d, 对 70 只大鼠进行造模, 其余 10 只为空白对照组. 量组 基本方中剂量组及基本方低剂量组 ; 秋 水仙碱组以 0.01 mg/kg 体质量灌胃, 基本方高 中 低剂量组分别以 20, 10, 5 g/kg 体质量灌胃 ; 模型对照组灌胃生理盐水 10 ml/kg. 均每天灌 胃, 共 21 d. 从开始造模到试验结束观察记录动 物死亡情况. 实验结束时摘眼球取血收集血清, 观察腹水情况 肝脏肉眼观形态 色泽 ; 并取 左前叶肝脏, 置于 bouin 固定液中固定 ALT Hyp ALT, Hyp 检测 分别严格按照试剂盒操作说明书进行操作 固定 36 h 后立即取出选块 石 蜡包埋 切片 5 μm, 然后行苏木素 - 伊红 (HE) 染 色 Masson 染色, 光镜下观察并拍照 [2]. 纤维化 程度评价用评分方法, 具体分级方法如下 : 0 分, 无纤维化 ; 1 分, 轻度纤维化, 纤维沉积仅位于小 叶中央 ; 2 分, 中度纤维化, 纤维沉积扩展至小叶 中央之外, 但仍未至小叶边缘 ; 3 分, 严重肝纤维 化, 纤维沉积扩展至小叶边缘 ; 4 分, 肝硬化 细胞复苏 传代与冻存采 用常规方法操作. 将已传至第三代的且已长满 培养瓶的 HSC-T6 细胞用 2.5 g/l 的胰酶消化, 调 细胞浓度至 /L, 铺于 96 孔板, 24 h 后上药. 基本方从 10 g/l 起始, 5 倍稀释, 共 7 个浓度, 即分 别为 10, 2, 0.4, 0.08, 0.016, , g/l.

16 1783 表 1 各组大鼠血清 ALT 水平及肝组织 Hyp 含量的比较 (mean±sd) 分组 n ALT(kU/L) Hyp(μg/g).. CCl4. 丹参注射液以原液稀释的 10, 100, 1000 倍共 3 个 浓度进行上药. [3] 根据相关文献常规操作进行 MTT 检测, 测 得的各复孔 A 值取平均数. 按文献方法 [4], 计算 出药物对细胞增殖的抑制率 IE. 公式如下 : IE = 1-A i /A 0 注 : IE(inhibitory effect) 表示药物对细胞 增殖的抑制率, A i 表示某药物浓度下的吸光度 值, A 0 表示对照组细胞的吸光度值. 细胞用 6 cm 方瓶培养, 分为丹参 基本方及 正常对照共 3 瓶, 按前述传代上药, 上药浓度为 基本方与丹参均为 2 g/l, 正常对照不上药. 作用 24 h 后用 2.5 g/l 胰酶消化细胞, 离心用戊二醛固 定后, 包埋制超薄切片, 电镜观察拍照. 2 结果 造模 第 1 周死亡 2 只, 第 2 周未见死亡, 第 3 周注射完毕 后开始有大鼠批量死亡, 至第 4 周造模结束时造 模大鼠共死亡 14 只, 仍有 56 只存活, 分组给药时 模型组 12 只, 秋水仙碱组 基本方高 中 低 剂量组均为 11 只. 在给药期间仍陆续有大鼠死 亡, 至给药结束采集标本时模型组为 10 只, 秋水 仙碱组为 8 只, 基本方高剂量组为 9 只, 中剂量组 为 8 只, 低剂量组为 6 只. 取肝脏时见模型对照组 8 只有大量腹水, 均 为血性, 另 2 只少量腹水 ; 秋水仙碱组 2 只有腹水, 其余 6 只未见腹水 ; 基本方高剂量组 1 只见少量 腹水 ; 基本方中剂量组 4 只见中等量腹水 ; 基本 方低剂量组 4 只有腹水 ; 其余未见腹水 ; 空白对 照组未见腹水, 肝脏表面平滑, 浅黄色, 边缘锐 利, 无肿大 缩小 ALT Hyp 所有标本均有大量汇管区纤维沉积, 有 5 个标本 模型对照组及各给药组血清 ALT 水平 均升高, 与空白对照组比较, 有非常显著性差异 ( 均 P <0.01); 基本方高 中剂量组血清 ALT 水平 显著降低, 与模型对照组比较有显著性差异 ( 分 别为 P <0.01, P <0.05); 秋水仙碱组血清 ALT 水 平也显著降低, 与模型对照组比较有显著性差 异 (P <0.05); 而基本方低剂量组血清 ALT 水平均 数也有降低, 但与模型对照组比较无显著意义 (P >0.05). 说明基本方高 中剂量均对该 LF 模型 血清 ALT 水平有显著降低作用 ( 表 1). 模型对照组及各给药组肝组织 H y p 水平 均升高, 与空白对照组比较, 有显著性差异 ( 均 P <0.01); 秋水仙碱组与模型对照组比较, Hyp 含 量显著降低 (P <0.01); 基本方高 中剂量组与 模型对照组比较, Hyp 含量均显著降低 ( 分别为 P <0.01, P <0.05), 说明基本方高 中剂量组均可 使纤维化大鼠的肝组织 Hyp 含量明显下降, 而高 剂量优于中剂量 ( 表 1) 空白对照组大 鼠肝组织肝小叶排列整齐, 各大鼠均未见明显 异常 ( 图 1A); 模型对照组所有标本汇管区大量纤 维沉积, 有 8 个样本形成假小叶 ; 肝细胞排列紊 乱, 所有标本均有脂肪沉积, 汇管区大片炎细胞 浸润, 肝组织大片出血灶 ( 图 1B); 秋水仙碱组所 有标本汇管区大量纤维沉积, 有 5 个样本形成假 小叶 ; 肝细胞排列紊乱, 4 个标本肝细胞有脂肪 沉积, 汇管区大片炎细胞浸润 ( 图 1C); 基本方高 剂量组中有 2 个标本大量纤维沉积于汇管区, 其 中 1 个形成假小叶, 大部分肝细胞排列整齐, 所 有标本均有少量炎细胞浸润, ( 图 1D); 基本方中 剂量组所有标本均有大量汇管区纤维沉积, 有 6 个标本形成假小叶, 肝细胞排列紊乱, 有 3 个标 本肝细胞中有脂滴沉积, 汇管区大片炎细胞浸 润 ; 肝组织大片出血灶 ( 图 1E); 基本方低剂量组 形成假小叶, 肝细胞排列紊乱, 有 3 个标本肝细 胞中有脂滴沉积, 汇管区大片炎细胞浸润 ; 肝组

17 1784 ISSN CN /R. DMN,,. MTT,. A C B D 图 1 各组肝组织病理检查结果 (HE 400). E F 表 2 各组大鼠肝纤维化分级评分 (mean±sd) 分组 n Staging scores 织大片出血灶 ( 图 1F). Masson 染色所见与 HE 染色中纤维化基本一致, 纤维沉积基本为胶原纤维, 显色为淡绿色 ( 图 2). 纤维化程度分级定量 ( 表 2) h 上药 24 h 后, 基本方 10 g/l 剂量组细胞与对照组细胞相比, 数量明显稀少, 大部分细胞伪足收缩, 不呈 星状. 2 g/l 剂量组细胞较 10 g/l 剂量组数量明显增多, 外形正常的星状细胞明显增多, 但与对照组细胞比较数量仍明显减少, 外形仍有较多未呈星状, 0.4 g/l 剂量组又较 2 g/l 剂量组细胞致密, 外形更为接近正常星状, 但与对照组细胞比较仍然能看出数量及形态差别, 0.08 g/l 剂量组细胞在数量与外形上均看不出与对照组细胞有明显区别 ( 图 3), 这些说明从光镜下观察细胞数

18 1785 A B 图 2 各组肝组 织病理检查结果 (Masson 400).,. C D E F 量及形态可以看出, 基本方从 10 g/l 浓度 5 倍稀释至 0.08 g/l 浓度, 对 HSC-T6 细胞生长呈梯度抑制, 说明基本方对 HSC-T6 生长有明显抑制作用, 且呈现剂量依赖型 MTT 基本方在 g/l 以上浓度时均对 HSC-T6 具有抑制作用, 随着药物浓度的增大, 其对 HSC-T6 增殖的抑制作用逐渐增强, 有明显的量效关系 ( 表 3) 丹参和基本方作用于 HSC-T6 细胞 24 h 后均可使 HSC-T6 细胞大量凋亡, 丹参组细胞凋亡的特点是凋亡细胞的数量明显多于复方组, 其凋亡细胞形态变小, 核染色体堆积, 线粒体 内质网等细胞器明显减少, 代之以大量空泡. 基本方组大量细胞形态明显缩小, 出现大批双核细胞, 此点明显不同于丹参组, 细胞质中线粒体 内质网等细胞器明显减少, 也出现大量空泡. 而且大量还未成熟的细胞已开始显现凋亡特征, 这点也与丹参组明显不同 ( 图 4). 3 讨论 LF 是一个病理过程, 中医大多从湿 热 毒 瘀 虚来解释其病理机制 [5], 目前治疗 LF 大多以活血化瘀为基础, 配合扶正, 取得一定疗效 [6-9]. 而实际情况是 LF 大多有湿热毒邪的存在 [10-11], 或十分明显, 或潜伏不显, 从现代医学角度讲, 大多是 HBV 慢性感染者 [12]. 而目前用于治疗 LF 的中药大都不具有解毒祛湿功效. 不能祛除湿热毒邪, LF 病理机制就不能去除 ; 因此只有兼顾解毒祛湿清热, 才可能使 LF 彻底逆转和恢复. 扶正利湿解毒法正好符合上述理念, 而且基本方是在具有确切抑制 HBV 和保护免疫性肝损伤效果的 复方肝毒清 的基础上组方而成 [13-14], 因此其具有确切的解毒祛湿清热功效, 再辅以扶正和活血化瘀, 使基本方能够针对 LF 的整体病机, 因此具有较好的逆转 LF 的作用. DMN 导致的大鼠 LF 具有停用 DMN 后不自发逆转的特点 [15-16], 因此用此模型可以观察药物是否能够逆转 LF [17-19]. 而实验显示, 基本方高

19 1786 ISSN CN /R (IE):, MTT A, A A, 1. A B C D 图 3 上药 24 h 后各药物浓度光镜下观察 ( 光镜 200). A B C 图 4 基本方与丹参对 HSC-T6 细胞影响的电镜观察 表 3 基本方各药物浓度对 HSC-T6 增殖的抑制作用 (g/l) 项目 对照 中剂量组均可使血清 ALT 水平和肝组织 Hyp 含量下降, 其中基本方高剂量组效果较好, 肝组织病理切片也证明了这一点, 病理染色切片分级评分显示, 基本方高 中剂量组均能显著改善 LF 大鼠的肝组织病理改变, 综合 HE 染色观察结果, 表明基本方具有改善肝组织出血 炎症, 减轻 LF 作用. 从基本方高 中剂量组病理切片及 ALT 水平 Hyp 含量来看, 基本方高 中剂量组具有确切的逆转 LF 效果. 近年来临床何实验研究都证实了 L F 可以 逆转以及肝星状细胞在 L F 逆转中的核心作用 [20-27], 因此我们采用 HSC-T6 细胞作为体外模型, 结果表明, 基本方在 g/l 以上浓度时均对 HSC-T6 具有抑制作用, 电镜观察发现, 基本方抑制 HSC-T6 细胞的机制主要是导致 HSC-T6 细胞凋亡, 这点与对照组的丹参类似但又有显著不同, 基本方作用后大量细胞形态变小, 但只有较少细胞出现染色体堆积现象, 大部分细胞尚未明显出现染色体堆积现象, 而是出现大量双核细胞, 而且尚未成熟的幼稚细胞即已开始凋

20 1787 亡, 说明一方面可能基本方能够刺激 HSC-T6 的生长, 而另一方面能够在其生长的初期即可导致其凋亡 ; 而丹参则不是这样, 因此基本方导致 HSC-T6 凋亡的分子机制可能不同于丹参, 值得进一步研究. 17 accumulation in dimethylnitrosamine-induced rat liver fibrosis. World J Gastroenterol 2007; 13: Yen MH, Weng TC, Liu SY, Chai CY, Lin CC. The hepatoprotective effect of Bupleurum kaoi, an endemic plant to Taiwan, against dimethylnitrosamine-induced hepatic fibrosis in rats. Biol Pharm Bull 2005; 28: 参考文献 18 Sakaida I, Hironaka K, Terai S, Okita K. Gadolinium chloride reverses dimethylnitrosamine (DMN)- 1 Elsharkawy AM, Oakley F, Mann DA. The role and regulation of hepatic stellate cell apoptosis in reversal of liver fibrosis. Apoptosis 2005; 10: induced rat liver fibrosis with increased matrix metalloproteinases (MMPs) of Kupffer cells. Life Sci 2003; 72: B r u n t E M. G r a d i n g a n d s t a g i n g t h e histopathological lesions of chronic hepatitis: the Knodell histology activity index and beyond. Hepatology 2000; 31: H u Q W, L i u G T. E f f e c t s o f b i c y c l o l o n dimethylnitrosamine-induced liver fibrosis in mice and its mechanism of action. Life Sci 2006; 79: Denizot F, Lang R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods 1986; 89: Dufour JF, DeLellis R, Kaplan MM. Reversibility of hepatic fibrosis in autoimmune hepatitis. Ann Intern Med 1997; 127: Wanless IR. Use of corticosteroid therapy in autoimmune hepatitis resulting in the resolution of 4 cirrhosis. J Clin Gastroenterol 2001; 32: ; 12: 22 Kaplan MM, DeLellis RA, Wolfe HJ. Sustained biochemical and histologic remission of primary 5 biliary cirrhosis in response to medical treatment. 2004; 14: Ann Intern Med 1997; 126: Kweon YO, Goodman ZD, Dienstag JL, Schiff ER, Brown NA, Burchardt E, Schoonhoven R, Brenner 2006; 12: DA, Fried MW. Decreasing fibrogenesis: an 7 immunohistochemical study of paired liver biopsies 2006; 29: following lamivudine therapy for chronic hepatitis 8 Liu P, Liu C, Xu LM, Hu YY, Xue HM, Liu CH, B. J Hepatol 2001; 35: Zhang ZQ. Effects of Fuzheng Huayu 319 recipe 24 Hammel P, Couvelard A, O'Toole D, Ratouis A, on liver fibrosis in chronic hepatitis B. World J Sauvanet A, Flejou JF, Degott C, Belghiti J, Bernades Gastroenterol 1998; 4: P, Valla D, Ruszniewski P, Levy P. Regression of 9 liver fibrosis after biliary drainage in patients with 2004; 24: chronic pancreatitis and stenosis of the common 10 bile duct. N Engl J Med 2001; 344: ; 19: Yang F, Yang XP, Liu YH, Xu J, Cingolani O, 11 Rhaleb NE, Carretero OA. Ac-SDKP reverses 2005; 21: inflammation and fibrosis in rats with heart failure ; 9: after myocardial infarction. Hypertension 2004; 43: 13 眆 Issa R, Williams E, Trim N, Kendall T, Arthur MJ, 2004; 21: Reichen J, Benyon RC, Iredale JP. Apoptosis of 14 hepatic stellate cells: involvement in resolution of biliary fibrosis and regulation by soluble growth 2005; 22: Jenkins SA, Grandison A, Baxter JN, Day DW, Taylor I, Shields R. A dimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat. J Hepatol 1985; 1: He JY, Ge WH, Chen Y. Iron deposition and fat,,. factors. Gut 2001; 48: Lee JI, Lee KS, Paik YH, Nyun Park Y, Han KH, Chon CY, Moon YM. Apoptosis of hepatic stellate cells in carbon tetrachloride induced acute liver injury of the rat: analysis of isolated hepatic stellate cells. J Hepatol 2003; 39:

21 ; 15(16): ISSN CN /R BASIC RESEARCH TNF-α 对肠上皮细胞紧密连接蛋白表达的作用 plied to the localization of claudin-1. Real-time quantity polymerase-chain reaction (RQ-PCR) was used to detect the mrna expression of, claudin-1. TNF-α. RESULTS: Immunofluorescence showed that claudin-1 was distributed around the cell membrane and presented scrobiculate linear fluo-, TNF-α rescence. A 10 μg/l concentration of TNF-α, caused weakened fluorescence signals that were Effect of tumor necrosis abnormally distributed dentately. Claudin-1. factor-α on protein expression has two molecular forms: one is the nonphosphorylated form (20 kda) that primarily exists of tight junction protein in, in NP-40 soluble proteins; the other is the phosphorylated form (25 kda) that only exists in intestinal epithelial cells, claudin-1 NP-40 insoluble proteins. Wei Cui, Dong-Yan Liu, Li Ma, Pei Liu TNF-α did not affect, the protein expression of 65-kDa claudin-1 but decreased 80-kDa claudin-1 protein expression Wei Cui, Pei Liu, Department of Digestive diseases, the in a concentration-dependant manner compared First Affiliated Hospital of China Medical University,. Shenyang , Liaoning Province, China with the control (10, 100 μg/l: 0.31 ± 0.02, 0.24 ± T N F - α Dong-Yan Liu, Li Ma, Department of Infectious Diseases, 0.05 vs 0.43 ± 0.09, P > 0.05, P < 0.05). Real time the Second Affiliated Hospital of China Medical University, PCR demonstrated that the mrna expression Shenyang , Liaoning Province, China Supported by National Natural Science Foundation of of claudin-1 in TNF-α treatment groups with claudin-1 China, No different concentrations (10 and 100 μg/l) for? Correspondence to: Pei Liu, Department of Digestive 24 hours, or a different reacting time (4, 8, 24 h), Diseases, the First Affiliated Hospital of China Medical was not significantly different from the corresponding time normal groups (P > 0.05). T N F - α University, 155 Nanjing North Street, Shenyang , Liaoning Province, China. syliupei2003@yahoo.com.cn Received: Accepted: claudin-1. Abstract AIM: To explore the mechanism of intestinal epithelial barrier disruption induced by tumor necrosis factor alpha (TNF-α). We detected the expression of the tight junction protein claudin-1 in Caco-2 cells with TNF-α treatment. CONCLUSION: TNF-α does not affect the mrna expression of the tight junction protein claudin-1 but decrease the expression of functional claudin-1 in Caco-2 cells. Key Words: Tissue necrosis factor-α; Tight junction protein claudin-1; Caco-2 cell; Immunofluorescence; Western blot; Real-time quantity polymerase-chain reaction METHODS: Caco-2 cells between passages 20 and 30 were cultured with DMEM including 20% fetal bovine serum and 2 mmol/l glutamine for 7 days. Cells were then treated with different concentrations of TNF-α (0, 10, and 100 μg/l) for 24 hours when they became fused. Protein was extracted from cells to prepare NP-40 detergent-soluble and insoluble protein fractions. Western blot was used to measure the protein levels of phosphorylated and unphosphorylated claudin-1. Indirect immunofluorescence was ap- Cui W, Liu DY, Ma L, Liu P. Effect of tumor necrosis factor-α on protein expression of tight junction protein in intestinal epithelial cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : α(tnf-α) claudin-1, TNF-α.

22 α 1789 方法 : Caco-2 (20-30 ) 2 mmol/ L 20% DMEM 7 d, TNF-α(0, 10, 100 μg/l) 24 h, NP-40, Western blot claudin-1, claudin-1, PCR claudin-1 mrna. 结果 : claudin-1,, 10 μg/l TNF-α claudin-1, ; Western blot claudin-1, 20 kda( claudin-1), NP-40 ; 25 kda( claudin-1), NP-40. TNF-α 20 kda claudin-1, 25 kda claudin-1 (10, 100 μg/l: 0.31±0.02, 0.24±0.05 vs 0.43±0.09 P >0.05, P <0.05); PCR TNF-α(10, 100 μg/l) 24 h 100 μg/l TNF-α (4, 8 24 h) claudin-1 mrna. 结论 : T N F-α C a c o-2 claudin-1 mrna, claudin-1. 养 24 h 后, 进行免疫荧光检测, 并收集 Caco-2 细关键词 α 胞提取蛋白及总 RNA, -130 保存待用. 每种实 验均选取 3 组非同代细胞进行 取同代细胞接种于盖玻片上, 待 -α 细胞生长融合 70% 左右加入处理因素, 取出盖玻 片, PBS 漂洗 3 次 ( 每次 10 min) 后, 用 40 g/l 多聚甲 醛固定 15 min, PBS 漂洗, 加入 5 g/l Triton X 引言 肠黏膜屏障功能损害被认为是炎症性肠病的始 动因素 [1], 可引起肠黏膜屏障通透性增高, 使正 常情况下不能通透的各种毒性物质 微生物进 入肠壁, 诱发炎症反应. 炎性细胞因子 TNF-α 在 这一过程中占据重要位置, 已有研究表明炎症 性肠病患者 TNF-α 异常增高, 并伴随肠黏膜屏 障通透性的增高, 应用 TNF-α 抗体可以降低这 些患者肠黏膜屏障的通透性 [2], 但是 TNF-α 引起 肠黏膜屏障通透性增高的具体机制还不十分清 楚. 炎症性肠病时肠黏膜屏障通透性增高的特征 是肠上皮细胞旁路的通透性明显增高, 而肠上皮 细胞旁路的通透性主要受紧密连接限制. 紧密连 接由多种紧密连接蛋白组成, claudin-1 是最重要 的一种紧密连接蛋白, 对于屏障功能的维持和 紧密连接的完整性具有重要作用. 有研究表明, claudin-1 表达异常可使肠上皮细胞跨上皮细胞 电阻 (transepithelial electrical resistance, TEER) 降 低, 肠黏膜通透性增高 [3]. 因此我们检测了 TNF-α 对紧密连接蛋白 claudin-1 表达的影响, 以探讨 TNF-α 增加肠上皮细胞屏障通透性的机制. 1 材料和方法 D M E M 高糖培养基, F C S 购自美国 Gibcobrl 公司, 非必须氨基酸 丙酮酸钠购自美 国 Hyclone 公司, 谷氨酰胺 重组人 TNF-α 购自美 国 Sigma 公司, 兔抗 claudin-1 多克隆抗体购自美国 Zymed 公司, FITC 辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔 IgG 购自美国 Santa Cruz 公司, PCR 试剂盒 T7 体外转录试剂盒 定时定量 PCR 试剂盒购自大 连宝生物工程有限公司 Caco-2 细胞应用含有 200 ml/l 胎 牛血清 10 g/l 非必须氨基酸 4 mmol/l 谷氨 酰胺和青霉素 - 链霉素双抗液的 DMEM 培养液, 在 ml/l CO 2 条件下进行培养, 每 7 天按 1 2 的比例传代. 传代后 7 d 左右细胞生长达到 融合, 加入不同浓度的 TNF-α(0, 10, 100 μg/l) 培 处理 10 min, PBS 漂洗, 100 ml/l 小牛血清白蛋 白室温封闭 30 min, 加入 claudin-1 抗体 (1 50), 4 过夜, PBS 漂洗后加入 FITC 标记二抗 (1 200) 室温孵育 1 h, 再用 PBS 漂洗, 蒸馏水洗后用 甘油封片, 荧光显微镜下观察. PBS 液代替一抗 作为空白对照 NP-40 细 胞用冰 PBS 洗 3 遍, 然后用 NP-40 蛋白裂解液 (25 mmol/l HEPES, ph 7.4, 150 mmol/l NaCl, 4 mmol/ L EDTA, 10 g/l Nonidet P-40, 25 mmol/l NaF, 1 mmol/l Na 3 VO 4, 10 mmol/l sodium pyrophosphate, 1 mmol/l PMSF) 冰上裂解细胞 20 min, 4, g 离心 30 min, 上清即为 NP-40 可溶性蛋白, 转移 TNF-α,. TNF-α,.

23 1790 ISSN CN /R, T N F - α claudin-1,., TNF-α claudin-1, T N F - α claudin-1. A C B D 图 1 各组免疫荧光染色结果 ( 400). -α -α 至新的 Microtube 内. 剩余沉淀应用 SDS 蛋白裂解 液 (25 mmol/l HEPES, ph 7.4, 4 mmol/l EDTA, 10 g/l SDS, 25 mmol/l NaF, 1 mmol/l Na 3 VO 4, 10 mmol/l sodium pyrophosphate, 1 mmol/l PMSF) 冰上裂解细胞 20 min, 超声波粉碎 5 s 5 次, 4, g 离心 30 min, 所得上清即为 NP-40 不溶性 蛋白, 两种蛋白的混合物即为总蛋白. 采用 BCA 法对蛋白样品进行定量, 用蒸馏水将蛋白样品调 成相同浓度, 加入相同体积上样缓冲液, 沸水煮 5 min 进行蛋白变性 Western blot 每个样本取等量蛋白 ( 约 50 μg) 进行 80 g/l SDS-PAGE 凝胶电泳, 电压 100 V, 2.5 h, 电泳后将蛋白转至硝酸纤维素膜上, 电压 50 V, 2 h, 脱脂奶粉 4 封闭过夜, TBS 洗 5 min 3 次, 加入多克隆兔抗 claudin-1 抗体 (1 500) 室温 2 h, TTBS 洗 5 min 3 次, 然后加入碱性磷酸酶标 记的羊抗兔 -IgG 抗体 ( ) 室温 2 h, TTBS 洗 5min 3 次, ECL 显色. 以同一样本的 β-actin 作 TNF-α 为内参. 结果通过天能图像分析系统进行分析, claudin-1 蛋白含量 = 样本 claudin-1 蛋白灰度值 claudin-1 / 同一样本 β-actin 灰度值.. TNF-α PCR 用 TRIzol 一步法提取细胞 总 RNA. 采用 SYBR Green Ⅰ 荧光染料嵌合法 检测 claudin-1 mrna. 简言之先构建目的基因, (claudin-1 基因 ) 和管家基因 (GAPDH) 的 RNA 标. 准品, 制作标准曲线, 利用标准曲线对样品中的 目的基因和管家基因分别进行定量. 通过管家 基因的校正, 检测各组大肠组织中 claudin-1 目 的基因的相对表达量. Claudin-1 mrna 的相对 表达量 = claudin-1 基因拷贝数 /GAPDH 基因拷 贝数. PCR 反应体系的组成参照说明书进行, 反 应条件为逆转录反应 min, 95 2 min, PCR 扩增 s 1 个循环, 95 5 s, s 45 个循环. Claudin-1 和 GAPDH 引物序列如下 : Claudin-1 引物 : 5'-AAGAGTTGACAGTCCCAT GGCATAC-3'( 上游 ), 5'-ATCCACAGGCGAAGT T A AT G G A A G - 3 ' ( 下游 ) ; G A P D H 引物 : 5'-AAATGGTGAAGGT CGGTGTG-3'( 上游 ), 5'- TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'( 下游 ). Claudin-1 产物片段 133 bp, GAPDH 产物片段 144 bp. 实验结果以 mean±sd 表示, 采 用 SPSS10.0 统计软件对各组间数据进行单因素 方差分析, 每种实验均选取 3 组数据进行分析. 2 结果 2.1 对照组 claudin-1 蛋白主要 沿细胞膜分布, 呈蜂巢状线性荧光 ; 加入 TNF-α 10 μg/l 可使 claudin-1 蛋白荧光信号减弱, 并呈锯 齿状分布 ; 增加 TNF-α 浓度到 100 μg/l 发现 claudin-1 蛋白荧光信号进一步减弱, 锯齿状分布更加

24 α 1791 明显, 并且在胞浆内可见阳性染色. 以上结果提示 TNF-α 可引起 claudin-1 分布异常, 由膜顶端向膜下及胞浆转移, 并具有浓度依赖性 ( 图 1). 2.2 Western blot 各组蛋白样品分为 NP-40 可溶性与 NP-40 不溶性两个框架分别进行蛋白杂交, 结果发现 NP-40 可溶性标本仅在 20 kda 处见一特异性的蛋白条带, 对各条带进行灰度分析发现各组 claudin-1 蛋白的表达无明显差异. NP-40 不溶性标本可见两条蛋白条带, 分别在 20 kda 和 25 kda, 对各条带进行灰度分析发现各组标本 20 kda 的蛋白含量无统计学差异, 但是对于 25 kda 的蛋白含量, TNF-α 组较对照组明显下降并呈剂量依赖性 (0.31±0.02, 0.24±0.05 vs 0.43±0.09, P >0.05, P <0.05, 图 2). 2.3 PCR 电泳结果和 OD 值结果显示, 构建的人 claudin-1 基因和 GAPDH 基因 RNA 标准品片段长度分别为 358 bp 和 1043 bp. 其质量良好, 所获得的标准曲线相关系数为 0.998, 线性关系良好, 融解曲线显示特异性良好. 利用标准曲线对样品中的 claudin-1 基因和 GAPDH 基因进行定量, 结果发现不同浓度 TNF-α 组与正常对照组比较 claudin-1 mrna 的水平没有统计学差异 (0.63 ±0.1,0.61±0.06 vs 0.6±0.07, P >0.05). 进一步我们检测了 TNF-α 100 μg/l 作用不同时间 (4, 8, 24 h)claudin-1 mrna 水平的变化, 与正常对照组相应时间点相比, claudin-1 mrna 水平仍然没有统计学差异 (0.9±0.4, 1.02±0.6, 0.92±0.3 vs 0.94± 0.4, P>0.05). 这些结果提示 TNF-α 对 claudin-1 的调节不发生在转录水平 ( 图 3). 3 讨论 TNF-α 已被证实是炎症性肠病时引起肠黏膜屏障功能损伤的重要启动因子, 这可以从下面几点证明 : (1) 炎症性肠病患者 TNF-α 水平异常增高, 并与肠黏膜损伤的程度直接相关 [4] ; (2) 抗 TNF-α 抗体治疗炎症性肠病患者有效 [5-8] ; (3)TNF-α 可引起其他细胞因子如 IL-1, -6, -8, -12 CSF 等增高, 这些细胞因子被证实参与了炎症性肠病的发生 [4,6]. T N F-α 引起肠黏膜屏障通透性增高的机制还不十分清楚, 与 NF-κB 活化有关 [9], MLCK, MAPK, PKC 等信号途径皆参与其调节 [10-16]. 最近越来越多的研究表明, TNF-α 可以增加肠上皮细胞细胞旁的通透性, 降低肠上皮细胞屏障的跨上皮电阻, 并认为这是 TNF-α 引起肠黏膜屏障通透性增高的主要原因 [17-19]. 正常情况下肠上皮细胞细胞旁间隙是由连接复合体封 25 kda 20 kda claudin-1, TNF- α claudin-1, claudin-1 mrna, a TNF-α α μ 图 2 各组 Western blot 结果. 闭的, 其中最重要的是紧密连接 (tight junction, T J) [20]. 紧密连接由多种紧密连接蛋白分子组 成, 包括跨膜蛋白 claudin-1 claudins 连接黏 附分子 (junctional adhesion molecule, JAM) 和胞 质附着蛋白 Zos AF6 7H6 等. Claudin-1 是最 先分离出来的 TJ 跨膜蛋白, 分子量为 20 kda, 形 成两个细胞外环和一个短的细胞内环. 相邻细 胞间通过外环以 拉链 状结合产生细胞旁 封闭. Claudin-1 蛋白对于上皮细胞屏障功能的 维持和紧密连接的完整性具有重要作用. 有研 究表明, 用 claudin-1 转染 L- 纤维母细胞 ( 缺乏 TJ) 后, 相邻细胞之间可以形成 TJ 样结构 [21]. 另外在 MDCK( 犬肾上皮 ) 细胞中增加 claudin-1 表达可以 增加上皮细胞的 TEER [22-23], 而在蟾蜍胚胎中, 转 入缺乏完整结构的 claudin-1 片段可破坏屏障功 能 [24]. 这提示 claudin-1 是 TJ 的主要功能蛋白, 参 与屏障功能的调节. 因此我们推测 TNF-α 是通 过影响紧密连接蛋白的表达, 从而破坏紧密连 接的完整性, 增加肠黏膜屏障的通透性. 为了验 证这一假设, 我们检测了 TNF-α 对 TJ 中最重要 的跨膜蛋白 claudin-1 表达和定位的影响. 我们首 先应用免疫荧光染色对 claudin-1 蛋白的定位进 行研究. 正常情况下, claudin-1 定位在细胞膜顶 端, 交织成网状, 加入 TNF-α 后, claudin-1 由膜顶 端向膜下转移, 表现为荧光信号呈锯齿状分布 并有中断现象. 这说明 TNF-α 可以引起 claudin-1 蛋白分布异常, 使其不能定位在紧密连接上发 挥功能, 从而引起紧密连接的断裂. 这与 H a n 和 Sappington 在 Caco-2 细胞中的研究结果相一 致 [25-26]. Claudin-1 存在磷酸化和非磷酸化两种 形式, 磷酸化是其活性形式, 在 ATP 或钙转移 实验中发现 T J 的组装和高 T E E R 的形成有赖

25 1792 ISSN CN /R,,., claudin, claudin-1 Zo-1,Zo-2, Zo-3,,. occludin mrna occludin mrna α μ t /h 图 3 各组实时定量 PCR 结果. α α μ 于 claudin-1 酪氨酸残基的磷酸化 [27]. 有研究表 明磷酸化的 claudin-1 定位在 TJ 上, 而非磷酸化 claudin-1 沿膜的基底侧分布, 并且磷酸化会使 claudin-1 分子量上调并不溶于 NP-40 [28]. 利用这 一特性我们制备了 NP-40 可溶性和不溶性蛋白 框架, 分别进行 claudin-1 蛋白杂交. 结果发现在 NP-40 可溶性蛋白框架内只存在一种蛋白, 分 子量在 20 kda, TNF-α 不能影响其表达 ; 而在 NP-40 不溶性蛋白框架内存在两种蛋白, 一种为 20 kda 的非磷酸化 claudin-1 蛋白, 一种为 25 kda 的磷酸化 claudin-1 蛋白, TNF-α 可以下调后者的 表达并具有浓度依赖性. 这也进一步解释了免 疫荧光中 TNF-α 为何会引起 claudin-1 蛋白的分 布异常 - 是 TNF-α 减少 claudin-1 蛋白磷酸化的结 果. 在目前研究中, TNF-α 对 claudin-1 蛋白含量 的影响存在不同结果, 有研究表明 TNF-α 或细 胞因子混合物 (TNF-α IFN-γ IL-1β) 可以减少 claudin-1 蛋白的表达 [25-26], 也有研究认为 TNF-α 对 claudin-1 蛋白总量没有影响 [29-30]. 我们实验中 发现 TNF-α 不影响 claudin-1 蛋白的总量, 但可以 减少 claudin-1 蛋白的磷酸化, 这些结果上的差异 可能与选择的细胞系及细胞因子的作用时间有 关, 单一细胞因子及较短的作用时间 (24 h) 不引 起 claudin-1 蛋白总量的改变. 有报道称 TNF-α 可 以下调肠上皮细胞 HT-29/B6 claudin-1 基因启动子的表达 [31-32], 提示 claudin-1 蛋白表达亦受转录 水平的调节, 因此我们应用实时定量 PCR 技术检测了 TNF-α 对 claudin-1 mrna 的影响, 结果表明无论哪种浓度的 TNF-α 均不能引起 claudin-1 mrna 水平的变化. 对于蛋白分子调控, 其转录 水平的调节与蛋白水平的调节具有一定的时相 性, 因此我们又检测了 TNF-α 100 μg/l 作用不同 时间 (4, 8, 24 h)claudin-1 mrna 水平的变化, 同 样没有发现任何阳性结果. 提示在 Caco-2 细胞 中, TNF-α 对 claudin-1 的调节发生在蛋白水平, 而不是转录水平, 这一结果也与 Western blot 实 验中 claudin-1 蛋白的总量没有变化相一致. 在本 实验中, 我们证明 TNF-α 可以减少紧密连接蛋白 claudin-1 磷酸化, 使其从紧密连接上解聚, 紧密 连接断裂, 并认为这是 TNF-α 增加肠上皮屏障通 透性的作用靶点. 为进一步研究 TNF-α 增加肠上 皮细胞屏障通透性的分子机制提供基础. 4 参考文献 1 Ma TY. Intestinal epithelial barrier dysfunction in Crohn's disease. Proc Soc Exp Biol Med 1997; 214: Suenaert P, Bulteel V, Lemmens L, Noman M, Geypens B, Van Assche G, Geboes K, Ceuppens JL, Rutgeerts P. Anti-tumor necrosis factor treatment restores the gut barrier in Crohn's disease. Am J Gastroenterol 2002; 97: Hopkins AM, Walsh SV, Verkade P, Boquet P, Nusrat A. Constitutive activation of Rho proteins by CNF-1 influences tight junction structure and

26 α 1793 epithelial barrier function. J Cell Sci 2003; 116: (TNFalpha) regulates the epithelial barrier in the 4 Van Deventer SJ. Tumour necrosis factor and Crohn's disease. Gut 1997; 40: human intestinal cell line HT-29/B6. J Cell Sci 1999; 112 ( Pt 1): Ricart E, Panaccione R, Loftus EV, Tremaine WJ, Sandborn WJ. Infliximab for Crohn's disease in clinical practice at the Mayo Clinic: the first 100 patients. Am J Gastroenterol 2001; 96: Bruewer M, Luegering A, Kucharzik T, Parkos C A, M a d a r a J L, H o p k i n s A M, N u s r a t A. Proinflammatory cytokines disrupt epithelial barrier function by apoptosis-independent 6 Rutgeerts P, Feagan BG, Lichtenstein GR, Mayer LF, Schreiber S, Colombel JF, Rachmilewitz D, Wolf DC, Olson A, Bao W, Hanauer SB. Comparison of scheduled and episodic treatment strategies of infliximab in Crohn's disease. Gastroenterology 2004; 126: mechanisms. J Immunol 2003; 171: ; 13: Furuse M, Fujita K, Hiiragi T, Fujimoto K, Tsukita S. Claudin-1 and -2: novel integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence 7 Hanauer SB, Feagan BG, Lichtenstein GR, Mayer LF, Schreiber S, Colombel JF, Rachmilewitz D, Wolf DC, Olson A, Bao W, Rutgeerts P. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet 2002; 359: similarity to claudin-1. J Cell Biol 1998; 141: McCarthy KM, Skare IB, Stankewich MC, Furuse M, Tsukita S, Rogers RA, Lynch RD, Schneeberger EE. Claudin-1 is a functional component of the tight junction. J Cell Sci 1996; 109 ( Pt 9): Zeissig S, Bojarski C, Buergel N, Mankertz J, Zeitz M, Fromm M, Schulzke JD. Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment. Gut 2004; 53: Balda MS, Whitney JA, Flores C, Gonzalez S, Cereijido M, Matter K. Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apicalbasolateral intramembrane diffusion barrier by 9 Ma TY, Iwamoto GK, Hoa NT, Akotia V, Pedram A, Boivin MA, Said HM. TNF-alpha-induced increase in intestinal epithelial tight junction permeability requires NF-kappa B activation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 286: G expression of a mutant tight junction membrane protein. J Cell Biol 1996; 134: Chen Y, Merzdorf C, Paul DL, Goodenough DA. COOH terminus of claudin-1 is required for tight junction barrier function in early Xenopus embryos. 10 Wang F, Graham WV, Wang Y, Witkowski ED, Schwarz BT, Turner JR. Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by upregulating myosin light chain kinase expression. Am J Pathol 2005; 166: J Cell Biol 1997; 138: Han X, Fink MP, Delude RL. 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Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006; 290: G Nonreceptor tyrosine kinase c-yes interacts with claudin-1 during tight junction formation in canine kidney epithelial cells. Mol Biol Cell 2002; 13: Sakakibara A, Furuse M, Saitou M, Ando- 13 Ma TY, Boivin MA, Ye D, Pedram A, Said HM. Mechanism of TNF-{alpha} modulation of Caco-2 intestinal epithelial tight junction barrier: role of myosin light-chain kinase protein expression. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2005; 288: G Akatsuka Y, Tsukita S. Possible involvement of phosphorylation of claudin-1 in tight junction formation. J Cell Biol 1997; 137: Poritz LS, Garver KI, Tilberg AF, Koltun WA. Tumor necrosis factor alpha disrupts tight junction 14 Banan A, Zhang LJ, Shaikh M, Fields JZ, Farhadi A, Keshavarzian A. Theta-isoform of PKC is required for alterations in cytoskeletal dynamics and barrier permeability in intestinal epithelium: a novel function for PKC-theta. Am J Physiol Cell Physiol 2004; 287: C assembly. J Surg Res 2004; 116: Quesnell RR, Erickson J, Schultz BD. Apical electrolyte concentration modulates barrier function and tight junction protein localization in bovine mammary epithelium. Am J Physiol Cell Physiol 2007; 292: C Mankertz J, Waller JS, Hillenbrand B, Tavalali 2006; 14: S, Florian P, Schoneberg T, Fromm M, Schulzke 16 JD. Gene expression of the tight junction protein 2003; 11: Gitter AH, Bendfeldt K, Schmitz H, Schulzke JD, Bentzel CJ, Fromm M. Epithelial barrier defects in HT-29/B6 colonic cell monolayers induced by tumor necrosis factor-alpha. Ann N Y Acad Sci 2000; 915: Schmitz H, Fromm M, Bentzel CJ, Scholz P, Detjen K, Mankertz J, Bode H, Epple HJ, Riecken EO, Schulzke JD. Tumor necrosis factor-alpha TNF-α,,. TNF-α claudin-1,,,. 20 claudin-1 includes differential splicing and alternative promoter usage. Biochem Biophys Res Commun 2002; 298: Mankertz J, Tavalali S, Schmitz H, Mankertz A, Riecken EO, Fromm M, Schulzke JD. Expression from the human claudin-1 promoter is affected by tumor necrosis factor alpha and interferon gamma. J Cell Sci 2000; 113 ( Pt 11):

27 ; 15(16): ISSN CN /R BASIC RESEARCH 生长抑素类似物对大鼠急性胰腺炎 PAP 的影响 verified by pathological method. Then the level of serum PAP was measured by enzyme-linked, AP immunosorbent assay (ELISA)., RESULTS: IHC showed that the expression of ; PAP was significantly higher in group C than AP, that in group B (χ 2 = 26.11, P < 0.01), but it was AP markedly lower in group D than that in group C, Influence of somatostatin (χ 2 = 15.65, P < 0.05). RT-PCR and ELISA demonstrated a significant PAP increase in tissue AP. anologue on pancreatitisassociated protein in rats with and serum in group C, but a notable decrease in group D, and there were significant differences acute pancreatitis between group B, C and D (RT-PCR: F = 71.3, P, < 0.01; ELISA: F = 925, P < 0.001). PAP expression at the 6 th and 12 th hour had obvious differ- Bai-Feng Tong, Hao-Xin Zhou, Xiao-Ming Zou,, Hai Peng, Wen-Xue Zhou, Wei-Liang Yang ence in group C (IHC: χ 2 = 16.92, P < 0.05; RT-, PCR: t = 2.49, P < 0.05; ELISA: t = 2.56, P < 0.05), Bai-Feng Tong, Hao-Xin Zhou, Xiao-Ming Zou, Hai PA P Peng, Wen-Xue Zhou, Wei-Liang Yang, Department of but not in the other groups (except the ELISA General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin result). Dramatic pathological changes were observed, Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China in group C. PA P, Supported by the Pancreatic Surgery Research Foundation of Chinese Medical Association (2005) CONCLUSION: PAP highly expressed at the AP Correspondence to: Xiao-Ming Zou, Department of early stage of AP, and it is sensitive to the treatment of octreotide. PAP is also useful for the General Surgery, the Second Affiliated Hospital of Harbin AP. Medical University, Harbin , Heilongjiang Province, China diagnosis and prognosis of acute panreatitis. Received: Accepted: Abstract AIM: To investigate the influence of somatostatin anologue octreotide on the expression of pancreatitis-associated protein (PAP) and pathological changes in pancreas in rats with acute pancreatitis (AP). Then the level of serum PAP was measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). METHODS: Eighty Wistar rats were randomized into group A, B, C and D, served as negative control group, sham operation group, AP model group and octreotide-treated group, respectively. The experimental samples were collected at the 6 th and 12 th hour in all the groups. The expression of PAP in pancreas was detected by semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemistry (IHC) after the AP tissues were Key Words: Somatostatin similarity; Acute pancreatitis; Pancreatitis-associated protein; Rat Tong BF, Zhou HX, Zou XM, Peng H, Zhou WX, Yang WL. Influence of somatostatin anologue on pancreatitisassociated protein in rats with acute pancreatitis. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : ( ) (acute pancreatitis, AP) (pancreatitis-associated protein, PAP). 方法 : Wistar 80,, 6, 12 h., PAP RT-PCR, ELISA.

28 1795 结果 :, PA P (χ 2 = 26.11, P <0.01), (χ 2 = 15.65, P <0.05). RT-PCR ELISA, PAP,, 3(RT-PCR: F = 71.3, P <0.01; ELISA: F = 925, P <0.001). RT-PCR ELISA, PAP, 6, 12 h (χ 2 = 16.92, P <0.05; t = 2.49, P <0.05; t = 2.56, P <0.05), ( ELISA )6, 12 h (P >0.05).. 结论 : PAP AP,,. 引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成, 引物序列 ( 由 Primer3 软件设计 ) 如下 : PAP( 目的片段长度为 330 bp): 上游 : 5'TGCTCTCCTGC CTGATGCTCTTAT3'; 下游 : 5'TACTCCACTCC CATCCACCTCCAT3'. β-actin( 目的片段长度为 452 bp): 上游 : 5'GAGAGGGAAATCGTGCGTG AC3'; 下游 : 5'CATCTGCTGGAAGGTGGACA3'. 小鼠抗大鼠 PAP 单克隆抗体购自美国 R&D 公司, 兔抗小鼠超敏试剂盒 (UltraSensitiveTM SP, 即用型 ) 购自福州迈新生物技术有限公司, 操作按说明书进行. 大鼠 PAP 定量 ELISA 试剂盒购自美国 Rapidbio 公司 将实验动物随机分为 4 组, 分别为 A 组 ( 阴性对照组 ) B 组 ( 假手术组 ) C 组 ( 手术组 ) D 组 ( 治疗组 ), 每组 20 关键词 只. 各组内每 10 只分别于造模后 6 和 12 h 采集标 本. 用 100 ml/l 水合氯醛 (3 ml/kg) 腹腔注射麻醉大鼠, 固定于无菌手术台, 消毒腹部皮肤, 正 中切口进腹, 于十二指肠内侧可见片状分布的 胰腺. 在近肝门端胆胰管用无损伤金属夹将其 夹闭, 通过十二指肠侧壁用注射器针头穿入胆胰管, 细丝线活结结扎胆胰管和针头, 用 WZS-50 0 引言型微量注射泵 ( 浙江大学仪器厂 ) 以 20 μl/min 速近些年的研究发现, 由于胰腺炎相关蛋白度逆行注射 3.5 g/100 ml 牛磺胆酸纳 (1 ml/kg), (pancreatitis-associated protein, PAP) 在急性胰腺然后松开结扎线和金属夹, 两层连续缝合关闭炎 (acute pancreatitis, AP) 时大量合成 分泌, 而腹腔 [17-18]. 假手术组于胆胰管逆行注射等剂量生在正常胰腺及胰液中并不存在 ; 并且其与 AP 的理盐水, 手术组于术后 30 min 背部皮下注射奥发生 发展密切相关, 故他可作为 AP 的特异性曲肽 (20 μg/kg). 各组动物每 10 只分别于造模后诊断指标, 并可用于 AP 的治疗效果评价和预后 6 和 12 h 处死大鼠, 于下腔静脉采血后离心 (3000 判断 [1-8]. 人工合成的生长抑素类似物已广泛用 r/min), 保留血清, -20 冻存备用. 完整切除胰腺于临床治疗急性胰腺炎多年, 取得了一定的治组织, 部分于中性甲醛中固定, 另一部分立即至疗效果 [9-16], 但对其具体作用机制至今也尚未完于 -195 液氮保存备用. 全阐明, 因此我们研究生长抑素类似物对 PAP 蛋 每标本随机选取 100 视野 30 个, 白水平和基因表达的影响, 探讨生长抑素类似每视野划分 100 个网络, 计算该区域正常与坏死物和 PAP 之间的关系, 将有助于进一步揭示 AP 胰腺组织所占网格数目及间质浸润炎症细胞数发病机制和指导临床对 AP 的治疗. 量. 坏死为丧失正常腺泡细胞结构及 HE 改变, 选取造模成功者进行下一步实验. 1 材料和方法 选取造模成功的标本按试 健康成年 Wistar 大鼠 80 只, 体质量剂盒说明, 采用 DAB 显色, 苏木素复染. 用推荐 g, 由哈尔滨医科大学第二临床医学院的阳性标本和磷酸盐缓冲液 (PBS) 代一抗分别实验动物中心提供, 适应性饲养 1 wk 后开始实做阳性和阴性对照. 高倍视野分 4 区各计数 100 验. 奥曲肽购自诺华公司. 牛磺胆酸钠 (970 g/l) 个细胞, 求其平均数值. 阳性判断标准 : 阳性细购自 Sigma 公司. 琼脂糖购自上海蓝季科技发展胞 25% 为 +( 弱阳性 ), 25%-50% 为 ++( 阳性 ), 有限公司. TRIzol 试剂为 Invitrogen 公司产品, RT 50% 为 +++( 强阳性 ), 未见阳性染色为 -( 阴性 ). 试剂盒 (A3500) 购自 Promega 公司. PAP 及 β-actin RNA RT-PCR 将保存于液, PAP 20,,,.

29 1796 ISSN CN /R A B 图 1 造模后胰腺组织病理改变 (HE 染色 ). 氮中的胰腺组织研碎后加 1 ml TRIzol 试剂, 按 试剂盒说明书提取 RNA 后至于 -80 保存. 采 用紫外分光光度仪测定 A 260 /A 280 比值为 1.9, 按 1A = 40 mg/l 计算 RNA 含量. 逆转录反应 : 按 A3500 试剂盒说明书进行反应, 将 RNA 逆转录 为 cdna. PCR 反应 : 每 0.2 ml Eppendorf 管中加 入 MgCl 2 (25 mmol/l) 2 μl, 10 反应缓冲液 2.5 μl, dntp(10 mmol/l) 0.5 μl, 上下游特异引物 1 μl, Tag DNA 聚合酶 0.5 μl, 各实验样品 (cdna) 2 μl, 加入 RNase Free dh 2 O 15.5 μl, 补足 25 μl 反应体系, 94 5 min, s, s, s, 后三步反应进行 35 个循环, 结束前 72 7 min 以充分延伸, 产物置 4 保存 PCR ELISA PCR 产物经 20 g/l 琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果, 以 b-actin 为内参照, 结果以 PCR 产物 /b-actin 比值 表示. 按照试剂盒说明测定各组血清标本 PAP 含量. 所有数据以均数加减标准差 (mean±sd) 表示. 用 t 检验 χ 2 检验 单因素方 差分析及多个样本均数间的多重比较进行显著 性检验, P 0.05 表示差异具有显著性. 2 结果 2.1 阴性对照组及假手术组胰 腺无明显病理改变. 其余各组均可见胰腺组织 出血成血块, 多叶成片坏死, 成堆炎细胞浸润, 或破坏原组织, 胰腺炎的炎症改变随时间延长 病变明显加重, 相继有间质水肿 灶性出血 白细胞浸润 脂肪坏死 腺泡坏死 小脓肿 大出血等 ( 图 1). 2.2 A 组及 B 组在胞质中呈 阴性或极少有弱阳性表达. C 组在胞质中呈较 强棕黄色表达. D 组介于两者之间. 与 B 组相比, C 组 PAP 的表达差异有统计学意义 (χ 2 = 26.11, P <0.01, 图 2A-B). 与 C 组相比, D 组 PAP 的表达差异有统计学意义 (χ 2 = 15.65, P <0.05, 图 2C-D). 另外, C 组中 12 h 的 PAP 蛋白 90% 呈强阳性表达, 且颜色较深, 而 6 h 组中仅 40% 呈强阳性, 两者相比表达差异有统计学意义 (χ 2 = 16.92, P <0.05, 图 2B-C). D 组中 6 h 与 12 h 相比 PAP 的表达差异无统计学意义 (χ 2 = 9.91, P >0.05). 2.3 PAP 6 12 h 阴性对照组未见 PAP 表达. B 组 C 组及 D 组的 mrna 表达明显增强 ( 图 3), 3 组之间差异具有显著性 (F = 71.3, P <0.01, 表 1). 各组 AP 6 与 12 h 相比较, B 组与 D 组 mrna 表达的差异不具有显著性 (0.05 vs 0.06, t = 0.82, P >0.05; 0.14 vs 0.16, t = 1.33, P >0.05), C 组 PAP 的表达差异具有显著性 (0.32 vs 0.37, t = 2.49, P <0.05). 2.4 PAP 阴性对照组血清中未能检测到 PAP. B 组中可检测少量 PAP. C 组及 D 组血中 PAP 的含量明显增加, 3 组之间差异具有显著性 (F = 925, P <0.001). 各组 AP 6 与 12 h 相比较, B 组 PAP 含量差异不具有显著性 (230 vs 243, t = 1.21, P >0.05), C 组 D 组两时间点的 PAP 含量差异具有显著性 (1378 vs 1606, t = 2.56, P <0.05; 1294 vs 1399, t = 2.78, P <0.05, 表 2). 3 讨论 AP 是以胰腺自身消化为基础, 胰腺实质坏死为主要特征的一种全身性疾病, 发病机制目前尚不完全清楚. 因其起病急 病情重 发展快 并发症多 病死率高而不断受到消化内外科医生以及基础医学学者们的重视. 而 AP 发病的不确定性一直困扰着他的临床诊断和处理. 目前, 该病诊断的 金标准 为高分辨率 CT 以及 Ranson 和 APACHEⅡ 评分系统 [19]. 高分辨率 CT 在临床常规应用受到一定限制, 而评分系统不仅需要测定很多指标, 而且在症状发生后 48 h

30 1797 A B C D 图 2 胞质中 PAP 免疫组化结果, 胞质棕黄色为阳性细胞 (DAB 染色, 400). M 表 1 胰腺组织 PAP 在 6 及 12 h 的表达 500 bp 452 bp 330 bp 分组 6 h 12 h 表 2 血清中 6 及 12 h 的 PAP 水平 (ng/l) 图 3 胰腺组织 PAP 基因在 6 及 12 h 的表达. β 分组 6 h 12 h 才可判断. 虽有重症监护和内外科积极处理, 但 SAP 的病死率仍在 20%-40%. 尽早明确诊断和积 极干预对 SAP 的预后至关重要, 因此国内外医学 界一直试图建立一种既有较高敏感性 特异性 和准确性, 又简单易行的急诊 SAP 鉴别方法. PAP 是 Keim et al [20] 在 1984 年发现的一种新 的分泌型蛋白质. 由于这种蛋白质仅发现于诱 发 AP 模型的胰液中, 因此称为 PAP. PAP 在胰腺 外分泌部腺泡细胞的粗面内质网合成, 并储存 于酶原颗粒中. 在正常胰腺及胰液中检测不出 PAP, 仅在胰腺炎发生后, 尤其重症胰腺炎, 胰腺 的酶蛋白基因表达迅速调整 [21], 许多编码胰腺 酶蛋白的 mrna 水平显著降低, 其中淀粉酶, 胰 蛋白酶原 I, 糜蛋白酶原 B, 弹力蛋白酶 1, 前羧肽 酶 A 等的 mrna 水平在急性期降低了 50%. 相反, PAP mrna 表达明显升高, 本实验结果也证实 了这一点. 由于 PAP 基因在胰腺腺泡细胞中过表 达, 在胰液及血清中都可检测到较高水平 PAP. 因此, PAP 可望成为胰腺炎的一个特异性的早期 诊断指标. 病理研究发现 PAP 水平与胰腺炎的严

31 1798 ISSN CN /R 重程度密切相关 [22], 胰腺炎程度越高, PAP 水平也就越高. 随着病情控制和患者逐渐恢复, 血清 PAP 水平开始不断下降 [23]. 因此, PAP 可作为急性期胰腺炎轻重程度 病情预测的依据和病程追踪观察的血清指标. 近年来人工合成的生长抑素八肽拟似剂 奥曲肽, 广泛用于临床治疗 AP, 取得了一定的治疗效果, 但对其具体作用机制至今尚未完全阐明. 目前, 较为公认的理论为奥曲肽通过直接和间接的抑制胰酶的释放和活化, 松弛 Oddi's 括约肌, 降低胰管压力, 减少胰管内胰液进入胰腺组织, 减轻由此引起的胰腺自身消化, 从而在 AP 的治疗中发挥重要作用 [24], 近年来, Hietaranta et al [25] 认为, 生长抑素可能通过抑制胰弹性蛋白酶的释放, 进而使 TLR 信号通路所调控的 NF-κB 的表达降低, 从而下调了炎性细胞因子的基因表达, 这可能是生长抑素治疗胰腺炎的主要机制. 本实验结果证实, C 组中随造模时间延长, PAP mrna 表达明显升高. 奥曲肽在各时间点都可明显降低 PAP 在胰腺组织中的基因表达. 这提示奥曲肽有可能也是通过 TLR 信号通路实现其对 PAP 的表达调控, 而应用 PAP 的优势在于他的特异性较炎性因子为强. 本实验从多个角度验证了随胰腺炎时间延长, PAP 在基因水平 蛋白水平及外周血中表达明显增强, 应用奥曲肽治疗后, 从各个层次均可使 PAP 表达下降, 而 D 组中 6 与 12 h 相比 PAP 基因及蛋白的表达差异无统计学意义则提示在今后的实验中可将造模时间延长并增加给药次数以进一步观察有无变化. 虽然, PAP 产生的确切机制目前尚不清楚, 但在 AP 时其增高的程度明显高于其他疾病却是不争的事实. 采用 ELISA 法, 免疫组化法和 RT-PCR 方法从蛋白水平和 mrna 水平的检测均支持这一点. 对于 PAP 的功能, 尚处于探索中, Motoo et al [26] 研究发现通过诱导 PAP mrna 的表达, 合成 PAP 而抑制胰腺腺泡细胞凋亡的发生, 而奥曲肽治疗 AP 的机制之一可能是诱导损伤的胰腺细胞凋亡以减轻炎症反应 [27], 故奥曲肽可能是通过抑制 PAP mrna 的表达, 从而达到治疗胰腺炎的目的. 奥曲肽可直接作用于 PAP 并从各个层次降低其表达, 其机制尚未完全明了, 进一步研究其机制及 PAP 蛋白的功能将有助于揭示 AP 的病因, 指导 AP 患者的早期诊断和预后判断. 4 参考文献 1 Bodeker H, Keim V, Fiedler F, Dagorn JC, Iovanna JL. PAP I interacts with itself, PAP II, PAP III, and lithostathine/regialpha. Mol Cell Biol Res Commun 1999; 2: Kiriyama S, Kumada T, Tanikawa M. Recent advances in biochemical diagnosis and assessment of severity in acute pancreatitis. Nippon Rinsho 2004; 62: Heller A, Fiedler F, Schmeck J, Luck V, Iovanna JL, Koch T. Pancreatitis-associated protein protects the lung from leukocyte-induced injury. Anesthesiology 1999; 91: Zhang H, Kandil E, Lin YY, Levi G, Zenilman ME. Targeted inhibition of gene expression of pancreatitis-associated proteins exacerbates the severity of acute pancreatitis in rats. Scand J Gastroenterol 2004; 39: Wang X, Wang B, Wu J. Pancreatitis-associated protein-i mrna expression in mouse pancreas is upregulated by lipopolysaccharide independent of cerulein-pancreatitis. J Gastroenterol Hepatol 2001; 16: Fiedler F, Croissant N, Rehbein C, Iovanna JL, Dagorn JC, van Ackern K, Keim V. Acute-phase response of the rat pancreas protects against further aggression with severe necrotizing pancreatitis. Crit Care Med 1998; 26: Gronborg M, Bunkenborg J, Kristiansen TZ, Jensen ON, Yeo CJ, Hruban RH, Maitra A, Goggins MG, Pandey A. Comprehensive proteomic analysis of human pancreatic juice. J Proteome Res 2004; 3: Schiesser M, Bimmler D, Frick TW, Graf R. Conformational changes of pancreatitis-associated protein (PAP) activated by trypsin lead to insoluble protein aggregates. Pancreas 2001; 22: Suga H, Tsuruta O, Okabe Y, Saitoh F, Noda T, Yoshida H, Ono N, Kinoshita H, Toyonaga A, Sata M. A case of mediastinal pancreatic pseudocyst successfully treated with somatostatin analogue. Kurume Med J 2005; 52: Manfredi R, Calza L, Chiodo F. A case-control study of HIV-associated pancreatic abnormalities during HAART era. Focus on emerging risk factors and specific management. Eur J Med Res 2004; 9: Takase K, Ueda T, Kuroda Y. New aspects of pharmaco-therapy for acute pancreatitis. Nippon Rinsho 2004; 62: Yang YM, Tian XD, Zhuang Y, Wang WM, Wan YL, Huang YT. Risk factors of pancreatic leakage after pancreaticoduodenectomy. World J Gastroenterol 2005; 11: Jung DH, Hwang S, Lee SG. An analysis on the amount of excreted pancreatic juice after pancreatoduodenectomy. Korean J Gastroenterol 2004; 43: Rollins MD, Meyers RL. Frey procedure for surgical management of chronic pancreatitis in children. J Pediatr Surg 2004; 39: Chebli JM, Gaburri PD, de Souza AF, Ornellas AT, Martins Junior EV, Chebli LA, Felga GE, Pinto JR. Internal pancreatic fistulas: proposal of a management algorithm based on a case series analysis. J Clin Gastroenterol 2004; 38: Kohsaki T, Nishimori I, Onishi S. Treatment of acute pancreatitis with protease inhibitor, H2 receptor antagonist and somatostatin analogue.

32 1799 Nippon Rinsho 2004; 62: Iovanna JL, Keim V, Nordback I, Montalto G, 17 Camarena J, Letoublon C, Levy P, Berthezene P, p38 Dagorn JC. Serum levels of pancreatitis-associated 2005; protein as indicators of the course of acute 13: pancreatitis. Multicentric Study Group on Acute 18 Pancreatitis. Gastroenterology 1994; 106: ; 14: ; 9: Hietaranta A, Mustonen H, Puolakkainen P, 2004: Haapiainen R, Kemppainen E. Proinflammatory 20 Keim V, Rohr G, Stockert HG, Haberich FJ. An additional secretory protein in the rat pancreas. Digestion 1984; 29: effects of pancreatic elastase are mediated through TLR4 and NF-kappaB. Biochem Biophys Res Commun 2004; 323: Iovanna JL, Keim V, Michel R, Dagorn JC. Pancreatic gene expression is altered during acute experimental pancreatitis in the rat. Am J Physiol 1991; 261: G Motoo Y, Taga K, Su SB, Xie MJ, Sawabu N. Arginine induces apoptosis and gene expression of pancreatitis-associated protein (PAP) in rat pancreatic acinar AR4-2J cells. Pancreas 2000; 20: 22 Keim V, Willemer S, Iovanna JL, Adler G, Dagorn JC. Rat pancreatitis-associated protein is expressed in relation to severity of experimental pancreatitis. Pancreas 1994; 9: ; 7: ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 Meeting ESGAR th Annual Meeting and Postgraduate Course June 2007 Lisbon fca@netvisao.pt Meeting Falk Symposium 160: Pathogenesis and Clinical Practice in Gastroenterology June 2007 Portoroz symposia@falkfoundation.de Meeting 9 th World Congress on Gastrointestinal Cancer June 2007 Barcelona meetings@imedex.com Meeting ILTS 13 th Annual International Congress June 2007 Rio De Janeiro Meeting Falk Workshop: Mechanisms of Intestinal Inflammation 10 October 2007 Dresden symposia@falkfoundation.de Meeting Falk Symposium 161: Future Perspectives in Gastroenterology October 2007 Dresden symposia@falkfoundation.de

33 ; 15(16): ISSN CN /R BASIC RESEARCH OPN 和 Syndecan-1 在原发性肝癌中的表达及与临床病理参数之间的相关性 METHODS: The expression patterns of OPN and syndecan-1 proteins in HCC, liver cirrhosis (HCC) (LC) and normal liver tissue (NLT) were investigated using high throughput TMA specified 3, to HCC (478 spots, product batch No: OD-CT-, DgLiv01-001) by SP method.. RESULTS: The positive rate of OPN in HCC, was significantly higher than that in LC or NLT. O P N (73.3% vs 47.4%, 22.2%, both P < 0.05). Correspondingly, the positive rate of Syndecan-1 ex-, pression was significantly lower than that in LC Study on the expression of or NLT (19.6% vs 35.0%, 90.0%, P < 0.05, P < 0.01)., Osteopontin and Syndecan-1 The results of single-factor analysis showed that HCC and their correlations with OPN expression was correlated with the integrality of tumor membrane (χ 2 = 4.52, P < 0.05), the clinical pathological ; Syndecan-1 characteristics of the formation of embolus in portal vein (χ 2 =, hepatocellular carcinoma by 4.28, P < 0.05) and metastases (χ 2 = 7.21, P < 0.05). Syndecan-1 expression was correlated with the tissue microarray technique integrality of tumor membrane (χ 2 = 5.58, P < 0.01), metastases (χ 2 = 3.37, P < 0.05) and pathological grades (χ 2 = 4.35, P < 0.01). Moreover, Xiu-Feng Liu, Rui-Hua Shi, Guo-Xin Zhang, Xue-Hao Wang,. Heng-Jun Gao, Shu-Kui Qin OPN was negatively correlated with syndecan-1 (r = , P < 0.01). (478 ), HCC. Xiu-Feng Liu, Shu-Kui Qin, Cancer Center, the 81 st Hospital of Chinese PLA, Nanjing , Jiangsu Province, China Rui-Hua Shi, Guo-Xin Zhang, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China Xue-Hao Wang, Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China Heng-Jun Gao, National Engineering Center for Biochip, Shanghai , China Correspondence to: Dr. Rui-Hua Shi, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing , Jiangsu Province, China. ruihuashi@126.com Received: Accepted: CONCLUSION: TMA is a high-throughput platform by which molecular pathology of cancer can be studied effectively. Over-expression of OPN and down-regulation of syndecan-1 may be involved in the development and progression of HCC, suggesting that OPN may decrease the adhesiveness of tumor cells and promote the metastasis by down-regulating the expression of syndecan-1. Key Words: Tissue microarray; Hepatocellular carcinoma; Osteopontin; Syndecan-1 Abstract AIM: To explore the expression of osteopontin ( O P N ) a n d s y n d e c a n - 1 a s w e l l a s t h e i r correlations with the clinical pathological characteristics of hepatocellular carcinoma (HCC) by tissue microarray (TMA) technique, and analyze the potential mechanisms during the development and progression of HCC. Liu XF, Shi RH, Zhang GX, Wang XH, Gao HJ, Qin SK. Study on the expression of Osteopontin and Syndecan-1 and their correlations with the clinical pathological characteristics of hepatocellular carcinoma by tissue microarray technique. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 :

34 1801 (osteopontin, OPN) Syndecan-1 (hepatocellular carcinoma, HCC), HCC. 方法 : S-P (478, : OD-CT-DgLiv01-001), OPN Syndecan-1. 结果 : OPN HCC 73.3%, 47.4% 22.2%, (P <0.05, P <0.05); Syndecan-1 HCC 19.6%, 35.0% 90%, (P < 0.05, P <0.01). OPN (χ 2 = 4.52, P <0.05), (χ 2 = 4.28, P <0.05) (χ 2 = 7.21, P <0.05), ; Syndecan-1 (χ 2 = 5.58, P <0.01), (χ 2 = 4.35, P <0.01) (χ 2 = 3.37, P <0.05),., OPN Syndecan-1 (r = , P < 0.01). 结论 : ; HCC OPN Syndecan-1, OPN Syndecan-1,,. 酸化糖蛋白, 在多种实体瘤中均有表达, 目前该基因在 HCC 中的研究是热点课题 ; Syndecan-1 属于黏附分子家族成员, 研究发现其分子的表达在控制恶性肿瘤细胞生长和转移等过程中具有重要作用. 本研究在基因芯片工作的基础上应用高通量肝癌特异性组织芯片 (478 点阵 )(TMA), 考察两者在 HCC 中的表达及与临床病理参数之间的相关性. 1 材料和方法 OPN 鼠抗人单克 隆抗体系 Santa Cruz 公司产品, Syndecan-1 鼠抗人单克隆抗体购自 Ebioscience 公司, SP 染色试剂盒和 DAB 显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司, 一抗工作浓度均为 以 PBS 代替一抗作为阴性对照. 高通量肝癌 T M A ( 产品批号 : O D - C T- DgLiv01-001) 是芯超公司郜恒骏教授与上海市肿瘤研究所顾健人院士合作推出的最新产品. 高通量 -478 个样本 ; 高质量 - 最新鲜的标本材料和最敏感的生物学活性 ; 高价值 -203 例肝细胞癌组织 18 例肝硬化组织 10 例正常肝组织和 14 例其他组织对照. 每个点都经过病理诊断. 1.2 使用前将 T M A 从冰箱中取出放于玻片架上复温, 然后 60 左右烘烤 3 h 将表面封蜡融掉. 然后置于二甲苯 10 min, 无水乙醇 5 min, 95% 乙醇 5 min, 70% 乙醇 5 min, 进行脱蜡水化. 采用高压热修复法进行抗原热修复. S-P 免疫组织化学染色参考试剂盒 关键词 说明. 1.3 观察阳性反应采用双盲法, 并由两位上海第二医科大学附属仁济医院的病理 学专家独立观察 TMA 每个点阵的信息, 进行详 细记录. 免疫组化染色结果按 0-3+ 进行记录, 记 数胞质 胞膜和 / 或胞核阳性染色细胞所占比 例. 阴性为 10% 的肿瘤细胞染色, 10%-25% 阳性记为 1+, 26%-50% 记为 2+, 51%-75% 记为 3+, 0 引言 76%-100% 记为 4+. 原发性肝细胞癌目前是世界上死亡率第 3 位的 采用 SPSS11.0 软件包进行统计恶性肿瘤, 在亚洲和非洲发生率很高, 近年在学处理, 相关蛋白与 HCC 临床病理指标之间的欧美国家发病率呈上升趋势. 尽管 HCC 的临床关系用 χ 2 检验 ; 蛋白之间在肿瘤组织中表达的相研究取得了较大进步, 但其复发率仍然较高. 关性用 Spearman 进行相关性检验分析. 检验水我们在前期应用基因芯片对 H C C 的差异基因准以 P <0.05 为有显著性差异. 表达谱进行筛选时, 发现 osteopontin(opn) 和 Syndecan-1 基因分别出现了上调和下调表达. 2 结果 OPN 是一个有多种功能的分泌型钙结合磷 2.1 T M A 图 1 所示为高通量肝癌 OPN, H C C. Syndecan-1 HCC,.

35 1802 ISSN CN /R TMA, 含 478 个样本, 其中包括 203 例肝细胞癌组, OPN HCC 织 18 例肝硬化组织 10 例正常肝组织和 14 例 其他组织对照. AFP 2.2 OPN TMA 如图 2 所示,, O P N A 表示 TMA 点阵全貌 ( 100), B 表示局部放大结 Tcf 果 ( 200), 以下相同. OPN 表达一般定位于 HCC 细胞的胞质, 少数肿瘤细胞胞膜和胞质同时阳, upa MMPs 性. 而肝硬化组织中阳性着色细胞明显减少, 而 V E G F 正常肝组织几乎呈阴性., 2.3 Syndecan-1 TMA 如图. 3-4 所示, Syndecan-1 蛋白在 HCC 组织中基本不, 表达, 而在正常肝组织中呈明显阳性表达, 主要, 定位于细胞膜以及细胞与细胞之间的紧密连接. Syndecan OPN Syndecan-1 TMA, HCC OPN 染色过程中, 在 203 例 HCC 样本中出现了 8. 例脱片, 20 例肝硬化组织和 10 例正常肝组织分 别有 1 例脱片 ; Syndecan-1 染色过程中, 在 203 例 HCC 样本中出现了 4 例脱片, 20 例肝硬化组织和 10 例正常肝组织没有脱片发生. 如表 1 所示, OPN 在 HCC 组织中的阳性率为 73.3%, 与正常肝组织相比, 明显升高 (P = 0.030). 而肝硬化组织的染色阳性率为 47.4%, 与 HCC 组 织比较, 差异亦有显著性 (P = 0.041). 深入考察 OPN 与 HCC 临床病理特征之间的相关性, 如表 2 所示, OPN 的表达与肿瘤包膜的完整性 门静脉 有无癌栓以及肿瘤的转移与否有一定的相关性, 与其他临床病理特征没有相关性. Syndecan-1 在 HCC 组织中的阳性率为 19.6%, 正常肝组织的 阳性率为 90%, 而肝硬化组织的染色阳性率为 35.0%, 与 HCC 组织比较, 均具有显著性差异. 深 入考察 Syndecan-1 与 HCC 临床病理特征之间的 相关性, Syndecan-1 的表达与肿瘤转移与否 病 理分级以及肿瘤有无包膜有相关性, 与其他临 床病理特征没有相关性. 相关性检验分析发现 OPN 与 Syndecan-1 之间存在负相关 (r = , P = 0.003, 表 3). 3 讨论 TMA 技术随基因芯片技术与功能基因组的发展 应运而生, 与细胞芯片 蛋白芯片 抗体芯片 一样, 属于一种特殊生物芯片技术. TMA 技术可 (478 ), OPN 以将数十个甚至上千个不同个体的临床组织标 Syndecan-1 本按预先设计的顺序排列在一张玻片上进行分 HCC 析研究, 是一种高通量 多样本的基因功能分, 析工具. 他使科研人员第 1 次有可能同时对几百. 甚至上千种正常或疾病以及疾病发展不同阶段 图 1 高通量肝癌 TMA. 表 1 OPN Syndecan-1 在 TMA 上的表达情况 组织类型 OPN n 阳性率 (%) P 的自然病理生理状态下的组织样本, 进行某一个 或多个特定的基因, 或与其相关的表达产物的研 究. 这对人类基因组学的研究与发展, 尤其对基 因和蛋白质与疾病关系的研究, 疾病相关基因的 验证 新药物的开发与筛选 疾病的分子诊断, 治疗过程的追踪和预后等方面具有实际意义和 广阔的市场前景 [1] 年 Kononen et al [2] 首次应 用 TMA 技术对 6 种基因在 1000 乳腺癌中的表达 情况进行了研究, 揭开了 TMA 的研究序幕. OPN 是一种黏附蛋白, 又是一种细胞因子, 是一个有多种功能的分泌型钙结合磷酸化糖蛋 白, 相对分子质量为 41.5 kda. 编码他的单基因 序列在脊椎动物中是高度保守的, 与许多细胞 外基质 (ECM) 蛋白一样具有 RGD( 精氨酸 - 甘氨 酸 - 天冬氨酸 ) 细胞黏附序列 [3]. OPN 的受体家族 包括整合素受体和 CD44 受体 [4]. 通过受体结合, 促进细胞的趋化 黏附和迁移, 参与骨的吸收, 也能与羟磷灰石结合参与骨的形成. Syndecan-1 n 阳性率 (%) P OPN 在肺癌 [5] 乳腺癌 [6-8] 胃癌 [9] 前列 [10-11] [12-13] 腺癌以及卵巢癌等肿瘤中均有表达, 而 应用 TMA 技术研究 OPN 与 HCC 相关性的报道不 多. 本研究在前期的基因芯片结果中, 发现 OPN 在 HCC 中的表达水平较癌旁组织上调了 倍, 较正常肝组织上调了 倍 ( 结果未显示 ). 在蛋白水平的深入研究发现, 在 HCC 肝硬化 和正常肝组织中的阳性表达率分别是 73.3% 47.4% 和 22.2%, 差异具有显著性. 与临床病理参

36 1803 A B, HCC OPN Syndecan-1, OPN Syndecan-1,,. O P N Syndecan-1 HCC 图 2 OPN 蛋白在 HCC 组织中表达的 IHC 染色.. A B 图 3 Syndecan-1 蛋白在 HCC 组织中表达的 IHC 染色. A B 图 4 Syndecan-1 蛋白在正常肝组织中表达的 IHC 染色 数之间的相关性分析显示, OPN 过表达与肿瘤包膜 门静脉癌栓和转移呈正相关. 蛋白之间的相关性分析发现, OPN 与 Syndecan-1 之间呈负相关 (r = , P = 0.003), 提示 OPN 可能通过下调 Syndecan-1 的表达, 降低肿瘤细胞之间的黏附性, 从而促进肿瘤的转移. 目前 OPN 的受体 CD44 已经被用来作为各种肿瘤的治疗靶点, 整合素受体 α v β 3 不仅对肿瘤细胞的弥散有作用, 而且对血管生成和骨转移的骨质溶解起作用. 因此, OPN 和他的主要受体将成为治疗肿瘤新的药物靶点. Syndecan-1(CD138) 来自于希腊文 syndein, 是指将细胞微环境成分与细胞骨架结合起来. 他属于黏附分子整合素跨膜黏连蛋白聚糖家 族成员, 通过其分子表面的硫酸肝素侧链可结合一系列配基如细胞黏附分子 基质成分 生长因子 酶和酶抑制物等, 以共受体方式调节细胞与微环境之间的相互作用, 参与组织器官分化发育 血管形成 组织再生等一系列生理过程的调节 [14]. 随着研究的深入, 人们发现 Syndecan-1 分子的表达在控制恶性肿瘤细胞生长和转移等过程中具有重要作用, 而且可作为判断肿瘤预后的指标, 指导临床诊断与治疗. Syndecan-1 分子属于 Ⅰ 型跨膜蛋白, 含有 N 末端信号肽. 小鼠分子定位于 12 号染色体, 人则定位在第 2 号染色体 (2p23), 基因全长含有 5 个外显子, 分别编码分子量为 3.5 kd 单链结构的核

37 1804 ISSN CN /R 1 (tissue microarray, TMA):,. TMA,. 2 (OPN):,,, 41.5 kd. 3 Syndecan-1:,,,. 表 2 OPN Syndecan-1 与 HCC 临床病理特征之间的相关性 临床病理特征 OPN Syndecan-1 n 阳性率 (%) χ 2 P n 阳性率 (%) χ 2 P μ 心蛋白. 在人类恶性肿瘤形成过程中, 肿瘤细胞表面 Syndecan-1 分子的表达可以缺失. 如头颈部及肺部鳞状上皮癌细胞 Syndecan-1 分子的表达水平降低, 并与肿瘤恶性程度 瘤体积 淋巴结肿大 临床分期及预后呈负相关. 乳腺浸润性导管癌细胞较之正常乳房导管上皮细胞, Syndecan-1 表达明显减少, 而周围结缔组织和基质细胞表面 Syndecan-1 分子表达增加. 皮肤鳞状细胞癌 Syndecan-1 表达缺失, 伴随鳞状细胞失黏附增加, 从而促进肿瘤细胞侵入皮肤 [15]. 目前有关 Syndecan-1 与 HCC 之间的相关性研究报道很少, 可能的机制还不清楚. 我们应用 TMA 技术分析 Syndecan-1 在 HCC 组织中的表达情况, 结果发现 Syndecan-1 主要定位于细胞膜上, 在 HCC 中的阳性率为 19.6%, 正常肝组织的阳性率为 90%, 而肝硬化组织的染色阳性率为 35.0%, 与 HCC 组织比较, 均具有显著性差异. 深入考察 Syndecan-1 与 HCC 临床病理特征之间的相关性, 发现 Syndecan-1 的表达与肿瘤转移与否 病理分级以及肿瘤有无包膜有相关性, 与其他临床

38 1805 表 3 OPN 与 Syndecan-1 在 HCC 中的表达相关性 OPN Syndecan osteopontin in cellular signaling and toxicant injury. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2001; 41: Sodek J, Zhu B, Huynh MH, Brown TJ, Ringuette M. Novel functions of the matricellular proteins osteopontin and osteonectin/sparc. Connect Tissue Res 2002; 43: Zhang J, Takahashi K, Takahashi F, Shimizu K, Ohshita F, Kameda Y, Maeda K, Nishio K, Fukuchi Y. Differential osteopontin expression in lung cancer. Cancer Lett 2001; 171: Urquidi V, Sloan D, Kawai K, Agarwal D,,,,. Woodman AC, Tarin D, Goodison S. Contrasting expression of thrombospondin-1 and osteopontin correlates with absence or presence of metastatic phenotype in an isogenic model of spontaneous human breast cancer metastasis. Clin Cancer Res 病理特征没有相关性. 提示肝癌细胞 Syndecan ; 8: 分子表达下降或缺失是肝癌细胞具有高度转移 7 Reinholz MM, Iturria SJ, Ingle JN, Roche PC. Differential gene expression of TGF-beta family 性的一个特征, 是肝癌细胞的转移抑制因子. 由 members and osteopontin in breast tumor tissue: 于 Syndecan-1 分子能与碱性成纤维细胞生长因子 (bfgf) 结合 [16], 故肿瘤基质 Syndecan-1 分子的积聚有助于血管形成和基质增生. 因此, HCC 细胞表面 Syndecan-1 分子表达的缺失和基质细胞高表达 Syndecan-1, 是促进 HCC 转移的关键. analysis by real-time quantitative PCR. Breast Cancer Res Treat 2002; 74: Tuck AB, Chambers AF. The role of osteopontin in breast cancer: clinical and experimental studies. J Mammary Gland Biol Neoplasia 2001; 6: ; 27: T M A 是一个令人兴奋 功能强大的研究 10 Tozawa K, Yamada Y, Kawai N, Okamura T, Ueda 工具, 具有高通量 大样本 省时快速 简便 K, Kohri K. Osteopontin expression in prostate 经济 用途广泛 结果可靠 便于设计实验对照 可进行自动化研究等优点. 利用这一技术可以使疾病的分子诊断 预后和治疗等相关领域的大规模研究和开发成为可能. 但 TMA 仍以手工制作和人工判断和读片为主, 所以自动化 cancer and benign prostatic hyperplasia. Urol Int 1999; 62: Angelucci A, Festuccia C, D'Andrea G, Teti A, Bologna M. Osteopontin modulates prostate carcinoma invasive capacity through RGDdependent upregulation of plasminogen activators. Biol Chem 2002; 383: Kim JH, Skates SJ, Uede T, Wong KK, Schorge JO, 制备技术的发展无疑十分重要, 这些技术目前 Feltmate CM, Berkowitz RS, Cramer DW, Mok SC. 仍在研发之中 [1]. TMA 的应用领域十分广阔并正 Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. JAMA 2002; 287: 在进一步拓展, 相信这一技术在后基因组学 13 Tiniakos DG, Yu H, Liapis H. Osteopontin 蛋白质组学 药物基因组学 生物信息学等相 expression in ovarian carcinomas and tumors of 关领域将发挥越来越重要的作用. low malignant potential (LMP). Hum Pathol 1998; 29: 参考文献 14 Lopes CC, Dietrich CP, Nader HB. Specific structural features of syndecans and heparan 1 Shergill IS, Shergill NK, Arya M, Patel HR. Tissue microarrays: a current medical research tool. Curr sulfate chains are needed for cell signaling. Braz J Med Biol Res 2006; 39: Med Res Opin 2004; 20: Syndecan-1. 2 Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi A, Barlund 2001; 23: M, Schraml P, Leighton S, Torhorst J, Mihatsch MJ, Sauter G, Kallioniemi OP. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med 1998; 4: Li HG, Xie DR, Shen XM, Li HH, Zeng H, Zeng YJ. Clinicopathological significance of expression o f p a x i l l i n, s y n d e c a n - 1 a n d E M MPRIN i n hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 3 Denhardt DT, Giachelli CM, Rittling SR. Role of 2005; 11:

39 ; 15(16): ISSN CN /R BASIC RESEARCH PARP-1 抑制剂 PJ34 对人肝癌细胞株 HepG2 的抑制作用 significantly inhibited HepG2 cell growth, but there was no significant difference in cell growth between the group with γ-rays or PJ34 alone and the group with combination (t = , P > 0.05) PJ34 induced apoptosis of HepG2 cells, and the apoptosis rate of PJ34-treated cells was significantly higher than that of the control cells at 72 hours (33.2% vs 11.4%, P < 0.01). PARP-1 ADP, ADP, DNA. Suppressive effect of poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor PJ34 on human hepatoma cell line HepG2 Xin Zhou, Zhi-Yong Huang, Xiao-Ping Chen, Sheng-Hui Huang Xin Zhou, Zhi-Yong Huang, Xiao-Ping Chen, Sheng- Hui Huang, Hepatic Surgical Center, the Affiliated Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong Universty of Science and Technology, Wuhan , Hubei Province, China Supported by New Century Excellent Talent Program of Education Ministry, No. NCET Correspondence to: Zhi-Yong Huang, Hepatic Surgical Center, the Affiliated Tongji Hospital of Tongji Medical College, Huazhong Universty of Science and Technology, 1095 Jiefang Road, Wuhan , Hubei Province, China. zyhuang@medmail.com.cn Received: Accepted: Abstract AIM: To evaluate the inhibitory effect and its mechanism of poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor, PJ34, on the growth of human hepatoma cell line, and investigate whether PJ34 can further enhance the suppression of γ-rays on HepG2 cell growth. METHODS: Cell proliferation test was conducted to observe the effects of various concentrations of PJ34 or PJ34 in combination with γ-rays on the growth of HepG2 cells. Flow cytometry was used to examine the apoptosis rate in the PJ34-treated HepG2 cells. RESULTS: PJ34 significantly suppressed the growth of HepG2 cells (t = , P < 0.01). The suppressive effects were enhanced with the increase of PJ34 concentration. 1Gy γ-rays also CONCLUSION: PARP-1 inhibitor PJ34 can directly inhibit the cell growth of HepG2 cells through inducing cell apoptosis. However, PJ34 does not significantly increase the inhibitory effects of γ-rays on HepG2 cells. Key Words: Poly (ADP-ribose) polymerase-1; PJ34; Hepatoma; HepG2 cell line; Growth suppression; Flow cytometry Zhou X, Huang ZY, Chen XP, Huang SH. Suppressive effect of poly (ADP-ribose) polymerase-1 inhibitor PJ34 on human hepatoma cell lines HepG2. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : -1(PA R P-1) P J34 HepG2, PJ34 γ. 方法 : PJ34, PJ34 γ HepG2, PJ34 HepG2. 结果 : PJ34 HepG2 (t = , P < 0.01). PJ34,. 1Gy γ HepG2, γ PJ34 PJ34 γ (t = , P >0.05). PJ34 HepG2, 72 h, (33.2% vs 11.4%, P <0.01).

40 1807 结论 : PARP-1 PJ34 HepG2 ; PJ34 γ HepG2. 数 3 个培养皿, 取平均值 将 HepG2 细胞植入 6 孔培养板中, 以 100 ml/l 的胎牛血清的 DMEM 培 养液培养, 待细胞增殖至对数生长期, 实验组关键词 HepG2 细胞中加入终浓度为 1.0 mg/l 的 PJ34 溶液培养细胞, 而对照组细胞在不含 PJ34 的培养液中 培养, 分别于培养后 12, 24, 48, 72 h 收集细胞, 用 PBS 溶液洗涤 离心后, 冰乙醇固定, 离心去乙 醇, 加入碘化丙啶 (PI) 染液 ( 含 RNAse) 过夜. 采用 PI 染色法, 在 FACSort 流式细胞仪 ( 美国 ) 下分析 DNA 含量. 0 引言 采用配对 t 检验分析 P J34 对肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一, 其手术切 H e p G2 细胞增殖的影响和 χ 2 检验分析 P J34 对除率低, 易复发和转移, 目前尚无有效的药 HepG2 细胞凋亡的影响, 应用 SPSS12.0 统计软件物治疗, 预后差. 因此, 寻找新的有效的药对实验结果进行统计学处理. 物, 对肝癌的治疗具有重要的意义. P J34[N - (6-oxo-5, 6-dihydrophenanthridin-2-yl)-N, 2 结果 N -dimethylacetamide. HCl] 是选择性 PARP-1 抑制 2.1 PJ34 HepG2 当 PJ34 浓度剂, 能有效的抑制 PARP-1 活性. 在 PARP-1 活性为 0.5 mg/l, 与对照组相比, HepG2 细胞在给予增高的肿瘤中, 选择性抑制 PARP-1 活性, 能抑制 PJ34 培养第 6 天时开始出现增殖明显减慢, 至第恶性黑色素瘤 中枢神经系统肿瘤 乳腺癌等 9 天, 增殖抑制达到高峰, 与空白对照组相比较恶性肿瘤的生长 [1-3]. 我们在前期研究中发现, 人有明显的差异 (t = , P <0.01, 图 1A). 当 PJ34 肝癌组织及肝癌细胞株 HepG2 中 PARP-1 的表达的浓度增加至 1 mg/l 和 2 mg/l 时, 同样观察到增高 [4], 因此抑制 PARP-1 活性可能达到治疗肝癌 PJ34 对 HepG2 细胞的增殖抑制作用 ( 图 1B-C), 且的目的. 本研究选择人肝癌细胞株 HepG2 首先在 PJ34 对 HepG2 的增殖抑制作用随着 PJ34 浓度升体外研究 PARP-1 抑制剂 PJ34 对 HepG2 细胞的抑高而进一步增强, 0.5, 1 和 2 mg/l 浓度 PJ34 培养制作用. HepG2 于培养第 9 天计数的细胞平均数呈递减趋势 ( 图 2). 当以剂量为 1Gy 的 γ 射线照射 HepG2 细 1 材料和方法胞时, HepG2 细胞的增殖明显受抑, 但 γ 射线照射 1.1 HepG2 细胞株为华中科技大学同济医联合不同浓度的 PJ34 培养对 HepG2 细胞的抑制学院附属同济医院肝脏外科实验室提供. 用含作用与单用 PJ34 或 γ 射线照射对 HepG2 细胞的增 100 ml/l 的胎牛血清的 DMEM 培养液于 37 o C 殖抑制作用比较无显著统计学差异 (t = , 50 ml/l CO 2 培养箱培养. PJ34 购自美国 Inotek P >0.05). Pharmaceutical 公司. 2.2 PJ34 HepG2 对 1 mg/l 1.2 PJ34 培养的 HepG2 细胞和不含 PJ34 培养的对照 将对数生长期的 HepG2 细胞组细胞于培养后 12, 24, 48 和 72 h 行流式细胞仪消化后制成单细胞悬液, 并计数. 将 个细检测, 结果显示, 含 1 mg/l PJ34 培养的 HepG2 细胞置于直径为 6 cm 的培养皿中培养, 分为空白对胞在培养后第 12, 24, 48, 72 小时, 其细胞凋亡率照组和实验组, 每组 9 个培养皿. 实验组 HepG2 细逐渐增高, 于 72 h 时凋亡率达到 33.2%, 而对照组胞以分别含 0.5, 1.0, 2.0 mg/l 的 PJ34 的 DMEM 培细胞 72 h 时凋亡率为 11.4%, 二者有显著性差异养液培养, 空白对照组以常规 DMEM 培养液培 (P <0.01, 图 3A-B). 其空白对照组的细胞凋亡率养. γ 射线照射剂量为 1Gy, 细胞种植贴壁后的次随着时间的延长稍有升高, 这可能与培养过程日开始第一次照射, 细胞每 3 天更换培养液 1 次, 中自然凋亡细胞的积累有关. 每次换液后的次日照射 1 次, 共照射 3 次. 对照组与实验组同时换液, 但不接受照射. 实验组和对 3 讨论照组的细胞分别于培养 3, 6 和 9 d 后计数, 每次计聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶 -1[poly(ADP-ribose) PARP -1 PJ34 HepG2,. PARP-1,.

41 1808 ISSN CN /R A 1 PARP-1: -1[poly(ADPribose) polymerase - 1 ] A D P, D N A. PAPR-1 DNA,. 2 PJ34: [N-(6-oxo-5, B 6-dihydrophenanth r i d i n y l ) -N, N -dimethylacetam ide.hcl] PA R P - 1, PARP-1. C γ γ t /d γ γ t /d γ γ polymerase-1, PARP-1] 是存在于真核细胞中催化 聚 ADP 核糖化的细胞核酶, 他在 DNA 修复和细 胞凋亡中发挥至关重要的作用. PAPR-1 的缺失 使细胞对 DNA 损伤因子易感, 可能与某些肿瘤 的发生有关 [5], 同时, 抑制 PARP-1 可能减少 DNA 修复, 增强肿瘤的放疗或化疗效果 [6]. Nozaki et al [7] 通过破坏 PARP 外显子 1 产生 PARP-1 -/- 小 鼠, 给予氧化偶氮甲烷 (AOM) 后 PARP-1 -/- 小鼠 结肠腺瘤和腺癌 肝脏结节发生率均明显高于 PARP +/+ 组, 提示 PARP-1 缺失与结肠肿瘤的发 生有关. 而 Nomura et al [8] 利用 P32 标记 NAD 后多 聚 ADP 核糖基化的蛋白凝胶电泳发现, 肝癌组 织中 116 kda 蛋白条带明显高于邻近非肿瘤组 织, 提示 PARP-1 在肝癌组织中可能高表达. 我们 最近的研究表明, 人肝癌组织中 PARP-1 的表达 明显高于其癌周肝组织 [4]. 虽然我们对 PARP-1 在 肝癌中高表达的意义并不完全清楚, 推测可能 与乙肝病毒感染和化学致癌剂产生的 DNA 损伤 诱导机体启动 DNA 损伤修复机制有关. 因此, 抑 制 PARP-1, 阻止肝癌中 PARP-1 介导的 DNA 损伤 修复机制, 则可使已损伤的 DNA 得不到修复, 从 而对肝癌细胞的增殖产生抑制作用, 并可能增 强放 化疗对肝癌细胞 DNA 损伤, 进一步提高 放 化疗对肝癌的抑制作用. 我们的研究发现, PARP-1 抑制剂 PJ34 能够 对肝癌细胞株 HepG2 细胞的增殖产生明显的抑 制作用, 且有明显的量效关系. PJ34 虽然能一定 0 程度增强 γ 射线照射对 HepG2 的增殖抑制作用, t /d 但联合应用 PJ34 和 γ 射线照射对 HepG2 细胞的抑制作用与单用 PJ34 或单纯 γ 射线照射相比较无图 1 不同浓度 PJ34 以及 PJ34 合并 γ 射线照射对 HepG2 细统计学差异. 这可能与单用 PJ34 本身已对 HepG2 胞增殖的抑制作用. 细胞的增殖产生了显著的抑制, 致使对 γ 射线对 HepG2 细胞的抑制作用的增强效果不再显著有 图 2 不同浓度的 PJ34 培养 HepG2 细胞 9 d 时的细胞计数. 关. 对 PARP-1 抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的分子 机制的已在对乳腺癌的治疗有研究报道 [9], 即半 胱 - 天冬蛋白酶 Casepase7 和 Casepase3 可以通过 识别 PARP-1 核定位信号 (NLS) 的 DEVD 模序, 促 使 DNA 结合域与催化域分离导致 PARP-1 分裂成 p89 和 p24 两个片段, 后者可不可逆结合于 DNA 断端, 抑制 PARP-1 与 DNA 断端结合能力, 导致 PARP-1 损伤修复作用丧失, 诱发凋亡 [10]. 我们 的研究还表明, 给予 PJ34 培养的 HepG2 细胞 72 h 时凋亡率明显增高, 其凋亡率与空白组有显著 性差异, 证明 PJ34 同样能显著诱导肝癌细胞株

42 1809 A1 100 Counts PJ34 能直接抑制肝癌细胞的增殖, 其机制是通过 诱导肝癌细胞凋亡. 虽然这一观察有待于在动 物实验中来进一步证实, 该研究的重要意义在 于揭示 PARP-1 抑制剂 PJ34 对肝癌细胞有直接抑 制作用, 为我们的肝癌治疗的研究提供了一个 新的药物治疗靶点. 相信随着对 PARP-1 抑制剂 治疗肝癌研究的深入, 以及联合其他抗肿瘤治 疗手段的应用, PARP-1 抑制剂可能在将来肝癌 治疗中发挥重要的作用. PA R P - 1 PJ34 HepG2,,. M1 0 4 参考文献 Haince JF, Rouleau M, Hendzel MJ, Masson JY, Poirier GG. Targeting poly(adp-ribosyl)ation: a A2 100 promising approach in cancer therapy. Trends Mol Med 2005; 11: Tentori L, Leonetti C, Scarsella M, Vergati M, Xu W, Calvin D, Morgan L, Tang Z, Woznizk K, Alemu C, 60 Hoover R, Lapidus R, Zhang J, Graziani G. Brain distribution and efficacy as chemosensitizer of an oral formulation of PARP-1 inhibitor GPI in 40 experimental models of CNS tumors. Int J Oncol 2005; 26: P A R P ; 14: M1 5 Dandri M, Burda MR, Burkle A, Zuckerman DM, 0 Will H, Rogler CE, Greten H, Petersen J. Increase 1000 in de novo HBV DNA integrations in response to oxidative DNA damage or inhibition of poly (ADPribosyl) ation. Hepatology 2002; 35: B 35 6 Farmer H, McCabe N, Lord CJ, Tutt AN, Johnson 30 DA, Richardson TB, Santarosa M, Dillon KJ, 25 Hickson I, Knights C, Martin NM, Jackson SP, Smith GC, Ashworth A. Targeting the DNA repair 20 defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature 2005; 434: Nozaki T, Fujihara H, Watanabe M, Tsutsumi 10 M, Nakamoto K, Kusuoka O, Kamada N, Suzuki H, Nakagama H, Sugimura T, Masutani M. 5 Parp-1 deficiency implicated in colon and liver 0 t /h 8 Nomura F, Yaguchi M, Togawa A, Miyazaki M, Isobe K, Miyake M, Noda M, Nakai T. Enhancement 图 3 72 h 后 PJ34 诱导 HepG2 细胞凋亡. of poly-adenosine diphosphate-ribosylation in human hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 2000; 15: Yu SW, Wang H, Poitras MF, Coombs C, Bowers WJ, Federoff HJ, Poirier GG, Dawson TM, Dawson HepG2 的凋亡. VL. Mediation of poly (ADP-ribose) polymerase-1- dependent cell death by apoptosis-inducing factor. 目前, PARP-1 的抑制剂在国外已经在对恶 Science 2002; 297: 性黑色素瘤 中枢神经系统肿瘤 乳腺癌等恶 10 Veuger SJ, Curtin NJ, Richardson CJ, Smith GC, 性肿瘤的治疗中进入 I 期临床实验阶段 [2-3], 但对 Durkacz BW. Radiosensitization and DNA repair inhibition by the combined use of novel inhibitors PARP-1 的抑制剂是否可用于对肝癌的治疗尚 of DNA-dependent protein kinase and poly (ADPribose) polymerase-1. Cancer Res 2003; 63: 无研究报道. 该研究首次揭示 PARP-1 的抑制剂 tumorigenesis induced by azoxymethane. Cancer Sci 2003; 94: Counts

43 ; 15(16): ISSN CN /R BASIC RESEARCH 二甲双胍对高脂饲养大鼠肝脏脂肪变的干预作用 Glucose Infusion Rate (GIR) by the euglycermic hyperinsulinemia clamp technique. Assessments of steatosis and inflammatory activity in all rats were scored under light microscope. RESULTS: Notable steatosis and lobular inflammatory activities were more decreased in HF- Met than those in HF. The liver index, insulin, Effects of metformin on and levels of AST, ALT, TG and FFA were significantly decreased in HF-Met compared with hepatic steatosis induced in rats fed a high fat diet those in HF (3.25 ± 0.26 vs 4.29 ± 0.12, ± 8.34 vs ± 5.24, ± 5.34 vs ± 6.21, Shi-Qing Chen, Hua Li, Qi Liu 4.10 ± 2.47 vs ± 4.05, P < 0.01; ± vs ± 24.87, ± vs ± 21.94, P < 0.05) TNF-α expression also decreased, while GIR increased (7.58 ± 1.05 vs 6.31 ± 1.28, P < 0.05). NAFLD,,. NAFLD.,, NAFLD, NAFLD. Shi-Qing Chen, Hua Li, Taihe Hospital, Yunyang Medical College, Shiyan, , Hubei Province, China Qi Liu, Institute for Viral Hepatitis, Key Laboratory for Molecular Biology of Infectious Diseases of Education Minstry, Chongqing Medical University, Chongqing , China Correspondence to: Qi Liu, Institute for Viral Hepatitis, Chongqing Medical University, 72 Linjiang Road, Yuzhong District, Chongqing , China. liuqiz@hotmail.com Received: Accepted: Abstract AIM: To investigate the role and mechanism of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), and to evaluate the intervening effects of metformin (Met) on rats with hepatic steatosis induced by feeding a high fat diet. METHODS: Twenty-one male Wistar rats were randomly divided into three equal groups. Rats in standard chow group (SD) were fed normal food, those in the high fat diet group (HF) had a high fat diet, and rats in the HF-Met group were fed a high fat diet but gavaged with Met for 8 weeks. Rats were sacrificed at the end of 8 weeks to weigh epididymal fat and calculate the liver index. Levels of ALT, AST, insulin, TG, TC, FFA, SOD, and MDA were detected by biochemistry, and fasting insulin by radioimmunoassay. mrna and protein expression of hepatic TNF-α were detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. Insulin sensitivity was measured with CONCLUSION: Metformin intervention can markedly improve insulin resistance induced by a high fat diet, decrease the levels of hepatic TG, FFA and TNF-α expression, while lessen hepatic steatosis, suggesting that it could be an active strategy to enhance insulin sensitivity in NAFLD. Key Words: Nonalcoholic fatty liver disease; Insulin resistance; Metformin; Reverse transcriptionpolymerase chain reaction; Enzyme-linked immunosorbent assay Chen SQ, Li H, Liu Q. Effects of metformin on hepatic steatosis induced in rats fed a high fat diet. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 :,. 方法 : 21 Wistar 3, 7, (SD), (HF), (HF- Met), 8 wk. 8 wk,,, ALT AST TG TC FFA SOD MDA., (RT-PCR) ELISA TNF-α

44 1811 mrna, (GIR),. 结果 : HF, HF-Met, AST ALT TG FFA (3.25±0.26 vs 4.29 ±0.12, 33.37±8.34 vs 46.73±5.24, 17.29± 5.34 vs 43.48±6.21, 4.10±2.47 vs 12.05± 4.05, P <0.01; 106.0±31.04 vs ±24.87, 48.31±16.11 vs 88.34±21.94, P <0.05 )TNF-α, GIR (7.58±1.05 vs 6.31±1.28, P <0.05). 给每天为 320 kj/ 只, 并且观察大鼠摄食量的变化. 高速低温离心机 (Beckman 公司 ), PCR 扩增仪 (Eppendorf 公司 ), DU series600 全波长分光光度计 (Beckman 公司 ), GENEGENIUS 成像仪 (Gene 公司 ), GENEGNOME 化学发光仪 (Gene 公司 ). 水平电泳槽 电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ), 光学显微镜 (XSZ-G)( 重庆光学仪器厂 ). RT-PCR 试剂盒 (Promega 公司 ), RNeasy Mini Kit(Qiagene 公司 ), 核酸分子标准物 (Mbi 公司 ). 盐酸二甲双胍为中美上海施贵宝制药有限公司产品. 1.2 大鼠随机分为普通饮食组 (standard 结论 : chow diet, SD) 高脂饮食组(high-fat diet, HF), TG FFA TNF-α 和二甲双胍组 (HF-Metformin, HF-Met), 每组各 7,, NAFLD. 只. 普通饮食组喂养普通饲料, 二甲双胍组和高脂饮食组喂养高脂饲料. 普通饲料其蛋白质 关键词 脂肪 碳水化合物提供能量分别为 21%, 19% 和 60%; 高脂饲料其蛋白质 脂肪 碳水化合物 提供能量分别为 15%, 45% 和 40%. 适应性喂养 1 wk 后, 普通饮食组继续喂养普通饲料, 二甲双 胍组继续喂饲高脂饲料并用二甲双胍灌胃, 剂量为 200 mg/(kg d), 普通饮食组 高脂饮食组用 0 引言等量生理盐水灌胃. 每天上午 9 时左右灌胃给药, 非酒精性脂肪肝病 (NAFLD) 发病率逐年升高, 每周称重 1 次, 据此调整药物剂量, 饲养 8 wk, 至起病渐趋低龄化, 已成为严重影响人类健康的 8 wk 末全部大鼠称质量 测量血糖, 进行正常血主要慢性肝病, 但其发病机制尚不清楚, 直接影糖 - 高胰岛素钳夹实验. 响了对该病的有效治疗. 近年研究发现, NAFLD 用正常血糖高胰岛与胰岛素抵抗密切相关, 胰岛素抵抗是 NAFLD 素钳夹技术来评价胰岛素敏感性 : 大鼠均禁食的重要特征 [1]. 研究显示 [2], 高脂饲养的大鼠可产过夜 12 h, 用 200 ml/l 乌拉坦 (1.5 ml/kg) 腹腔内生明显的胰岛素抵抗. 为了研究胰岛素抵抗对注射麻醉后, 进行颈动脉和颈静脉插管留置. 胰脂肪肝形成和发展的影响, 设想在胰岛素抵抗岛素 葡萄糖分别用二个微电脑数字式微量注产生和肝脏脂质聚积的初始阶段, 给予胰岛素射泵由颈静脉泵入, 血液标本由颈动脉导管获增敏治疗, 提升机体对胰岛素的敏感性, 降低高取. 胰岛素输注率为 10.0 mu/(kg min), 从颈动脉胰岛素血症及随之导致的脂代谢紊乱和细胞因取血用微型血糖仪在 30 s 内测出血糖值, 维持稳子的异常, 有可能减轻或改善肝脏的脂肪变 态血糖在 5.0±0.5 mmol/l 的范围内, 持续上述炎症和坏死, 为 NAFLD 防治提供新的选择. 二甲过程达 2 h 完成. 钳夹实验结束后, 计算灌流第 2 双胍作为抗糖尿病药物, 具有胰岛素增敏作用, 小时的葡萄糖输注率 (glucose infusion rate, GIR), 可调节脂质代谢和脂肪细胞因子在肝脏中的表判断大鼠的胰岛素敏感性. 钳夹结束颈动脉采达 [3], 我们通过二甲双胍对高脂饲养大鼠的干预血后处死动物, 迅速取出肝脏并称质量, 按常规处理, 来探讨胰岛素抵抗在 NAFLD 发病中的作制备血清, 并在肝脏的同一部位切取肝组织, 放用及可能的机制. 入 40 g/l 甲醛溶液固定后制备石蜡切片 TNF-a 肝组织匀 1 材料和方法浆 离心 取上清, 用双抗体夹心 ELISA 法测定 Wistar 大鼠 21 只, 体质量 g, 鼠 TNF-a 及双缩脲法测匀浆蛋白浓度. 肝脏脂质的龄 4-6 wk, 分笼饲养在温度为 动物室抽取采用 Folch 法 [4]. 中, 明暗周期为 12 h(6 am-6 pm), 实验前适应性 TNF-a mrna 利用 RT-PCR 测定饲养 1 wk, 天黑前投食, 自由饮水. 大鼠能量供肝脏组织 TNF-a mrna: 细胞总 RNA 用 RNeasy NAFLD, NAFLD.

45 1812 ISSN CN /R 表 1 体质量 肝指数 附睾脂肪 血糖 胰岛素 GIR 的变化 分组 n 体质量 (g) 肝指数 (%) 附睾脂肪重量 / 体质量 (%) 血糖 (mmol/l) 胰岛素 (mu/l) GIR[mg(kg min)] Mini Kit 根据操作说明提取, 然后进行 RT-PCR. 用 Primier 4.1 软件设计目的基因和内参照 β-actin 引物, TNF-α mrna 引物序列如下 : 上游引物 : 5'-GGTCCCAACAAGGAGGAGAAGT-3'; 下游 引物 :5'-GTATGAAGTGGCAAATCGGCT -3'; 长 度 327 bp. 扩增条件为 min, 94 2 min, s, s, s, 循环数 30, 68 退火 7 min. 同时扩增 β-actin 基因 ( 长度 237 bp) 作为内参照. 扩增产物在 15 g/l 的琼脂糖凝胶 里电泳, 利用凝胶成像分析系统进行紫外光成 像和图形分析, 测出各条带的光密度值. 结果以 TNF-a 条带和 β-actin 条带的光密度比值表示 光镜下评估肝脏脂肪 变性和炎症情况, 肝细胞脂肪变程度和脂肪性 肝炎判断标准参照 1999 年 Brunt et al [5] 提出的分 级和分期方法, 由病理学专家评判. 所有计量资料以均数 ± 标准差 (mean±sd) 表示, 采用 One-Way ANOVA 和 q 检 验, P <0.05 表示统计学差异, P <0.01 表示显著性 差异. 所有资料应用 SPSS12.0 统计软件进行数据 分析. 2 结果 2.1 实验中 高脂饲养大鼠性情温顺, 皮毛无光泽, 大便松 软, 各组动物均无死亡发生, 大鼠每日摄食能量 基本相当. 高脂饮食组大鼠的肝指数 附睾脂 肪占体质量的百分比高于普通饮食组 (P <0.01 和 P <0.05), 体质量无差别. 与高脂饮食组相比, 二甲双胍组大鼠体质量增加减缓 (P <0.05); 肝 指数 附睾脂肪占体质量的百分比明显降低 (P <0.01 和 P <0.05), 且大鼠附睾脂肪占体质量的 百分比与普通饮食组相近 ( 表 1). 2.2 空腹 血糖各组间水平相似. 高脂饮食组大鼠的空腹 胰岛素水平高于普通饮食组 (P <0.05), GIR 低于 普通饮食组 (P <0.01). 与高脂饮食组相比, 二甲 双胍组大鼠空腹胰岛素水平明显降低 (P <0.01), a GIR 高于高脂饮食组 (P <0.05)( 表 1). 2.3 高脂饮食组大鼠的 AST A LT M D A 明显高于普通饮食组 (P <0.01 和 P <0.05), SOD 低于普通饮食组 (P <0.01). 与高 脂饮食组相比, 二甲双胍组大鼠 AST ALT MDA 明显降低 (P <0.01 和 P <0.05), SOD 高于高脂 饮食组 (P <0.05)( 表 2). SD HF-Met HF 2.4 高脂饮食组大鼠肝脏 TG TC FFA 明显高于普通饮食组 (P <0.01). 与高脂饮食组相比, 二甲双胍组大鼠肝脏 TG FFA 明显降低 (P <0.05), TC 无明显变化 ( 表 3). 2.5 TNF-α mrna 高脂饮食组 大鼠肝脏 TNF-α mrna 和蛋白含量明显高于普 通饮食组 (P <0.01). 与高脂饮食组相比, 二甲双 胍组大鼠肝脏 TNF-α mrna 和蛋白含量明显降 低 (P <0.01 和 P <0.05)( 图 1-2). c 图 1 肝脏 TNF-α 蛋白的表达 bp β-actin b 图 2 肝脏 TNF-α mrna 的表达.

46 1813 表 2 生化指标的变化 分组 n AST(U/L) ALT(U/L) SOD(U/mg) MDA(μmol/g), NAFLD.,,,. 2.6 肝组织 HE 染色显示, 普通饮食组肝细胞正常, 无脂滴和炎症细胞浸润 ( 图 3A), 高脂饮食组出现弥漫性脂肪变性, 以中央静脉周围最为明显, 细胞体积增大, 胞质中有大量脂滴空泡, 核居边, 小叶内有炎症细胞浸润 ( 图 3B). 二甲双胍组的肝脏脂肪变性程度和炎症活动度明显比高脂饮食组减轻 (P <0.01, 表 3, 图 3C). 3 讨论 NAFLD 是脂质在肝细胞内聚积过多的一种病理状态, 是胰岛素抵抗在肝脏的局部表现, 且胰岛素抵抗可能是 NAFLD 形成的启动和促发因素 [6]. 目前研究表明, 即使是预后良好的单纯性脂肪肝, 亦不能视为静止性病变, 由于遗传易感性和适应性反应机制的影响, 其肝病仍可能呈亚临床状态进展, 并可通过诱发全身炎症反应和代谢紊乱促进代谢综合征的发生. 为此, 需通过改善胰岛素抵抗 减轻氧应激 提高肝细胞存活能力来防治 NAFLD 及其相关事件. 二甲双胍能提高胰岛素受体酪氨酸激酶的活性, 增加胰岛素受体的数量 与靶组织的亲和力 促进葡萄糖转运蛋白的转位和抑制糖异生 减少肝脏葡萄糖的产生, 具有胰岛素增敏作用, 且研究证实二甲双胍可参与脂质代谢, 调节脂肪细胞因子在肝脏中的表达. 临床和实验研究均显示出对 NAFLD 有一定的防治效果 [7-8], 但其具体的机制尚未完全阐明. 高脂饮食可引起肝脏和外周组织的胰岛素抵抗, 使胰岛素抗脂解作用受损, 血中的游离脂肪酸 (FFA) 增加, 进入组织的 FFA 增多, 在肝脏, 当进入肝细胞的 F FA 超过肝脏的氧化能力时, 过多的 FFA 就会转化为 TG, 使 TG 在肝细胞内沉积, 导致肝脏发生脂肪变性, 而且脂肪酸还可活化多种细胞死亡途径直接杀伤肝细胞. 我们发现, 二甲双胍的干预可明显改善高脂饮食所致的胰岛素抵抗, 其可能与他能减轻体质量 降低循环的胰岛素水平和内脏脂肪的堆积, 减少 A B C 图 3 大鼠肝脏组织学的病理改变 (HE 染色 200). FFA 的产生, 增强了机体对胰岛素的敏感性有 关. 长期的 FFA 增高可通过以下机制引起胰岛 素抵抗 : FFA 增多使脂肪氧化增加, 葡萄糖氧化 受到抑制 [9] ; 抑制胰岛素介导的细胞对葡萄糖 的摄取 [10] ; 促进糖异生 ; 引起肝脏 骨骼肌中脂 肪聚集, 造成该组织的胰岛素抵抗 ; 对胰岛素下 游信号转导系统产生影响. 另一方面, 降低了肝 脏的 TNF-α, 阻断 TNF-α 引起的细胞外信号调节 激酶的活化和脂滴包被蛋 (perilipin) 的下调, 抑

47 1814 ISSN CN /R 表 3 肝脏的脂质变化及脂肪变性 炎症活动度计分 分组 n TG(mg/g) TC(mg/g) FFA(μmol/g) 脂肪变性炎症活动 制脂肪分解, 改善胰岛素抵抗 [11]. 二甲双胍还可 改善高脂饮食大鼠的脂代谢, 明显降低肝脏局 部的 TG 和 FFA, 从而减轻肝脏脂质的浸润, 改善 肝脏的胰岛素抵抗和脂肪变性. FFA TNF-α 和 高胰岛素血症的减轻还能改善或恢复肝脏胰岛 素信号转导分子的异常, 有助于机体胰岛素敏 感性的改善. 近年来研究发现, 二甲双胍可降低 NAFLD 升高的转氨酶, 但其对肝脏组织学的改 善报道不一, 可能与研究对象的入选标准 药 物的剂量 时间 组织学改善的判断方法等不 同有关 [12-13]. 本研究观察了二甲双胍干预对高脂 饮食大鼠肝脏组织学影响, 结果显示, 与高脂饮 食组相比, 肝脏的脂肪变 炎症细胞的浸润程 度均有明显的改善, 这可能与他降低了肝脏 FFA 和 TNF-α 的水平, 改善了机体的胰岛素抵抗, 减 轻了肝脏的 第一次打击 有关 ; 同时也与他 增加肝脏 SOD 的活性 减少 MDA 的形成, 改善 肝细胞的能量供应和抑制肝脏的氧化应激, 减 轻了肝脏的 第二次打击 有关. 研究发现, 二 甲双胍能提高高乳果糖喂养大鼠红细胞铜锰 SOD 的活性和血谷胱甘肽水平, 并独立于胰岛 素敏感性的改善, 提示二甲双胍可能还具有一 定的抗氧化作用和降低氧化应激反应 [14-15]. 总之, 二甲双胍在高脂饮食诱发大鼠脂肪肝 的形成中显示出有效的干预作用, 表明胰岛素 抵抗在 NAFLD 发病中占重要地位, 减轻胰岛素 抵抗, 增加胰岛素敏感性有助于预防 NAFLD. 4 参考文献 1 Utzschneider KM, Kahn SE. Review: The role of insulin resistance in nonalcoholic fatty liver disease. J Clin Endocrinol Metab 2006; 91: Samuel VT, Liu ZX, Qu X, Elder BD, Bilz S, Befroy D, Romanelli AJ, Shulman GI. Mechanism of hepatic insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. J Biol Chem 2004; 279: H u n d a l R S, I n z u c c h i S E. M e t f o r m i n : n e w understandings, new uses. Drugs 2003; 63: FOLCH J, LEES M, SLOANE STANLEY GH. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J Biol Chem 1957; 226: B r u n t E M, J a n n e y C G, D i B i s c e g l i e A M, Neuschwander-Tetri BA, Bacon BR. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histological lesions. Am J Gastroenterol 1999; 94: N e u s c h w a n d e r - T e t r i B A, C a l d w e l l S H. Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference. Hepatology 2003; 37: Lin HZ, Yang SQ, Chuckaree C, Kuhajda F, Ronnet G, Diehl AM. Metformin reverses fatty liver disease in obese, leptin-deficient mice. Nat Med 2000; 6: Nair S, Diehl AM, Wiseman M, Farr GH Jr, Perrillo RP. Metformin in the treatment of non-alcoholic steatohepatitis: a pilot open label trial. Aliment Pharmacol Ther 2004; 20: R A N D L E P J, G A R L A N D P B, H A L E S C N, NEWSHOLME EA. The glucose fatty-acid cycle. Its role in insulin sensitivity and the metabolic disturbances of diabetes mellitus. Lancet 1963; 1: Boden G, Chen X, Ruiz J, White JV, Rossetti L. Mechanisms of fatty acid-induced inhibition of glucose uptake. J Clin Invest 1994; 93: Ren T, He J, Jiang H, Zu L, Pu S, Guo X, Xu G. Metformin reduces lipolysis in primary rat adipocytes stimulated by tumor necrosis factoralpha or isoproterenol. J Mol Endocrinol 2006; 37: Marchesini G, Brizi M, Bianchi G, Tomassetti S, Zoli M, Melchionda N. Metformin in non-alcoholic steatohepatitis. Lancet 2001; 358: Uygun A, Kadayifci A, Isik AT, Ozgurtas T, Deveci S, Tuzun A, Yesilova Z, Gulsen M, Dagalp K. Metformin in the treatment of patients with nonalcoholic steatohepatitis. Aliment Pharmacol Ther 2004; 19: Faure P, Rossini E, Wiernsperger N, Richard MJ, Favier A, Halimi S. An insulin sensitizer improves the free radical defense system potential and insulin sensitivity in high fructose-fed rats. Diabetes 1999; 48: Beisswenger P, Ruggiero-Lopez D. Metformin inhibition of glycation processes. Diabetes Metab 2003; 29: 6S95-103

48 ; 15(16): ISSN CN /R CLINICAL RESEARCH 结肠癌多层螺旋 CT 表现与术后病理的相关性分析 surgical appearances and pathological findings (Kappa: 0.807, 0.673, 1.0 and 0.803, respectively, both P < 0.01). CONCLUSION: A very good correlation exist between manifestations on enhanced MSCT with MPR and operative pathology. MSCT may become the first choice diagnostic modality for pre-treatment staging evaluations of colorectal carcinomas. Correlative analysis of colorectal cancer stage between multi-slice spiral computed tomography and operative pathology Xue-Mei Zhao, Min Ma, Zong-Ming Zhang, Jian-Ping Zhu, Yan Bai Xue-Mei Zhao, Min Ma, Yan Bai, Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Tsinghua University, Beijing , China Zong-Ming Zhang, Jian-Ping Zhu, Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Tsinghua University, Beijing , China Correspondence to: Xue-Mei Zhao, Department of Radiology, the First Affiliated Hospital of Tsinghua University, Beijing , China. shangziqiang126@sina.com Received: Accepted: Abstract AIM: To evaluate correlations for the staging of colorectal cancer between enhanced multislice spiral computed tomography (MSCT) pneumocolon and surgical pathology. METHODS: Thirty-two patients diagnosed with colorectal cancer from surgery were examined by a three-phase enhanced scan with MSCT. Cancer was staged by Tumor, Node, Metastases (TNM) by axial images and multi-planar reformation (MPR) images. MSCT findings were compared with post- operative pathologic staging. RESULTS: The diagnostic accuracy of T-stage and N-stage before operation, metastasizing and the TNM-stage of MSCT in colorectal cancer was 90.63% (29/32), 84.38% (27/32), 100% (4/4) and 90.63% (29/32), respectively. All correlated with Key Words: Colorectal cancer; Multi-slice spiral computed tomography; Multi-planar reformation; Pathology; Correlation Zhao XM, Ma M, Zhang ZM, Zhu JP, Bai Y. Correlative analysis of colorectal cancer stage between multi-slice spiral computed tomography and operative pathology. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : CT(MSCT). 方法 : 32 MSCT, (MPR) TNM,. 结果 : MSCT T N TNM 90.63%(29/32), 84.38%(27/32), 100%(4/4), 90.63%(29/32), (kappa: 0.807, 0.673, 1, 0.803; P <0.01). 结论 : MSCT,. 关键词,,,,. MSCT,, CT. (MPR),,.

49 1816 ISSN CN /R M S C T A B,,,,. M S C T, 0 引言. 结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一, 检查方法各异, 内窥镜及气钡双重造影是最常用的检 查方法, 但只能观察肠腔内情况, 对于腔外侵 犯及淋巴结转移情况无法判定 [1]. 低张结肠充 气 16 层螺旋 CT(MSCT) 动态增强扫描具有速度 快 范围广及强大的后处理优势, 大大提高了 图像的空间及密度分辨率, 使腹部 CT 图像质量 明显提高. 原始轴位图像结合多平面重组图像 (MPR), 可以有效地显示肿瘤部位 大小 形 态 对肠壁的浸润深度及对周围组织器官的侵 犯范围 有无淋巴结转移及远处组织器官的转 移, 从而能够进行准确的术前分期并判定预后 情况 [2]. 1 材料和方法 1.1 收集手术病理证实结肠癌 32 例, 男 21 例, 女 11 例, 年龄 65-82( 中位年龄 71.8) 岁. 病变位于盲 肠和升结肠 10 例 横结肠 3 例 降结肠 12 例 乙 状结肠 7 例. 1.2 均采用美国 GE 公司 16 层螺旋 CT 扫描机 检查, 扫描参数 : 120 kv 及 ma. 常规肠 道准备后, 于检查前 10 min 肌注山莨菪碱 20 mg 后, 左侧卧位于 CT 扫描床, 将一次性肛管插入肛 门后, 注入 ml 气体, 以患者腹腔能够 耐受为准. 嘱患者适当翻转体位, 取仰卧位先行 全腹盆部平扫, 确定肿瘤部位后, 再行增强扫描. 以高压注射器静脉注入非离子型对比剂碘海醇 (300 g/l), 按 1.5 ml/kg 体质量, 流速约 3.0 ml/s, 扫描延迟时间分别为 : 动脉期 30 s 静脉期 80 s 平衡期 s. 每位患者均为一次屏气完 成扫描, 扫描层厚 5-10 mm 重组层厚 mm, 将重组轴位图像传至 AW4.2 工作站对薄层图像 连续滚动观察, 最后集中在病变部位, 然后用薄 层 MPR 进行重建, 选择轴位及有意义的重建图 像激光打印. 所有图像胶片由 2 位放射科主治医 师进行分析 (1) 病变的部位 大小 形 态. (2) 侵犯的范围及深度. (3) 病变不同时间强化 程度. (4) 浆膜是否受侵. (5) 相应肠腔周围脂肪是 否受侵. (6) 有无周围邻近组织器官侵犯. (7) 有无 周围及远处淋巴结转移 ( 位置 大小 数目 增 强后强化程度 ). (8) 有无远处脏器转移 ( 肝脏 肺 脏 腹腔 盆腔 及腹膜后 ). 我们通过大小 数目 形态及强化程度几方面来综合评估. 1-3 个淋巴结短径 8 mm 增强扫描后有明显强化 (CT 值 80 Hu) 或边缘强化中心未强化的淋巴 结可以考虑转移 ; 4 个以上淋巴结 4 mm 短径 8 mm 成簇状 增强扫描后有明显强化者可考虑 转移 [13-14] ( 图 1); 对于结节状腹腔种植转移表现 为大网膜 系膜区脂肪密度增高 模糊, 腹膜 增厚并见腹壁结节 网膜饼状改变及腹水等 ( 图 2). 图 1 横结肠癌淋巴结转移, 血管根部多个大小不等淋巴结, 部分呈簇状, 增强后 CT 值为 82 Hu. 图 2 结肠癌腹腔种植转移大网膜明显增厚呈饼状, 腹腔内大量积液 MSCT 参照国际统一 TNM 分 期标准并参照相关文献, 制定出术前 MSCT 分期 标准如下 [3] : T0 无异常发现 ; T1 肠壁局限性增厚 ( 大于 0.5 cm) 强化明显 肠腔无明显狭窄 ; T2 肠壁局限性增厚 ( 大于 0.5 cm) 可有挛缩 但 外壁光滑 周围脂肪组织清晰 ; T3 肠壁局限性 增厚 肠腔狭窄 肠外壁毛糙 周围脂肪组织 略显模糊 无邻近组织器官受侵 ; T4 病变突破

50 1817 表 1 32 例结肠癌 MSCT 浸润深度与病理的关系 CT MSCT 征象 n 病理未侵及浆膜 T 1+2 病理侵及浆膜 T 3+4 χ 2 P Kappa, M S C T,. 表 2 32 例结肠癌 MSCT 淋巴结转移与病理的关系 MSCT 征象 n 病理无淋巴结转移病理有淋巴结转移 χ 2 P Kappa 表 3 32 例结肠癌 MSCT 远处组织器官转移与病理的关系 MSCT 征象 n 病理无远处转移病理有远处转移 χ 2 P Kappa 表 4 32 例结肠癌 rmsct TNM 分期与病理的关系 MSCT 征象 n 病理 Ⅰ+Ⅱ 病理 Ⅲ+ Ⅳ χ 2 P Kappa 浆膜 肠腔明显狭窄 外周脂肪密度增高 见 条索样高密度影 并侵及邻近组织器官 ; N0 局 部未见明确转移淋巴结 ; N1 有 1-3 个可视淋巴结 ( 直径大于 4 mm) 并有明显强化 ; N2 有 4 个或以上 可视淋巴结 ( 直径大于 4 mm) 并有明显强化 ; M0 未发现远处转移 ; M1 有远处脏器转移 ( 肝脏 肺 脏 腹腔 盆腔 及腹膜后等 ) 的证据. 双向无序计数资料进行 χ 2 检验, 以 P <0.05 为差异有统计学意义. 一致性检验用 Kappa 检验, Kappa 值小于 0.4 一致性差 具有中度一致性 大于 0.7 有较强一致性. 2 结果 M S C T 对结肠癌术前 T 分期诊断准确率为 90.63%(29/32), 其中非浆膜侵犯诊断准确率为 92.31%(12/13), 1 例高估 ; 在 32 例患者中有 19 例 显示肠腔周围的脂肪组织密度增高, 并可见条 索状高密度影, 判定为浆膜侵犯 ( 图 3), 浆膜侵犯 诊断准确率为 89.47%(17/19), 2 例低估 ; MSCT 诊断结肠癌浸润深度与手术病理有较强一致性 (P <0.001, Kappa = 0.807, 表 1). MSCT 对结肠癌术前 N 分期诊断准确率为 84.38%(27/32), 其中非转移淋巴结诊断准确率为 83.33%(10/12), 转移淋巴结诊断准确率为 85.0%(17/20), MSCT 诊断结肠癌淋巴结转移与手术病理有中等一致性 (P <0.005, Kappa = 0.673, 表 2). MSCT 对结肠癌远处转移诊断准确率为 100.0%(4/4), 其中 2 例为肝转移 1 例为腹腔种植转移 1 例为肝转移 肺转移合并腹腔淋巴结转移 ( 表 3). MSCT 对 32 例结肠癌术前 T N M 分期诊断准确率为 90.63%(29/32), 与手术病理 TNM 分期有较强一致性 (P <0.001, Kappa = 0.803, 表 4). 3 讨论本研究结果表明 MSCT 对结肠癌术前分期与术后病理分期具有较强一致性, 对肿瘤突破浆膜,

51 1818 ISSN CN /R A B 图 3 升结肠癌突破浆膜, 升结肠壁明显增厚并见强化软组织团块影, 周围脂肪间隙内可见模糊条带形高密度影. 向外直接侵犯 淋巴结转移和远处转移均能较准确判断, 对临床治疗有重要的指导意义, 关系到是否行手术切除 手术术式 综合治疗方案以及预后评估. 因此, MSCT 对结肠癌术前分期具有重要作用. MSCT 具有安全无创 扫描速度快 范围广 无重叠 对比剂用量少 具有很高的时间 空间及密度分辨率, 采用轴位薄层扫描图像并结合多平面重组图像可以满足临床诊断的需要. 能从不同平面更好地评估病变的侵犯范围. 扫描时间短, 可以明显减少肠道蠕动伪影, 对于那些不能配合的患者以及体质较弱患者, 这项检查更具有临床实用性. 内窥镜能够取活检对小黏膜病变诊断很有帮助, 但不能观察肠腔外病变情况, 对于肠腔重度狭窄患者不能通过, 有肠梗阻及结肠冗长患者不宜采用 [4-6]. MSCT 原始轴位图像对于放射科医师来说是诊断病变最准确的依据, 但不适合外科医师做手术参考. 多平面重组图像可以从多平面 多角度整体观察病变的解剖关系, 这一点对于外科医生进行术前评估及推测预后是很有意义的 mm 的重组层厚完全可以满足临床诊断和图像处理需要, 使 MSCT 有很高的空间及密度分辨率, 对小病灶不易漏诊. MPR 能够很好消除容积效应, 在二维多平面上任意重建, 以结肠病变段为中心, 逐层行轴位 冠状位及矢状位重建, 无明显阶梯伪影, 可以利用不同的灰阶反映不同密度的组织, 密度分辨率高, 能清晰显示病变段肠腔 肿块沿肠壁侵犯的范围. 结肠周围脂肪组织较丰富, 通过调节窗宽窗位, 可以较准确判断浆膜及邻近脏器受侵情况, 结合三期动态增强扫描对于病变的定位 定性 浸润深度 淋巴结及远处脏器转移等均能较准确识别. 使 MSCT 成为结肠癌术前分期的常规检查方法之一 [7-10]. MSCT 三期扫描诊断的重点在于病变是否侵犯浆膜及邻近脏器, 这一点直接影响结肠的 手术切除率及 5 a 生存率, 本组病例中 MSCT 对浆膜侵犯诊断的准确率为 89.47% 对无浆膜侵犯诊断的准确率为 92.30% 与术后病理有较强一致性. 表明 MSCT 三期扫描对结肠癌浆膜侵犯有较高敏感性, 与术后病理对照, 其中有 17 例有浆膜侵犯, 1 例为炎性反应 1 例为过分消瘦脂肪组织大部分消失而误判. 1 例出现过判主要因为炎性浸润与早期浸润不易判别. 在结肠充盈良好的情况下, 结合三期增强扫描, 观察浆膜及周围脂肪内条形强化病灶, 适当调整窗宽窗位, 薄层图像连续滚动观察并结合 MPR 图像可消除容积效应而造成的误判 [4], 对于观察浆膜及邻近脏器侵犯很有帮助 [11-12]. 判断转移淋巴结仍然是对三期增强 MSCT 的挑战, 结合结肠癌本身的病变特点是否有浆膜及邻近脏器侵犯, 可以提高诊断的准确率. 本组非淋巴结转移诊断的准确率为 83.33% 淋巴结转移诊断的准确率为 85.0%, 与术后病理有中等一致性. 我们通过薄层轴位图像结合 MPR 图像调节窗宽窗位以及静脉期 平衡期淋巴结与强化血管的鉴别, 对于提高 N 分期的准确率是有帮助的 [5], 这一点对于治疗方法的选择有重要指导意义. 刘玉金 et al [6] 报道转移淋巴结平扫密度高于非转移淋巴结, 转移淋巴结强化明显, 且随时间延长而强化 ; 而反应性及炎性淋巴结强化不明显, 由于 MSCT 发现的淋巴结难以与手术结果一一对照, 故研究有一定局限性 [4]. 结肠癌常见的远处转移为肝脏 腹腔种植转移及远处淋巴结转移. 肝脏 MSCT 多期扫描结合结肠癌病史, 可以与其他肝实质病变相鉴别. 远处淋巴结转移可根据多期扫描后薄层图像调节灰阶度与强化血管鉴别. 可以通过三期扫描后薄层轴位结合 MPR 重组图像调节窗宽窗位均可准确显示. 但对于颗粒状腹腔种植转移难以判定, 尚不具备与手术病理完全对照的条件. 总之, MSCT 三期增强扫描与 MPR 相结合对

52 1819 结肠癌术前评估病灶大小 浆膜侵犯 淋巴结转移及远处脏器转移等 TNM 分期有重要作用, Radiol 2003; 47: Panzironi G, De Vargas Macciucca M, Manganaro L, Ballesio L, Ricci F, Casale A, Campagnano [7, 准确性较高 15-18]. 与病理分期有较强一致性. 因 D. Preoperative locoregional staging of rectal carcinoma: comparison of MR, TRUS and Multislice 此可以根据影像表现特点推测出结肠癌的病理 CT. Personal experience. Radiol Med (Torino) 2004; 特性, 从而指导手术及判断预后. 且为无创性检查, 可以成为结肠癌治疗前分期的首选检查方 107: Kulinna C, Scheidler J, Strauss T, Bonel H, Herrmann K, Aust D, Reiser M. Local staging of 法 [19-20] rectal cancer: assessment with double-contrast. multislice computed tomography and transrectal ultrasound. J Comput Assist Tomogr 2004; 28: 参考文献 13 Liersch T, Langer C, Jakob C, Muller D, Ghadimi BM, Siemer A, Markus PM, Fuzesi L, Becker H. 1 CT Preoperative diagnostic procedures in locally 2001; 35: advanced rectal carcinoma (> or = T3 or N + ). What 2 Harvey CJ, Amin Z, Hare CM, Gillams AR, Novelli does endoluminal ultrasound achieve at staging and MR, Boulos PB, Lees WR. Helical CT pneumocolon restaging (after neoadjuvant radiochemotherapy) to assess colonic tumors: radiologic-pathologic in contrast to computed tomography? Chirurg 2003; correlation. AJR Am J Roentgenol 1998; 170: 74: Bertoglio S, Sandrucci S, Percivale P, Goss M, 3 Iyer RB, Silverman PM, DuBrow RA, Charnsangavej Gipponi M, Moresco L, Mussa B, Mussa A. C. Imaging in the diagnosis, staging, and follow-up of colorectal cancer. AJR Am J Roentgenol 2002; 179: 3-13 Prognostic value of sentinel lymph node biopsy in the pathologic staging of colorectal cancer patients. J Surg Oncol 2004; 85: Hur J, Park MS, Lee JH, Lim JS, Yu JS, Hong YJ, CT Kim KW. Diagnostic accuracy of multidetector 2006; 40: row computed tomography in T- and N staging of 5 Sinha R, Verma R, Rajesh A, Richards CJ. Diagnostic value of multidetector row CT in rectal gastric cancer with histopathologic correlation. J Comput Assist Tomogr 2006; 30: cancer staging: comparison of multiplanar and axial images with histopathology. Clin Radiol 2006; 61: Jin KN, Lee JM, Kim SH, Shin KS, Lee JY, Han JK, Choi BI. The diagnostic value of multiplanar reconstruction on MDCT colonography for the 6 preoperative staging of colorectal cancer. Eur Radiol CT 2006; 16: ; 25: Filippone A, Ambrosini R, Fuschi M, Marinelli T, Genovesi D, Bonomo L. Preoperative T and N 7 Harvey CJ, Renfrew I, Taylor S, Gillams AR, Lees staging of colorectal cancer: accuracy of contrastenhanced multi-detector row CT colonography-- WR. Spiral CT pneumocolon: applications, status and limitations. Eur Radiol 2001; 11: initial experience. Radiology 2004; 231: Caseiro-Alves F, Goncalo M, Cruz L, Ilharco J, Leite 18 Kulinna C, Eibel R, Matzek W, Bonel H, Aust J, Agostinho A, Castro e Sousa F, Vilaca-Ramos D, Strauss T, Reiser M, Scheidler J. Staging of H. Water enema computed tomography (WE-CT) rectal cancer: diagnostic potential of multiplanar in the local staging of low colorectal neoplasms: reconstructions with MDCT. AJR Am J Roentgenol comparison with transrectal ultrasound. Abdom 2004; 183: Imaging 1998; 23: Sun CH, Li ZP, Meng QF, Yu SP, Xu DS. Assessment 9 Chiesura-Corona M, Muzzio PC, Giust G, Zuliani M, Pucciarelli S, Toppan P. Rectal cancer: CT local of spiral CT pneumocolon in preoperative colorectal carcinoma. World J Gastroenterol 2005; 11: staging with histopathologic correlation. Abdom Imaging 2001; 26: Ashraf K, Ashraf O, Haider Z, Rafique Z. Colorectal carcinoma, preoperative evaluation by spiral 10 Ji H, Rolnick JA, Haker S, Barish MA. Multislice CT colonography: current status and limitations. Eur J computed tomography. J Pak Med Assoc 2006; 56:

53 ; 15(15): ISSN CN /R CLINICAL RESEARCH 三种抗病毒治疗方法对慢性乙型肝炎患者生活质量的影响 respectively. The life quality of the 143 patients with chronic hepatitis B was assessed by the, quality of life questionnaire (SF-36 in Chinese).. The laboratory data and marks of questionnaires. SF-36 were compared before and after the antiviral treatments. The marks of the following-up period were also considered. (medical outcomes study, MOS) RESULTS: The SF-36 marks of patients with, chronic hepatitis B were not significantly different between the 3 types of antiviral treatments.. There were no significant differences between Assessment on life quality of the marks of life quality before and after the patients with chronic hepatitis same treatment. The life quality of patients with B after three types of antiviral different virus loads showed no marked differences, either, at the end of antiviral treatment treatment and following up. Yan Wang, Yan-Yan Yu, Chong-Wen Si, Xin-Yue Chen, Zhong-Hou Han, Yu-Ping Chen Yan Wang, Yan-Yan Yu, Chong-Wen Si, Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing , China Xin-Yue Chen, Department of Special Service, Beijing You an Hospital, Beijing , China Zhong-Hou Han, Department of Hepatology, Qinhuangdao Third Hospital, Qinhuangdao , Hebei Province, China Yu-Ping Chen, Department of Hepatology, Baoding Hospital for Infectious Diseases, Baoding , Hebei Province, China Supported by the Important Item of Beijing Science Committee, No. H , Peking University 211 Project Item, No Correspondence to: Yan-Yan Yu, Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, 8 Xishiku Street, Xicheng District, Beijing , China. yyy@bjmu.edu.cn Received: Accepted: Abstract AIM: To assess the life quality of patients with chronic hepatitis B after different approaches to antiviral treatment. METHODS: A total of 143 patients were randomly divided into group A, B and C, received lamivudine plus interferon-α2b sequential therapy, lamivudine and interferon-α2b therapy, CONCLUSION: The life quality of patients with chronic hepatitis B is not associated with the different antiviral approaches. It is essential that a reasonable and available antiviral approach combined with the positive psychological treatment should be used to improve the patients life quality. Key Words: Chronic hepatitis B; Antiviral treatment; SF-36 questionare; Life quality Wang Y, Yu YY, Si CW, Chen XY, Han ZH, Chen YP. Assessment on life quality of patients with chronic hepatitis B after three types of antiviral treatment. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 :,. 方法 : 143, ( + α2b, n = 56) (n = 60) (n = 27). (SF36 ),. 3.

54 1821 结果 :, ;,. 结论 :,. 疗组 56 例, 拉米夫定组 60 例, 干扰素组 27 例. 临关键词 床研究符合 GCP 规范, 入组前签署知情同意书. 序贯组 ( 甲组 ): 拉米夫定口服 0.1 g, 每日 1 次, 共 8 mo, 第 7 个月开始加用干扰素 α2b, 5 MIU, 隔日 一次肌注, 共用 6 mo, 两种药重叠应用 2 mo, 总 疗程 12 mo. 拉米夫定组 ( 乙组 ): 拉米夫定口服 g, 每日 1 次, 共 12 mo. 干扰素 α2b 组 ( 丙组 ): 干扰素 α2b, 5 MIU, 隔日 1 次肌注, 共 6 mo. 三组患者 0 引言治疗结束后均随访 6 mo. SF-36 作为健康状况问卷由美国医学疗效研究 SF36 健康状况调查问卷 ( 中文版 ). 他是一个机构 (medical outcomes study, MOS) 研究并发展普适性测定量表, 是国际上普遍认可的代表性成熟 [1]. 最初, 问卷冗长, 90 年代初发展为仅仅包生活质量测评工具, 分 8 个方面, 包括生理功能含 36 个问题的短问卷, 并被广泛应用 [2-9]. 英国于 (PF) 生理职能(RP) 躯体疼痛(BP) 总体健 1990 年开始应用 SF-36 问卷, 澳大利亚 1992 年开康 (GH) 活力(V) 社会功能(SF) 情感职能始应用, 我国近 10 a 也应用广泛 [10-11]. 本研究应用 (RE) 和精神健康 (MH) 8 个领域, 有 36 个条目, 按 SF-36 中文问卷, 对 143 例经三种不同治疗方法百分制评分 [13-14]. 治疗的慢性乙型肝炎患者在治疗前后 随访后应用标准化的量表评定法. 全部调查对象进行生活质量测评, 并对三种治疗方案治疗前均在无医护人员干扰的情况下, 填写健康状况后 随访后的病毒载量 总疗效和生活质量主调查问卷. 每名治疗对象于治疗前 治疗结观指标进行对照分析, 从生活质量的角度进行束 随访结束分别接受评定 3 次. 由有经验的临综合评价. 床医师在调查前进行调查方法 程序等的培训, 保证患者填表时不受到任何干扰和暗示. 资料 1 材料和方法收集完成后由项目主持者逐份核查. 选择北京大学第一医院感染疾病科 北京市佑安医院 河北省秦皇岛市第三医院 北京市地坛医院 河北省保定市传染病院 / 门诊及住院的慢性乙型肝炎患者 143 例. 按 2000 年西安第十次全国病毒性肝炎与肝病学术会议修订的 病毒性肝炎防治方案 的诊断标准 [12]. 年龄在 岁, 性别不限 ; 血清 HBsAg 阳性持续半年以上 HBeAg 阳性 HBV DNA 10 8 copies/l; 血清 ALT 2-10 倍正常值上限 ; 血清总胆红素 2 倍正常值上限 ; PTA 正常者 ; 治疗前 6 mo 未用过抗病毒药及免疫调节剂 ; 除外合并其他肝炎病毒感染 肝硬化 孕妇 合并其他系统性疾病 不稳定糖尿病 甲亢 SLE 等. 表 1 三组患者一般情况的比较 SF-36, 143 分组 n 年龄 ( 岁 ) 性别 ( 男 )% 病程 (mo), 1.2 入选 143 例患者, 随机分为 3 组 : 序贯治 数据采用均数 ± 标准差 (mean ±SD) 和百分数表示, 使用 SPSS12.0 建立数据库进行统计描述和分析, P <0.05 为统计学上有显著性差异. 2 结果年龄 性别和病程经分析, 各组之间差异无显著性统计学意义 (P >0.05, 表 1). 说明三组间具有可比性 三组患者治疗前 结束时 随访时生活质量量表的 8 个纬度用 mean±sd 表示, 结果显示差异无显著性统计学意义 (P >0.05, 表 2-4) ,,,.

55 1822 ISSN CN /R 表 2 治疗前组间比较 (mean±sd) SF36 ( ): 分组 n GH PF RP RE SF BP V MH SF36,, 8, (PF) (RP) (BP) (GH) (V) (SF) (RE) (MH)8, 36, 表 3 治疗结束点组间比较 ( 甲 乙组 48 wk, 丙组 24 wk, mean±sd). 分组 n GH PF RP RE SF BP V MH SF36 表 4 随访结束点组间比较 ( 甲 乙组 72 wk, 丙组 48 wk, mean±sd) 分组 n GH PF RP RE SF BP V MH SF36 三组在治疗前 治疗结束 随访结束不同时间点 ( 组内 ) 的生活质量量表的差异无显著性统计学意义 (P >0.05, 表 5). 2.3 治疗结束时, 不同病毒载量与生活质量量表的 8 个纬度的差异无显著性统计学意义 (P >0.05, 表 6). 3 讨论病毒性肝炎是一种严重影响人们身体健康的疾病. 我国有慢性乙型肝炎患者 3000 万, 如未经治疗, 慢性乙型肝炎可进展为肝硬化 肝癌, 慢性乙型肝炎的治疗最重要的是抗病毒治疗, 现有的抗病毒药物主要包括干扰素和核苷类似物, 他们都有一定的副作用, 如发热 抑郁以及疾病的反弹等, 可能影响生活质量, 我们探讨了不 表 5 甲 乙 丙三组治疗前 治疗结束 随访结束不同时间点 SF-36 总分比较 (mean±sd) 时间点甲组乙组丙组 同抗病毒药物治疗慢性乙型肝炎对生活质量的 影响. 对患者生活质量的关注有助于对患者身体 和心理的全面了解, 这也正符合近些年来医学 模式的转变, 即从过去的单纯生物型模式逐渐 向生物 - 社会 - 心理模式的转变, 注重疾病整体

56 1823 表 6 治疗结束时病毒载量与对生活质量量表的关系 (mean±sd) 3 病毒量 copies/l n GH PF RP RE SF BP V MH SF36,. 的发生与发展, 从而使患者全身心得到康复. 对生活质量的了解可以从患者的工作 学习 生活 情绪 社交等多个方面进行. 多项研究证实慢乙肝患者生活质量明显低于健康人群 [15-16]. 有研究结果也显示干扰素 拉米夫定 联合治疗, 不同抗病毒治疗方案对患者的生活质量影响差异无统计学意义 [17]. 但易露茜 et al [18] 报道拉米夫定治疗 6 mo 前后慢乙肝患者生活质量有显著性差异. 我们的研究结果显示, 接受干扰素 - 拉米夫定序贯组 拉米夫定组 干扰素组三种治疗方法的患者, 其生活质量无明显差别 ; 同一种治疗方法, 在治疗前 治疗结束及随访结束, 其生活质量也无明显变化 ; 生活质量与治疗后患者的病毒载量无明显相关性. 本研究与某些作者研究结果不同, 分析原因 : 本研究入选患者主要是轻 中度肝炎, 治疗前基线生活质量并无明显下降, 因此随后的生活质量改善空间很小 ; 本研究入选患者多为长期接受治疗监测的患者, 由于心理治疗的及时介入, 使得生活质量的改善不显著 ; 患者的生活质量是与多方面因素有关的, 如病情的轻重 病程的长短 患者的性格和心理因素 社会与周围环境的影响等 [19-21]. 肝炎患者心理问题的严重程度与其采用消极的应对方式有关, 消极的应对方式可以影响生活质量. 傅文青 et al [22] 对 152 例慢乙肝患者的生活质量评估和医学问卷调查的结果显示, 慢性乙肝患者具有广泛的心理问题, 其中以躯体化 强迫 焦虑 抑郁 敌对为主, 逃避和屈服与心身症状呈正相关, 提示肝炎患者心理问题的严重程度与其采用消极的应对方式有关, 推测肝病对患者造成的心理应激可能是以回避 屈服等消极的应对方式为中介的, 这可解释临床中观察到的病情严重程度与心身症状不一致的现象. 相关分析发现, 回 避和屈服, 尤其是屈服应对与生活质量呈负相 关, 说明消极的应对方式可以降低生活质量. 杜 耀民 et al [23] 与王佳贺 et al [24] 报道常规治疗加健 康教育, 比单纯常规治疗的患者生活质量明显 提高. 因此, 我们认为, 提高慢性乙肝患者生活质 量, 除了根据病情选择合理的抗病毒治疗方法 外, 还需要配合积极的心理治疗和健康教育. 心 理干预的要点是 : 帮助患者改变消极的 任由 疾病摆布的生活状态, 培养积极乐观的康复信 念和生活方式. 只有医疗和心理兼顾的治疗才 能最大效能的提高慢性乙型肝炎患者的生活质 量, 才能给他们最全面的关爱. 另外, 也需要探 讨更有助于反映 HBV 感染者的生活质量的专用 量表, 以期能更好的关注并提高 HBV 感染者的 生活质量. 4 参考文献 1 Sanson-Fisher RW, Perkins JJ. Adaptation and validation of the SF-36 Health Survey for use in Australia. J Clin Epidemiol 1998; 51: Velanovich V. Comparison of generic (SF-36) vs. disease-specific (GERD-HRQL) quality-of-life scales for gastroesophageal reflux disease. J Gastrointest Surg 1998; 2: Kvien TK, Kaasa S, Smedstad LM. Performance of the Norwegian SF-36 Health Survey in patients with rheumatoid arthritis. II. A comparison of the SF-36 with disease-specific measures. J Clin Epidemiol 1998; 51: Manu MA, Radulescu S, Harza M, Manu R, Capsa D, Sinescu I. Quality of life assessed by SF-36 health survey in renal transplant patients. Transplant Proc 2001; 33: L Gee, J Abbottt, S Conway, C Etherington, AK Webb. Testing and validation of the SF-36 as a suitable quality of life measure for adults with CF. Neth J Med 1999; 54: 75 6 J Bellido-Casadoa, J Martyn-Escuderob, A Duen as-laitac, FJ Mena-Martynb, D Arzua-Mouronteb, F Simal-Blancob. The SF-36 Questionnaire as a measurement of health-related quality of life: assessing short- and medium-term effects of exposure to tobacco versus the known long-term

57 1824 ISSN CN /R effects. Eur J Intern Med 2004; 15: C Virus Infection. Dig Dis Sci Failde I, Ramos I. Validity and reliability of the SF-36 Health Survey Questionnaire in patients with coronary artery disease. J Clin Epidemiol 2000; 53: ; 11: Aydemir O, Ozdemir C, Koroglu E. The impact of co-morbid conditions on the SF-36: a primary-carebased study among hypertensives. Arch Med Res 2005; 36: ; 24: ; 24: Jomeen J, Martin CR. The factor structure of the SF-36 in early pregnancy. J Psychosom Res 2005; 59: ; 25: Sobhonslidsuk A, Silpakit C, Kongsakon R, 生存质量的分析. 国外医学 流行病学传染病学分册 2004; 31: Satitpornkul P, Sripetch C, Khanthavit A. Factors influencing health-related quality of life in chronic 11 liver disease. World J Gastroenterol 2006; 12: 2001; 6: von Wagner M, Lee JH, Kronenberger B, Friedl 2000; 8: R, Sarrazin C, Teuber G, Herrmann E, Zeuzem S Ware JE Jr, Gandek B. Overview of the SF-36 Health Survey and the International Quality of Life Assessment (IQOLA) Project. J Clin Epidemiol 1998; 51: Apolone G, Mosconi P. The Italian SF-36 Health Survey: translation, validation and norming. J Clin Epidemiol 1998; 51: Kallman J, O'neil MM, Larive B, Boparai N, Calabrese L, Younossi ZM. Fatigue and Health- Related Quality of Life (HRQL) in Chronic Hepatitis Impaired health-related quality of life in patients with chronic hepatitis C and persistently normal aminotransferase levels. J Viral Hepat 2006; 13: ; 12: ; 8: ; 9: 35, 37 ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯为推动期刊出版事业的繁荣和发展, 中共山西省委宣传部 山西省新闻出版局 山西省科学技术厅共同组织了 2006 年度期刊质量评估工作. 此次参评的为 2005 年度山西省出版的 196 种期刊, 其中, 社科期刊 110 种 科技期刊 86 种. 评估结果如下 : 一级 ( 优秀 ) 期刊共 88 种, 其中社科期刊 42 种, 科技期刊 46 种, 包括世界胃肠病学杂志和世界华人消化杂志 ; 二级期刊共 103 种, 其中社科期刊 64 种, 科技期刊 39 种 ; 三级期刊共 5 种, 其中社科期刊 4 种, 科技期刊 1 种. ( 中共山西省委宣传部 山西省新闻出版局 山西省科学技术厅 )

58 ; 15(16): ISSN CN /R CLINICAL RESEARCH 细胞色素 P4502E1 酶与非酒精性脂肪肝的关系 the frequency of the c2 allele gene increased with the degree of pathogenesis of liver disease (P = 0.000). CONCLUSION: The genetic polymorphism of CYP2E1 at the PstⅠ and RsaⅠ sites is associated with susceptibility for NAFLD. Association of CYP2E1 enzymes and susceptibility for non-alcoholic liver disease Yan-Mei Guo, Qin Wang, Zhi Qi Yan-Mei Guo, Department of Clinical Medicine, Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou , Gansu Province, China Qin Wang, Zhi Qi, Department of Gastroenterology, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou , Gansu Province, China Correspondence to: Yan-Mei Guo, Department of Gastroenterology, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou , Gansu Province, China. guoyanmei100@126.com Received: Accepted: Abstract AIM: To investigate correlations between cytochrome P4502E1 (CYP2E1) enzyme gene polymorphisms and non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). METHODS: A polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to determined polymorphisms of CYP2E1 PstⅠ and RsaⅠ sites. RESULTS: Genotypes were separated into three: type A (homozygous for c1 gene), type B (heterozygous for c1/c2 gene), and type C (homozygous for c2 gene). In 20 healthy controls, c1 frequency was 85.0% and c2 15.0%. In 40 patients with NAFLD, c1 was 58.8% and c2 41.2%. Comparing the NAFLD group with the healthy controls, c1 was decreased and c2 increased, significantly (P = 0.004). Comparing the NAFLD group with the alcoholic liver disease group, the frequency of the c2 allele gene was not significantly different (P = 0.896). In the NAFLD group Key Words: Non-alcoholic fatty liver disease; Genetic polymorphism; Cytochrome P4502E1 Guo YM, Wang Q, Qi Z. Association of CYP2E1 enzymes and susceptibility for non-alcoholic liver disease. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : P4502E1(CYP2E1) (NAFLD) NAFLD. 方法 : (PCR RFLP) 40, 20, 20, 20 CYP2E1,. 结果 : NAFLD c 2 (χ 2 = 8.376, P = 0.004) (χ 2 = 6.769, P = 0.005), (P <0.01), NAFLD, (P = 0.896). NAFLD, c 2, (P = 0.04) (P = 0.000), (P <0.05). 结论 : NAFLD CYP2E1, NAFLD. 关键词 CYP2El D-,,. CYP2El, CYP2El,. CYP2El.

59 1826 ISSN CN /R 0 引言, C Y P 2 E 1 非酒精性脂肪性肝病 (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) 是一类肝组织学与酒精性肝病, - 相似 [1-2], 但无过量饮酒史的临床病理综合征, 包. 括单纯性脂肪肝, 脂肪性肝炎和肝硬化三种病 C Y P 2 E 1 理类型. NAFLD 的病因和发病机制较复杂, 迄 今尚未完全明了. 文献报道遗传易感性与其发, 3, 病关系密切 [3]. 细胞色素 P4502E1(cytochrome P4502E1, CYP2E1) 是细胞色素 P450 的乙醇诱,., 导形式, 在非乙醇脱氢酶氧化途径中起重要 C Y P 2 E 1, 作用, 是酒精性脂肪肝的主要发病形式 [4-6]. 而, NAFLD 与酒精性脂肪肝有相似的病理特征, 推. 测 CYP2E1 可能在 NAFLD 发病中起一定作用. 我们利用聚合酶链反应 - 限制性片段长度多态 性分析法 (polymerase chain reaction- restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP), 研究 CYP2E1 基因多态性与 NAFLD 发病的关系, 以寻 找 NAFLD 的易感因素, 并从分子水平探讨该病 的发病机制. 1 材料和方法 所有研究对象均来自 /11-28 在兰州大学第一医院消化科住院及门诊患者以 及健康体检中心体检者, 均为长期 (10 a 以上 ) 居 住在甘肃地区无血缘关系的甘肃籍汉族人. 检 测生化全项 ( 肝功 血脂 ) 肝纤维化 4 项 肝脏 B 超. 非酒精性脂肪性肝病组 40 例, 男 / 女 : 29/11, 平均年龄 50±6.25 岁, 诊断标准符合 中 华医学会肝病学分会通过的 非酒精性肝病诊 疗指南 [7] ; 并排除病毒性 药物性 自身免疫 性肝病. NAFLD 组根据生化全项, 肝脏 B 超, CT 检查及肝脏穿刺活检分为单纯性脂肪肝, 脂肪 性肝炎 (5 例为穿刺活检证实 ) 和肝硬化 (10 例为 穿刺活检证实 )3 组. NAFLD 组根据伴随症状不 同分为肥胖组 ( 体质量指数 : 女 25, 男 27) 和 糖尿病组, 诊断符合 WHO 1999 年糖尿病诊断 标准 [8]. 酒精性肝病组 20 例, 均为男性, 平均年 龄 51±6.43 岁, 诊断标准符合 2006 年 酒精性 肝病诊疗指南 [9]. 非脂肪肝对照组 20 例, 暴露 因素相似, 无肝脏疾病, 男 / 女 : 8/12, 平均年龄 50±4.32 岁. 健康对照组 20 例, 来自健康体检人 群, 男 / 女 : 10/10, 平均年龄 49±5.22 岁, B 超 生化全项 肝纤维化 4 项均正常, 不吸烟 不饮 酒. 空腹抽取静脉血 2 ml 乙二胺四乙酸防凝处 理后 -80 保存备用. 聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 扩增仪, Eneamp system 2400 型, 美国 Perkin-Elmer 公司生产. 凝胶成像系统 : HOOD-SN73S 型, BIO-RAD, 意大利米兰 生产. 内切酶 Rsa Ⅰ 和 Pst Ⅰ 酶购自 Sangon 公司. 扩增 CYP2E1 基因的引物由 Sangon 公司合成. 引 物 1: 5'-CCAGTCGAGTCTACAT TGTCA-3'; 引 物 2: 5'-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3' DNA 用血液基因组 DNA 抽提 试剂盒按说明书提纯 DNA PCR 94 预变性 2 min 后, 94 变 性 1 min, 50 退火 50 s, 72 延伸 50 s, 共 40 个循 环. 72 延伸 10 min 在检测 PCR 扩增产物后, 分 别用限制性内切酶 Rsa Ⅰ 或 Pst Ⅰ 消化 PCR 产物, 37 电热恒水温箱孵育 18 h. 加样于 25 g/l 琼脂 糖凝胶上, 70 V 恒压条件垂直电泳 45 min. 凝胶 电泳成像分析系统扫描分析仪分析各基因型并 拍照. 采用 SPSS10.0 软件进行 t 检验, χ 2 检验. 对群体数据作 Hardy-Weinberg 平衡吻合 度检验. 2 结果 2.1 CYP2E1 Rsa Ⅰ 的酶切位点存 在 C/T 突变, 酶切后野生纯合子片段为 360 和 50 bp; 杂合子为 410, 360 和 50 bp; 突变纯合 子片段为 410 bp [10] ( 图 1). Pst Ⅰ 的酶切位点存在 G/C 突变, 酶切后野生纯合子片段为 290 和 120 bp; 杂合子为 410, 290 和 120 bp; 突变纯合子 片段为 410 bp( 图 2). 2.2 非 酒精性脂肪性肝病组与正常对照组相比 c 2 等位 基因型明显升高, 差异有统计学意义 (c 2 = 8.376, P <0.05). NAFLD 组与非脂肪肝对照组相比 c2 等位基因型明显升高, 差异有统计学意义 (c 2 = 6.769, P 0.05). NAFLD 组与酒精性肝病组相 比, 基因型无明显改变, 差异无统计学意义 (c 2 = 0.017, P 0.05, 表 1). 2.3 CYP2E1 NAFLD 中, 肝脏病变程度不同, c 2 等位基 因频率不同, 差异有统计学意义 ( 表 2). 2.4 CYP2E1 NAFLD 伴肥胖与 NAFLD 伴糖 尿病等位基因分布无显著性差异 (c 2 = 0.052, P >0.05, 表 3).

60 M M,, c 2. c bp 500 bp 300 bp 400 bp 200 bp, 300 bp 100 bp., c 2, 图 1 Rsa 酶切电泳图. 图 2 Pst 酶切电泳图. c 2, 表 1 非酒精性脂肪性肝病组基因型分布. 基因型 基因型 分组 n A B C c 1 c 2 χ 2 P (c 1/c 1) (c 1/c 2) (c 2/c 2) 表 2 CYP2E1 基因型与非酒精性脂肪性肝病的关系 (n, %) 基因型 基因型 分组 n A B C c 1 c 2 χ 2 P (c 1/c 1) (c 1/c 2) (c 2/c 2) 表 3 非酒精性脂肪肝不同伴发症基因型分布 基因型 基因型 分组 n A B C c 1 c 2 χ 2 P (c 1/c 1) (c 1/c 2) (c 2/c 2) 3 讨论 CYP2El 酶是二甲基亚硝胺 D- 脱甲基酶, 主要在肝脏表达 [11-12], 参与许多外源性化合物的代谢 [13]. 大量证据表明, CYP2E1 在酒精性肝病中表达明显增强 [14-19], 主要参与氧应激 - 脂质过氧化损伤. 而非酒精性脂肪性肝病的组织病理学变化与酒精性脂肪肝相似, 推测两者在引起肝 脏损害中有相似的致病机制. 动物实验证明, 在高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠 CYP2E1 表达与酒精性脂肪肝相似, 即在腺泡 3 区表达增强, 且脂肪肝程度的加重, 表达逐渐增高 [13,17,20-27]. 有研究证实在脂肪肝患者, CYP2E1 的含量和活性均增加 [28], 而且, 随着脂肪肝形态学上的病理严重程度增加而增加 [29-30]. CYP2E1 酶基因位于人第

61 1828 ISSN CN /R 10 号染色体上, 长 个碱基对, 包括 9 个外 C Y P 2 E 1 显子和 8 个内含子 [31], CYP2E1 基因存在 6 种限 制性内切酶片段长度多态性, 其中 5'- 端的 Rsa, Ⅰ/Pst Ⅰ 多态是两个连锁多态不平衡, 存在 c 1 单 c 2 倍型 (Rsa Ⅰ+, Pst Ⅰ-) 和 c 2 单倍型 (Rsa Ⅰ-, Pst Ⅰ. +). Rsa Ⅰ/Pst Ⅰ 酶切位点的变异在转录水平影 CYP2E1 响 CYP2E1 的表达, c 2 位基因使其增加 [32-33]. 本 研究所有数据符合 Hardy-Weinberg 平衡吻合度. 检验, 说明群体基因遗传平衡, 来自同一蒙德尔 群体. 研究结果发现 CYP2El 至少可分为 3 个基 因型, 即 A 型 (c 1 基因纯合子 ) B 型 (c 1/c 2 基因的 杂合子 ) 及 C 型 (c 2 基因的纯合子 ). 在 20 例健康对 照组中, A 型为主, 说明在正常人群中以 c 1 型为 主. 在 NAFLD 中, 各基因型分布与正常人群相比 差异有统计学意义, 这与以往研究相符 [29,34] ; 与 酒精性脂肪肝分布相似, 以 c 2 型为主. 说明 c 2 型 基因在 NAFLD 发生中起着重要的作用, 其发病 机制与酒精性肝病有相似之处. 在不同伴发症 NAFLD 中无统计学差异, 即基因型与伴发症无 关. NAFLD 随肝脏病变程度增加, c 2 等位基因明 显升高, 进一步证实 c 2 等位基因与 NAFLD 的发 病相关, 并更容易发展为肝硬化. 总之, CYP2E1 酶基因多态性在 NAFLD 的 发生 发展中具有重要意义, 其中 c 2 等位基因 与 NAFLD 的遗传易感性有关, 同时也为研究 NAFLD 遗传易感性提供了新的思路. population. Arch Toxicol Pentiuk OO, Kachula SO, Herych OKh. Cytochrome P4502E1. Polymorphism, physiological function, regulation, and role in pathology. Ukr Biokhim Zh 2004; 76: Plumlee CR, Lazaro CA, Fausto N, Polyak SJ. Effect of ethanol on innate antiviral pathways and HCV replication in human liver cells. Virol J 2005; 2: Nielsen JS, Moller BL. Cloning and expression of cytochrome P450 enzymes catalyzing the conversion of tyrosine to p-hydroxyphenylacetald oxime in the biosynthesis of cyanogenic glucosides in Triglochin maritima. Plant Physiol 2000; 122: Lieber CS. Pathogenesis and treatment of alcoholic liver disease: progress over the last 50 years. Rocz Akad Med Bialymst 2005; 50: Wong NA, Rae F, Simpson KJ, Murray GD, Harrison DJ. Genetic polymorphisms of cytochrome p4502e1 and susceptibility to alcoholic liver disease and hepatocellular carcinoma in a white population: a study and literature review, including meta-analysis. Mol Pathol 2000; 53: T s u t s u m i M, T a k a d a A, W a n g J S. G e n e t i c polymorphisms of cytochrome P4502E1 related to the development of alcoholic liver disease. Gastroenterology 1994; 107: Lieber CS. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol 2004; 34: Konishi T, Calvillo M, Leng AS, Feng J, Lee T, Lee H, Smith JL, Sial SH, Berman N, French S, Eysselein V, Lin KM, Wan YJ. The ADH3*2 and CYP2E1 c2 alleles increase the risk of alcoholism in Mexican American men. Exp Mol Pathol 2003; 74: Leclercq IA, Farrell GC, Field J, Bell DR, Gonzalez F J, R o b e r t s o n G R. C Y P 2 E 1 a n d C Y P 4 A a s microsomal catalysts of lipid peroxides in murine nonalcoholic steatohepatitis. J Clin Invest 2000; 105: 参考文献 1 20 Quertemont E. Genetic polymorphism in ethanol P450 2E1 metabolism: acetaldehyde contribution to alcohol 2005; 13: abuse and alcoholism. Mol Psychiatry 2004; 9: 2 Lieber CS. CYP2E1: from ASH to NASH. Hepatol Res 2004; 28: Gonzalez FJ. Role of cytochromes P450 in chemical 3 Yu AS, Keeffe EB. Nonalcoholic fatty liver disease. Rev Gastroenterol Disord 2002; 2: toxicity and oxidative stress: studies with CYP2E1. Mutat Res 2005; 569: Gemma S, Vichi S, Testai E. Individual susceptibility and alcohol effects:biochemical and genetic aspects. Ann Ist Super Sanita 2006; 42: Rana SV, Chaudhary N, Verma Y. Circadian variation in lipid peroxidation induced by benzene in rats. Indian J Exp Biol 2007; 45: Zhuge J, Luo Y, Yu YN. Heterologous expression of human cytochrome P450 2E1 in HepG2 cell line. World J Gastroenterol 2003; 9: Xu Y, Leo MA, Lieber CS. DLPC attenuates alcoholinduced cytotoxicity in HepG2 cells expressing CYP2E1. Alcohol Alcohol 2005; 40: Castaneda F, Rosin-Steiner S. Low concentration of ethanol induce apoptosis in HepG2 cells: role of various signal transduction pathways. Int J Med Sci 2006; 3: Hayashi N, Tsutsumi M, Fukura M, Yano H, Tsuchishima M, Takase S. Effect of chronic dietary ethanol consumption on colonic cancer in rats induced by 1,1-dimethylhydrazine. Alcohol Clin Exp 7 Res 2007; 31: S Kim BJ, Hood BL, Aragon RA, Hardwick JP, 2006; 14: Conrads TP, Veenstra TD, Song BJ. Increased ; 18: 180 oxidation and degradation of cytosolic proteins in 9 alcohol-exposed mouse liver and hepatoma cells. 2006; 14: Proteomics 2006; 6: Zhou Z, Wang L, Song Z, Saari JT, McClain CJ, 10 Ulusoy G, Arinc E, Adali O. Genotype and allele frequencies of polymorphic CYP2E1 in the Turkish Kang YJ. Zinc supplementation prevents alcoholic liver injury in mice through attenuation of oxidative

62 1829 stress. Am J Pathol 2005; 166: Arsov T, Larter CZ, Nolan CJ, Petrovsky N, Goodnow CC, Teoh NC, Yeh MM, Farrell GC. Adaptive failure to high-fat diet characterizes steatohepatitis in Alms1 mutant mice. Biochem Biophys Res Commun 2006; 342: Wan J, Ernstgard L, Song BJ, Shoaf SE. Chlorzoxazone metabolism is increased in fasted Sprague- Dawley rats. J Pharm Pharmacol 2006; 58: Orellana M, Rodrigo R, Varela N, Araya J, Poniachik J, Csendes A, Smok G, Videla LA. Relationship between in vivo chlorzoxazone hydroxylation, hepatic cytochrome P450 2E1 content and liver injury in obese non-alcoholic fatty liver disease patients. Hepatol Res 2006; 34: Wu D, Cederbaum A. Nitric oxide donors prevent 31 while the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME increases arachidonic acid plus CYP2E1-dependent toxicity. Toxicol Appl Pharmacol 2006; 216: Lieber CS, Leo MA, Mak KM, Xu Y, Cao Q, Ren C, Ponomarenko A, DeCarli LM. Model of nonalcoholic steatohepatitis. Am J Clin Nutr 2004; 79: P450, SCD, 32 Orellana M, Guajardo V. Cytochrome P450 activity TNF-α., and its alteration in different diseases. Rev Med Chil P4502E1 2004; 132: N A S H 33 Chelule PK, Pegoraro RJ, Gqaleni N, Dutton MF. The frequency of cytochrome P450 2E1. polymorphisms in Black South Africans. Dis P4502E1 Markers 2006; 22: Piao YF, Li JT, Shi Y. Relationship between genetic polymorphism of cytochrome P450IIE1 and fatty liver. World J Gastroenterol 2003; 9: ,,. ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯经卫生部批准, 由甘肃省人民医院消化科主办的 2007 年国家级继续医学教育项目 功能性胃肠病诊 治进展 ( 项目编号 : ), 定于 /05 在甘肃兰州举行. 学习班期间将邀请国内及省内知名消 化专家, 讲授功能性胃肠病诊治进展. 1 授课内容功能性胃肠病罗马 Ⅲ 分类及诊断标准的核心内容, 有消化道症状的抑郁及焦虑症状的判定评分标. 伴有抑郁及焦虑症状的功能性胃肠病患者的心理治疗, 便秘及腹泻型 IBS 功能性腹胀 功能性便秘等, 功能性烧心 食管源性胸痛 功能性吞咽困难, 食管压力测定的临床意义 ; 糖尿病人食管压力测定结果与正常人群食管压力测定结果对比分析 ; 功能性消化不良 反刍综合征等 ; 胆囊及 Oddi 括约肌功能紊乱的诊断和治疗 ; 功能性大便失禁 功能性肛门直肠疼痛 功能性排便障碍 ; 功能性腹痛的诊断标准及治疗, 兰州地区 50 例健康成人食管 PH 测定结果分析 ; 食管 PH 监测的临床意义 ; 胃食管反流病人反流程度不同伴有不同的症状积分 ; 治疗功能性胃肠道疾病新方法疗效的临床试验设计 ; 学习班结业时授予国家级继续医学教育项目学分 12 学分. 学习班费用 ( 含资料及证书费 ): 680 元. 食宿统一安排. 费用自理. 有意参加者请于 日前将回执寄至甘肃省人民医院消化科, 以便预定房间并发第二轮通知. 2 联系方式 兰州市东岗西路 160 号甘肃省人民医院消化科 ; 邮编 : 联系人 : 陈翔 ; 电话 : ;

63 REVIEW ; 15(16): ISSN CN /R PET/CT 在胰腺癌临床应用中的进展 with pancreatic cancer. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): PET/CT PET CT,, /,,. PET/CT,., PET/CT,. Progress in the clinical application of in patients with pancreatic cancer Rong-Fu Wang Rong-Fu Wang, Department of Nuclear Medicine, Peking University First Hospital, Beijing , China Supported by National Basic Research Program-973 Program of China, No. 2006CB705705; and 985-II Project Foundation of Peking University, No Correspondence to: Rong-Fu Wang, Department of Nuclear Medicine, Peking University First Hospital, Beijing , China. rongfu_wang2003@yahoo.com Received: Accepted: Abstract Pancreatic cancer, which has high morbidity, difficult diagnosis, and poor treatment results, is a type of malignant tumor in the digestive system. Positron emission tomographycomputed tomography, an important imaging modality in modern medicine, combines the functional imaging of PET and the anatomic imaging of CT to efficiently image tumor metabolism, proliferation, hypoxia and cell apoptosis. It can also precisely image the anatomic structure of tumors and their adjacent organs or tissues. Positron emission tomography-computed tomography was found to be particularly helpful for guiding diagnosis and therapy, the staging and grading of tumors, monitoring therapy and in evaluating the prognosis of patients with pancreatic cancer. Key Words: Positron emission tomography-computed tomography; Pancreatic cancer; Clinical application; Progression Wang RF. Progress in the clinical application of Positron emission tomography-computed tomography in patients. PET/CT, PET CT,,., PET/CT. PET/CT. 关键词 0 引言 胰腺癌 (pancreatic cancer) 是胰外分泌性恶性肿 瘤, 发病率仅次于胃癌 食管癌 肝癌 大肠 癌, 居消化系统恶性肿瘤第五位, 近年呈增多趋 势. 我国胰腺癌的年发病率为 5.1/10 万, 好发年 龄在 岁之间, 男性多于女性. 由于胰腺癌的 临床表现较多样化, 常与癌肿的部位 病程早 晚 远近组织受累 转移及有关并发症因素有 关 ; 而且生长较快, 很早发生转移, 所以早期诊 断困难, 绝大多数患者一经确诊已属晚期. 据统 计, 未经治疗的胰腺癌患者, 90% 以上于诊断明 确后 1 a 内死亡. 只有 10%-15% 的患者有手术切 除的机会, 其中能根治者仅为 5%-7.5%. 美国国 立卫生研究院报告, 胰腺癌 1 a 生存率为 8%, 5 a 生存率为 3%, 中位生存期仅 2-3 mo. 我国外科的 统计资料显示, 胰腺癌患者的 5 a 生存率在 5% 左右. 鉴于胰腺癌患者的预后极差, 因此应用合 适方法进行早期诊断, 进而采取适当手段干预 治疗就显得至关重要. 目前, 常用的筛选胰腺癌

64 1831 的方法是肿瘤标志物 CA19-9 测定, 70%-90% 的胰腺癌患者的血清 CA19-9 水平升高, 但是该方法的特异性不强 [1]. 影像诊断方法主要有计算机体层摄影 (CT) 门静脉造影(portocavogram) 核磁共振成像 (M R I) 内镜逆行胰胆管造影 (endoscopic retrograde cholangiopancreatography, ERCP) 超声内镜(ultrasonic endoscope) 等, 其中 CT 检查是临床上最常应用的诊断胰腺癌手段. 随着正电子发射计算机断层 / 计算机体层摄影 (PET/CT) 的逐渐应用, 其在胰腺癌的临床应用价值也日趋显著. 本文将就 PET/CT 在临床应用中的进展以及他与其他影像诊断技术之间的比较综述如下. 1 PET/CT 在胰腺癌临床诊断中的应用 PET/CT 是现代医学成像重要组成内容之一, 其显像原理与 X 线 B 超 CT 和 MR 等检查截然不同, 是通过探测器接收并记录引入体内靶组织或器官的正电子药物发射的核射线 ; 然后以影像的方式显示出来, 不仅可以显示脏器或病变的位置 形态 大小等解剖学结构, 更可以同时提供有关脏器和病变的血流 功能 代谢和 / 或受体密度, 甚至是分子水平的化学信息, 因此有助于疾病的早期诊断. 此外, PET/CT 显像为无创性检查, 所用的放射性核素半衰期短, 显像剂化学量极微, 患者所接受的辐射吸收剂量低, 发生毒副作用的几率极低 [2]. 目前, 随着多种正电子药物的开发以及融合图像技术的发展, PET/CT 在临床疾病诊断, 尤其是肿瘤诊断中具有重要的应用价值. 1.1 氟 [ 18 F]- 氟代脱氧葡萄糖 ( 18 F-fluorodeoxyglucose, 18 F-FDG) 是目前临床上应用最多的肿瘤代谢显像剂. 他与天然葡萄糖的化学结构相似, 在己糖激酶的作用下, 磷酸化成 6- 磷酸氟代脱氧葡萄糖 ( 18 F-FDG-6-PO4). 但与葡萄糖代谢不同的是, 18 F-FDG-6-PO4 不是磷酸己糖变构酶的底物, 不能继续进一步的代谢反应 ; 而且带负电荷, 不能反向通过细胞膜离开细胞 ; 另外, 肿瘤细胞内使 18 F-FDG-6-PO4 去磷酸化的葡萄糖 -6- 磷酸酶活性极低, 所以 18 F-FDG-6-PO4 最后滞留在肿瘤细胞内, 其滞留率与葡萄糖在体内的代谢率具有一定的比例关系. 通过 PET/CT 探测 18 F 湮灭辐射后发射的高能射线, 再经过计算机的处理, 就可以获得 18 F-FDG 在体内的分布影像, 该影像实质是反应体内葡萄糖代谢的状态和水平 [3]. 由于恶性肿瘤如胰腺癌具有异常旺盛的 糖酵解, 因此在 18 F-FDG 代谢显像上具有一定的基本特征, 即肿瘤病灶处出现异常增高并且持续存在的 18 F-FDG 摄取, 摄取增高程度与肿瘤的病理类型 大小和所处肿瘤增殖周期的不同阶段密切相关 胰腺癌的主要治疗手段是手术治疗, 但是仅有 20% 的胰腺癌患者有手术治疗的机会 [4]. 通常导致胰腺癌手术无法正确实施的困难在于以下两方面 : 一, 缺乏组织学诊断, 错过了切除恶性胰腺肿瘤的良机 ; 二, 临床上疑似恶性胰腺肿瘤, 实为良性病变, 却采取了手术切除措施. 这些无疑都给患者带来极大的痛苦. 多项研究表明, 18 F-FDG PET 显像相较于 C T 来说, 可以提高术前胰腺癌患者的诊断精确度 ( 达到 85%-93%), 而且显像灵敏度达到 85%-100%, 特异性为 67%-99%. 另外, CT 成像灵敏度随着胰腺癌病灶大小的增加而提高, 而 18 F-FDG PET 显像的灵敏度是不依赖于病灶的大小 [5]. PET/CT 图像的融合, 将 PET 与 CT 在诊断胰腺癌方面的优势结合起来, 不仅能够准确显示出病灶范围 大小 与邻近组织器官的关系, 还能够区分肿瘤的良恶性, 提供肿瘤生物学活性的信息, 从而有助于判断是否适宜进行手术治疗以及采取何种手术方法. 另一方面, 对于原发病灶未明的患者, PET/CT 全身显像有助于追溯原发病灶 ( 主要是肺癌或胰腺癌 ), 从而有效地制定治疗方案 [6]. Heinrich et al [7] 对已确诊并拟定手术治疗的胰腺癌患者行 PET/CT 检查, 诊断的阳性率达到 91%, 其中 16% 的患者在检查之后确定无手术适应征而改变治疗方案. Nishiyama et al [8] 对 86 例胰腺肿瘤患者 (55 例为胰腺癌, 31 例为良性病变 ) 进行临床试验, 评价 18 F-FDG PET 延迟显像是否更有助于区分良恶性病灶以及是否能够发现更多的病灶. 他们采用 SUV(standard uptake value) 值作为分析指标, 并且计算滞留指数 (retention index, RI) = (SUV 延迟 -SUV 早期 ) 100/SUV 早期, 其中延迟显像为注射 18 F-FDG 后 2 h, 早期显像为注射 18 F-FDG 后 1 h. 结果发现 : RI 的诊断精确度达到 88%; 胰腺癌患者的 SUV 延迟平均值显著高于 SUV 早期平均值 ; 而且仅在延迟图像中观察到 2 例肝转移 1 例淋巴结转移. 通过研究结果, 可得出结论 : 18 F-FDG PET 延迟显像有助于区分病灶的良恶性, 并且有助于发现更多的转移病灶, 从而有利于正确地实施治疗方案. CT. PET/CT,.

65 1832 ISSN CN /R 研究发现, 在 1 PET/CT: 诊断 II 期胰腺癌方面, 解剖性成像技术 ( 如 CT MRI) 具有较大的优势 ; 但是, 在诊断 III 期 ( 淋巴 结转移 ) 和 IV 期 ( 远处转移 ) 胰腺癌方面, 功能性 ; 显像如 18 F-FDG PET 具有较高的诊断效率 [4].. PET [9] CT 一项临床研究报道, 对 42 例未经过任何治. 疗的胰腺癌患者行 18 F-FDG PET 全身显像, 然后 F - F D G : [ 1 8 F ] 结合临床症状 体征和放射学资料进行肿瘤分 期. 结果表明 : PET 显像的诊断精确度达到 81%; ( 18 F-fluorodeo x y g l u c o s e, 他能发现 7 例患者身上的共 8 处转移灶, 而相应 18 F-FDG). 的 CT 检查结果为阴性. 最后, 依据 PET 显像结果,, 有 5 例患者的临床分期做出相应修改., PET 临床上, 胰腺癌的患者通常发生原位复 发 肝转移和腹膜转移等恶性肿瘤征象, 但是. 很少见有胃转移的病例. Takamori et al [10] 报道 1. 例胰体癌患者 (49 岁, 女性, 行远端胰腺切除术后 合并放疗 ), 通过 18F-FDG 显像, 发现在胃部出现 一高摄取区域, 经组织学诊断确定为胃转移癌. 另一项研究中, 对 31 例胰腺癌术后患者进 行随访 ( 分别进行 18 F-FDG PET 显像和 CT/MRI 扫 描 ), 发现其中 25 例患者出现复发病灶, 18 F-FDG PET 的诊断率为 96%, CT/MRI 的诊断率为 34%. 但是, 研究同时表明, CT/MRI 更有利于发现肝脏 转移病灶, 而 PET 倾向于发现腹部转移病灶和腹 腔外的转移病灶 [11]. 肿瘤的分期情况, 如表 1-2 所示 胰腺癌患者 在手术期间, 如果辅以放射治疗和 ( 或 ) 化学治疗, 有助于提高生存率. 初步研究结果表明, 18 F-FDG PET 显像可以评价肿瘤患者对放 化疗的反应, 并且监控在肿瘤切除部位是否出现复发病灶 [12]. Yoshioka et al [13] 应用 18 F-FDG PET 评价胰腺 癌患者经过动脉灌注化疗结合放疗之后的治疗 疗效. 研究中, 10 例胰腺癌患者 ( 无手术治疗适应 证 ) 在放化疗前后分别进行 CT 检查 ( 显示肿瘤大 小情况 ) 18 F-FDG PET 检查 ( 以 SUV 值评价肿瘤 的生物学活性 ) 以及血清 CA19-9 水平测定. 结果 显示, 18 F-FDG PET 显像能早期 有效地评价肿 瘤患者的治疗疗效, 而且在 18 F-FDG PET 显示肿 瘤部位放射性摄取降低的 2 mo 之后, CT 才检测 出肿瘤病灶缩小 胰腺癌的预 后与该病的分级 分期 肿瘤标志物的水平 早期诊断和及时治疗等因素有关 [14]. 多项研究表 明, 18 F-FDG 在肿瘤部位的摄取变化有利于评价 患者的生存期长短, 是一个良好的预后因素. 表 1 肿瘤 (TNM) 分期 ( 美国癌症联合委员会 ) 分组 Lyshchik et al [15] 对 65 例胰腺癌患者进行双时 相 18 F-FDG PET 显像 ( 分别在注射 18 F-FDG 后 1 h 和 2 h), 并且计算 RI = (SUV 2 h -SUV 1 h )/SUV 1 h. 通 过多因素分析发现, 只有 3 个因素 ( 即女性性别 TNM 分期和 RI 值 ) 与患者的预后有独立相关性. Ⅰ-Ⅲ 期患者伴有 RI>10%, 其生存期显著长于同 分期但 RI<10% 的患者 ( 分别为 15.3 和 11.5 mo); Ⅳ 期患者伴有 RI>10%, 其中位生存期为 9.5 mo; Ⅳ 期患者伴有 RI<10%, 其预后最差, 中位生存期 为 4.9 mo. 标准 表 2 综合分期 另一项临床研究对 118 例胰腺癌患者进行长 期随访 ( 年 ), 分析多个参考因素 ( 包 括 18 F-FDG PET 显像的 SUV 值, TNM 分期标准, 肿瘤分级, 是否患有糖尿病, 年龄, 性别, 血清

66 1833 表 3 PET 与 CT 诊断胰腺癌 PET/ CT CT PET(CT 检查阳性 ) PET(CT 检查阴性 ) PET(CT 检查不明确 ),. CA19-9 水平等 ) 对患者预后的影响. 通过多因素 分析, 结果显示其中三个因素 ( 即肿瘤分期 分 级与 SUV 值 ) 可作为判断患者预后的独立因素 [16]. 1.2 首先用于诊断胰腺癌患者 的显像剂有 DL- 碳 [ 11 C-] 缬氨酸和 DL- 11 C- 色氨酸, 他们能快速聚集在肿瘤病灶处, 并且清除速度 快, 静脉注射这些显像剂后几乎可以立即进行 PET 显像. 之后, 逐渐发展有其他的正电子药物 用于诊断胰腺肿瘤, 诸如 11 C- 蛋氨酸 氮 [ 13 N]-L- 谷氨酸 14 C- 酪氨酸 氧 [ 15 O]- 水 13 N- 氨水 11 C-5- 羟色氨酸 11 C-L-DOPA 18 F-FET [17] 以 及 18 F 镓 [ 67 Ga] 钇 [ 86 Y] 等标记的生长抑素特 异受体等等. 但是, 在临床上应用较多的还是 18 F-FDG PET 显像. 2 其他技术在胰腺癌诊断中的作用及与 PET/CT 的比较 在诊断胰腺癌方面, 主要的诊断技术有 : CT MRI ERCP 超声内镜等. 其中, CT 超声内 镜是首选的临床诊断手段. 2.1 PET, CT, PET/CT 不仅能探测到胰腺肿块, 而 且随着 CT 成像技术的不断发展, 能够清楚地显 示出肿瘤周边血管侵袭和邻近器官组织浸润的 情况. 在一项多中心性研究中 [4], 结果显示 : CT 的 诊断精确度达到 73%; 对非适合手术切除治疗病 例的阳性预测率达到 90%. 然而, 在以下几种情 况中, CT 检查很难做出正确的诊断 : (1) 肿块型胰 腺炎或其他可疑发现 ( 如胰头扩大而不伴有确定 的恶性征象 ); (2) 胰腺癌发生局域性淋巴结转移 ; (3) 小转移病灶 ( 病灶直径小于 1 cm) 和包囊. 同为 解剖型成像技术, MRI 和 MRI 结合 MR 血管造影 可为 CT 检查提供进一步的有用信息, 但是他的 临床应用局限如同 CT [18]. Orlando et al [19] 采用偏位分析法, 比较 PET 与 CT 在诊断胰腺癌上的作用. 患者分别在 CT 检查 结果阳性 阴性和不明确的情况下行 PET 显像, 如表 3 所示. 在另一项研究中, 对 104 例疑似胰腺癌患者 行 PET CT 和 PET/CT 检查, 结果表明 : PET/CT 的诊断精确度达到 96%; 仅通过 PET/CT 发现 2 例 主动脉旁淋巴结转移. PET CT 和 PET/CT 的灵敏度分别是 84.4% 76.6% 和 89.1%. 由此可见, PET/CT 图像融合有助于提高诊断灵敏度 [20]. 2.2 超声内镜能探测到直径为 2-3 mm 的微小病灶. 而且, 在超声内镜的引导下进行病灶活检, 做病理诊断, 可以提高诊断的精确度, 但是该方法的局限性在于活检的范围有限, 并且容易存在取样误差的情况. ERCP 是一种较好的诊断胰腺癌的手段, 其区分良 恶性肿瘤 ( 包括慢性胰腺炎 ) 的精确度可以达到 80%-90%. 但是, ERCP 主要适用于伴有胆管阻塞的胰腺癌患者, 当胰腺肿瘤不是来源于主胆管时, 应用该方法常出现诊断假阴性的情况. 而且, 临床实践表明, 进行该操作时会出现 10% 的失败率, 从而导致医源性胰腺炎. 3 总结及展望总之, PET/CT 能有效显示肿瘤的代谢 增生 乏氧和细胞凋亡状态, 能精确显示解剖结构, 对于肿瘤患者的诊疗指导 肿瘤分期 疗效监控 预后评价等具有十分重要的作用 [21-22]. 18 F-FDG 是目前 PET/CT 显像中最常应用 也最成熟的显像剂. 但是在应用 18 F-FDG 时, 须考虑到以下几方面的问题 : (1) 患者的血糖水平对 18 F-FDG PET 诊断精确度的影响. 高葡萄糖耐量患者和糖尿病患者, 由于血清葡萄糖浓度升高, 通过竞争性抑制的作用导致 18 F-FDG 在肿瘤部位的摄取降低, 从而引起诊断假阴性率提高 SUV 比值降低. 有研究者提出根据患者的血糖水平来校正 SUV 值. 但是, 关于血糖水平对 18 F-FDG PET 诊断精确度的真正影响机制, 还存在一定的争议, 这需要提高临床诊断样本量来进行进一步的研究. (2) 18 F-FDG PET 诊断的假阳性情况. 许多良性炎症病变, 如慢性活动性胰腺炎 ( 伴或不伴有脓肿形成 ) 浆液性囊腺瘤 腹膜后纤维变性 胰腺假瘤 胰腺内分泌肿瘤等等, 均能导致 18 F-FDG 在病灶部位的摄取增加, 出现假阳性的诊断. 因此, 在诊断过程中, 应当结合患者的病史 临床表现 体征和其他的辅助检查来提高诊断的精确度.

67 1834 ISSN CN /R 另外, PET/CT 在诊断胰腺癌方面, 还具有极大的潜在发展空间, 这有赖于研究者开发出具有特异性的 正电子标记的 可在胰腺癌聚集, 12 H. Detection of recurrent pancreatic cancer: c o m p a r i s o n o f F D G - P E T w i t h C T / M R I. Pancreatology 2005; 5: Ruf J, Amthauer H, Oettle H, Steinmuller T, Plotkin M, Pelzer U, Scholman HJ, Felix R, 而不在其他病变组织中聚集的显像剂 ; 结合基 Wust P. Role of F18-FDG PET for monitoring 因诊断技术, 研发能在基因水平上早期诊断胰腺癌的正电子分子探针 ; 并且研发监测胰腺癌治疗疗效的正电子显像剂. of radiochemotherapy--estimation of detectable number of tumour cells. Onkologie 2004; 27: Yoshioka M, Sato T, Furuya T, Shibata S, Andoh H, Asanuma Y, Hatazawa J, Shimosegawa E, Koyama K, Yamamoto Y. Role of positron emission 4 参考文献 tomography with 2-deoxy-2-[ 18 F]fluoro-D-glucose in evaluating the effects of arterial infusion 1 Papos M, Takacs T, Pavics L, Farkas G, Ambrus chemotherapy and radiotherapy on pancreatic E, Szakall S Jr, Lonovics J, Csernay L, Tron L. The cancer. J Gastroenterol 2004; 39: role of FDG-PET scan in the diagnosis of pancreatic 14 van Kouwen MC, Laverman P, van Krieken JH, carcinoma. Orv Hetil 2002; 143: Oyen WJ, Jansen JB, Drenth JP. FDG-PET in the 2 detection of early pancreatic cancer in a BOP 2004; 20: hamster model. Nucl Med Biol 2005; 32: : Michl P, Pauls S, Gress TM. Evidence-based diagnosis and staging of pancreatic cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol 2006; 20: Valk PE, Bailey DL, Townsend DW, Maisey MN. Positron emission tomography, basic science and clinical practice. Springer Press, 2003: Scott CL, Kudaba I, Stewart JM, Hicks RJ, Rischin D. The utility of 2-deoxy-2-[F-18]fluoro-D-glucose positron emission tomography in the investigation of patients with disseminated carcinoma of unknown primary origin. Mol Imaging Biol 2005; 7: Heinrich S, Goerres GW, Schafer M, Sagmeister M, Bauerfeind P, Pestalozzi BC, Hany TF, von Schulthess GK, Clavien PA. Positron emission tomography/computed tomography influences on the management of resectable pancreatic cancer and its cost-effectiveness. Ann Surg 2005; 242: Nishiyama Y, Yamamoto Y, Monden T, Sasakawa Y, Tsutsui K, Wakabayashi H, Ohkawa M. Evaluation of delayed additional FDG PET imaging in patients with pancreatic tumour. Nucl Med Commun 2005; 26: Nishiyama Y, Yamamoto Y, Yokoe K, Monden T, Sasakawa Y, Tsutsui K, Satoh K, Ohkawa M. Contribution of whole body FDG-PET to the detection of distant metastasis in pancreatic cancer. Ann Nucl Med 2005; 19: Takamori H, Kanemitsu K, Tsuji T, Kusano S, Chikamoto A, Okuma T, Iyama K. Metastatic gastric tumor secondary to pancreatic adenocarcinoma. J Gastroenterol 2005; 40: Ruf J, Lopez Hanninen E, Oettle H, Plotkin M, Pelzer U, Stroszczynski C, Felix R, Amthauer 15 Lyshchik A, Higashi T, Nakamoto Y, Fujimoto K, Doi R, Imamura M, Saga T. Dual-phase 18 F-fluoro-2- deoxy-d-glucose positron emission tomography as a prognostic parameter in patients with pancreatic cancer. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2005; 32: Sperti C, Pasquali C, Chierichetti F, Ferronato A, Decet G, Pedrazzoli S. 18-Fluorodeoxyglucose positron emission tomography in predicting survival of patients with pancreatic carcinoma. J Gastrointest Surg 2003; 7: ; discussion Pauleit D, Stoffels G, Schaden W, Hamacher K, Bauer D, Tellmann L, Herzog H, Broer S, Coenen HH, Langen KJ. PET with O-(2-18 F-Fluoroethyl)-L- Tyrosine in peripheral tumors: first clinical results. J Nucl Med 2005; 46: Saisho H, Yamaguchi T. Diagnostic imaging for pancreatic cancer: computed tomography, magnetic resonance imaging, and positron emission tomography. Pancreas 2004; 28: Orlando LA, Kulasingam SL, Matchar DB. Metaanalysis: the detection of pancreatic malignancy with positron emission tomography. Aliment Pharmacol Ther 2004; 20: Lemke AJ, Niehues SM, Hosten N, Amthauer H, Boehmig M, Stroszczynski C, Rohlfing T, Rosewicz S, Felix R. Retrospective digital image fusion of multidetector CT and 18 F-FDG PET: clinical value in pancreatic lesions--a prospective study with 104 patients. J Nucl Med 2004; 45: Ell PJ. PET/CT in oncology: a major technology for cancer care. Chang Gung Med J 2005; 28: Delbeke D, Pinson CW. Pancreatic tumors: role of imaging in the diagnosis, staging, and treatment. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2004; 11: 4-10

68 REVIEW ; 15(16): ISSN CN /R 慢性 HBV 感染的免疫治疗 Immunotherapy for chronic hepatitis B virus infections Xian-Jie Yu, Gui-Qiang Wang Xian-Jie Yu, Laboratory of Virology, Peking University First Hospital, Beijing , China Gui-Qiang Wang, Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing , China Correspondence to: Gui-Qiang Wang, Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing , China. wanggq@hotmail.com Received: Accepted: Abstract The immune system functions to control and clear virus infections. Viral persistence has been closely associated with dysfunctional specific immunity, especially cellular immunity. Current antiviral therapies have been disappointing. Immunotherapies with strategies to boost or restore the virus-specific immune response of patients with chronic hepatitis B virus infection have been proposed for curing persistent infections, and are attracting increasing attention. This review summarizes recent advances in the field of immunology and the immunotherapy of chronic HBV infections, including dendritic, regulatory T and CD8 + T cells, and discusses therapeutic vaccines. Key Words: Chronic hepatitis B virus infection; Immunotherapy; Dendritic cell; Regulatory T cell; CD8 + T cell; Therapeutic vaccine Yu XJ, Wang GQ. Immunotherapy for chronic hepatitis B virus infections. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): HBV. HBV,,. ( HBV HBV HCV HIV) HBV,., T CD8 + T. HBV. 关键词., 0 引言 尽管有效的 HBV 疫苗已经存在 20 多年, 但 HBV 感染所致的慢性肝炎依然是严重危害人类健康 的全球性疾病, 是人类十大死亡原因之一 [1]. 中 国作为 HBV 感染的高发流行区, 慢性 HBV 感染 的危害尤为严重. 因此, 寻求和探索能够有效抑 制或消除 HBV, 减少和防止肝脏失代偿 肝硬 化 肝癌及死亡的治疗方法或药物显得尤为 迫切和重要. 然而, 目前国内外公认的有效抗 HBV 药物 - 干扰素和核苷 ( 酸 ) 类似物, 无法清除 cccdna, 对携带者无效, 只适应于已进展成为 肝炎或存在并发症的患者, 并且前者由于存在 副作用限制其广泛应用, 且有效率仅为 30% 左 右 ; 后者抗病毒作用较强, 但疗效不能持久, 停 药复发率高, 且长期应用经济负担重, 而且还有 耐药性变异问题而影响疗效. 近几年研究表明 H B V 感染的控制和清除有赖于机体的免疫系 统, 其感染慢性化与机体针对 HBV 的特异性免 疫, 尤其是细胞免疫的缺陷或低下相关, 但现有 的抗 HBV 药物无法帮助恢复这种免疫缺陷, 故 而很难清除病毒. 因此, 目前认为增强或恢复机 体针对 HBV 的特异性免疫, 尤其是细胞免疫的 治疗策略能够最终消除 HBV 的慢性感染, 并且

69 1836 ISSN CN /R 这也应该成为未来慢性 HBV 感染治疗的研究焦 HBV 点之一 [2-4]. 免疫治疗策略通过激发和增强机体. 的免疫功能, 以控制和清除病毒, 成为人们从根, 本上征服慢性 HBV 感染的一条希望之路. 此外,. 发现慢性乙型肝炎患者接受 HBV 自愈者的骨髓, 移植后得到治愈, 直接证实了免疫治疗的有效. [2, 性 6]. 因此, 免疫治疗日益受到重视并成为目前研 DC, 究热点. 慢性病毒感染的免疫学基础的不断进 展, 为人们探求有效治疗慢性病毒感染如 HIV. HBV HCV 等提供了新的途径和思路. 本文将 就近几年慢性 HBV 感染的免疫学和免疫治疗研 究进展进行综述. 1 树突状细胞 (DC) 及其介导的免疫治疗 目前 DC 在人类主要分为两大类, MDC(myeloid DC, conventional DC) 和 PDC(plasmacytoid DC). 两者在外周血含量低, 因为现在已经能够在体外 通过细胞因子 ( 主要是 GM-CSF 和 IL-4) 诱导外周 血单核细胞或骨髓干细胞分化来得到数量可观 的 MDC, 对该类细胞的研究更为详尽, 且已经被 用于治疗各种肿瘤和慢性感染性疾病的动物模 型和临床试验中. DC 是目前公认的体内功能最 强的抗原提呈细胞, 也是唯一能够刺激活化初 始性 T 细胞 (naïve T cell) 的抗原提呈细胞. 他功能 众多, 具有很强的可塑性, 能通过膜表面的分子 或分泌的细胞因子直接或间接影响辅助性 T 细 胞 (Th 细胞 ) 的分化, 也是 Th 细胞帮助产生记忆性 CD8 + T 细胞的重要的中间环节 [5]. 其中, PDC, 又 称作 IPC(type 1 interferon-producing cells), 病毒刺 激后能够产生大量的 I 类干扰素, 调节各种免疫 细胞如 NK 细胞 MDC T 细胞 B 细胞的功能, 被认为是天然免疫和特异性免疫的桥梁和抗病 毒天然免疫中最重要的细胞 [7]. 可见, DC 在机体 抗病毒免疫的启动 转归及维持中的重要地位. 因此, 该类细胞在探究慢性病毒感染的免疫机制 和免疫治疗中受到高度重视. 目前国内外已有不少文章报道慢性 HBV 感 染者的 MDC( 或是单核细胞诱导分化的或外周 血中存在 ) 和 PDC 数目减少和功能存在缺陷, 后 者表现为 : 在体外促成熟后某些共刺激分子 ( 如 CD80, CD86) 表达低下, 分泌细胞因子 ( 如 IL-12, TNF-α) 的能力下降, 体外混合淋巴反应功能低 下, 诱导 Th 细胞向 Th1 型细胞分化的能力下降 等 [8-11]. 存在缺陷的 DC 不能有效地呈递抗原或 刺激活化特异性 T 细胞, 进而出现慢性 HBV 感染 中特异性 T 细胞免疫反应低下. 因此, 恢复慢性 HBV 感染者 DC 的功能, 增强其活化特异性细胞免疫的能力, 则有望纠正慢性 HBV 感染中的免疫低下, 有助于清除 HBV. 我们和其他课题组都发现改善慢性 HBV 患者 DC 功能能够增强 HBV 特异性细胞反应 [12-13]. 然而 DC 功能低下的原因目前并不清楚, 但已基本明确 DC 不支持 HBV 的复制 [14], 这也为 DC 免疫治疗的安全性提供了保障. 需要指出的是, DC 功能缺陷究竞是病毒感染所致的结果还是导致病毒持续感染的原因至今仍不清楚, 有待于进一步研究. 此外, DC 功能低下在导致免疫功能低下中的作用也存在争议 [3]. 研究 DC 介导的慢性 HBV 感染的免疫治疗是基于两点 : 一是慢性 HBV 感染中 DC 存在功能的低下, 可能是 HBV 感染慢性化的原因之一, 需要恢复 DC 功能 ; 二是 DC 独特而又强大的免疫学功能使其成为良好的免疫学疫苗. 体外通过细胞因子 GM-CSF 和 IL-4 诱导外周血单核细胞或骨髓干细胞分化为 DC, 加入相关抗原和促成熟剂 ( 或免疫佐剂 ) 后, 回输入体内治疗 HIV 的动物实验和临床研究在国外已有很多报道, 已发现此方法能够诱导机体产生有效抑制 HIV 的特异性 T 细胞反应, 并证实了 DC 临床治疗的安全性和可行性 [15]. DC 治疗 HBV 感染的动物实验已有报道, 但关于其在临床上的研究国外尚无报道. 我国学者任红 et al [22] 在 2005 年报道, 用 HBsAg 负载的 DC 治疗 19 例慢性乙型肝炎患者, 发现能够有效抑制病毒复制, 但其结论有待于更大样本的临床试验进一步证实. 然而, 我们可以从 DC 治疗在 HIV 的临床试验和 HBV 的动物模型研究中总结经验, 指导未来人类慢性 HBV 感染的 DC 治疗. 其中尤值得一提的是 DC 治疗在 HIV 感染者中的研究. Lu et al [15] 在 2004 年首次报道灭活 HIV 负载的 DC 在 18 例 HIV 患者中的应用, 发现病毒载量在第 112 天下降 80%, 其中 8 例患者在 1 a 内病毒载量下降 90%, 剩余 10 例则只表现出一过性微弱反应. 病毒载量的下降与外周血中能够分泌 IL-2 和 IFN-γ 的 CD4 + T 细胞和表达穿孔素的特异性 CD8 + T 细胞的数目增加呈正相关. 这与 Kundu et al [16] 应用重组 HIV-1 蛋白抗原和抗原肽负载 DC 对病毒载量无影响的报道截然不同. 作者分析认为可能是灭活病毒的抗原性优于重组蛋白和抗原肽的原因. 但在最近的两个相关报道中, DC 的治疗效果却令人不甚满意. 其中, Garcia et al [17] 对接受 HAART 治疗的 12 例 HIV 患者中应用热灭活 HIV 负载的 DC( 皮下注射 ), 发现仅能够激发弱的

70 1837 Th1 和 HIV 特异性的 CD8 + T 细胞反应, 一过性地部分控制 HIV 的复制. 近年来 Ide et al [18] 用 TNF 和 HIV 表位相关的 7 个抗原肽负载 DC 治疗 4 例接受 1 年 HAART 治疗的男性患者, 发现只有 2 例患者能检测到比较局限的分泌 IFN-r 的 CD8 + T 细胞. 可见目前 DC 介导的免疫治疗在 HIV 感染中疗效的不确定性, 可能与选取的患者的疾病进展程度 应用 DC 的数量和成熟度 抗原的选取等因素的不同有关. 因此, 有待于设计更为完善的大样本的临床试验研究来进一步证实. DC 介导的免疫治疗在 HBV 转基因小鼠中有诸多报道. 其中, 美国学者 Shimizu et al [19] 发现, 回输活化的 DC 能够打破 HBV 转基因小鼠体内的免疫耐受, 诱发抗原特异性 CTL 反应, 但不能抑制病毒基因的表达和病毒复制. 日本学者 Akbar et al [20] 却发现只有回输 HBsAg 负载的 DC 才能使 HBV 转基因小鼠的表面抗原转阴, 产生抗体. 这些研究初步显示了 DC 在 HBV 转基因小鼠中的有效性, 为 DC 介导的免疫治疗在人 HBV 的感染中的应用做好铺垫, 但有待于进一步的研究. 此外, 德国学者陆蒙吉等也在土拨鼠肝炎动物模型中对 DC 的免疫治疗进行了多方面的探索. DC 介导的免疫治疗是个非常复杂的过程, DC 制备必须个体化, 其有效性受到以下因素的制约 : DC 的种类和质量 抗原负载的方式 剂量和输入途径以及患者的选择等 [21]. 但我们可以初步推测 : 灭活病毒优于抗原肽或重组蛋白, 成熟的 DC 优于非成熟 DC, 促成熟剂中混合细胞因子 (IL-1 IL-6 TNF CD40L) 优于其他细胞因子. 总之, DC 免疫治疗依然处于早期阶段, 需要进行更多的基础研究和临床试验来获得最佳优化的 DC 治疗方案. 2 慢性 HBV 感染中的 CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞 CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞在 70 年代早期最初被称作抑制性 T 细胞. 近几年研究表明, 慢性 HBV 感染者外周血和肝脏中的调节性 T 细胞数目增多, 在体外能够抑制 HBV 特异性 T 细胞的增殖, 祛除这些细胞能够增强特异性反应. 因此, 认为 CD4 + CD25 + 调节性 T 细胞参与慢性 HBV 感染中的免疫耐受, 是病毒持续感染的原因之一 [23-25]. 减少这些调节性细胞的数目或下调其功能有望打破机体对病毒的免疫耐受, 有利于病毒的清除, 是慢性 HBV 感染免疫治疗的一条新思路, 值得探讨和研究. 目前, 关于调节性 T 细胞的免疫治疗在肿瘤中的研究较为详尽并已显示出了 良好的前景, 如去除调节性 T 细胞的 CD25 抗体 已在小鼠肿瘤模型中显示出强大的抗肿瘤效 应, 在疫苗治疗前祛除肾癌患者的调节性 T 细胞 能够使特异性 T 细胞增加 100 倍 [26], 但其在治疗 HBV 感染中的研究尚未见报道. 3 抗原特异性 CD8 + T 细胞 CD8 + T 细胞是免疫系统控制和清除 HBV 感染的 中心环节, 其反应低下或处于 exhausted 状 态与感染慢性化直接密切相关, 目前机制不明 确, 但已经证实这种功能低下是可以逆转的, 因 而通过重塑这些 CD8 + T 细胞的功能以控制病毒 感染是可行的. 因此, 直接向患者体内回输体外 扩增的功能正常的特异性 T 细胞的过继性免疫 治疗是个很值得探索的领域. 已发现给骨髓移 植患者输入体外扩增的 CMV 特异性 CTL 细胞, 能 够有效控制 CMV 的复制 [27]. 该免疫策略在慢性 HBV 感染中的应用已在进行中. 新近 Daniel et al [28] 在淋巴细胞脉络丛脑膜 炎病毒 (LCMV) 小鼠模型中发现慢性感染中的 exhausted 的抗原特异性的 CD8 + T 细胞始 终选择性地高表达 PD-1, 阻断 PD-1/PDL-1 途径 能够逆转 T 细胞的功能并使病毒载量明显下降. 这一发现为人类慢性病毒感染的治疗提供了崭 新而又充满希望的思路 [29-30]. 随后陆续有报道发 现 HIV 感染中的特异性 CD8 + T 细胞同样高表达 PD-1, 在体外阻断 PD-1/PDL-1 途径能够使特异 性 T 细胞反应明显增强, 相应的抗 H I V 药物已 在研发中 [31-33]. 美国学者 Isogawa et al [34] 也发现 HBV 转基因小鼠中的特异性 CD8 + T 细胞 IFN 分 泌降低的同时伴随 PD-1 表达升高. 急性 HBV 感 染过程中, HBV 特性型 CD8 + T 细胞的体外扩增 能力在清除期的升高伴随 PD-1 表达下调 [35]. 关 于人慢性 HBV 感染中的抗原特异性 CD8 + T 细胞 与 PD-1 的关系目前正在研究中, 相信很快就有 结果, 并将会为 HBV 治疗提供很好的启示. 4 治疗性疫苗 治疗性疫苗, 与预防性疫苗完全不同, 是以增强 和扩大机体内已经存在的特异性免疫为目的免 疫策略. 他起源于预防性狂犬病疫苗能够使狂 犬病感染者的病症减轻和发作时间延缓, 现在 已被人们广泛用于尝试治疗目前用药物不能清 除的慢性病毒感染, 如 HIV HPV 和 HBV. 他的 理论基础是病毒感染的慢性化是因为机体的免 疫系统不能有效控制病毒或出于不合适的免疫,, HBV,.

71 1838 ISSN CN /R 耐受状态 [36]. 尽管疫苗用于治疗这些感染性疾病 的合理性存在争议 [36], 但不少临床研究报道已初 步提示他们在慢性感染性疾病中可能的有效性., HIV 鉴于 HBV 预防性疫苗的成功应用, 治疗性 疫苗的探索也是从应用这类单纯表面抗原疫苗, HBV 开始的, 并已显示出了一定的有效性, 但远不尽, 人意 [4]. 因此, 为了增强免疫效果, 表面抗原疫苗. 联合应用佐剂或免疫调节因子, 如 IL-2, IL-12, GM-CSF, CpG 等的研究正在进行中. 疫苗与抗病 毒药物联合应用 表面抗原与表面抗体的复合 物的应用也是研究热点. 这些联合应用是目前 疫苗免疫策略研究的主要方向. 其中疫苗联合 抗病毒药物的临床研究已有报道. Dahmen et al [37] 发现皮下注射乙肝疫苗加拉米夫定治疗 14 例慢 乙肝患者中有 9 例患者出现病毒清除. 在 Horiike et al [38] 的研究中, 拉米夫定与疫苗联合组中有 9 例患者出现 DNA 阴转, 联合组 e 抗原转换明显高 于单纯拉米夫定组, 显示出联合治疗的优越性. Helvaci et al [39] 在一项 interferon-alpha-2b 治疗儿 童慢性乙肝的临床对照研究中发现加用疫苗能 降低血清病毒载量, 但不能维持. 相比蛋白疫苗, DNA 疫苗具有许多优点, 如 能够同时激活体液和细胞免疫 因本身含有天 然佐剂如 CpG 等有利于 Th1 型细胞反应 由于 需要在胞内从头合成抗原能如灭活病毒疫苗一 样激发 CTL 反应, 因而也倍受研究者青睐. 其中, Mancini et al [40] 2004 年首次报道 DNA 疫苗 (pres2 +S) 在慢性 HBV 感染 (11 例常规治疗无效的慢性 HBV 携带者 ) 中的研究, 结果发现有 5 例患者出现 病毒 DNA 量一过性下降, 大部分患者仅出现一 过性特异性分泌 IFN-γ 的 T 细胞反应. 目前其他 能够同时编码表面抗原和其他免疫调节分子如 IL-12 的 DNA 疫苗的临床研究正在进行中 [2]. 各种治疗性疫苗的安全性和耐受性在治疗 HBV 感染中得到证实, 并能在某种程度上增强 机体针对 HBV 的特异性反应, 有助于降低 HBV 复制, 但疗效不甚满意, 大多维持时间不长, 表 现为一过性, 且在病毒载量高时, 疗效不显著. 因此, 该免疫策略有待于进一步探讨, 关键在于 疫苗的设计. 更加有效的疫苗免疫策略应该尽 量包含有助于清除病毒的抗原 增大剂量 含 有能够有效活化天然免疫和后天免疫系统的佐 剂或免疫调节剂 与抗病毒治疗联合应用 选 择合适的患者 ( 病毒载量最好不要太高 ) [2, 36]. 细胞因子 IL-12 能够刺激活化 NK 细胞, 促 进 Th1 型细胞反应, 增强 CD8 + T 细胞功能, 在细 胞免疫中起重要作用. 已发现 I L-12 能够通过 诱导细胞产生 IFN-γ 完全抑制 HBV 转基因小鼠 肝内的病毒复制 [41], 并在体外能够恢复慢乙肝 患者特异性 T 细胞的功能 [42-43]. 在临床研究中, Rigopoulou et al [44] 联合应用重组 IL-12 和拉米夫 定治疗 15 例慢性乙型肝炎患者, 发现 IL-12 能够 增强 HBV 特异性 Th1 细胞的反应, 提高 IFN-r 的 生成, 更明显抑制病毒复制, 但中断拉米夫定, 病毒载量会缓慢升高. 总之, 免疫治疗是被人们寄予厚望能够终 止病毒慢性感染的一种治疗策略, 也正在从各 个方面进行研究, 并已得到了一些可靠结论, 显 示出某些免疫治疗的可行性和有效性, 但目前 尚无大的突破, 依然处于探索阶段. 然而, 我们相 信随着免疫学的不断进展和病毒感染慢性化机 制的不断揭示, 最终能够寻求到有效的免疫治 疗策略, 消除 HBV HIV 等慢性病毒感染. 5 参考文献 1 Mailliard ME, Gollan JL. Emerging therapeutics for chronic hepatitis B. Annu Rev Med 2006; 57: Hui CK, Lau GK. Immune system and hepatitis B virus infection. J Clin Virol 2005; 34 Suppl 1: S44-S48 3 Bertoletti A, Gehring AJ. The immune response during hepatitis B virus infection. J Gen Virol 2006; 87: Michel ML, Mancini-Bourgine M. Therapeutic vaccination against chronic hepatitis B virus infection. J Clin Virol 2005; 34 Suppl 1: S108-S114 5 Castellino F, Germain RN. Cooperation between CD4+ and CD8+ T cells: when, where, and how. Annu Rev Immunol 2006; 24: Lau GK, Suri D, Liang R, Rigopoulou EI, Thomas MG, Mullerova I, Nanji A, Yuen ST, Williams R, Naoumov NV. Resolution of chronic hepatitis B and anti-hbs seroconversion in humans by adoptive transfer of immunity to hepatitis B core antigen. Gastroenterology 2002; 122: Liu YJ. IPC: professional type 1 interferonproducing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu Rev Immunol 2005; 23: van der Molen RG, Sprengers D, Binda RS, de Jong EC, Niesters HG, Kusters JG, Kwekkeboom J, Janssen HL. Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendritic cells of patients with chronic hepatitis B. Hepatology 2004; 40: Duan XZ, Zhuang H, Wang M, Li HW, Liu JC, Wang FS. Decreased numbers and impaired function of circulating dendritic cell subsets in patients with chronic hepatitis B infection (R2). J Gastroenterol Hepatol 2005; 20: Zheng BJ, Zhou J, Qu D, Siu KL, Lam TW, Lo HY, Lee SS, Wen YM. Selective functional deficit in dendritic cell--t cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection. J Viral Hepat 2004; 11: Beckebaum S, Cicinnati VR, Zhang X, Ferencik S, Frilling A, Grosse-Wilde H, Broelsch CE, Gerken

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73 1840 ISSN CN /R HBV,,,. In vivo immunization by vaccine therapy following virus suppression by lamivudine: a novel approach for treating patients with chronic hepatitis B. J Clin Virol 2005; 32: Helvaci M, Kizilgunesler A, Kasirga E, Ozbal E, Kuzu M, Sozen G. Efficacy of hepatitis B vaccination and interferon-alpha-2b combination therapy versus interferon-alpha-2b monotherapy in children with chronic hepatitis B. J Gastroenterol Hepatol 2004; 19: Mancini-Bourgine M, Fontaine H, Scott-Algara D, Pol S, Brechot C, Michel ML. Induction or expansion of T-cell responses by a hepatitis B DNA vaccine administered to chronic HBV carriers. Hepatology 2004; 40: C a v a n a u g h V J, G u i d o t t i L G, C h i s a r i F V. Interleukin-12 inhibits hepatitis B virus replication in transgenic mice. J Virol 1997; 71: Suri D, Schilling R, Lopes AR, Mullerova I, Colucci G, Williams R, Naoumov NV. Non-cytolytic inhibition of hepatitis B virus replication in human hepatocytes. J Hepatol 2001; 35: Lohr HF, Pingel S, Bocher WO, Bernhard H, Herzog-Hauff S, Rose-John S, Galle PR. Reduced virus specific T helper cell induction by autologous dendritic cells in patients with chronic hepatitis B - restoration by exogenous interleukin-12. Clin Exp Immunol 2002; 130: Rigopoulou EI, Suri D, Chokshi S, Mullerova I, Rice S, Tedder RS, Williams R, Naoumov NV. Lamivudine plus interleukin-12 combination therapy in chronic hepatitis B: antiviral and immunological activity. Hepatology 2005; 42: ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯为提高我国消化内镜诊疗技术的整体水平, 中华消化内镜杂志 编辑部拟于 在新疆乌鲁木 齐市召开 全国消化及消化内镜诊断与治疗进展学术研讨会, 邀请消化和消化内镜专家作有关专题学术报 告. 会议将出论文汇编, 并授予继续教育 Ⅰ 类学分, 中华消化内镜杂志 将择优刊登应征论文. 1 征文内容征文内容包括消化系统疾病的内镜 ( 食管镜 胃镜 十二指肠镜 小肠镜 大肠镜 肠道镜 腹腔镜 超声内镜等 ) 诊疗技术 ; 内镜外科的临床应用及进展 ; 食管 胃 肠 肝胆 胰腺疾病的基础研究 临床诊治及其进展 ( 炎症 溃疡 出血 肿瘤 异物等 ); 消化系统疾病的中医 中西医结合治疗及其进展 ; 消化内镜消毒及护理技术, 消化系统疾病的急诊护理. 2 征文要求应征文章按 中华消化内镜杂志 稿约要求撰写打印, 并寄 3000 字以内全文及 500 字以内的论文摘要各一份 ; 已投 中华消化内镜杂志 尚未发表的稿件, 请注明稿号. 应征文章经单位推荐盖公章后, 寄南京市紫竹林 3 号 中华消化内镜杂志 编辑部卜小乐 赵在文同志收. 邮编 : 信封左下脚注 征文 字样, 同时汇寄审稿费 10 元. 请自留底稿, 恕不退稿. 截稿日期 有关会议的具体事项另行通知. 联系电话 : ,

74 REVIEW ; 15(16): ISSN CN /R 胶囊内镜在小肠 Crohn 病的应用. Video capsule endoscopy for diagnosis of small bowel Crohn s disease Jian Wang, Hong Jia Jian Wang, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou , Sichuan, China Hong Jia, Department of Public Health, Luzhou Medical College, Luzhou , Sichuan, China Correspondence to: Jian Wang, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou , Sichuan Province, China. sdwangjian888@yahoo.com.cn Received: Accepted: Abstract Small bowel Crohn s disease is a segmental transmural inflammatory disease of the intestinal tract. Its etiological factors remain unclear, clinical manifestations are variegated and histological changes show no distinctive features. Therefore, it is easily misdiagnosed. Video capsule endoscopy can play an important role in the diagnosis of small bowel Crohn s disease. In this paper, we review the rationale for clinical application and discuss other problems and potential utilities in the diagnosis of small bowel Crohn s disease. Key Words: Video capsule endoscopy; Small bowel Crohn s disease; Disease of the digestive tract Wang J, Jia H. Video capsule endoscopy for diagnosis of small bowel Crohn s disease. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): Crohn,,,,. Crohn,. Crohn Crohn,,. Crohn, 关键词,., 0 引言 Crohn 病是一种与免疫异常 遗传 感染等多 Crohn, 种因素有关的非特异性炎症性疾病, 多发生于 小肠和结肠, 不少临床症状也见于肠结核和溃. 疡性结肠炎等其他炎症性肠病, 诊断和鉴别诊 断都较困难, 术前误诊率高. Crohn 可累及胃肠道 各部位, 其中小肠约占 30%-40% [1]. 近年来有大 量文献报道在全世界范围内小肠 Crohn 病发病 率有明显升高的趋势. 小肠是消化道最长的器 官, 由于其解剖和生理的特殊性, 传统的各种检 查手段因敏感性和准确性较低, 很难对其作出 明确诊断. 因此, 广大临床工作者迫切寻求一种 可获得全小肠图像 无创 诊断阳性率高的新 型检查方法. 胶囊内镜的问世革命性地填补了 这一领域的空白. 1 胶囊内镜简述 胶囊内镜 (capsule endoscopy, CE) 又名无线胶囊 内镜 (wireless capsule endoscopy, WCE), 为一种直 观 全面 准确 简便 安全和无痛的检查小 肠疾病的新方法 由以色列 Given 影像公 司生产并且正式面世, 并于 获 FDA 认证, 准许运用于临床 [2] 重庆金山科技集团公 司自主研发的 OMOM 胶囊内镜正式投放市场, 并且在多家综合性医院应用, 效果等同于进口产 品, 虽体积稍大但具有价格优势. 胶囊内镜实际 是一台微型的摄像机, 外面包裹生物兼容性塑料 制成的外壳, 因为胶囊内镜体积小, 易吞入, 吞入 后借助消化道自身的蠕动能力通过全消化道, 整

75 1842 ISSN CN /R 个检查过程无痛苦, 而且患者无需住院, 不影响 (CE) 日常活动, 因此胶囊内镜自从问世以来, 在临床 上迅速推广, 尤其是在胃肠道出血 小肠 Crohn. 病 小肠肿瘤的诊断方面应用广泛 [3]. CE Crohn 2 目前研究及优势, CT X. 胶囊内镜的面世时间虽短, 但是据不完全统计, CE Crohn 全球检查人数已逾 例, 尤其在西方发达 国家中已经广泛使用 [4]. 我国已有部分医院引 - 进了胶囊内镜, 并且也有不少研究论著发表., Marmo et al [5] 开展了一项胶囊内镜和钡剂灌肠 CE. 在小肠 Crohn 病方面诊断的评价研究. 本次研究 的 31 例患者 ( 男 20 例 ; 平均年龄 43 岁 ) 均已经被组 织学证明为 Crohn 病. 采取单盲的方法分别评价 两种检查方法. 放射学者运用小肠灌肠在 31 例 患者中确诊 8 例患者, 胃肠医生使用胶囊内镜在 31 例患者中确诊 22 例 (25.8% vs 71%, P <0.05). 在 已知回肠末端被累及的 16 例患者中, 胶囊内镜 和小肠灌肠的诊断阳性发现率为 (89% vs 37%, P <0.05). 在回肠末端未被累及的 15 例患者中, 胶 囊内镜发现有 7 例患者 (46%) 在小肠近侧端有病 变, 而在小肠灌肠中只发现 2 例患者 (13%). 胶囊 内镜还发现了 45% 的病例中小肠灌肠未发现的 其他损害. 我们认为胶囊内镜可能是用于没有 狭窄和瘘管的小肠 Crohn 病诊断的新标准. Fireman et al [6] 评估胶囊内镜对采用传统方 法未能明确的小肠可疑 Crohn 病患者的诊断效 果. 其中符合录入标准的 17 例患者 ( 男 8 例, 平均 年龄 40 岁 ) 完成了研究. 17 例患者诊断前的平均 症状持续时间为 (6.3±2.2) 年, 其中 9 例患者为 缺铁性贫血 ( 平均血红蛋白 10.5±1.8 g/l),8 例腹 痛, 7 例腹泻, 3 例伴有体质量下降. 以上病例采 用小肠和胃肠内镜所见正常. 每个受试者均吞 下一个 MZA Given Capsule, 记录时间大约为 8 h, 17 例患者所吞胶囊内镜均随胃肠道运动自然排 出体外. 结果根据 MZA Given Capsule 的发现 17 例患者中 12 例 (70.6%) 被诊断患有小肠 Crohn, 5 例 (29.4%) 患者没有阳性发现. 证明胶囊内镜为 一种有效可行的方法, 可用于对传统诊断方法 检查未能明确的可疑 Crohn 病患者诊断. Gezz et al [7] 在传统检查方法未被发现却高度怀疑小 肠 Crohn 病患者中开展无线胶囊内镜检查效力 评估. 根据录入标准共选择了 20 例患者, 这些患 者都具有腹痛 腹泻 发热 体质量减轻 缺 铁性贫血和潜血实验阳性等临床表现. 20 例患 者均顺利完成了胶囊内镜检查, 结果显示 13 例 (65%) 患者被诊断为小肠 Crohn 病, 病变主要累及小肠远侧端. 病变表现为黏膜性侵蚀 (2 例 ), 小溃疡 (5 例 ), 结节样淋巴增生 (1 例 ), 较大溃疡 (2 例 ) 和肠腔狭窄 (3 例 ). 认为胶囊内镜在可疑小肠 Crohn 病患者中可早期发现小肠病变. Hara et al [8] 在怀疑患有小肠 Crohn 病患者中开展 4 种小肠诊断技术, 评价其诊断效果. 四种小肠诊断技术分别为 CT, 结肠镜, 全小肠钡剂造影 (SBFT) 和胶囊内镜. 共有 20 例患者登记, 但是只有 17 例患者 ( 男 8 例, 平均年龄 49 岁 ) 完成了本项研究. CT 确诊 9 例 (53%) 为小肠 Crohn 病, 结肠镜确诊 11 例 (65%), SBFT 确诊 4 例 (24%), 胶囊内镜确诊 12 例 (71%). 这项研究中胶囊内镜的诊断阳性率最高, SBFT 的诊断阳性率最低, 这种差异虽然经过统计学处理以后无意义, 但是我们仍能看到胶囊内镜在诊断小肠 Crohn 病方面的优势. 在一项评价胶囊内镜对小肠 Crohn 病诊断价值的研究中, Herrerias et al [9] 共选择了 21 例患者进行胶囊内镜检查, 这 21 例患者 ( 男 14 例, 女 7 例, 平均年龄 43 岁 ), 被高度怀疑为 Crohn 病, 但是采用传统的检查方法均无阳性发现. 胶囊内镜的检查结果是 12 例 (57%) 未有阳性发现, 在另外的 9 例 (43%) 患者中发现支持 Crohn 病的影像学改变. 病变主要累及回肠末端, 其中 1 个患者十二指肠远端受累. 胶囊内镜采集图片主要改变为阿弗他溃疡, 这些溃疡多位于肠壁的肠系膜缘, 可融合成匍行或者线行溃疡. 这项研究结论是胶囊内镜可以成为小肠 Crohn 病有价值的诊断工具. Leighton et al [10] 在安装心脏起搏器的患者中开展胶囊内镜检查的安全性评估. 共有 5 例患者 ( 男 4 例, 女 1 例, 平均年龄 73 岁 ), 进行了检查. 在进行胶囊内镜检查的过程中, 由 1 位心脏疾病专家和 1 位护士对心脏起搏器进行监测和评估, 在整个检查过程中没有发现心脏节律不齐和不利于心脏的事件发生. 胶囊内镜传出图像也未受到起搏器的干扰. 在装有起搏器的患者中进行胶囊内镜检查毫无疑问是安全的. 小肠 Crohn 病目前诊断的依据主要是临床表现 影像学表现和内镜检查. 常用的检查方法有 X 线钡剂检查 CT MRI 小肠镜 胶囊内镜. X 线钡剂检查往往是诊断小肠 Crohn 病和判断疾病累及范围的首选方法, 但是其检查结果的可靠性有一定程度取决于放射学者的操作水平和工作经验. CT MRI 虽然采取了一些新的方法来诊断小肠 Crohn 病, 但是检测黏膜的变化阳性率不及 X 线钡剂检查 [11], 只是在诊断小肠

76 1843 表 1 胶囊内镜并发症的文献调研 第一作者 n 嵌顿手术取出其他 Crohn 病严重并发症方面优于钡剂检查. 最新型 的双气囊小肠镜可以直观获得肠内图像 [12], 并进 行活检. 但是整个检查过程耗时长 (78±10 min), 通常需要麻醉和镇静, 患者痛苦较大, 并有出血 和穿孔的危险性. 小肠 Crohn 病早期仅有黏膜炎 症表现和扁平的或轻度的微隆起病灶, 这正是 传统检查方法的盲区. 而胶囊内镜对经传统方 法未能检出的疑似小肠 Crohn 病具有较高的检 出率, 尤其是对疾病早期和对轻型患者的诊断 具有明显优越性. 虽然目前胶囊内镜的检查费 用偏高, 但是他对于早期 Crohn 病有着良好的诊 断效果, 可以使患者得到及时的治疗, 避免并发 症的出现. 因此胶囊内镜的成本 - 效果分析 (costeffectiveness analysis, CEA) 优于其他检查手段. 3 并发症和存在问题 目前, 胶囊内镜最主要的并发症就是胶囊嵌顿, 绝大多数患者最终都需要手术取出. 尤其是在 明确 Crohn 病的患者中, 目前 Crohn 病在无严重 并发症时属于手术禁忌症, 因此一旦发生嵌顿 是一个比较棘手的问题. 现将目前有关胶囊内 镜并发症的文献进行总结 ( 表 1) [13-17]. 胶囊内镜 是安全的, 但是存在着一些不稳定的因素, 小肠 狭窄是胶囊内镜并发症的重要诱因, 在进行胶 囊内镜检查前最好进行小肠钡餐检查, 对小肠 的狭窄程度进行严格的评估, 以降低胶囊内镜 的风险. 胶囊内镜检查全过程, 要密切注意大便 情况, 了解胶囊内镜排出情况, 必要时可以进行 X 线检查, 但是胶囊内镜在排出体外之前禁止进 行核磁共振检查. 当前对于胶囊内镜的研究也 存在着一定局限性, 这些研究在病例入选时, 就 存在着选择性偏移, 而且样本量不大, 我们还需 要设计合理 评测严格的大样本研究来进一步 探讨胶囊内镜的应用. 胶囊内镜的发射器在工作中不断向体外发 射无线信号, 由于胶囊内镜的信号与日常生活 中的电磁信号不一致, 互相干扰很少, 但是胶囊 内镜之间干扰很明显 [18], 在相距 3 m 以内两个胶 囊内镜的信号可以互相接受, 而且计算机在处 理时不易区分, 因此在同一时间和同一地点不 能同时进行两个人以上的胶囊内镜检查. 胶囊 内镜的图象还不是很清晰, 有待于改进. 而且不 能进行活检和内镜下治疗是其缺点. 4 创新性 胶囊内镜在小肠 Crohn 病早期诊断方面的优势 是不容置疑的, 但是胶囊内镜的稳定性有待 进一步的提高 [19], 现在已经有多种新型的胶囊 内镜问世. 一种可以推进胶囊内镜在小肠内向 前或向后运动的电子装置已经用于动物实验, 该小组已经发明了各种可以供胶囊附着和回 收的装置. 目前, 又有一种新型的 开放式胶 囊 问世, 这种胶囊配备有电频尾随监视器, 并且能被吞咽下. 如果这种胶囊在狭窄处嵌 顿, 信号仍会被传送, 但是如果该胶囊滞留超 过 24 h 或 4 d( 分别为 2 种型号 ), 他即开始自动 溶解 [20]. 相信随着胶囊内镜的不断完善, 将在 临床上日益普及, 并且具有广泛的应用前景. 5 参考文献 1 Delaney CP, Fazio VW. Crohn's disease of the small bowel. Surg Clin North Am 2001; 81: Meron GD. The development of the swallowable video capsule (M2A). Gastrointest Endosc 2000; 52: Kubota K, Nakamura T, Terano A. Capsule endoscopy. Nippon Geka Gakkai Zasshi 2005; 106: Swain P. Wireless capsule endoscopy and Crohn's disease. Gut 2005; 54: Marmo R, Rotondano G, Piscopo R, Bianco MA, Siani A, Catalano O, Cipolletta L. Capsule endoscopy versus enteroclysis in the detection of small-bowel involvement in Crohn's disease: a prospective trial. Clin Gastroenterol Hepatol 2005; 3: Fireman Z, Mahajna E, Broide E, Shapiro M, Fich L, Sternberg A, Kopelman Y, Scapa E. Diagnosing small bowel Crohn's disease with wireless capsule endoscopy. Gut 2003; 52: Ge ZZ, Hu YB, Xiao SD. Capsule endoscopy in diagnosis of small bowel Crohn's disease. World J Crohn,.. [16] Crohn,.

77 1844 ISSN CN /R Gastroenterol 2004; 10: Crohn, 8 Hara AK, Leighton JA, Heigh RI, Sharma VK, Silva AC, De Petris G, Hentz JG, Fleischer DE. Crohn disease of the small bowel: preliminary comparison among CT enterography, capsule endoscopy, smallbowel follow-through, and ileoscopy. Radiology. 2006; 238: Herrerias JM, Caunedo A, Rodriguez-Tellez M, Pellicer F, Herrerias JM Jr. Capsule endoscopy in patients with suspected Crohn's disease and negative endoscopy. Endoscopy 2003; 35: Leighton JA, Srivathsan K, Carey EJ, Sharma VK, Heigh RI, Post JK, Erickson PJ, Robinson SR, Bazzell JL, Fleischer DE. Safety of wireless capsule endoscopy in patients with implantable cardiac defibrillators. Am J Gastroenterol 2005; 100: Mako EK, Mester AR, Tarjan Z, Karlinger K, Toth G. Enteroclysis and spiral CT examination in diagnosis and evaluation of small bowel Crohn's disease. Eur J Radiol 2000; 35: May A, Nachbar L, Wardak A, Yamamoto H, Ell C. Double-balloon enteroscopy: preliminary experience in patients with obscure gastrointestinal bleeding or chronic abdominal pain. Endoscopy 2003; 35: Enns R, Go K, Chang H, Pluta K. Capsule endoscopy: a single-centre experience with the first 226 capsules. Can J Gastroenterol 2004; 18: Fireman Z, Eliakim R, Adler S, Scapa E. Capsule endoscopy in real life: a four-centre experience of 160 consecutive patients in Israel. Eur J Gastroenterol Hepatol 2004; 16: Fidder HH, Nadler M, Lahat A, Lahav M, Bardan E, Avidan B, Bar-Meir S. The utility of capsule endoscopy in the diagnosis of Crohn's disease based on patient's symptoms. J Clin Gastroenterol 2007; 41: Delvaux M, Fassler I, Gay G. Clinical usefulness of the endoscopic video capsule as the initial intestinal investigation in patients with obscure digestive bleeding: validation of a diagnostic strategy based on the patient outcome after 12 months. Endoscopy 2004; 36: Buchman AL, Miller FH, Wallin A, Chowdhry AA, Ahn C. Videocapsule endoscopy versus barium contrast studies for the diagnosis of Crohn's disease recurrence involving the small intestine. Am J Gastroenterol 2004; 99: ; 12: Jonnalagadda S, Prakash C. Intestinal strictures can impede wireless capsule enteroscopy. Gastrointest Endosc 2003; 57: Delvaux M, Ben Soussan E, Laurent V, Lerebours E, Gay G. Clinical evaluation of the use of the M2A patency capsule system before a capsule endoscopy procedure, in patients with known or suspected intestinal stenosis. Endoscopy 2005; 37: ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯 根据 中国学术期刊综合评价数据库 (CAJCED) 2005 年 6182 种统计刊源析出的 214 万条中国期刊引文数据库及 CNKI 中国期刊网 中心网站 /12 全文下载记录 (1.5 亿篇次 ) 的大样本数据统计分析得到 : 世界华人消化杂志 [ 标准刊号 : ISSN CN /R; 类目名称 : 医药科学 \ 临床科学 \ 呼吸及消化系统疾病 (YK5.2.3)] 总被引频次为 2471, 影响因子为 0.661, 5 年影响因子为 0.644, 即年指标为 0.079, 他引总引比为 0.73, 被引期刊数为 491, 被引半衰期为 4.6, 2005 载文量为 768, 基金论文比为 0.44, Web 即年下载率为 0.6. [ 中国学术期刊 ( 光盘版 ) 电子杂志社 ; 中国科学文献计量评价研究中心 ].

78 ; 15(16): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION 通腑颗粒改善犬缺血再灌注状态下实施肠内营养时的小肠功能 symptoms of diarrhea and vomiting. Intestinal cavity pressure (ICP), plasma D-xylose absorption and diamine oxidase (DAO) activities were measured to determine intestinal function. RESULTS: The value of ICP and the activities of DAO were significantly increased (ICP: 17.5 ± 1.1 kpa, 17.6 ± 1.3 kpa, 17.3 ± 1.5 kpa vs 12.3 ± 0.9 kpa, all P < 0.01; DAO: 1.19 ± 0.15 U, 1.14 ± 0.13 U, 1.18 ± 0.15 U vs 0.68 ± 0.23 U, all P < 0.01), but Improvement effect of Tongfu the plasma D-xylose absorption was decreased particles on gut function in the (2.28 ± 0.23 mmol/l, 2.31 ± 0.14 mmol/l, 2.33 ± process of enteral nutrition 0.10 mmol/l vs 3.68 ± 1.05 mmol/l, all P < 0.01) following intestinal ischemia in group B, C and D as compared with those in group A. The most significant changes were and reperfusion in dogs found in group C, with a higher intolerance than Sen Hu, Hai-Bin Wang, Bin Xia, Yong Yu, Jun-You Li, that group B and A (87.5% vs 12.5%, 0%, both Xiao-Fang Zou, Guo-Yong Zhou, Jin-Wei Che P < 0.01). Tongfu particles caused significant decreases of plasma ICP and DAO (ICP: 17.1 ± 1.3 kpa vs 27.5 ± 1.1 kpa, P < 0.01; DAO: 1.19 ± 0.24 U vs 1.94 ± 0.27 U, P < 0.01) and increases of D-xylose absorption (2.97 ± 0.21 mmol/l vs 1.07 ± 0.15 mmol/l, P < 0.01) 1 hour after EN, and the gut tolerance to EN was also down-regulated. Sen Hu, Bin Xia, Jun-You Li, Xiao-Fang Zou, Guo-Yong Zhou, Jin-Wei Che, Laboratory of Shock and Multiple Organ Dysfunction, Burn Institute, the First Hospital Affiliated to General Hospital of Chinese PLA, Beijing , China Hai-Bin Wang, Yong Yu, Department of Clinical Laboratory, the First Hospital Affiliated to General Hospital of Chinese PLA, Beijing , China Supported by the Special Foundation of the 11 th Five-Year Plan for Military Medical Project, No. 06Z055 Correspondence to: Sen Hu, Laboratory of Shock and Multiple Organ Dysfunction, Burn Institute, the First Hospital Affiliated to General Hospital of Chinese PLA, 51 Fucheng Road, Beijing , China. hs82080@yahoo.com.cn Received: Accepted: CONCLUSION: Tongfu particles have obvious improvement effect on gut tolerance to EN by attenuating gut dysfunction in dogs with I/R injury. Key Words: Tongfu particles; Intestinal ischemia and reperfusion; Enteral nutrition; Gut tolerance EN., EN, EN., I/R EN, I / R, EN, EN. EN. Abstract AIM: To investigate the effect of Tongfu particles (TF) on gut function during the administration of enteral nutrition (EN) following intestinal ischemia and reperfusion (I/R). METHODS: Thirty-two male dogs were randomly and averagely divided into group A, B, C and D, received single EN, single I/R, I/R plus EN, and I/R plus EN plus TF, respectively. The intestinal I/R were achieved by clipping superior mesenteric artery (SMA) for 1 hours. EN was performed 4 hours after reperfusion. Gut intolerance was assessed by monitoring the Hu S, Wang HB, Xia B, Yu Y, Li JY, Zou XF, Zhou GY, Che JW. Improvement effect of Tongfu particles on gut function in the process of enteral nutrition following intestinal ischemia and reperfusion in dogs. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : (TF) - (I/ R) (EN). 方法 : 32EN I/R I/R+EN I/R+EN+TF, (SMA)1 h I/R,

79 1846 ISSN CN /R I/R EN. 4 h EN. (ICP) D- (DAO). 结果 : I/R EN ICP DAO (ICP: 17.5±1.1 kpa, 17.6±1.3 kpa, 17.3±1.5 kpa vs 12.3±0.9 kpa, P <0.01; DAO: 1.19±0.15 U, 1.14±0.13 U, 1.18± 0.15 U vs 0.68±0.23 U, P <0.01), D- (2.28±0.23 mmol/l, 2.31±0.14 mmol/l, 2.33±0.10 mmol/l vs 3.68±1.05 mmol/l, P <0.01). I/R+EN, I/R EN (87.5% vs 12.5%, 0%, P <0.01). EN 1 h, I/R+EN, ICP DAO (ICP: 17.1±1.3 kpa vs 27.5± 1.1 kpa, P <0.01; DAO: 1.19±0.24 U vs 1.94± 0.27 U, P <0.01). D- (2.97±0.21 mmol/l vs 1.07±0.15 mmol/l, P <0.01);. 结论 :, I/R. 1 材料和方法 雄性健康杂种犬 32 只 ( 解放军总医院 第一附属医院实验动物科提供 ), 体质量 kg. 通腑颗粒 : 主要成分厚朴 大黄 枳实 木香等, 北京友谊医院研制, 北京长城制药厂产品, 使用前用生理盐水配成 0.15 g/ml 通腑颗粒溶液. 瑞代营养液 : 德国费森尤斯卡比公司产品. CardioMaxⅡ 型动力监测仪 : 美国 Columbus Instruments 公司产品. ZNB-XB 型输液泵 : 北京科利丰科技公司产品 动物适应性饲养 1 wk 后进行实验. 手术前禁食水 18 h, 氯胺酮 (8 mg/kg)+ 速眠新 Ⅱ(0.1 ml/kg) im 麻醉. 无菌手术行右侧股动 静脉插管, 监测平均动脉压 (MAP) 采集血样本及输液. 取上腹部正中切口逐层进腹, 于距 Treiz 韧带 cm 处行空肠造口, 放置 TONO- 16F 肠黏膜张力计, 荷包缝合固定. 各组动物术中均按 30 ml/h 输入 9 g/l 氯化钠和 50 g/l 葡萄糖注射液. 术后 6 h 待动物完全清醒后制作动物模型. 即钝性游离肠系膜上动脉 (SMA) 根部, 用 关键词 动脉夹夹闭 SMA 60 min 后恢复血流. 还纳肠管后逐层关闭腹腔, 术毕 im 硫酸庆大霉素注射液 8 万单位. SMA 恢复灌流后 4 h 开始实施 EN, 先用 ZNB-XB 型输液泵的配套加温装置预热肠内营 养管, 至温度达到 时, 按照 4 ml/(kg. h) 滴速持续滴注 ( 经预实验 EN 对照组动物完全 0 引言耐受, I/R+EN 组出现不能耐受时间为实施 EN 早期肠内营养 (early enteral nutrition, EN) 作为后 2-4 h) 瑞代营养液, 维持并连续观察直至动一种治疗手段, 因更符合机体的生理状态和能物出现肠道不能耐受症状时停止 E N, 所有不有效促进胃肠功能恢复, 而被外科及危重病医能耐受的动物在停止 EN 并间隔 6 h 后均能够学领域所广泛接受和普遍采用 [1-3]. 我们以往的耐受再次 E N. 整个肠内营养过程在动物完全研究表明, 肠道低灌流和再灌流能能显著降低清醒状态下完成, 动物于恢复 SMA 灌流后 24 h 小肠对 EN 的耐受能力, 造成肠道功能和病理损处死. 害 [4-6], 因此改善肠缺血状态下实施 EN 时的小肠 动物随机分为 4 组 : (1) 单纯缺血功能, 对于休克患者安全有效的实施 EN 具有重 - 再灌注组 (I/R): 夹闭 SMA 1 h 后恢复灌流, 自复要意义. 通腑颗粒是国内学者根据胃气上逆腑流 4 h 起肠内滴注生理盐水 4 ml(kg h); (2) 缺血 - 气不通证理论和治则研制成功的中药复方颗再灌注后 EN 组 (I/R+EN): 夹闭 SMA 1 h 复流 4 h 粒, 经动物实验与临床研究验证, 在改善肠黏后行肠内滴注瑞代营养液 4 ml(kg h); (3) 通腑膜灌流 保护胃肠黏膜及防治微生态紊乱等方颗粒治疗组 (I/R+EN+TF): 于 EN 后 5 min 经肠黏面显示了良好的治疗效果 [7-8]. 本文研究通腑颗膜张力管同时滴注 0.15 g/ml 通腑颗粒溶液, 剂粒对肠缺血 - 再灌注 (I/R) 状态下实施 EN 时小肠量为 0.3 g/kg, 滴注速度 1 ml/min, 约 20 min 滴吸收 运动和屏障功能的影响, 为其用于提高完 ; (4) 单纯 EN 组 (EN): 不夹闭 SMA, 其余操作同创 烧伤休克患者对 EN 的耐受能力, 防治肠道 I/R+EN. 的并发症提供实验依据 分别在缺血 60 min(i60) 实施

80 1847 表 1 肠 I/R 犬小肠腔内压的变化 (n = 8, mean±sd, kpa) 分组 I60 I/R EN 后时间 (h) ,. EN 即刻及实施 EN 后 1, 4, 8 和 20 h( 相当恢复灌流 24 h) 各时相点测定 : (1) 小肠动力 : 测定肠腔内压 力反映. 将腹腔引出的肠腔内测压管 ( 北京颐松 科技发展有限公司制作 ) 与 CardioMax 型压力监 测仪连接后, 先抽空测压管气囊内空气, 然后注 入 2 ml 气体, 待气体平衡 5 min 后, 通过压力传 感器压力经监测仪显示出肠内压记录值, 连续 记录 10 min 肠腔内平均压力, 单位以 kpa 表 示 ; (2) 小肠吸收功能 : 测定血浆 D- 木糖吸收量 [9] : 即用注射器将木糖溶液 (0.5 g/kg) 经肠内营养通 道注入肠腔, 1 h 后采血, 取血浆 25 µl, 分别加入 显色剂 ( 间苯三酚 1 g, 冰乙酸 200 ml, 浓盐酸 12 ml)2.5 ml, 充分混匀后, 100 水浴 8 min, 流水 中冷却至室温. 于 DU-7Beckman 紫外分光光度 计上在 554 nm 处测定 A 值. 根据标准曲线计算 D- 木糖浓度. 单位以 mmol/l 表示 ; (3) 血浆二胺 氧化酶 (DAO) 活性 : 采用黎君友 et al [9] 报道的方 法测定, 单位以 U 表示. [10-11] 根据参考文献和 预实验结果, 我们以呕吐和腹泻等肠道症状做为 肠道不能耐受时的临床症状指标, 出现其中任一 项症状即判定为肠道不能耐受. 其中呕吐物在 50 ml 以内者为 (+), ml 之间为 (++), 在 100 ml 以上者为 (+++); 腹泻量在 50 ml 以内者为 (+), ml 为 (++), 100 ml 以上者为 (+++). 数据以均数 ± 标准差 (mean± SD) 表示, 采用 SPSS10.0 统计软件进行 t 检验 方差分析及相关分析, P <0.01 为差异有统计学 意义. 2 结果 2.1 单纯 EN 组全部耐受 (0/8); I/R+EN 组 7 只动物不能耐受 (7/8), 出现时间为实 施 EN 后 2-4 h, 其中呕吐 5 只 (+++2 只, ++3 只 ), 腹 泻 6 只 (+++3 只, ++2 只, +1 只 ); 单纯 I/R 组 1 只不能 耐受 (1/8, 腹泻 +++); TF 治疗组 1 只不能耐受 (1/8, 呕吐 ++). I/R+EN 组不能耐受发生率 (87.5%) 及严重程度均高于单纯 I/R 组和 TF 治疗组 (12.5%, P <0.01). 单纯 I/R 组 单纯 EN 及 TF 治疗组 3 者之间无显著性差异 (P >0.05). 所有不能耐受的动物在停止 EN 并间隔 6 h 后均能够耐受再次 EN. 2.2 恢复灌流前, I/R 组 I/R+EN 组及 I/R+EN+TF 组 ICP 无显著差别, 但均显著高于 EN 组 (P <0.01), 恢复灌流后, I/R+EN 组 ICP 进行性增加, 显著高于 EN 组和 I/R 组 (P <0.01); 给予通腑颗粒使 ICP 明显降低, I/R+EN+TF 组 ICP 显著低于 I/ R 组和 I/R+EN 组 (P <0.01), EN 后 8 h 起 I/R+EN+TF 组 ICP 与 EN 组相比无显著差别 (P >0.05)( 表 1). 2.3 D- 实验过程中 EN 组 D- 木糖含量变化不大. 恢复灌流前, I/R 组 I/R+EN 组及通腑颗粒治疗组 D- 木糖含量均显著低于 EN 组 (P <0.01), 但 3 组间无显著差别 ; 实施 EN 后, I/R+EN 组 D- 木糖进行性降低, EN 后 1-8 h(8/7 动物出现肠道不能耐受 ), I/R+EN 组 D- 木糖与 I/R 组比较差异非常显著 (P <0.01); 而通腑颗粒治疗组肠 D- 木糖迅速回升, EN 后 4 h 起显著高于 I/R 组和 I/R+ EN 组 (P <0.01)( 表 2). 2.4 DAO I/R+EN 组和 I/R 组 DAO 显著高于 EN 组, I/R+EN 组与 I/R 组之间 DAO 差别无显著性 ; EN 后 1 h 起, 通腑颗粒治疗组 DAO 显著低于 I/R 组和 I/R+EN 组 (P <0.01), EN 后 4 h 回降至 EN 组水平 (P >0.05)( 表 3). 3 讨论近年的临床实践表明, 在严重创伤 烧伤 休克以及外科大手术后患者实施 EN 过程中, 常发生腹胀 腹痛 呕吐 腹泻 甚至非梗阻性肠坏死 (NOBN) 等肠道并发症和对 EN 不能耐受. 以往认为实施 EN 时发生肠道并发症主要与 EN 成分和技术有关, 但通过临床病例分析发现, 许多不能耐受 EN 的患者都不同程度的处于肠道低灌流和 / 或隐匿性休克状态下 [12-13]. 严重创 ( 烧 ) 伤休

81 1848 ISSN CN /R 表 2 肠 I/R 犬血浆 D- 木糖含量变化 (n = 8, mean±sd, mmol/l) ( g u t tolerance) EN 后时间 (h), 分组 I60, ( ).. 表 3 各组犬血浆 DAO 活性的变化 (n = 8, mean±sd, U) EN 后时间 (h) 分组 I 克时, 机体通过神经体液调节促使全身血流重新分布, 减少胃肠道 肌肉 皮肤等组织的血液供应, 以保障心 脑等生命器官的血液供应. 胃肠道作为 牺牲器官, 在创 烧伤休克时及复苏后可出现严重的缺血 缺氧和再灌注性损伤 [14-15]. 为了模拟休克时肠道低灌流状态及隐匿性缺血时实施 EN 的临床过程, 我们建立了肠道 I/R 状态下实施 EN 的实验模型. 在研究中我们分别以木糖吸收实验 肠腔内压力和血浆 DAO 作为反映小肠吸收 运动及屏障功能的指标. 其中木糖吸收实验中测定的 D- 木糖为五碳糖, 在肠道内不能完全被吸收, 其吸收需要钠泵转运, 血浆或尿液中的含量能反映小肠的吸收功能 ; 肠腔内压力测定是评价小肠动力变化的方法之一 ; 而 DAO 存在于小肠黏膜上皮绒毛内, 缺血性损伤后可大量释放入血, 因而可以间接反映小肠黏膜屏障的损伤 [16]. 本实验结果显示, 与单纯 EN 组比较, 肠 I/R 各组血浆 D- 木糖明显降低, DAO 和 ICP 显著升高. 其中肠 I/R+EN 组的变化最重, 肠道不能耐受发生率 (87.5%) 显著高于 I/R 组 (12.5%) 和 EN 组 (0%), 表明肠 I/R 能显著降低小肠对早期肠内营养的耐受能力, 造成小肠动力 吸收和屏障功能损害. 发生上述变化的机制主要是由于缺血缺氧引起肠组织细胞能量代谢障碍, 使肠道环行肌与纵行肌的收缩受到抑制, 造成肠麻痹或肠腔闭塞使营养物排空受阻, 导致 肠内压升高. 另一方面, 大多数营养物质在肠道的吸收过程需要消耗 ATP 通过 Na + -K + -ATP 酶泵做功完成, 肠 I/R 损伤能显著降低肠黏膜 ATP 的含量, 从而加重了肠黏膜的代谢应激, 造成肠黏膜吸收障碍和屏障损害 [4-5], 充分说明肠 I/R 时过早实施 EN 不仅不能改善肠道功能, 反而加重肠黏膜代谢应激和缺血状态, 进一步抑制小肠吸收和运动功能, 这也有助于解释临床危重患者实施 EN 时出现不能耐受的情况. 研究还显示, 通腑颗粒治疗组与 I/R+EN 和 I/R 组相比, 血浆 D- 乳酸和 ICP 显著降低, 血浆 D- 木糖明显升高 (P <0.01); 肠道不能耐受发生率也显著降低. 说明肠内给予通腑颗粒能显著改善肠组织功能指标, 减轻肠黏膜的病理损害, 对 I/R 时小肠有保护作用. 本实验中所用通腑颗粒为首都医科大学附属北京友谊医院研制的中药制剂, 由厚朴 大黄 枳实 木香等中药组成, 是一种以通里攻下 清热解毒 疏肝理气 活血化瘀为主旨的中药方剂. 根据以往的报告和本研究结果分析, 通腑颗粒对 I/R 小肠的保护作用的机制可能有以下几方面. (1) 活血化瘀 增加肠道血流 : 我们以往的研究表明通腑颗粒能降低狗肠 I/R 时升高的小肠黏膜 phi. 国内其他学者的研究报告也显示通腑颗粒主要成分大黄能显著增加失血性休克大鼠和危重病患者肠黏膜血流量, 降低血液黏度, 改善肠道微循环 [16] ; (2) 清

82 1849 热解毒 减轻黏膜炎症 : 大黄能降低休克和脓 毒症患者血浆 TNFα 和 IL-6 含量, 减轻胃肠黏膜 的炎症损害 [17] ; (3) 气促动, 改善胃肠麻痹 : 研究 表明大黄能提高内毒素休克大鼠肠跨膜电位和 肠道平滑肌兴奋性 [18]. 厚朴能改善内毒素休克时 胃肠电抑制及肠麻痹 [19]. 木香能促进内源性胃动 素的释放, 加速胃的排空 [20]. 通腑颗粒主要成分 中含有上述三种中药, 协同作用能显著改善胃 肠动力, 纠正胃肠功能紊乱. 2000; 12: , 10 Davies AR, Froomes PR, French CJ, Bellomo R, Gutteridge GA, Nyulasi I, Walker R, Sewell RB. Randomized comparison of nasojejunal and nasogastric feeding in critically ill patients. Crit Care Med 2002; 30: ,,,. 11 Munshi IA, Steingrub JS, Wolpert L. Small bowel necrosis associated with early postoperative jejunal tube feeding in a trauma patient. J Trauma 2000; 49: Mentec H, Dupont H, Bocchetti M, Cani P, Ponche F, Bleichner G. Upper digestive intolerance during enteral nutrition in critically ill patients: frequency, risk factors, and complications. Crit Care Med 2001; 4 参考文献 29: Davies AR, Froomes PR, French CJ, Bellomo R, 2003; 23: 67 Gutteridge GA, Ny0ulasi I, Walker R, Sewell 2 Braga M, Gianotti L, Gentilini O, Parisi V, Salis C, Di Carlo V. Early postoperative enteral nutrition improves gut oxygenation and reduces costs RB. Randomized comparison of nasojejunal and nasogastric feeding in critically ill patients. Crit Care Med 2002; 30: compared with total parenteral nutrition. Crit Care Med 2001; 29: Hu S, Sheng ZY. The effects of anisodamine and dobutamine on gut mucosal blood flow during gut 3 Fukatsu K, Zarzaur BL, Johnson CD, Lundberg AH, ischemia/reperfusion. World J Gastroenterol 2002; 8: Wilcox HG, Kudsk KA. Enteral nutrition prevents remote organ injury and death after a gut ischemic 15 Li JY, Lu Y, Hu S, Sun D, Yao YM. Preventive effect insult. Ann Surg 2001; 233: of glutamine on intestinal barrier dysfunction 4 induced by severe trauma. World J Gastroenterol 2002; 8: ; 82: ; 19: 5 Kozar RA, Hu S, Hassoun HT, DeSoignie R, Moore FA. Specific intraluminal nutrients alter mucosal 17 blood flow during gut ischemia/reperfusion. JPEN J Parenter Enteral Nutr 2002; 26: ; 12: ; 18: ; 9: ; 27: ; 6: ; 13: ; 14: ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯自 起, 世界华人消化杂志正式开通了在线办公系统 ( aspx), 所有办公流程一律可以在线进行, 包括投稿 审稿 编辑 审读, 以及作者 读者 编者之间的信息 反馈交流. 凡在在线办公系统注册的用户, 将可获得世界华人消化杂志最新出版消息.

83 ; 15(16): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION 凝结芽孢杆菌活菌 TBC169 株对右旋葡聚糖硫酸钠引发大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用 RESULTS: After treatment, the body weights of rats in all the groups were increased, especially in the group received BC at 10 7 CFU/mL (P <, 0.05). Intestinal wet weight, ulcerative number, and area, and MPO activity were significantly reduced in all the treatment groups (P < 0.05 or,. P < 0.01 or P < 0.001) as compared with those,, in model control group. Analysis on intestinal. flora showed that the number of Bifidobacterium was decreased remarkably after modeling, but it,, Therapeutic effects of Bacillus was significantly increased in all the treatment., coagulans on the dextran groups (P < 0.01 or P < 0.001). BC was found sodium sulfate-induced colonized in the intestinal tract of BC-treated, ulcerative colitis in rats group.. Fu-Chang Wan, Yun-Long Cui, Shu-Cui Yan CONCLUSION: BC has notable therapeutic effect on DSS-induced UC. Fu-Chang Wan, Department of Medicine, Beijing Tian Shi Kang Medicine and Technology Corporation Limited, Beijing , China Yun-Long Cui, Shu-Cui Yan, Division of Bacterial Strain Selection and Identification, Qingdao Eastern Sea Pharmaceutical Corporation Limited, Qingdao , Shangdong Province, China Supported by The National 863 Plan Item from the Ministry of Science and Technology, China, No.2003AA2ZC50 Correspondence to: Fu-Chang Wan, Department of Medicine, Beijing Tian Shi Kang Medicine and Technology Corporation Limited, Beijing , China. wanfc2@126.com Received: Accepted: Abstract AIM: To investigate the effect of Bacillus coagulans (BC, TBC169 strain) in the treatment of rats with ulcerative colitis induced by dextran sodium sulfate (DSS). METHODS: DSS was used to induce UC in Sprague Dawley rats, and then the rats were treated with 10 7 CFU/mL, 10 6 CFU/mL BC, 0.02 g/ml sulfasalazine and normal saline (control), respectively. After 21 days of treatment, the body weight, colorectal wet weight, intestinal mucosal ulcer, erosion spots and area, myeloperoxidase (MPO) activity, and intestinal bacterial flora were observed. Key Words: Bacillus coagulans ; Dextran sodium sulfate; Rat; Ulcerative colitis; Intestinal flora Wan FC, Cui YL, Yan SC. Therapeutic effects of Bacillus coagulans on the dextran sodium sulfate-induced ulcerative colitis in rats. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : (Bacillus coagulans, BC) (DSS) (UC). 方法 : DSS UC, CFU/mL BC 0.02 g/ml (SASP) (NS). 21 d. 结果 : 21 d,, BC10 7 CFU/mL (P <0.05); MPO (P <0.05 P <0.01 P <0.001);, (P <0.05), (P <0.01

84 1851 P <0.001), BC SASP 测试盒 ( 南京建成生物工程研究所 ). EC 培养基 (P <0.01 P <0.001). BC. ( 肠球菌 ), EMB 培养基 ( 肠杆菌 ), KV 培养基 ( 类杆菌 ), TPY 培养基 ( 双歧杆菌 ), MRS 培养基 ( 乳结论 : BC DSS UC. 杆菌 ) 和凝结芽胞杆菌 (BC) 选择性培养基. SD 关键词 雄性大鼠 60 只, 体质量 g, 标准 2 级, 购自 中国药品生物制品检定所实验动物中心, 证号 : SCXK( 京 ) UV-2100 型紫外光分析仪 ( 北京市技术应用研究所 ) UC SD 大鼠 60 只, 试验前在无菌情况下, 从大鼠肛门采大便作正常肠道菌群培养, 然后其中 10 只大鼠作为正常对照, 50 只大 0 引言鼠参照吴小平 et al [5] 报道的大鼠 UC 造型等方溃疡性结肠炎 (UC) 是一种发病原因不明的慢性法 [6-7], 略加改进, 即用 DSS(30 g/l) 溶液给空腹结肠和直肠炎症性肠道疾病, 许多研究提示该大鼠 10 ml/kg. 体质量, ig, qd 7 d, 最后 1 次, 从病可能与免疫 感染 遗传 肠道菌群失调 肛门加注 DSS 1 ml/ 只, 至直肠内, 7 d 后采大便食物过敏和精神因素等有关 [1]. 有研究表明感染用作菌群分析. 然后处死其中 10 只, 剖腹取结可能是一种始动因子 (triggering factor) 引起肠道直肠, 测定结直肠湿质量 (g/kg. 体质量 ), 甲醛固炎症, 动物模型显示大多数动物在无菌环境中定. 用爱尔新蓝溶液染色, 按李兆申 et al [8] 所述不发生结肠炎, 结肠袋囊手术后也一定要有细方法, 肉眼观测肠黏膜糜烂和溃疡点数, 用卡尺菌定植才有炎症发生, 肠道正常菌群改变或对测量蓝染点 ( 溃疡病灶 ) 的蓝染面积 (cm 2 ). 证实肠道微生物免疫耐受有缺陷而引起 [1-2]. 中国炎 UC 形成后, 将 UC 大鼠分为 4 组, 每组 10 只, 分别症性肠病协作组报道我国近年来 UC 患病率为用 BC(10 10 CFU/L) BC(10 9 CFU/L) SASP ( /10 万, 住院 UC 患者以轻度 (35.4%) 和中度 g/l) 和 NS, ig, bid 21 d, 21 d 后取大便作肠道菌 (42.9%) 为主, 也有报道我国 UC 患者累计超过 12 群分析. 之后称体质量, 处死全部大鼠, 按上法万例 [2-3] ; 在西方国家患病率为每年 /10 万, 处理结直肠标本, 检测相应指标, 并采取肠组织在亚洲 20 世纪后期日本和新加坡报道患病率分块制成 5% 匀浆, 采用髓过氧化物酶测试盒, 用紫别为每年 /10 万和 8.6/10 万, 近年来有上外光分析仪测定髓过氧化物酶 (MPO) 活性 (U/g 升的趋势 [2-3] ; 在美国约有 人被湿片 ). UC 所困扰 [4]. 该病目前尚未有根治方法, 常反复 分别在造型前 造型发作, 不但给人们造成精神和肉体上的痛苦, 而后和治疗结束后, 在无菌操作下, 分别采取从大且还会给国家和个人带来沉重的经济负担, 且鼠肛门挤出的新鲜大便, 称重后 10 倍稀释, 取 UC 患者久病不愈, 还有恶化为结肠癌的危险. 10-2, 10-3, 10-4 稀释匀浆液各 0.1 ml, 接种到含有本试验用 DSS 造成大鼠实验性 UC 模型, 之适宜培养基的平板上, 涂匀, 需氧菌在 37 培养后用 BC 进行治疗, 以 SASP 作对照, 研究试药对 48 h, 厌氧菌在 37 培养 72 h, 计数活菌数 (CFU/ UC 的治疗作用, 开辟用凝结芽胞杆菌活菌制剂 g) 肠杆菌, 肠球菌, 类杆菌, 乳杆菌和双歧杆菌 ( 商品名爽舒宝 ) 治疗该病的新途径. 的培养分别为 EMB, EC, KV, MRS, TPY, BC. 数据用 m e a n±s D 表示, 用 1 材料和方法 Student's t -test, 进行组间均数差异的显著性检 1.1 凝结芽胞杆菌活菌 ( 含凝结芽胞杆菌活验. 统计学显著性为 P <0.05. 菌 TBC169 株 CFU/g, 批号 : , 北京天施康医药科技发展有限公司 ), 柳氮磺吡啶片 2 结果 (0.25g, 批号 : C02, 上海三维制药有限公 2.1 如表 1 所示造型前司 ), 右旋葡聚糖硫酸钠 (10 g/ 瓶, 批号 : BI03071, 与造型后, 各组中大鼠的体质量均有增加, 但在 Sino-American Biotec), 爱尔新蓝 (1 g/ 瓶, 批号 : 各组间无显著性差异 ; 治疗后 5 组大鼠体质量 BS0084, Sino-American Biotec), 髓过氧化物酶均有增加, 其中以正常组和 BC10 10 组增加更显,,,,,,.,,.

85 1852 ISSN CN /R DSS, U C, DSS (21 d ),,,, (7 d). UC,. 表 1 大鼠实验性溃疡性结肠炎 DSS 造型和 BC 治疗作用 (mean±sd, n = 10) 分组 体质量 (g) 肠湿重溃疡或糜烂点 MPO 活性 造型前造型后治疗后 (g/kg. 体质量 ) 点数面积 (cm 2 ) (U/g 湿片 ) 著, 与造型 +NS 组比较有显著性差异 (P <0.05 或 P <0.001). 正常组中大鼠的结直肠湿质量与 3 个药物治疗组接近, 无明显不同. 治疗后造型组肠湿质量与造型组 +NS 组的比较有非常显著性差异 (P <0.001), 2 个 BC 组与造型 +NS 组比较也均有非常显著性差异 (P 均 <0.001), SASP 组与造型 +NS 组比较也有显著性差异 (P <0.05), 而 3 个药物间作用则基本接近 ( 表 1). 2.2 ( ) 用 DSS 溶液给大鼠 ig, 加直肠给药后可形成典型的大鼠溃疡性结肠炎, 在整个结直肠, 尤其结肠下端和直肠的肠标本用爱尔新蓝染色后, 肠黏膜可见明显深染的不规则的溃疡点或糜烂点. 结直肠溃疡 ( 糜烂 ) 点数, 3 个药物治疗组与造型 +NS 组比较均有很显著差异 (P <0.01 或 P <0.001), 而他们间比较无多大差异. 溃疡面积, 造型组与造型组 +NS 组与比较有显著性差异 (P <0.05), 治疗后 2 个 BC 组的溃疡面积与造型 +NS 组的比较均有很显著差异 (P <0.01 或 P <0.001), 而 SASP 组与造型组 +NS 组比较也有显著性差异 (P <0.05), 但 3 组间无明显不同 ( 表 1). 2.3 MPO 正常组中大鼠结肠组织中 MPO 活性极低, 有的检测为 0. 造型后, 造型组的 MPO 活性比造型 +NS 组的非常显著地增高 (P <0.001). 治疗后, 各治疗组的 MPO 活性大幅度下降与造型 +NS 组的比较均有显著性差异 (P <0.05 或 P <0.01 或 P <0.001). 而 3 个治疗组之间的 MPO 活性无明显不同 ( 表 1). 2.4 正常大鼠肠道的肠杆 菌 肠球菌 类杆菌 乳杆菌和双歧杆菌的 生长状态属正常 ( 表 2). 经 DSS 造型后, 造型组 大鼠肠道双歧杆菌的数量比正常组的明显地低 (P <0.05), 而其他菌群无明显变化 ; 治疗后的各 组肠道菌群基本恢复到正常, 但 BC 组和 SASP 组 的双歧杆菌数量均非常显著高于 (P <0.001) 造型 组 ; 造型 +NS 组 ( 自然恢复 ) 也显著高于 (P <0.01) 造型组. BC 在肠道定植, CFU/L 组定植数较 高 ( 表 2). 3 讨论本实验结果提示 BC 对 DSS 引起的大鼠实验性 溃疡性结肠炎有一定治疗作用, 其表现是治疗 后的大鼠肠湿质量显著地减轻, 结直肠黏膜溃 疡的糜烂点数显著减少 溃疡面积明显缩小, MPO 活性明显下降, 肠道内的双歧杆菌数减少 有明显恢复, 对照药 SASP 也有一定的治疗效果. 造型 +NS 组的大鼠结直肠湿质量和溃疡病灶也 比造型组减轻, 说明大鼠实验性溃疡性结肠炎 有自愈倾向, 肠道双歧杆菌下降也有自然恢复 现象. 凝结芽胞杆菌治疗大鼠溃疡性结肠炎的作 用机制是 : (1) 修复肠黏膜, BC 在代谢过程中能 产生短链脂肪酸 (SCFAs) 如乳酸 乙酸等, 这类 物质能作为受损的肠黏膜的能量供给, 有利于 溃疡面的修复, 日本 Araki et al [9] 报道酪酸梭菌产 生的 SCFAs, 能修复受损的肠黏膜, 因而对溃疡 性结肠炎有一定疗效, 吴小平 et al [5] 也报道酪酸 梭菌可治疗 DSS 引发的大鼠 UC; (2) 抗氧化作用,

86 1853 表 2 大鼠肠道菌群培养 (mean±sd, n = 10, log 10 n CFU/g) BC 组别 EMB EC KV MRS TPY BC, UC. 本研究证明 BC 能抑制髓过氧化物酶的活性, 减 少氧自由基对肠黏膜的损伤. Krawisz et al [10] 报 道用 8%-12% 醋酸给大鼠灌肠造成结肠炎也可 激活 MPO 活性, 且肠黏膜损害炎症越严重, 白细 胞数目也越多, MPO 活性就越高, 甚至高达 30.5 U/g. 可见 MPO 活性的高低明显影响着溃疡性结 肠炎的发生和发展, 当自由基不断增多, 超过机 体清除能力时, 则引起周围组织的严重破坏性 损伤, 并使炎症和组织损伤之间形成恶性循环 ; (3) 免疫调节作用, 在 IBD 病程中经常可以观察 到肠道免疫系统失调, 包括抗原的刺激作用, 使 得黏膜 IgG 产生细胞聚集和激活 ; T 淋巴细胞亚 群以辅助性 T 细胞激活为主, 而非抗原特异性的 抑制性 T 细胞, 由此产生致炎细胞因子 (IL-1 IL-6 IL-8 TNF-α 和 TGF-γ 等 ), 而抑制性炎症 细胞因子 (IL-ra IL-4 IL-10 和 TGF-β 等 ) 则相 对不足, 从而产生细胞因子网络调控失衡, 引起 和放大黏膜的炎症反应. 乙酸性大鼠 UC, 也发现 结肠黏膜 TNF-α, NF-κB 表达明显提高, IL-10 表 达则明显降低 [2,6,11], 张婵 et al [11] 使用能释放谷胱 苷肽的发酵乳杆菌治疗 IBD, 发现其主要通过降 低结肠内 TNF-α 和诱导氮氧合酶的表达, 从而调 节 NO 等炎性介质产生, 以改善炎症症状. 向军英 et al [12] 用美常安 ( 枯草杆菌 屎肠球菌二联活菌 ) 联合柳氮磺吡啶治疗溃疡性结肠炎 22 例, 总有 效率为 91.66%. 王文杰 et al [13] 和房志仲 et al [14] 的 研究均证实 BC 能提高机体的巨细胞吞噬功能 增加血清溶血素的生成 增强 NK 细胞活性和 淋巴细胞的转化, 对异常的免疫反应 炎症反 应及过敏反应有下调作用, 减轻或消除黏膜内 皮细胞过强的免疫应答. 还有研究表明, 敲除小 鼠 IL-10 基因能导致动物产生结肠炎, 而用 IL-10 灌肠治疗 UC 患者, 能明显改善肠道黏膜炎症 [15] ; (4) 解毒作用,BC 对肠道中有害菌产生的氨 胺 和硫化氢等有毒物质, 能阻止其产生或加速其 排出, 防止这些有毒物质对肠道的损害, 起到 解毒和排毒作用 [13] ; (5) 抑菌和调节肠道菌群平 衡, Hyronimus et al [16] 报道 BC 在代谢中能分泌凝 固素 (coagulin), 这种细菌素对肠球菌 明串珠 球菌 李斯特菌等有抑制作用, 能防止有害菌 的感染也有利于炎症消除. 本研究得出 BC 能将 UC 大鼠肠道内下降的双歧杆菌恢复到正常水 平. 万阜昌 et al [17] 的动物实验表明 BC 对由氨苄 青霉素引起的小鼠实验性腹泻有明显的止泻作 用, 并能加速肠道菌群失调的恢复, 双歧杆菌数 量明显增加. Cui et al [18] 报道在临床研究中也证 实 BC 能治疗急慢性肠炎性腹泻, 并使患者肠道 内低下的双歧杆菌和乳酸杆菌数量显著地提高, 这表明 BC 有促进双歧杆菌和乳酸杆菌繁殖, 调 整肠道菌群平衡的作用, 可防范有害菌对肠道 的侵袭. 崔云龙 et al [19] 的抑菌实验也证实 BC 对 大肠埃希菌 痢疾志贺菌 伤寒沙门菌 普通 变形杆菌 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌均 有明显的抑制作用, 能减少黏膜需氧粘附菌和 易位菌数量, 防止肠道细菌性感染, 消除 UC 感染 这一致病因素, 以阻止肠道炎症的发生. 本实验 结果首次证实了 BC 对大鼠实验性 UC 的治疗作 用, 为正在进行的用该活菌制剂 ( 爽舒宝片 ) 治疗 人体 UC 提供了临床理论依据. 4 参考文献 ; 11: ; 20: ; 26: Kornbluth A, Sachar DB. Ulcerative colitis practice

87 1854 ISSN CN /R (TBC169 ),,,,. guidelines in adults (update): American College of Gastroenterology, Practice Parameters Committee. Am J Gastroenterol 2004; 99: ; 18: ; 14: ; 23: ; 18: ; 5: ; 17: 2006; 18: ; 31: : 16 Hyronimus B, Le Marrec C, Urdaci MC. Coagulin, a bacteriocin-like inhibitory substance produced 9 Araki Y, Andoh A, Fujiyama Y, Takizawa by Bacillus coagulans I4. J Appl Microbiol 1998; 85: J, T a k i z a w a W, B a m b a T. S h o r t - t e r m o r a l administration of a product derived from a 17 probiotic, Clostridium butyricum induced no 2005; 17: pathological effects in rats. Int J Mol Med 2002; 9: Cui YL, Wan FC, Tang DL, Wu SH. Efficacy of 10 Krawisz JE, Sharon P, Stenson WF. Quantitative assay for acute intestinal inflammation based on myeloperoxidase activity. Assessment Bacillus coagulans tablets in the treatment of acute and chronic diarrhea. INT.J.IMMUNOTHERAPY 2004; XX(1): of inflammation in rat and hamster models. Gastroenterology 1984; 87: TBC ; 17: ISSN CN /R 2007 年版权归世界华人消化杂志 消息 本刊讯为了推动肝胆胰外科临床及科研工作的深入开展, 由哈尔滨医科大学附属第一医院肝胆胰外科与 World Journal of Gastroenterology 共同举办的国家继续教育项目 肝胆胰外科领域新技术研讨会 拟于 /05 在哈尔滨召开. 届时将邀请日本及国内肝胆胰领域知名专家进行讲座和学术交流, 会议将对活体肝移植供受体手术 肝脏手术 血管技术在肝胆胰手术中的应用 如何提高胰十二指肠手术切除率以及生物人工肝脏等技术的新进展进行深入讨论, 学习该领域国内外先进技术和理念, 促进学术交流和学科发展. 与会者将被授予国家 I 类继续教育学分 12 分. 欢迎各位肝胆胰及相关领域同仁参加. 通讯地址 : 黑龙江省哈尔滨市南岗区邮政街 23 号, 哈尔滨医科大学附属第一医院肝胆胰腺外科邮编 : 联系人 : 吴祥松电话 : , wxs417@yahoo.com.cn 收费标准 : 500 元 ( 含资料费及午间工作餐, 统一安排食宿, 费用自理 ). 报到日期 :

88 ; 15(16): ISSN CN /R RAPID COMMUNICATION 自创微需氧罐优选幽门螺杆菌培养与保存条件 with self-made microaerophilic pot. Solid cultivation medium for H pylori: H pylori grew well as presented in the Colombian agar medium and brain heart infusion agar with 53 ml/l calf serum or sheep serum and 26 ml/l mixed antibiotics at ph 7.5. Under -20, the survival time of H pylori was 7 and 20 days when 300 ml/l glycerine/bromfield medium and 200 ml/l glycerine/brain heart infusion were used, respectively. Optimization of cultivation and preservation of Helicobacter pylori using self-made microaerophilic pot Hua Zhou, Fan Xu, Ping Li, Geng-Wu Chu, Gen-Chun Wang Hua Zhou, Department of Radiotherapy, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College, Kunming , Yunnan Province, China Fan Xu, Department of Pharmacy, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Kunming , Yunnan Province, China Ping Li, Geng-Wu Chu, Basic Department, Yunnan College of Chinese Traditional Medicine, Kunming , Yunnan Province, China Gen-Chun Wang, Department of Microbiology, Kunming General Hospital of Chengdu Military Region, Kunming , Yunnan Province, China Supported by The Natural Science Foundation of Yunnan Province, China, No. 2003C0089M Correspondence to: Ping Li, Basic Department, Yunnan College of Chinese Traditional Medicine, 201 Shuangqiao Road, Guanshang, Kunming , Yunnan Province, China. kmliping08@126.com Received: Accepted: Abstract AIM: To optimize the operation and condition of cultivation and preservation for Helicobacter pylori. METHODS: Self-made microaerophilic pot was used to optimize the cultivation condition for H pylori with orthogonal designing, and the anabiosis of H pylori was observed and compared in two preservative fluids of different concentration under -20. RESULTS: H pylori were cultivated successfully CONCLUSION: The self-made microaerophilic pot is reliable and its operation is simple, by which the cultivation and preservation of Helicobacter pylori were optimized. Key Words: Microaerophilic pot; Helicobacter pylori ; Cultivation; Preservation Zhou H, Xu F, Li P, Chu GW, Wang GC. Optimization of cultivation and preservation of Helicobacter pylori using self-made microaerophilic pot. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(16): 目的 : (H pylori ), H pylori. 方法 :, H pylori, -20 H pylori. 结果 : H pylori ; 53 ml/l / 26 ml/l, ph 7.5, H pylori ; -20 : 300 ml/l / 200 ml/l / 7 d 20 d. 结论 :, H pylori. H pylori H pylori, H pylori,,.,, SS1,,. 关键词

89 1856 ISSN CN /R 0 引言 幽门螺杆菌 (H pylori ) 培养是 H pylori 诊断的 金 标准, 特异性 100% [1]. 但 H pylori 体外生长条件, 非常苛刻, 所需试验设备特殊, 培养过程繁琐 困难. 我们自行创新了操作简便 价格低廉, 效果可靠的微需氧培养罐, 简化了 H pylori 培养. 操作. 以 H pylori 标准菌株 SS1 为研究对象, 比较 了不同培养条件和保存方法的优缺点, 选择出 最佳的培养和保存方法. 1 材料和方法 1.1 H pylori SS1 标准菌株由中国疾病预防 控制中心传染病预防控制所馈赠. 哥伦比亚琼脂 和脑心浸液琼脂 ; 脱纤维绵羊血 绵羊血清 新生小牛血清 ; 选择性抗生素 : 盐酸万古霉素 多黏菌素 可溶性两性霉素 B 三甲氧苄氨嘧 啶 ; 乳酸 触酶 氧化酶 快速尿素酶试纸 ; 主 要设备 : 自制微需氧培养罐 ( 用市场易购的真空 干燥器, 仅对其盖子活塞加以改造为气体进出 口双通道即成, 图 1) 特种混合气体 ( 配比 : 50 ml/l CO ml/l CO ml/l N 2 ) 温湿 度计 超净工作台 37 恒温培养箱 -20 冰 箱 高温高压消毒锅等 分析天平准确称取万 古霉素 g, 两性霉素 B g, 多黏菌素 B g, 3 种抗生素在紫外线下照射 1 h, 均匀 混合. 准确称取三甲氧苄胺嘧啶 (TMP) g, 溶于 10 ml 蒸馏水, 并加乳酸一滴, 煮沸 10 min 后 无菌加入以上混合抗生素中, 用灭菌蒸馏水加 至 40 ml, 混匀, 4 冰储备用 H pylori 称取哥伦 比亚琼脂 5 g, 溶于 128 ml 蒸馏水中, 脑心浸液琼 脂 5 g 溶于 100 ml 蒸馏水中, 均匀混合, 121 高 压灭菌 15 min. 待温度降至 时, 在 9 个小 烧杯中分别倒入 15 ml, 按正交设计, 在各烧杯 中加入不同的血样 混合抗生素并调节不同 ph 值 ( 表 1-2), 混匀后趁热快速浇板, 数分钟冷却凝 固后备用. 其中血样按 53 ml/l 浓度加入 0.8 ml, 混合抗生素按 26 ml/l 浓度加入 0.4 ml, 用 HCl 和 NaOH 调节 ph 值. 各固体培养基制备好后, 将 -70 冻存的 H pylori SS1 标准菌株室温解冻, 接 种于不同固体培养基, 每板 50 μl, L 棒涂匀, 放 入微需氧培养罐, 置入 37 恒温箱, 通入特种混 合气体 5 min, 湿度为 95% 条件下, 培养 3 d H pylori (1) 菌落形态 : 平板上的 H pylori 菌落呈针尖样, 透明湿润, 直径 mm; (2) 涂片镜检 : 滴 1 滴生理盐水于干净载玻片上, 用接种环刮取少许菌落在生理盐水中涂开. 将 涂片烘干后进行常规革兰氏染色, 在显微镜下 观察, 见紫色短杆状 ; (3) 氧化酶试验 : 刮取细菌 放置在浸有氧化酶试剂的滤纸上, 出现深蓝 / 黑 色反应者为阳性 ; (4) 触酶试验 : 在 1 张载玻片上 滴加 1 滴触酶液 (30 ml/l H 2 O 2 液 ), 刮取一环菌落 置入后, 阳性可见到连续的氧气泡形成 ; (5) 尿素 酶试验 : 刮取 1 环细菌放置到尿素酶试纸上, 约 1 min 后试纸变为紫红色为阳性 H pylori (1)300 ml/l 甘油 / 布氏肉汤保存液的 配制 : 参照周殿元 et al [2] 的经典配方, 称取 0.6 g 布氏肉汤培养基, 溶于 14 ml 蒸馏水, 加入 6 ml 甘油, 混匀, 121 高压灭菌 15 min, 300 ml/l 甘 油 / 布氏肉汤保存液 20 ml 配制完毕, 4 冰储备 用. (2)200 ml/l 甘油 / 脑心浸液保存液的配制 : 称 取 3.7 g 脑心浸液培养基, 溶于 80 ml 蒸馏水, 加 入 20 ml 甘油, 混匀, 121 高压灭菌 15 min, 200 ml/l 甘油 / 脑心浸液保存液 100 ml 配制完毕, 4 冰储备用. 将上述的两种保存液 1 ml 分别装 入 1 支试管, 用接种环刮取菌落加入不同保存液 中, 迅速置于 -20 冰箱保存. 每隔两天同样方法 各保存 1 支, 共保存到各 10 支, 1 mo 同时复苏对 照观察. 图 1 自创微需氧罐. 表 1 优选 H pylori 最佳固体培养条件因素与水平 水平 A 因素 B 因素 C 因素 D 因素 琼脂血样混合抗生素 ph 采用 S P S S12.0 统计软件的