长沙市70株沙门菌的血清型分布、耐药特征及PFGE分型研究

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1 长沙市沙门菌表型特征及 PFGE 分子分型研究 杨柳青 1 欧新华 1 贾华云 2 苏良 1 刘晓蕾 1 王岚 2 1. 长沙市疾病预防控制中心 ( 湖南长沙 );2. 湖南省疾病预防控制中心 ( 湖南长沙 ) 摘要 : 目的研究长沙市沙门菌的血清型分布 耐药特点及分子流行病学特征 方法对分离自长沙地区食源性疾病粪便标本及市售食品中的 70 株沙门菌, 用玻片凝集试验确定血清型, 微量肉汤稀释法检测 14 种抗生素的敏感性, 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 进行分子分型 结果鼠伤寒沙门菌为优势血清型, 占 51.43%, 其次是肠炎沙门菌, 占 7.15% 在抗生素敏感性测试中, 对氨苄青霉素 磺胺嘧啶和氯霉素的耐药率较高, 分别为 68.57% 61.43% 和 57.14% 62.86%(44/70) 的沙门菌呈多重耐药, 且鼠伤寒沙门菌的多重耐药率比其他血清型高 (χ 2 =7.068,P 0.01), 差别有统计学意义 PFGE 分型结果显示 69 株沙门菌按照 100% 的相似度可分为 57 个 PFGE 型,36 株鼠伤寒沙门菌可分为 4 个聚类, 相似度在 58.1%~100% 之间 结论本市的沙门菌以鼠伤寒和肠炎沙门菌为主,PFGE 分型结果显示可能存在沙门菌的流行株, 且菌株耐药形势严峻 关键词 : 沙门菌 ; 血清学 ; 药物敏感性 ; 脉冲场凝胶电泳 Title Author affil Abstract:Objective To study the stereotyping,drug resistance and the molecular epidemiological characteristics of Salmonella in Changsha. Methods 70 Salmonella strains that isolated from stool specimens of foodborne disease and foods in Changsha were identified by stereotyping. The antimicrobial susceptibilities were determined by broth microdilution method and 14 antimicrobial agents were chosen and examined. Homology analysis was performed with PFGE according to the protocols of PulseNet.Results The dominant Salmonella serovars were Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis, accounting for 51.43% and 7.15% respectively. In the antimicrobial susceptibilities testing, the highest resistant rates were found in Ampicillin (68.57%), Sulfadiazine (61.43%) and chloramphenicol (57.14%) % salmonella strains were multi-drug resistant isolates. And a significant difference was observed for multidrug resistance between Salmonella typhimurium and other Salmonella serovars. All the isolates were divided into 57 PFGE type according to similarity 100%. The similarity coefficient of 36 isolates of Salmonella typhimurium 基金 : 湖南省卫生厅科研项目 (B ) 作者简介 : 杨柳青, 女, 本科学历, 主管技师, 主要从事食源性致病菌及病原微生物研究 邮箱 : @qq.com 通讯作者 : 王岚邮箱 : @qq.com

2 that divided into four Clusters were between 58.1% and 100%. Conclusion Our findings indicated that Salmonella typhimurium and Salmonella enteritidis were the dominant Salmonella serovars. And PFGE result showed that there were epidemic strains in Changsha. Additionally, antibiotic resistance of Salmonella was in serious situation. Key words:salmonella; Serology; Drug resistance; PFGE 在国家卫计委关于 2013 年全国食物中毒事件情况的通报中, 微生物性食物中毒事件中毒人数最多, 占食物中毒事件总中毒人数的 60.4%, 主要是由沙门菌 副溶血性弧菌等引起的细菌性食物中毒 沙门菌广泛存在于自然界, 可以引起的症状有伤寒 副伤寒性 胃肠炎 败血症和局部感染等 为了掌握长沙市沙门菌的流行和耐药情况, 我们对 年从食品和食源性疾病病例中分离的 70 株沙门菌进行了血清型研究和药敏试验, 并用 PFGE 分型方法对流行菌株进行分子分型以揭示菌株之间的同源性 为控制沙门菌污染, 指导临床合理使用抗生素和防控食源性疾病提供技术依据 1 材料与方法 1.1 菌株来源 年本实验室分离的沙门菌共 70 株, 其中 55 株分离自长沙地区食源性疾病病例的粪便标本中 15 株分离于市售食品中 ( 主要来源生禽肉 生畜肉和水产品 ) 所有菌株均使用 API 20E 进行生化鉴定 药敏试验用质控菌株大肠埃希氏菌 ATCC25922,PFGE 相对分子量标准用布伦登卢普沙门菌 H9812, 均由国家食品安全风险评估中心提供 1.2 培养基和试剂 BPW BGB TTB SC 增菌液 BS XLD 营养琼脂 BHA 培养基购自广东环凯微生物科技有限公司 ;API 20E 生化试剂盒购自法国生物梅里埃 ; 沙门菌诊断血清购自泰国 S&A 公司 ; 微量细菌定量 (MIC) 药敏试剂盒购自天津金章科技发展有限公司 ;SeaKemGold 琼脂糖,10 TBE 缓冲液购自美国 Bio- Rad 公司 ;SDS 蛋白酶 K 购自美国 Sigma 公司 ; 限制性内切酶 XbaI 购自大连宝生物 ; 上述实验材料均在有效期内使用 1.3 方法 沙门菌的检测按照 GB 食品微生物学检验沙门氏菌检验 进行沙门菌分离与鉴定 血清型测定沙门菌的血清分型方法按照泰国 S&A 公司提供的沙门菌血清诊断操作步骤

3 进行, 根据 Kauffmann-White 表确定沙门菌的血清型 药敏试验药敏试验采用 CLSI 推荐的微量肉汤稀释法, 参照 CLSI 微生物药物敏感性试验执行标准进行结果判定, 判断结果分为敏感 中介和耐药 3 种 PFGE 分型参照美国 PulseNet PFGE 标准化分型方法进行 沙门菌经琼脂糖固定 裂解 洗涤后, 包埋的 DNA 在 37 水浴中使用 40U 的 XbaI 酶切至少 2h 得到的 DNA 片段使用 Chef Mapper 脉冲场凝胶电泳分型, 电泳缓冲液为 0.5 TBE, 电泳时间为 18.5 h, 电泳温度为 14, 脉冲时间为 2.16~63.8 s 凝胶使用 GelRed 染色后成像,PFGE 成像结果使用 BioNumerics 6.6 软件采用 UPGMA 方法进行聚类分析, PFGE 带型之间的相似度采用 Dice 系数来衡量, 确定沙门菌的基因型和同源关系 2 结果 2.1 血清学分型 70 株沙门菌分为 22 个血清型 其中鼠伤寒沙门菌 36 株, 占 51.43% 肠炎沙门菌 5 株, 占 7.15% 斯坦利沙门菌 4 株, 占 5.72% 阿贡纳沙门菌 德尔比沙门菌 汤卜逊沙门菌 山夫登堡沙门菌 新加坡沙门菌各 2 株, 未定型 1 株, 其余 14 个血清型各 1 株, 见表 1 表 1 70 株沙门菌血清型分布 血清型菌株数构成比 (%) 血清型菌株数构成比 (%) 鼠伤寒沙门菌 自贡沙门菌 肠炎沙门菌 赫尔沙门菌 斯坦利沙门菌 阿富拉沙门菌 阿贡纳沙门菌 瓦伊勒沙门菌 德尔比沙门菌 病牛沙门菌 汤卜逊沙门菌 利文斯通沙门菌 山夫登堡沙门菌 印第安纳沙门菌 新加坡沙门菌 加里玛沙门菌 阿拉莫沙门菌 盖勒特匹沙门菌 猪伤寒沙门菌 纽波特沙门菌 舒卜拉沙门菌 未定型

4 罗森沙门菌 合计 药敏结果分析 70 株沙门菌对阿米卡星 头孢噻肟和萘啶酸最敏感, 敏感率达 90% 以上 ; 对氨苄青霉素 磺胺嘧啶和氯霉素的耐药性高, 耐药率分别为 68.57% 61.43% 及 57.14% 对比 37 株鼠伤寒沙门菌和其他血清型 33 株沙门菌, 鼠伤寒沙门菌和其他型沙门菌对氨苄青霉素 磺胺嘧啶和氯霉素的耐药百分率分别为 91.67/ /47.06 和 88.89/23.53, 鼠伤寒沙门菌对上述三种药物的耐药率更高,χ 2 值分别为 及 30.5,P 值均 0.05, 差别有统计学意义 ( 见表 2 图 1) 表 2 长沙市 70 株沙门菌对 14 种抗生素的耐药性 (%) 抗生素 敏感中介耐药 百分率 (%) 百分率 (%) 百分率 (%) 阿米卡星 (AMK) 头孢噻肟 (CTX) 萘啶酸 (NAL) 头孢吡肟 (FEP) 卡拉霉素 (KAN) 头孢曲松 (CRO) 甲氧苄啶 / 磺胺甲恶唑 (SXT) 阿莫西林 - 克拉维酸 (AMC) 环丙沙星 (CIP) 庆大霉素 (GEN) 四环素 (TET) 氯霉素 (CHL) 磺胺嘧啶 (SDI) 氨苄青霉素 (AMP)

5 多重耐药结果显示,78.57%(55/70) 的沙门菌至少对 14 种抗生素中的一种以上抗生素耐药,62.86%(44/70) 的沙门菌对 3 类以上的抗生素耐药 其中耐 5 种抗生素的最多, 多达 15 株, 有 1 株舒卜拉沙门菌对 14 种抗生素全部耐药 对比鼠伤寒沙门菌和其他血清型沙门菌的多重耐药, 结果表明耐 3 类以上抗生素的鼠伤寒沙门菌为 77.78%(28/36), 其他血清型为 47.06%(16/34), 鼠伤寒沙门菌的多重耐药率比其他血清型高 (χ 2 =7.068,P 0.01), 差别有统计学意义 ( 见图 1.2) 3.PFGE 分型结果除一株沙门菌 DNA 降解未获得图谱外, 其他 69 株沙门菌按照 100% 的相似度可分为 57 个 PFGE 型, 分别命名为 P1-P57 其中优势型 P28 共 5 株, P20 P56 型各 3 株,P17 P24 P26 P54 型各 2 株, 其余 51 个型相对独立 ( 见图 2.)36 株鼠伤寒沙门菌的相似度在 58.1%~100% 之间 根据带型相似度 85% 归为同一克隆系的原则 ( 聚集 ) [1],36 株鼠伤寒沙门菌可分为 4 组大的克隆系, 其中克隆系 Ⅰ12 株, 克隆系 Ⅱ 5 株, 克隆系 Ⅲ 8 株, 克隆系 Ⅳ 2 株 克隆系 Ⅰ 和克隆系 Ⅲ 中既有病人株也有食品株 ( 见图 3.)

6 图 2 长沙市 70 株沙门菌 PFGE 及抗生素耐药图谱

7 图 3 长沙市 37 株鼠伤寒沙门菌 PFGE 聚类图谱 3. 讨论血清学分型是沙门菌的传统分型方法, 到目前为止已鉴定有 2500 多种, 血清型的正确鉴定对确定沙门菌病的感染源及控制减少发病率具有重要意义 [2] 长沙地区 年分离的沙门菌优势血清型为鼠伤寒沙门菌, 其次为肠炎沙门菌, 该结果与广州市 [3] 深圳市[4] 甘肃省[5] 等从腹泻病人分离到的沙门菌型别基本一致, 与湖南省 [6] 江西省[7] 等从食品中分离到的沙门菌型别有一定的差异 可能和本次的试验菌株来源以腹泻病人分离株占多数 (78.57%) 有关, 也

8 说明不同来源的沙门菌的血清型有一定的差异 在临床治疗和畜牧业养殖过程中, 由于抗生素的广泛使用和滥用导致很多病原菌 ( 包括沙门菌 ) 出现了多重耐药现象, 且全球范围内沙门菌分离株的耐药性在逐渐增强 [8] 药敏实验结果表明本市的沙门菌耐药情况比较严重,14 种抗生素没有一种对实验菌株 100% 的敏感, 有 1 株舒卜拉沙门菌对 14 种抗生素全部耐药 氟喹诺酮类和第三代头孢类药物是目前临床治疗沙门菌感染的一线药物 [9-10], 本次实验菌株对第三代头孢类药物头孢噻肟比较敏感 (95.72%), 但对头孢曲松的耐药率达到了 17.14%, 对氟喹诺酮类药物环丙沙星的耐药率高达 27.14%, 需引起高度重视 多重耐药结果显示,70 株沙门菌中对 3 种及以上抗生素的耐药率为 62.86% 而且研究结果显示鼠伤寒沙门菌较其他血清型更易对抗生素耐药, 这与 Meakins [ 11] 的研究结果一致, 鼠伤寒沙门菌对临床首选药物头孢曲松和环丙沙星的耐药率分别为 25.00% 和 41.67%, 耐 3 类以上抗生素的鼠伤寒沙门菌占 77.78% (28/36), 鼠伤寒沙门菌的多重耐药率比其他型沙门菌高, 应关注鼠伤寒沙门菌的高耐药性 PFGE 型与血清型分析结果表明, 同一血清型可分为相同或不同的 PFGE 型别, 如 37 株鼠伤寒可分为 27 个 PFGE 型, 其中 5 株鼠伤寒沙门菌为同一 PFGE 型 (P28), 且均分离自病例标本, 提示本市沙门菌可能存在着流行株 另有 12 株鼠伤寒沙门菌的相似度在 85% 左右 ( 聚类 1), 菌株既有病人株也有食品株, 提示人感染这一带型沙门菌的来源可能是食品, 有待结合流行病学资料做进一步的研究 PFGE 型和药敏结果结合分析表明, 具有相同的 PFGE 型的菌株可以有不同的耐药表型 ( 如 P17 P20 型和 P28 型等 ), 而不同 PFGE 型的菌株也可拥有完全相同的耐药表型 ( 如 P23 型和 35 型 ) 未发现耐药谱与 PFGE 型之间有直接的关联 本研究揭示了长沙市近年来分离的沙门菌的血清型 耐药谱及 PFGE 型别分布特征, 为指导临床和畜牧业中抗生素的合理使用提供了依据, 建立了长沙市食源性沙门菌分子分型数据库, 本数据库在今后将用于食源性沙门菌病暴发调查和诊断溯源, 对提高长沙市食源性沙门菌病应急处置能力提供技术支撑 参考文献 : [1] Fakhr MK, Nolan LK, logue CM. Multilocus sequence typing lacks the discriminatory ability of pulsed-field gel electrophoresis for typing Salmonella enteric serovar Typhimurium[J]. J Clin Microbiol, 2005,43(5): [2] 朱超, 许学斌. 沙门菌属血清型诊断 [ M]. 上海 : 同济大学出版社, 2009,

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