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晃响甘
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1 基于全基因组和转录组分析的赤芝密码子使用偏好性比较研究朱孝轩 1, 朱英杰 1, 宋经元 1 1* 1, 2, 孙超, 陈士林 (1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 北京 ; 2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 ) 摘要 : 密码子使用偏好性是物种在遗传信息传递过程中的一个重要特点, 分析物种的密码子使用偏好性对于了解该物种遗传信息的传递规律具有重要意义原有的密码子偏好性分析主要基于全基因组数据完成, 然而由于目前可获得的高等生物全基因组数据有限, 使得密码子偏好性分析受到了极大的限制本研究通过分析赤芝 [Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst] 全基因组及其液体培养菌丝原基和子实体大规模转录组数据, 发现基于全基因组和转录组数据分析获得的所有氨基酸的最优密码子完全一致以上研究结果表明利用大规模转录组数据代替基因组数据分析物种密码子使用偏好性具有可行性通过计算 26 个赤芝萜类合酶 (terpene synthase, TS) 编码基因中大肠杆菌和酿酒酵母稀有密码子所占比例, 发现酿酒酵母稀有密码子在赤芝 TS 基因中所占比例较高, 而大肠杆菌稀有密码子所占比例相对较低, 表明赤芝 TS 基因更难以在酿酒酵母中进行表达参照酵母最优密码子, 利用化学方法全合成 TS 基因将是解决外源基因与底盘系统密码子不匹配问题的有效手段关键词 : 赤芝 ; 基因组 ; 转录组 ; 密码子偏好性中图分类号 :R931 文献标识码 :A 文章编号 : Comparative studies on codon usage bias of Ganoderma lucidum based on analysis of genomic and transcriptomic data ZHU Xiao-xuan 1, ZHU Ying-jie 1, SONG Jing-yuan 1, SUN Chao 1*, CHEN Shi-lin 2 (1. Institute of Medicinal Plant Development, China Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing , China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing , China) 收稿日期 : ; 修回日期 : : 共同第一作者项目基金 : 国家自然科学基金面上项目 ( ), 协和青年基金 (2013), 中央高校基本科研业务费专项资金 (2013) 通讯作者 :Tel: , Fax: , csun@implad.ac.cn

2 Abstract: Codon usage bias is an important characteristic of genetic information transfer in organisms. Analysis of codon usage bias of different species is important for understanding the rules on genetic information transfer. The previous method for analysis of codon usage bias is mainly based on genomic data. However, this method is greatly limited, because the genome sequences of most higher organisms are still not available up to date. In this study, we found that we could obtain the same optimal codons of Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst based on its whole genomic data or large-scale transcriptomic data from its liquid-cultured hyphae, primordium and fruiting body, respectively. This result indicated the feasibility to understand the codon usage bias based on the large-scale transcriptomic data. By calculating the proportion of rare codons of Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae in 26 terpene synthase (TS) of G. lucidum, we found that the rare codons of S. cerevisiae has a higher proportion in TS genes, while the rare codons of E. coli has relatively lower, suggesting that the TS genes of G. lucidum are possibly more difficult to be expressed in S. cerevisiae than in E.coli. Chemical synthesis of TS genes according to the yeast optimal codons will be an effective way to solve the problem on the mismatch of gene codon bias between the foreign genes and the host strain. Key words: Ganoderma lucidum; genome; transcriptome; codon usage bias 密码子是遗传信息输出的重要环节, 是连接 DNA 和蛋白质的信息纽带每种氨基酸至少对应一种密码子, 最多对应 6 种密码子编码同一种氨基酸的密码子称为同义密码子在蛋白质翻译过程中, 同义密码子的使用频率并不相同, 某一物种甚至某一基因通常倾向于使用一种或几种特定的同义密码子, 这种现象被称为密码子使用偏好性已有研究表明, 密码子使用偏好性与基因表达水平 [1,2] trna 丰度 [3,4] GC 含量 [5-7] [8,9] [10] 突变偏好以及基因长度等众多因素相关不同物种之间的密码子使用偏好往往不同, 甚至同一物种不同基因的密码子使用偏好也存在很大的差异通过密码子使用偏好性分析, 寻找和发现不同物种的密码子使用偏好特点, 对于物种分子进化规律的分析及外源表达基因的序列优化等都具有重要的意义以往的密码子使用偏好性研究主要是通过全基因组数据分析完成的但是目前已完成全基因组测序的高等生物还很少, 已严重制约了对不同物种的密码子偏

3 好性研究相对于全基因组测序的高投入和高难度, 随着高通量测序技术的不断进步 [11-12], 转录组测序已变得更加经济和快捷 [13], 目前 NCBI 等数据库中已积累了大量物种的大规模转录组数据通过大规模转录组数据分析物种的密码子使用偏好性将成为解决基因组数据匮乏问题的新途径赤芝 [Ganoderma lucidum (Curtis: Fr.) P. Karst] 是传统珍贵中药材, 其药用记载最早出现在神农本草经上, 目前赤芝已被美国草药药典与治疗纲要 (American Herbal Pharmacopoeia and Therapeutic Compendium) 收录 [14], 药用价值已得到世界各国的广泛认可赤芝中含有多种生物活性物质, 目前已有 400 多种不同的化合物被鉴定出来 [15], 其中灵芝三萜和灵芝多糖是赤芝的主要药用活性成分本研究以赤芝为材料, 基于本课题组完成的赤芝基因组和转录组数据 [16] 对赤芝的密码子使用偏好性进行了系统研究, 首次证明了基于基因组和大规模转录组数据的分析结果的一致性, 从而为通过大规模转录组数据分析研究物种的密码子使用偏好性, 进而为研究物种的进化规律及异源基因表达的优化奠定了基础此外, 通过分析赤芝中 26 个萜类合酶 (terpene synthase, TS) 编码基因中大肠杆菌和酿酒酵母稀有密码子所占比例, 为实现赤芝萜类化合物在微生物系统中的高效异源表达奠定了基础材料与方法数据来源赤芝 (C. lucidum) 基因组与转录组数据来源于赤芝基因组数据库 ( [16] 通过编写 Perl 语言程序, 对数据进行筛选, 标准如下 :1 密码子数大于等于 100 (300 bp) 的蛋白质编码序列 (coding sequence,cds);2 能够比对到 NCBI 公共数据库酿酒酵母与大肠杆菌的密码子使用偏好性数据来源于数据库 Codon Usage Database ( 同义密码子相对使用度分析同义密码子相对使用度 (relative synonymous codon usage, RSCU) 是对同义密码子使用偏好的评估该值等于同义密码子的实际观测值与同义密码子平均使用期望值的比值如果密码子使用无偏好性, 则 RSCU 值为 1; 如果该密码子比其他同义密码子使用更频繁, 则其 RSCU 值大于 1; 反之 RSCU 值则小于 1 [17] 同义密码子相对使用度分析使用 CodonW 1.4.2

4 ( 完成有效密码子数分析有效密码子数 (effective number of codons, ENC or Nc) 检测单个基因密码子非均衡使用的偏好程度, 取值范围为 20( 每个氨基酸只使用一个密码子 ) 到 61( 各个密码子被均衡使用 ) 其值越低, 表明该基因的密码子使用偏好性越强 [18] 有效密码字数分析使用 CodonW ( 完成最优密码子分析采用高表达优越密码子分析方法 [19], 首先计算所有基因的 ENC 值, 并对这些值进行排序, 取该有序数据集的上下限区域各 10% 的序列数据, 形成 2 个新的数据子集比较 2 个数据子集中密码子的 RSCU 值, 如果差异大于 0.3, 且该密码子的 RSCU 值在高表达基因样本中大于 1, 在低表达基因样本中小于 1, 则将该密码子定义为最优密码子结果 1 基于基因组和转录组的灵芝基因密码子偏好性分析通过编写 Perl 语言程序进行数据筛选, 共获得赤芝基因组 CDS 9702 条, 液体培养菌丝转录组 CDS 3176 条, 原基转录组 CDS 3108 条, 子实体转录组 CDS 3370 条利用 Codon W 分别计算赤芝基因组及菌丝原基子实体转录组的密码子第三位碱基组成 (G3 A3 T3 C3) 及 RSCU 值等密码子偏好性分析参数, 并确定其最优密码子, 结果如下 : 1.1 灵芝基因密码子的 GC 含量分析基因组数据分析结果显示, 所有 CDS 的总 GC 含量为 59.5%, 而菌丝原基子实体转录组的总 GC 含量分别为 58.6% 58.4% 和 58.7%, 不同来源数据的分析结果基本一致基因组 CDS 的第三位密码子平均 GC 含量为 70.6%, 显著高于总 GC 含量, 且第三位密码子的碱基组成分析表明,G 和 C 的使用频率 ( 分别为 38.87% 和 47.89%) 显著高于 A 和 T 的使用频率 ( 分别为 15.59% 和 19.71%) 这说明赤芝较偏爱使用以 G 和 C 结尾的密码子, 对以 A 和 T 结尾的密码子使用较少 ( 表 1) 基于菌丝原基子实体的转录组数据分析结果与基因组数据分析结果一致, 密码子第三位碱基组成中 GC 明显占优势 ( 分别是 71.3% 70.7% 70.9%) Table 1 GC content analysis of G. lucidum genome and transcriptome

5 T3 C3 A3 G3 GC3 GC Genome Mycelium Primordium Fruiting body 灵芝基因有效密码子数分析基因组数据中各基因的 ENC 值取值范围为 [20] [18] 24.75~61,Jiang 等和 Wright 等将 ENC 取值 35 作为偏好性强弱的区分标准基因组数据分析结果中取值范围从 24.75~35 的 CDS 有 632 条, 占所有 CDS 的 6.51%; 取值范围从的 CDS 有 9070 条, 占所有 CDS 的 93.49%, 其中取值为 61( 密码子使用绝对平均 ) 的 CDS 有 127 条, 占所有 CDS 的 1.31% 这说明赤芝所有蛋白编码基因的密码子使用偏好程度差别较大, 既存在使用偏好性非常强的基因, 也存在使用偏好性绝对平均的基因, 但整体来说, 大多数蛋白编码基因的密码子使用偏好性较弱 1.3 基于基因组和转录组数据的灵芝最优密码子比较分析通过分析来源于基因组及菌丝原基和子实体转录组数据, 发现 RSCU > 1 的密码子多以 G 或 C 结尾 ( 表 2) 根据高表达优越密码子分析方法, 分别计算基因组样本及各转录组样本的最优密码子, 结果完全一致 ( 表 2), 最终确定 18 个氨基酸 ( 未包含蛋氨酸和色氨酸, 因其只有 1 个密码子, 不存在密码子使用偏好性 ) 在赤芝中的最优密码子, 共 22 个 :UUC CUC AUC GUC GAG UGC CCC CCG ACC ACG GCG UAC CAC CAG AAC AAG GAC UCC UCG AGC CGC GGC 其中, 脯氨酸和苏氨酸拥有两个最优密码子, 分别为 CCC CCG 和 ACC ACG; 丝氨酸 Ser 拥有 3 个最优密码子 UCC UCG 和 AGC 最优密码子在赤芝中具有较高的使用频率, 转录组数据和基因组数据的分析结果在密码子碱基组成和最优密码子计算结果上表现出的高度一致性, 表明在缺乏基因组数据的情况下, 利用转录组数据分析物种的密码子使用偏好性是可行的 Table 2 RSCU value and optimal codons based on genome and transcriptome data of G. lucidum

6 Amino acid Codon Genome Mycelium Primordiu m Fruiting body Amino acid Codon Genome Mycelium Primordi um Fruitin body Phe UUU Tyr UAU UUC 1.59* 1.65* 1.63* 1.65* UAC 1.45* 1.51* 1.49* 1.50* Leu UUA His CAU /67 UUG CAC 1.33* 1.34* 1.33* 1.33* CUU Gln CAA CUC 2.55* 2.55* 2.48* 2.57* CAG 1.37* 1.39* 1.38* 1.38* CUA Asn AAU CUG AAC 1.51* 1.55* 1.54* 1.56* Val GUU Lys AAA GUC 1.90* 2.08* 1.93* 1.96* AAG 1.58* 1.64* 1.62* 1.62* GUA Asp GAU GUG GAC 1.40* 1.41* 1.39* 1.39* Glu GAA Ser UCU GAG 1.44* 1.48* 1.45* 1.45* UCC 1.53* 1.50* 1.47* 1.51* Pro CCU UCA CCC 1.31* 1.31* 1.29* 1.35* UCG 1.50* 1.59* 1.54* 1.52* CCA AGU CCG 1.18* 1.17* 1.17* 1.13* AGC 1.14* 1.18* 1.18* 1.17* Thr ACU Arg CGU ACC 1.37* 1.43* 1.39* 1.42* CGC 2.13* 2.06* 2.00* 2.06* ACA CGA ACG 1.42* 1.41* 1.41* 1.39* CGG Ala GCU AGA GCC AGG GCA Ile AUU GCG 1.50* 1.46* 1.47* 1.45* AUC 2.01* 2.08* 2.03* 2.06* Gly GGU AUA

7 GGC 1.69* 1.72* 1.71* 1.73* Cys UGU GGA UGC 1.40* 1.40* 1.40* 1.40* GGG : Optimal codons 2 萜类合酶基因在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达预测根据 Codon Usage Database 数据, 大肠杆菌中最稀有的 8 个密码子分别为 : AGG AGA AUA CUA CGA CGG CCC UCG, 其中仅大肠杆菌稀有密码子 CCC 为赤芝中的最优密码子如果赤芝基因中含有较多的 CCC 密码子, 可能会造成该基因在大肠杆菌中表达困难大肠杆菌基因组总 GC 含量为 52.35%, 稍低于赤芝基因组总 GC 含量 59.5%; 密码子第三位碱基 GC 含量为 55.62%, 显著低于赤芝基因组的 70.6%, 显示大肠杆菌并不像赤芝一样偏好使用以 GC 结尾的密码子酿酒酵母中最稀有的 8 个密码子分别为 :AGG CGA CGG CGC CCG CUC GCG ACG 其中, 有 5 个稀有密码子 (CGC CCG CUC GCG ACG) 在赤芝中作为最优密码子被使用酿酒酵母基因组总 GC 含量为 39.77%, 显著低于赤芝基因组总 GC 含量 59.5%; 密码子第三位碱基 GC 含量为 38.10%, 显著低于赤芝基因组的 70.6% 因此, 与大肠杆菌相比, 酵母的密码子使用偏好性与赤芝的差别更大如果一个赤芝基因含有大量的酿酒酵母稀有密码子, 其在酿酒酵母中的表达可能会受到较大影响为了更直观的预测赤芝基因在大肠杆菌及酿酒酵母中的表达情况, 我们挑选了 26 个萜类合酶 (terpene synthase, TS) 编码基因, 分别计算其基因序列中大肠杆菌和酿酒酵母稀有密码子所占比例结果如图 1 所示, 酿酒酵母稀有密码子在 TS 基因中所占比例明显高于大肠杆菌稀有密码子, 最高时接近 25%, 这表明 TS 基因在酿酒酵母中的表达可能会受到较大的限制

8 .25 E. coli S. cerevisiae.20 Proportion of rare codons Terpene synthase genes of Ganoderma lucidum Figure 1 The rare codon proportion of Ganoderma lucidum TS gene in E. coli and Saccharomyces cerevisiae. 1: GL28150-R1; 2: GL20791-R1; 3: GL30649-R1; 4: R1; 5: GL26009-R1; 6: GL20244-R1; 7: GL20792-R1; 8: GL27623-R1; 9: GL18758-R1; 10: GL22353-R1; 11: GL24248-R1; 12: GL22395-R2; 13: GL22395-R1; 14: GL20423-R1; 15: GL23883-R1; 16: GL23663-R1; 17: GL23663-R2; 18: GL24515-R1; 19: GL27625-R1; 20: GL19741-R1; 21: GL23369-R1; 22: GL20733-R1; 23: GL31554-R1; 24: GL16845-R1; 25: GL25909-R1; 26: 讨论 GL23797-R1 了解物种的密码子使用偏好性对于预测并指导相关基因在异源生物中的表达有着十分重要的意义, 然而由于绝大多数高等生物缺乏关键的基因组数据支撑, 使得我们无法通过分析基因组数据获得相应物种的密码子使用偏好特性赤芝为担子菌纲 (Basidiomycetes), 多孔菌目 (Polyporales), 灵芝属 (Ganoderma) 药用真菌, 在我国被称为仙草, 已有 2000 多年的应用历史 [21,22] 2012 年陈士 [16] 林等人发布了赤芝全基因组序列, 为赤芝功能基因组学研究奠定了基础 2003 [23] 年张乐等首次比较了大豆基因组和转录组的核基因密码子使用偏好性, 发现转录组基因的同义密码子第三位鸟嘌呤频率 G3 和芳香族氨基酸含量这两个参数

9 的变化范围大于基因组基因, 其余各参数变化范围都位于大豆基因组高置信蛋白编码区密码子使用参数的取值范围内, 不同组织转录组数据分析结果有轻微变动, 可能与其转录组数据量较少有关本研究分别通过基于赤芝基因组及大规模转录组数据的密码子使用偏好性分析, 证明以大规模转录组数据为基础分析物种密码子使用偏好的可行性, 将会极大地拓展可进行密码子使用偏好特性分析的物种范围, 进而推进相关物种的生物进化及其基因异源表达研究我国药用物种多达 1 万种以上 [24], 蕴藏着丰富的药用基因资源近年来通过解析天然药物的生物合成途径, 并利用合成生物学技术异源合成天然产物已成为国内外研究热点 [25] 2013 年, 美国 Amyris 公司通过在酿酒酵母中重构部分青蒿素合成途径合成青蒿素前体 - 青蒿酸, 产量达到 25g/L, 然后通过化学方法成功将青蒿酸转化为青蒿素, 实现了合成生物学技术生产青蒿素的产业化, 为天然产物合成生物学应用提供了成功的范例 [26] 外源基因和底盘系统密码子使用偏好的匹配性是影响外源基因表达的重要因素之一萜类化合物是种类最多的一类天然产物, 目前已分离鉴定的萜类化合物达到 5.5 万种, 目前一些重要的临床药物, 如青蒿素和抗癌药物紫杉醇都属于萜类物质, 因此萜类化合物是新药研发的重要源泉以赤芝编码的 26 个 TS 基因为例, 预测了其在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达情况, 大肠杆菌 8 个稀有密码子中仅一个为灵芝的最优使用密码子, 而酵母的 8 个稀有密码子中有 5 个为灵芝的最优密码子, 提示灵芝与酵母的密码子使用偏好特性差异更大, 有可能影响灵芝 TS 基因在酵母中表达能力随着长片段 DNA 化学合成技术的进步, 参照酵母的最优密码子, 利用化学方法全合成相应的基因将是解决外源基因与底盘系统密码子不匹配问题的有效手段 References [1] Duret L, Mouchiroud D. Expression pattern and, surprisingly, gene length shape codon usage in Caenorhabditis, Drosophila and Arabidopsis [J] Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: [2] Carlini DB, Chen Y, Stephan W. The relationship between third-codon position nucleotide content, codon bias, mrna secondary structure and gene expression in the drosophild alcohol dehydrogenase genes Adh and Adhr [J]. Genetics, 2001, 159:

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doc 1340 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2014, 49 (9): 1340 1345 基于全基因组和转录组分析的赤芝密码子使用偏好性比较研究朱孝轩 1, 朱英杰 1, 宋经元 1, 孙超 1*, 陈士林 1, 2 (1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193; 2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700) 摘要 : 密码子使用偏好性是物种在遗传信息传递过程中的一个重要特点,