2013,33(3) 巩元勇等 : 植物表达载体 pcambia S GUS CaMVterm 的构建及验证 87 图 1 pcambia2300 载体多克隆位点示意图 Fig.1 Schematicdiagram ofmultiplecloning sitesofpcambia2300

Save this PDF as:
 WORD  PNG  TXT  JPG

Size: px
Start display at page:

Download "2013,33(3) 巩元勇等 : 植物表达载体 pcambia S GUS CaMVterm 的构建及验证 87 图 1 pcambia2300 载体多克隆位点示意图 Fig.1 Schematicdiagram ofmultiplecloning sitesofpcambia2300"

Transcription

1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(3):86 91 植物表达载体 pcambia S GUS CaMVterm 的构建及验证 1,2 巩元勇 2 冯永坤 1 倪万潮 1 束红梅 1 郭书巧 2 刘来华 (1 江苏省农业科学院经济作物研究所农业部长江下游棉花和油菜重点实验室 南京 ) (2 中国农业大学资源 环境及粮食安全中心教育部植物与土壤互作重点实验室 北京 ) 摘要为拓宽 pcambia2300 表达载体的使用范围, 进一步方便植物基因工程科研工作者在构建表达载体时的需要, 利用 SacⅠ 和 XhoⅠ 双酶切 pjit166 载体获取 35S GUS CaMVterm 片段, 将该片段插入到 pcambia2300 表达载体的多克隆位点区, 构建完成了 pcambia S GUS CaMVterm 表达载体 所构建的表达载体通过农杆菌介导转化拟南芥, 获得拟南芥转基因植株, 转基因植株的 GUS 染色结果进一步验证了本文所构建表达载体的正确性和实用性 该表达载体的成功构建, 方便了构建基因超表达载体, 以及使得研究启动子的活性及 GUS 组织化学定位成为可能, 还可以通过 GUS 染色对转基因植物进行鉴定, 为植物基因工程科研工作提供了一个较好的备选植物表达载体 关键词植物表达载体 pcambia2300 pjit166 中图分类号 Q812 pcambia 系列载体是植物基因工程中最常用的植物双元表达载体之一,pCAMBIA2300 因其在植物转化时具有最短的异源序列, 所以在 pcambia 系列中被归到 最小选择载体 之列 pcambia2300 的载体骨架是 puc18, 全长 8742bp, 在细菌和植物转化时所用的选择标记都是卡那霉素 (Kan) 1, 在其多克隆位点区域 (multiplecloningsites,mcs) 包含 EcoRⅠ SacⅠ Kpn Ⅰ SmaⅠ BamHⅠ XbaⅠ SalⅠ PstⅠ 和 HindⅢ 等 9 个常用的限制性内切酶酶切位点 ( 图 1), 但是不包含其它的功能基因元件 ( 组成型启动子 终止子和报告基因等 ) 因此该表达载体最直接的应用是, 在 MCS 选择合适的位点插入包含基因本身的启动子序列 编码区序列和终止子序列在内的核苷酸片段, 用于基因功能 [1] 互补研究 例如,Hu 等将全长为 9.4kb 的 OsLTN1 收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金 ( ) 江苏省自然科学基金 (BK ) 江苏省博士后科研资助计划 ( B) 国家转基因植物新品种培育科技重大专项 (2011ZX ) 资助项目 并列第一作者 通讯作者, 电子信箱 yahoo.com.cn 基因的 DNA 片段, 通过 XhoI 和 KpnI 位点插入 pcambia2300 载体, 转化水稻 ltn1 突变体植株用于 [2] OsLTN1 基因的功能互补研究 ; 巩元勇克隆了全长为 5590bp 的 AtGLR2.5 基因的基因组核苷酸片段, 通过在该序列两端添加的 BamH I 酶切位点连入 pcambia2300 载体, 转化拟南芥 Atglr2.5 1 突变体植 [3] 株用于 AtGLR2.5 基因的功能互补研究 ;Zhou 等将 2kb 的 MOM1 基因启动子序列 MOM1 基因 CDS 和 1.5 kb 的 MOM1 基因编码区终止子后的 DNA 序列片段分别通过 SalⅠ BamHⅠ,BamHⅠ KpnⅠ, 和 KpnⅠ EcoRⅠ 位点插入 pcambia2300 载体, 用于基因功能互补的研究 为拓宽 pcambia2300 载体的使用范围, 研究者采用必要的基因工程手段, 或通过中间表达载体过渡, 以便获得必需的基因功能元件, 再将所需片段整体切下插入 pcambia2300 载体 ; 或直接将基因功能元件添加到 pcambia2300 载体中, 先对该载体进行改造, 再将 1 载体图谱见 :htp://

2 2013,33(3) 巩元勇等 : 植物表达载体 pcambia S GUS CaMVterm 的构建及验证 87 图 1 pcambia2300 载体多克隆位点示意图 Fig.1 Schematicdiagram ofmultiplecloning sitesofpcambia2300vector [4] 目的基因插入 周鹏等先将人胰岛素样生长因子 Ⅰ (huigf Ⅰ) 基因插入 pbi121 载体, 获得 35S huig F I NOSterm 片段, 再将该片段切下连入 pcambia2300 载体中 当前对 pcambia2300 改造后使用最普遍的是 pcambia S OCS( 章鱼碱合成 [5] 酶终止序列 ) 载体, 陈虞超等克隆了水稻硅转运子基因 Lsi1 和 Lsi2, 然后分别将这两个基因插入 pcambia S OCS 载体, 构建了 pcambia S Lsi1 OCS 和 pcambia S Lsi2 OCS 植物表达 [6] 载体 ; 张艳妮等以海岛棉基因组 DNA 为模板扩增获得了 DREB 基因编码框的 DNA 片段, 然后将该片段连入 pcambia S OCS 载体, 构建了 [7] pcambia S DREB OCS 表达载体 ; 田华英等 扩增获得尾穗苋凝集素 (ACA) 基因, 并将该基因通过 KpnⅠ 和 SalⅠ 位点连入 pcambia S OCS 载体, 构建了 pcambia S ACA OCS 表达载体 ; 院海 [8] 英等以质粒 pmc30 作为模板, 扩增 GFP 基因, 然后连入 pcambia S OCS 载体, 构建过量表达载体 pcambia S GFP OCS 经过改造后的 pcambia S OCS 载体, 在植物基因工程研究中的使用范围还相对较窄, 还存在可以进一步提高的空间 因此, 本研究用 SacⅠ 和 Xho Ⅰ 双酶切 pjit166 载体, 获取 35S GUS CaMVterm 片段, 然后将该片段插入 pcambia2300 的 MCS, 最终完成对 pcambia2300 的改造, 构建获得 pcambia S GUS CaMVterm 植物表达载体, 相对于 pcambia S OCS 载体进一步拓宽了 pcambia2300 载体的使用范围 1 材料与方法 1.1 实验材料 种子 载体和菌株拟南芥 (Arabidopsis thalianal. Col 0 生态型 ) 种子,pCAMBIA2300 和 pjit166 载体, 以及根癌农杆菌菌株 GV3101 为中国农业大学资源与环境学院刘来华教授实验室保存 主要试剂限制性内切酶和 T4DNA 连接酶是 NEB 公司产品 ;DNA 快速提取试剂盒 (Extract N AmpTM PlantPCRKits) 是 Sigma 的产品 ;EasyTaqDNA 聚合酶是北京全式金生物技术有限公司产品 ; 用于 GUS 组织化学染色的 X GLUC 是 BBI 的产品, 购于上海生工生物工程技术服务有限公司 1.2 pcambia S GUS CaMVterm 载体的构 用 SacⅠ 和 XhoⅠ 双酶切 pjit166 载体, 琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物, 按照琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒说明书操作回收大于 3000bp 的酶切产物, 所得即为包含 35S GUS CaMVterm 的插入核苷酸片段 ; 用 SacⅠ 和 XhoⅠ 双酶切 pcambia2300 载体, 琼脂糖凝胶电泳后, 按上述方法回收 8000bp 10000bp 间酶切产物, 所得即为被插入的载体片段 ; 将获得的插入核苷酸片段和被插入载体片段用 T4DNA 连接酶连接, 连接产物以热激法转化到大肠杆菌 Trans1 T1 感受态细胞中, 在含有 Kan(25μg/ml) 的 LB 培养基上筛选具有抗性的菌株, 阳性克隆通过 SmaⅠ 单酶切鉴定 鉴定正确的重组载体, 即为本研究所需改造完成的 pcambia S GUS CaMVterm 载体 1.3 pcambia S GUS CaMVterm 载体的农杆菌转化 将构建好的表达载体通过电击法转化根癌农杆菌菌株 GV3101, 在含有 Rif(100μg/ml) Gen(25μg/ml) 和 Kan(25μg/ml) 的 LB 固体培养基上筛选单菌落, 菌落 PCR 验证为阳性的单菌落转化子保存备用 [2] 1.4 蘸花法 (Floraldip) 转化拟南芥 转化步骤参照 Clough 和 Bent [9] 报道的研究方法, 将最终收获的 T 0 代拟南芥种子用于筛选转基因植株 1.5 转基因拟南芥的转化效率 表达效率统计及 PCR 检测 [10] 采用 Harison 等报道的一种快速筛选转基因拟南芥的方法, 从 T 0 代种子中筛选转化成功的转基因拟南芥 转化效率以筛选获得的转基因拟南芥的个数占总筛选 T 0 代种子数的百分比表示, 表达效率以 GUS 染色成功的株数占筛选获得的转基因拟南芥的个数的百分比表示 按照 DNA 快速提取试剂盒说明书操作, 提取转基因植株的基因组 DNA 作为模板, 在 GUS 序列两端设计引物 GUS F(ATGTTACGTCCTGTAGAAACCC)

3 88 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 和 GUS R(TCATTGTTTGCCTCCCTGCT) 用于 PCR 检测 将经过 PCR 检测仍然是阳性的转基因植株收获 T 1 代种子 1.6 转基因拟南芥的 GUS 染色检测将收获的 T 1 代转基因拟南芥种子土培, 经 PCR 检测后收获 T 2 代种子 ; 继续种植 T 2 代种子,PCR 检测后收获的 T 3 代种子用于后续的 GUS 染色检测 不同单株的 T 3 代种子用 1/2MS 固体培养基垂直培养, 待拟南芥主根长到 2cm 左右用于 GUS 染色检测 参照 Weigel 和 Glazebrook 的方法进行 GUS 组织化学染色, 用显微镜观察染色结果并拍照 [11] 2 结果与分析 2.1 pcambia S GUS CaMVterm 表达载体的构建 pjit166 载体全长 5612bp, 经 SacⅠ 和 XhoⅠ 双酶切后产生 3426bp 的大片段和 2186bp 的小片段 ( 如图 2), 其中大片段包含 35S GUS CaMVterm 基因元件, 也就是本研究所构建载体需要的插入核苷酸片段, 将该片段回收用于后续实验 图 3 pcambia2300 载体 SacⅠ /SalⅠ 双酶切产物电泳分析 Fig.3 Gel electrophoreticanalysisofsacⅠ /SalⅠ double digestedpcambia2300vector M:1KbDNAMarker;1:SacⅠSalⅠ double digestedpcambia2300 的 pcambia S GUS CaMVterm 表达载体 Sma Ⅰ 单酶切鉴定所构建表达载体, 如图 4 所示, 酶切产物包含 10000bp 左右的大片段和 2000bp 左右的 GUS 小片段, 表明所构建的表达载体正确无误 图 2 pjit166 载体 SacⅠ /XhoⅠ 双酶切产物电泳分析 Fig.2 Gel electrophoreticanalysisofsacⅠ /XhoⅠ double digestedpjit166vector M:1KbDNAMarker;1:SacI/XhoIdouble drgestedpjit166vector 选取 pcambia2300 载体多克隆位点区的 SacⅠ 和 SalⅠ 进行双酶切, 以便获得相应的粘性连接末端, 切除两酶切位点间 23bp 的小片段后, 剩余 8719bp 的载体大片段 ( 如图 3) 段回后收用于所构建表达载体的骨架部分 将来自 pjit166 的包含 35S GUS CaMVterm 的核苷酸片段和 pcambia2300 经 SacⅠ 和 SalⅠ 双酶切后的大片段用 T4DNA 连接酶连接后, 获得本研究需要构建 图 4 pcambia S GUS CaMVterm 载体 SmaⅠ 酶切产物电泳检测 Fig.4 Gel electrophoretictestofsmaidigested pcambia S GUS CaMVterm vector M:1KbDNAMarker;1:SmaⅠ digested pcambia S GUS CaMVterm 2.2 转基因拟南芥的转化效率 表达效率统计及 PCR 检测选取转化获得的 2000 粒 T 0 代转基因拟南芥种子, 通过快速筛选转基因拟南芥的方法筛选得到 22 株具有 Kan 抗性的转基因苗, 转化率达到 1.1%; 用这 22 株转基因苗的叶片进行 GUS 染色, 只有 3 株转基因苗 GUS 染色没有成功, 表明表达效率为 77.27% 用 DNA 快速提取试剂盒提取 9 个染色成功植株的叶片基因组 DNA, 以引物 GUS F 和 GUS R 进行 PCR 扩增检测 PCR 扩增电泳结果见图 5,9 株转基因拟南芥都扩增出

4 2013,33(3) 巩元勇等 : 植物表达载体 pcambia S GUS CaMVterm 的构建及验证 89 来略小于 2000bp 的特异性片段, 同以 pcambia S GUS CaMVterm 质粒为模板的阳性对照扩增结果一致 图 5 pcambia S GUS CaMVterm 转化植株 PCR 检测结果 Fig.5 PCR baseddetectionofpcambia S GUS CaMVterm intransgenicplants M:DNAMarker I;1 9:pCAMBIA S GUS CaMVtermtransenicplants;N:Water;P:Plasmid 2.3 转基因拟南芥的 GUS 染色检测将转基因拟南芥继代培养并通过 PCR 检测后的 T 3 代植株用于 GUS 组织化学染色检测, 通过对拟南芥根尖部位的 GUS 染色结果显示,GUS 基因在拟南芥根部的所有组织都有强烈表达 ( 图 6), 进一步证明本研究所构建的表达载体的正确性 方法达到试验目的 本研究所构建的 pcambia S GUS CaMVterm 表达载体 ( 图 7), 在以下几个方面拓宽了原先 pcambia2300 表达载体的使用范围 : 首先, 可以使用 GUS 基因序列两端的多个酶切位点, 将 GUS 核苷酸片段切除, 把要研究基因的编码序列插入, 用于构建基因超表达载体 ; 其次, 可以将载体中的 35S 启动子序列用所要研究的启动子序列替换, 用 GUS 染色研究启动子的活性或化学组织定位 ; 再次, 载体上的 CaMVterm 序列可以为所研究的基因提供终止序列, 避免在构建载体时重新添加终止序列 ; 最后, 载体上的 SacⅠ 和 Pst Ⅰ 酶切位点还可以插入基因全部序列 ( 启动子序列 编码区序列和终止子序列 ) 用于构建功能互补表达载体, 而 GUS 染色可用作对转基因植物的快速鉴定 pcambia S GUS CaMVterm 载体同 pcambia S OCS 载体相比最直观的区别是多了 GUS 片段, 因此相比而言所增加的最主要的是对基因启动子的研究范围 pcambia 系列载体也有部分载体包含有类似本文所构建载体的 35S GUS CaMVterm 部分, 如 pcambia2301 载体就含有 35S GUS NOSterm 序列, 但由于缺乏必要的酶切位点, 使得该类载体的主要功能是前面所述的本文所构建载体的最后一项功能 图 6 转基因拟南芥主根根尖部位 GUS 组织化学染色 Fig.6 ExpresionofGUSgeneinprimaryroot tipoftransgenicarabidopsisthaliana 3 讨论 同尾酶是指能识别不同的核苷酸序列, 但能够切出相同末端的限制性内切酶 同尾酶的合理使用, 在基因克隆和表达载体构建等基因工程操作过程中往往能够起到异曲同工之妙 最常见的同尾酶有 SalⅠ 和 XhoⅠ BamHⅠ 和 BglⅡ SmaⅠ 和 XmaⅠ 等, 本研究中就使用到了 SalⅠ 和 XhoⅠ 这一组同尾酶 pcambia2300 载体 MCS 上的 SalⅠ 位点和 pjit166 上 CamvTerm 末端的 XhoⅠ 位点为这一组同尾酶的使用提供了前提, 从而使得本研究的载体构建工作在没有相同酶切位点的情况下, 同样可以一蹴而就, 以最便捷的 图 7 pcambia S GUS CaMVterm 载体多克隆位点图谱 Fig.7 pcambia S GUS CaMVterm vectormapandmultiplecloningsites 本文所构建载体也存在某些不足之处 在载体构建过程中为了插入 35S GUS CaMVterm 部分, 使得 KpnⅠ SmaⅠ BamHⅠ XbaⅠ 和 SalⅠ 这 5 个酶切位点被切除或修改, 从而减少了在构建表达载体时对这些位点的选择 ( pcambia S OCS 载体不可避免

5 90 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 的也存在类似的不足 ); 载体所插入的花椰菜花叶病毒 35S 启动子是双子叶植物最常用的组成型启动子之一, 而在单子叶植物中的效果不是很好, 因此限制了本载体的转化对象最好是双子叶植物 希望本研究所构建的 pcambia S GUS CaMVterm 表达载体能够为植物基因工程研究人员提供合适的备选载体, 为相应的科研工作提供便利 参考文献 [1]HuB,ZhuC,LiF,etal.LEAFTIPNECROSIS1Playsa PivotalRoleintheRegulationofMultiplePhosphateStarvation ResponsesinRice.PlantPhysiology,2011,156(3): [2] 巩元勇. 谷氨酸受体基因参与谷氨酸调控根系生长发育的分子机理研究. 北京 : 中国农业大学,2011. GongY Y. Investigation ofthemolecularmechanism ofan InvolvementofGlutamate ReceptorGene(s) in Glutamate regulated Root Growth and development. Beijing: China AgriculturalUniversity,2011. [3]ZhouY,ZhangJ,LinH,etal.Morpheus molecule1isrequired to prevent aberant RNA transcriptional read through in Arabidopsis.PlantPhysiology,2010,154(3): [4] 周鹏, 王跃进, 贺普超. 人胰岛素样生长因子 I 基因农杆菌工程菌株的构建. 西北农林科技大学学报 ( 自然版 ),2001, 29(3): ZhouP,WangYJ,HePC.Theconstructionofrecombinational agrobacterium of huigf I. Journal of Northwest Sci Tech University of Agricultural and Forestry (Natural Science Edition),2001,29(3): [5] 陈虞超, 宋玉霞, 石磊, 等. 水稻硅转运子基因的克隆与表 达载体的构建. 西北农业学报,2009,18(4): ChenYC,SongYX,ShiL,etal.Cloningandconstructionof expresionvectorofsitransportergeneinrice.actaagriculturae Boreali occidentalissinica,2009,18(4): [6] 张艳妮, 陈全家, 张桦, 等. 海岛棉 DREB 基因的克隆及植物表达载体的构建. 新疆农业大学学报,2010,33(4): ZhangYN,ChenQJ,ZhanH,etal.CloningofDREBgene fromislandcoton(gosypiumbarbadensel.)andconstructionof a plantexpresion vector. JournalofXinjiang Agricultural University,2010,33(4): [7] 田华英, 庞彩红, 夏阳, 等. 尾穗苋凝集素 (ACA) 基因植物表达载体的构建. 山东农业科学,2011,6: TianH Y,PangC H,XiaY,etal.Constructionofplant expresionvectorofamaranthuscaudatusagglutinin Gene ( ACA).ShandongAgriculturalSciences,2011,6: [8] 院海英, 吴祥辉, 东锐等.GFP 基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析. 西北植物学报,2012,32(5): YuanHY,WuXH,DongR,etal.ExpresionanalysisofGFP geneinolimarabidopsispumilaandarabidopsisthaliana.acta BotanicaBoreali Occidentaliasinica,2012,32(5): [9] CloughSJ,BentA F.Floraldip:asimplifiedmethodfor Agrobacterium mediatedtransformationofarabidopsisthaliana. ThePlantJournal,1998,16(6): [10]HarisonSJ,MotE K,ParsleyK,etal.A rapidandrobust methodofidentifyingtransformedarabidopsisthalianaseedlings folowingfloraldiptransformation.plantmethods,2006,2: [11]WeigelD,GlazebrookJ.Arabidopsis:alaboratorymanual.New York:ColdSpringHarborLaboratoryPres,2002. ConstructionandVerificationofanPlantExpresionVector pcambia S GUS CaMVterm GONGYuan yong 1,2 FengYong kun 2 GUOShu qiao 1 SHUHong mei 1 NIWan chao 1 LIULai hua 2 (1InstituteofIndustrialCrops,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofCotonandRapeseed, MinistryofAgriculture,Nanjing ,China) (2KeyLaboratoryofPlant SoilInteractions,MinistryofEducation;CenterforResources,EnvironmentandFoodSecurity, ChinaAgriculturalUniversity,Beijing ,China) Abstract InordertobroadenthescopeofuseofplantexpresionvectorpCAMBIA2300andconvenientto useforplantgeneticengineeringscientistsinprocesofconstructionofexpresionvector,thisresearchusedsac ⅠandXhoⅠdouble digestedpjit166vectorobtaining35s GUS CaMVtermfragment,theninsertedthisfragment

6 2013,33(3) 巩元勇等 : 植物表达载体 pcambia S GUS CaMVterm 的构建及验证 91 tomultiplecloningsitesofpcambia2300vector,constructedthefinalexpresionvectorpcambia S GUS CaMVterm.TheconstructedexpresionvectorwasmediatedbyA.tumefacien(strainGV3101)using floral dipmethodtransformedtoarabidopsisthaliana.thegusstainingresultoftransgenicplantswasfurther validatedthecorectnesandpracticalityofthisconstructedvector.theconstructionofthisexpresionvectorwas convenientforconstructinggeneover expresionvector,madeitposibleforstudyingpromoteractivityandgus histochemicallocalization,andcanalsobeusedtoidentifytransgenicplants.thisconstructedexpresionvector providedabeteralternativeplantexpresionvectorforplantgeneticengineeringwork. Keywords Plantexpresionvector pcambia2300 pjit166 沃特世推出表面带电杂化颗粒的全新肽分离色谱柱 沃特世近期推出了一系列创新超高效液相色谱 (UPLC ) 及高效液相色谱 (HPLC) 色谱柱, 可应用于肽图 蛋白组学以及合成肽的分析和实验室纯化 Waters ACQUITYUPLC CSH130C18 及 XSelect TM HPLCCSH130C18 色谱柱为肽分析纯化 UPLC/LC/LC-MS 实验数据质量等建立了全新标准 沃特世采用独家合成方法制造的 CSH130 色谱柱表面带电杂化颗粒, 使颗粒表面均匀带有弱正电荷 该表面带电杂化 (CSH TM ) 颗粒技术使得色谱柱在使用弱酸调节剂 ( 如甲酸 ) 条件时, 能够展现出更好的分离度与灵敏度, 尤其是与使用 MS 信号抑制作用离子对添加剂 ( 如三氟乙酸 TFA) 的标准 LC-MS 方法做对比时 在所有的测试实验中, 全部温度 流速条件下 CSH130 C18 使用甲酸时柱效都有显著提升