平均回收率为 99.10% 累积透皮量与时间呈良好的线性关系, 自制软膏与市售软膏的透皮结果无显著性差异结论检测方法操作简便, 快速准确, 是考察他克莫司软膏体外透皮性能的理想方法关键词 : 他克莫司 ; 软膏 ; 透皮吸收 ; 高效液相色谱法中图分类号 :R 文献标志码 :B

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寂迁邹
5 years ago
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1 采用中国药典 2010 年版附录 XC 溶出度测定为后期稳定性试验留下空间法第二法的装置分别测定 CXB 原料药西乐葆气流粉碎的关键在于高压气流产生的高度湍微粉化 CXB 3 组样品溶出度溶出介质为 0.5% 流和能量转换流可以使物料之间发生相互剧烈的 SDS ph 6.8 的磷酸盐缓冲液体积为 900 ml 转冲击碰撞和摩擦压缩空气喷气流的动能与其速为(100±1)r min 温度为(37±0.5) 分别于质量流的一次方成正比与其速度的平方成正比 min 取样 5 ml 过 0.45 μm 因此喷气流的速度是影响物料破碎程度的一个微孔滤膜同时补加等温释放介质 5 ml 按 2.2 重要因素通常喷气流的速度与气流入口的压项下紫外分光光度法测定溶出介质中 CXB 的浓强成正比压缩空气的压强越大其喷气动能越度并计算 CXB 的累积溶出度绘制溶出曲线大从图 1 的试验结果可以看出压缩空气的压结果见图 4 力越大粉碎效果越好 CXB 微粉的粒度越小粒度分布范围也越窄 REFERENCES [1] [2] 图 4 CXB 体外溶出度实验 Fig. 4 Release profile in vitro of CXB [3] 实验结果表明 CXB 经微粉化后可显著提高溶出速率在 30 min 内 CXB 基本溶出完全与市 [4] 售制剂塞来昔布胶囊溶出行为形似而 CXB 原料药溶出非常缓慢在 60 min 溶出率仅为 15%左右说明将 CXB 经微粉化处理能够显著提高药物溶出度 3 讨论 [6] 通过前期预实验药物平均粒径控制在 1~3 μm 时药物溶出较好考虑到药物放置后期 REDDY M N, REHANA T, RAMAKRISHNA S, et al. β-cyclodextrin complexes of celecoxib: molecular-modeling, characterization, and dissolution studies [J]. AAPS PharmSci, 2004, 6(1): 1-9. PAULSON S K, VAUGHN M B, JESSEN S M, et al. Pharmacokinetics of celecoxib after oral administration in dogs and humans: Effect of food and site of absorption [J]. J Pharmacol Exp Ther, 2001, 297(2): KAYE B H, CLARK G G, LEBLANCE J E. Image analysis procedures for characterizing the fractal dimension [J]. Particle Characteristic, 1987, 4(1): YOUNG B D, BRYSON A W, VANVLIET B M. An evaluation of the technigue of polygonal harmonies for the characterization of particle shape [J]. Powder Technol, 1990, 63(1): YANG L W, ZHAO X W. Ultrafine grinding and its effects on traditional Chinese medicine [J]. World Sci Technol Mod Tradit Chin Med(世界科学技术: 中医药现代化), 2008, 10(6): JU A H, ZHOU K, ZHANG J, et al. Study on dissolution rate of general flavonoides in Xanthoceras sorbifolia Bung by technique of superfine grinding [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2013, 30(7): 粒径可能有增大故本试验将粒径控制到 1 μm 收稿日期 HPLC 测定他克莫司软膏体外透皮吸收肖学成熊驰彭秀菊张磊(湖北中医药大学药学院武汉摘要目的 ) 建立规格为 0.03%的他克莫司软膏体外透皮接收液中药物的 HPLC 测定方法研究 0.03%他克莫司软膏的体外透皮量方法采用 Diamonsil C18 色谱柱(250 mm 4.6 mm 5 μm) 流动相乙腈-水-磷酸( ) 流速 1.0 ml min 检测波长 215 nm 体外透皮实验采用改良的 Franz 直立式扩散池透皮屏障采用实验用离体乳猪皮将自制软膏与市售软膏的透皮结果进行对比分析分别在设定的不同时间点取样测定透皮接收液中他克莫司的浓度计算累积透皮量结果他克莫司的标准曲线方程为 A= C (r= ) 线性范围为 2.088~20.88 µg ml 作者简介肖学成男博士教授 Tel: 中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期 xiaoxcen@sina.com Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 839

2 平均回收率为 99.10% 累积透皮量与时间呈良好的线性关系, 自制软膏与市售软膏的透皮结果无显著性差异结论检测方法操作简便, 快速准确, 是考察他克莫司软膏体外透皮性能的理想方法关键词 : 他克莫司 ; 软膏 ; 透皮吸收 ; 高效液相色谱法中图分类号 :R 文献标志码 :B 文章编号 : (2014) DOI: /j.cnki.issn 该 Determination of Percutaneous Absorption of Tacrolimus Ointment by HPLC XIAO Xuecheng, XIONG Chi, PENG Xiuju, ZHANG Lei(College of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish an HPLC method for quantitative determination of tacrolimus in vitro percutaneous solution, and investigate the ability of percutaneous penetration of 0.03% Tacrolimus ointment. METHODS Diamonsil C 18 column(250 mm 4.6 mm, 5 μm) was used as the fixed phase and a mixture of acetonitrile, purified water and phosphoric acid( ) as mobile phase. The flow rate was 1.0 ml min 1. The detection wavelength was at 215 nm. Improved Franz type diffusion cells were used in vitro permeation studies and excised mini pigs skins in vitro were used as transdermal barrier. The concentration of tacrolimus in the receptor solution was determined by HPLC to investigate its cumulative permeation quantities at different time respectively and compared with that of the commercial ointment. RESULTS The regression equation of Tacrolimus ointment was linear in the range of µg ml 1 (A= C , r= ). The average recovery was 99.10%. A good linear relationship existed between the cumulative penetration quantities and the time. There was no significant difference in the permeation quantities between the self-made and commercial ointment. CONCLUSION The method is simple, rapid, and accurate. It is a good method to evaluate the characteristic of permeation for Tacrolimus ointment. KEY WORDS: tacrolimus; ointment; percutaneous absorption; HPLC 他克莫司, 又名 FK506, 是一种具有免疫活性的大环内酯类抗菌药物, 有很强的免疫抑制作用, 通过抑制早期淋巴细胞相关基因的表达, 从而抑制 T 淋巴细胞的免疫活性 [1] 他克莫司在皮肤科的主要应用有特异性皮炎掌跖部湿疹溢脂性皮炎慢性光化性皮炎银屑病白癜风大疱性疾病斑秃及其他头皮皮肤病酒渣鼻肉芽肿性疾病坏疽性脓皮病的伤口愈合皮肤型红斑狼疮和结缔组织疾病继发性皮肤瘙痒症及其他皮肤病 [2-3] 本研究建立了高效液相色谱法测定 0.03% 他克莫司软膏体外透皮吸收量, 结果表明该方法能使样品得到较好分离, 排除辅料及其他干扰, 方法操作简便, 快速准确, 可用于产品的质量控制和体外透皮量检测, 为临床使用提供了实验依据 1 材料 1.1 仪器 AUW220D 分析天平 ( 日本岛津 );HH 型恒温电热水浴器 ( 巩义市英峪予华仪器厂 );HJ-4A 型数显恒温多头磁力搅拌器 ( 金坛市岸头中旺实验仪器厂 ); 改良的 Franz 直立式扩散池 ( 自制 );KNAUER 高效液相色谱仪 ( 德国诺尔公司 ) 1.2 试样市售 0.03% 他克莫司软膏 ( 日本 Astellas Toyama Co., Ltd. Toyama Plant, 批号 :029720);0.03% 他克莫司软膏 ( 武汉诺安药业有限公司, 批号 : , , ); 他克莫司对照品 ( 国药集团川抗制药有限公司, 批号 :110201, 纯度 :99.7%);0.9% 氯化钠水溶液 ( 即生理盐水, 氯化钠, 台山市新宁制药有限公司 ); 无水乙醇 ( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司 ); 乙腈 ( 色谱纯, 天津科密欧化学试剂有限公司 ); 磷酸 ( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司 ) 1.3 动物实验用小型乳猪 ( 巴马香猪 ), 购自重庆宗申医达生物技术研发有限公司, 健康,,9 周, 体质量 7.2 kg, 许可证号 :SYXK( 渝 ) 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为 Diamonsil C 18 色谱柱 (250 mm 4.6 mm,5 μm); 流动相 : 乙腈 - 水 - 磷酸 ( ); 流速 :1.0 ml min 1 ; 检测波长 :215 nm; 进样量 :20 µl 2.2 溶液的配制 840 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期

3 2.2.1 对照品储备液的制备精密称取他克莫司对照品 mg, 至 100 ml 量瓶中, 加生理盐水 - 无水乙醇 (50 50) 溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即得浓度为 µg ml 1 的溶液, 作为对照品储备液对照品溶液的制备吸取 5 ml 对照品储备液置于 50 ml 量瓶中, 加生理盐水 - 无水乙醇 (50 50) 溶解并稀释至刻度, 即为浓度为 µg ml 1 的对照品溶液空白软膏基质的制备按处方量制备成不含他克莫司的阴性样品适量, 作为空白软膏基质空白基质液的制备取空白软膏基质 0.5 g, 将其均匀涂布于固定在 Franz 扩散池的猪皮上, 12 h 后取接收液适量, 用孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤过, 取续滤液作为空白基质液样品溶液的制备取 0.03% 他克莫司软膏 0.5 g, 将其均匀涂布于固定在 Franz 扩散池的猪皮上,12 h 后取接收液适量, 孔径为 0.45 μm 的微孔滤膜滤过, 取续滤液作为样品溶液 2.3 专属性试验分别取 2.2 项下中对照品溶液空白基质液样品溶液各 20 μl 进样, 记录色谱图, 结果表明在此色谱条件下, 空白基质不会对皮肤产生影响, 且空白基质在他克莫司主峰处无吸收峰, 故对他克莫司的含量测定无干扰结果见图标准曲线的绘制精密量取项下对照品储备液各 2,5, 3,5,3,5 ml 分别至 100,100,50,50,25, 25 ml 的量瓶中, 加生理盐水 - 无水乙醇 (50 50) 稀释至刻度, 摇匀, 得到浓度分别为 2.088,5.22, 6.264,10.44,12.528,20.88 µg ml 1 的系列标准溶液按 2.1 项下色谱条件, 分别进样 20 μl, 以峰面积 A 为纵坐标浓度 C 为横坐标, 得标准曲线方程为 A= C (r= ), 表明他克莫司浓度在 2.088~20.88 µg ml 1 内线性关系良好图 1 高效液相色谱图 A 对照品溶液 ;B 空白基质液 ;C 12 h 后接受液 Fig. 1 HPLC chromatograms A reference solution; B blank substrate solution; C accept liquid after 12 h 2.5 精密度试验精密量取 2.2 项下对照品储备液各 5 ml, 分别移至 100,50 和 25 ml 量瓶中配制成 5.22, 和 µg ml 1 的低中高 3 个浓度的他克莫司对照品溶液, 分别于 1 d 内每个浓度重复进样 5 针, 连续进样测定 6 d, 根据所得数据计算得到日内精密度 RSD 为 1.32%, 日间精密度 RSD 为 1.96% 2.6 回收率实验按项下对照品溶液的配制方法, 配制浓度为 µg ml 1 对照品溶液 2 份按处方量制备出含他克莫司分别为 80%,100%,120% 的样品软膏, 制备成对应的供试品溶液每个浓度制备 3 批供试品溶液, 每批供试品溶液 1 式 2 份在每个浓度项下,2 份对照品溶液及每份供试品各进样 2 次, 进样量 20 µl, 测定峰面积, 用外标法计算回收率, 结果为 80%,100%,120% 3 种浓度的回收率分别为 99.32%,98.92% 和 99.07%, 平均回收率为 99.10% 2.7 样品溶液稳定性将 12 h 接收液于室温下存放 24 h, 分别于 0, 4,6,8,12,24 h 量取 20 µl 注入液相色谱仪, 计算峰面积的 RSD 为 1.47%, 表明样品溶液在 24 h 内稳定 2.8 体外透皮实验离体猪皮的制备巴马香猪处死后立即剪取腹部皮肤, 仔细剥离皮下脂肪层和结缔组织, 用生理盐水冲洗干净, 置生理盐水中, 低温冰箱保存备用实验前自然解冻, 并用生理盐水浸泡 30 min, 用滤纸吸干, 备用 [4] 每块皮肤随机分成 2 份,1 份用市售软膏, 另 1 份用自制软膏, 以尽量消除动物皮肤不同所产生的误差透皮扩散装置采用改进的 Franz 立体扩散装置, 接受递质体积为 14 ml, 有效释药面积为 4.7 cm 2,(37±0.5) 恒温, 搅拌速度为 300 r min 实验步骤取制备好的离体猪皮置于 Franz 立式扩散池的 2 个半池之间, 用夹子固定好皮肤角质层朝上, 分别取 0.03% 他克莫司软膏 0.5 g 均匀涂布于皮肤上, 在接受池中加生理盐水 - 无水乙醇 (50 50)14 ml, 以皮肤恰好与液面接触为好, 用磁力搅拌器不断搅拌接收液, 使药物自然释放, 保持 (37±0.5) 恒温水浴分别于涂布后的 1,2, 4,6,8,12 h 各点取接受液 1 ml[ 取样后即向接受室内补充 1 ml 生理盐水 - 无水乙醇 (50 50)] 中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 841

4 用 0.45 μm 微孔滤膜过滤, 取续滤液进样测定, 按下列公式计算单位面积累积渗透量 (Q): n 1 Q n =V o q n /V+ i 式中 V o 为接收液总体积,V 为取样量,q n 为第 n 次实测单位面积渗透量 q n = 样品峰面积对照 1 q i 品浓度接收液取样量 /( 对照品峰面积释放面积 ),q i 为第 n 次前每次测得的单位面积渗透量实验结果各时间点药物单位面积累计渗透量见表 1 以单位面积累积渗透量对时间进行线性回归, 所得直线斜率即透皮速率, 结果见表 2 表 1 2 处方药物单位面积累积渗透量 Tab. 1 Cumulative permeation in unit area of two formulations 累积渗透量 /μg 项目 1 h 2 h 3 h 4 h 6 h 8 h 10 h 12 h 自制软膏定量限以下, 未检出市售软膏定量限以下, 未检出表 2 2 处方药物单位面积累积渗透量 Q 及透皮速率分析 Tab. 2 Analysis between cumulative permeation Q in unit area of two formulations and penetration rate 处方回归曲线方程相关系数 r 透皮速率 /μg cm 2 h 1 12 h 累积渗透量 /μg cm 2 自制软膏 Q= t 市售软膏 Q= t 自制软膏和市售软膏的平均累积渗透量的统计分析结果表明, 他克莫司的累积渗透量与渗透时间呈良好的线性关系, 且自制软膏与市售软膏的平均积累渗透量没有明显差异结果见表 3 表 3 2 处方平均累积渗透量的比较 ( 方差分析表 ) Tab. 3 Comparison of average cumulative permeation of two prescription drugs (analysis of variance table) 变异来源离均差平方和 SS 组间组内自由度均方 MS F 值 P 值 (>0.05) 3 讨论由于他克莫司在水中几乎不溶, 而易溶于乙醇, 考虑到他克莫司的溶解性, 及皮肤的生理特性, 选用生理盐水 - 无水乙醇 (50 50) 为透皮接受介质体外方法最常用于皮肤穿透性研究, 体外皮肤对化合物和水的渗透试验显示人和猪的皮肤是相似的在体外相同的条件下, 用猪皮肤预测人皮肤的通透性数据亦是相似的, 一些化合物体内皮肤穿透证明, 刚断奶的猪的背部皮肤与人的前臂皮肤最相近, 而小型猪的皮肤与人的皮肤穿透性特征最接近所以本实验选用小型猪猪皮为模型进行透皮分析在体外皮肤渗透实验中, 动物皮肤中的蛋白质的脱落或溶解不仅会污染接受液而且本身可能会有紫外吸收, 在本研究中, 波长 215 nm 处没有任何干扰主药测定的物质存在, 因此, 笔者采用检测灵敏度较高的 HPLC 测定吸收液中的他克莫司的含量, 排除了干扰, 得到了基线分离, 保证了实验结果的准确本实验采用改进的 Franz 立体扩散装置考察他克莫司体外透皮量, 操作简便, 重复性好为防止由于猪皮中蛋白质和脂质等大量生物大分子在接收液中溶出影响检测结果污染色谱柱, 因此在进行 HPLC 检测之前必须对接收液进行过滤由测定结果可以看出, 自制软膏和市售软膏的相关系数透皮速率及 12 h 累积渗透量均非常平行, 其结果是准确可信的 2 处方平均累积渗透量方差统计分析结果显示, 自制软膏与市售软膏的透皮平均累积渗透量无显著性差异, 即两者透皮现象基本一致, 表明两者的治疗效果相当 REFERENCES [1] WU X J, ZHEN M. Progress of tacrolimus topical treatment of skin diseases [J]. Chin J Dermatol( 中华皮肤科杂志 ), 2002, 35(6): [2] MA Y, CHEN L J. Progress of Tacrolimus ointment in the application of dermatology [J]. Shanghai J Pharm( 上海医药 ), 2010, 31(4): [3] LAN S, YE D M, MO G Y. Investigation on the relationship between tacrolimus blood concentration and clinical efficacy in treatment of nephrotic syndrome patients [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2013, 30(8): Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期

5 [4] ZHANG Y, XU S B. The effect of different permeation receptors and various exercised animal skin on the percutaneous permeability of glimepiride in vitro [J]. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni(中山大学学报自然科学版), 2004, 43(5): LIU P S, ZHEN J R. The relevant information of using pig as transdermal experimental animal Model [J]. Foreign Med Sci(Sec Dermatol Venereol)(国外医学皮肤性病学分册), 2001, 27(4): 收稿日期 UPLC 同时测定复方守宫散中核苷类含量吴健 1,2 高家荣 1,2* 韩燕全 1 李翔 1(1.安徽中医药大学第一附属医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室合肥安徽中医药大学合肥 ) 摘要目的建立 UPLC 同时测定复方守宫散中腺嘌呤腺苷含量的方法方法色谱柱 Acquity BEH C18(2.1 mm 100 mm 1.7 μm) 甲醇-水为流动相梯度洗脱流速 0.25 ml min 柱温 26 检测波长 254 nm 结果腺嘌呤腺苷的进样量分别在 ~ mg ml (r= )和 ~ mg ml (r= )内与其峰面积呈良好的线性关系平均回收率分别为 97.7% 97.7% RSD 分别为 0.96% 1.18% 结论该方法快速可靠准确可作为复方守宫散的质量控制方法关键词超高效液相色谱复方守宫散腺嘌呤腺苷含量测定中图分类号 R 文献标志码 B DOI: /j.cnki.issn 文章编号 (2014) Simultaneous Determination of Nucleoside Contents in Compound Shougong Powder by UPLC WU Jian1,2, GAO Jiarong1,2*, HAN Yanquan1, LI Xiang1(1.The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, Grade 3 Laboratory of TCM Preparation, State Administration of TCM, Hefei , China; 2.Anhui University of Chinese Medicine, Hefei , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a UPLC method for the determination of adenine and adenosine in Compound Shougong powder. METHODS The determination was performed on Acquity BEH C18(2.1 mm 100 mm, 1.7 μm) with mobile phase consisted of methabol-water(gradient elution) at a flow rate of 0.25 ml min. Column temperature was 26. The UV detection wavelength was set at 254 nm. RESULTS The calibration curves were linear in the range of mg ml(r= ) for adenine, mg ml(r= ) for adenosine. The average recoveries were 97.7%, 97.7% and RSDs were 0.96%, 1.18%, respectively. CONCLUSION The determination method is fast, reliable, accurate, and can be used for quality control of Compound Shougong powder. KEY WORDS: UPLC; Compound Shougong powder; adenine; adenosine; content determination 复方守宫散为安徽中医药大学第一附属医院外核苷类成分有可能亦是主要活性成分[4] 在前特色中药制剂由守宫何首乌生晒参三七期生产过程中仅采用薄层扫描法对其蒽醌类成梅花没药 6 味药组成处方来源于安徽中医药分进行测定不能全面有效反映制剂的质量大学第一附属医院肿瘤科经验方具有补虚解毒根据国家食品药品监督管理局对医院制剂质量标消肿止痛功效临床应用近 20 年对于晚期肿瘤准提高的要求本实验采用 UPLC 对制剂中的腺 [1] 及肿瘤化疗患者增强免疫力效果良好其君药守嘌呤腺苷含量进行同时测定以达到控制制剂宫具有祛风定惊止咳平喘散结解毒通络止质量保证用药安全有效的目的痛等功效临床用于肿瘤的治疗效果确切 [2-3] 但其抗肿瘤的物质基础尚不明确除了小分子多肽 1 材料 1.1 仪器基金项目国家中医药重点学科(临床中药学)建设项目(国中医药人教发[2012]32 号) 安徽中医药大学青年科学研究基金项目(2013qn019) 作者简介吴健男硕士主管药师药师硕导 Tel: (0551) Tel: (0551) wujian7997@163.com * 通信作者高家荣男硕士主任 zyfygjr2006@163.com 中国现代应用药学 2014 年 7 月第 31 卷第 7 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2014 July, Vol.31 No.7 843

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.