High Confidence, Non-Targeted Screening for Drugs of Abuse in Urine

Size: px

Start display at page:

Download "High Confidence, Non-Targeted Screening for Drugs of Abuse in Urine"

紊税彭
5 years ago
Views:

尿液中滥用药物的高置信度非目标筛查 Dominic Roberts, 1 Andrea Steuer, 2 Michael Poetzsch, 2 Thomas Kraemer 2 and Paul Silcock 1 1 Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK 2 Department of Forensic Pharmacology and

1 尿液中滥用药物的高置信度非目标筛查 Dominic Roberts, 1 Andrea Steuer, 2 Michael Poetzsch, 2 Thomas Kraemer 2 and Paul Silcock 1 1 Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK 2 Department of Forensic Pharmacology and Toxicology, Zurich Institute of Forensic Medicine, University of Zurich, Zurich, Switzerland AN 10495_C_GCMSMS_1_201608Y 关键词药物滥用 ;GC-MS; 尿液 ; 筛查 ; 高分辨 ;Q Exactive GC;Orbitrap 质谱仪 ; 精确质量数简介药物滥用的特点是对某个药物的使用不按照说明书指导使用, 这通常源自具有严重问题的自我管理或者情绪低落几乎所有服用后让人感觉兴奋的药物都可能被滥用药物滥用 (DoA) 的药物包括镇静剂 ( 鸦片类巴比妥类苯二氮卓类酒精类 ) 兴奋剂( 安非他明可卡因 ) 迷幻剂(LSD 莫斯卡林苯环己哌啶 ) 和大麻类 ( 大麻 ) DoA 测试的目的有很多, 犯罪或者其他法医调查高风险的职业功能临床毒物学戒毒过程等都需要进行 DoA 测试对于这类测试, 尿液是广泛使用的样品, 因为尿液样品具有非侵入式可靠经 1 济使用广泛且具有严格规范等特点, 局限性是只能反映当前或者近期物质使用情况, 放置 2 3 天后可能导致结果呈阴性但是也有一些化合物及其代谢物可以存在较长时间, 例如,THC-COOH 和苯二氮卓类 1 为了尽可能延长有效检测时间, 高灵敏度的分析技术非常关键 DoA 的实验室测试是一项极具挑战性的任务主要因为样品包括各种化学背景, 而需要筛查的化合物和代谢物数量众多另外, 这类化合物水平可能很高也可能很低, 这取决于样品暴露情况 GC-MS 技术非常适合 DoA 筛查和确证, 因为它提供出色的色谱分辨率, 峰数量以及范围很广的谱库, 有利于化合在这篇应用文献中, 通过筛查尿液中的 DoA 评估 Thermo Scientific TM Q Exactive TM GC Orbitrap TM GC-MS/MS 系统性能是否符合药物滥用监控要求这篇文章的目的是演示采用 Thermo Scientific. Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统检测和识别 DoA 的非目标物定性工作流程本文章采用全扫描模式, 非目标采集和高分辨率状态分析真实尿液样品, 获得精确质量数结果, 支持谱库检索对于扫描速度及扫描间动态范围和高灵敏度的评估, 分别为低含量和高含量组分检测展开另外, 也对用于自动解卷积和识别的独特的软件算法进行评估, 评估其是否适合日常筛查物识别 2,3 但是, 更高的灵敏度和特异性会提高阳性结果的可靠性, 并提高系统耐用性, 尤其是在高通量实验室环境下的测试另一个挑战是采用 GC-MS 生成的信息丰富的电子轰击质谱图进行定性分析时, 尤其是当基质和背景离子在分析峰上发生重叠时

2 实验条件样品前处理 Zurich 大学的 Zurich Institute of Forensic Medicine 提供来自真实案例调查的六个尿液样品 (A F) 样品前处理过程如下: 在 0.5 ml 尿液中加入 100 µl 0.5 M 的乙酸盐缓冲液, 使其 PH 值调整为 5.2 加入 50 µl 葡萄糖醛酸酶 / 芳基硫酸酯酶结合物后, 在 60 下执行剪切 3 h 加入 200 µl 氨缓冲液, 采用 1 ml 乙酸乙酯 / 异丙醇 / 二氯甲烷混合物 (3:1:1,v/v/v) 进行液液萃取取 800 µl 有机层蒸干, 然后在 60 下加入 100 µl 乙酸酐 - 吡啶混合物 (3:2,v/v) 进行乙酰化一小时对乙酰化的混合物进行蒸发, 再将其重新溶解在 100 µl 乙酸乙酯中, 然后直接用于 GC-MS 分析仪器和方法设置所有实验均使用 Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap GC- MS/MS 系统使用 Thermo Scientific TM TriPlus TM RSH 自动进样器执行进样使用 Thermo Scientific TM TRACE TM 1310 GC 和 Thermo Scientific TM TraceGOLD TM TG-1MS 30 m 0.25 mm I.D µm (P/N ) 毛细管柱进行色谱分数据处理使用 Thermo Scientific TM TraceFinder TM 软件采集数据此软件集成了仪器控制方法开发及定性和定量工作流程 TraceFinder 软件还包括质谱图解卷积和峰匹配功能药物毒物农残污染物及其代谢物的 Maurer/Pfleger/Weber 2011 谱库用于质谱图匹配 4 使用精确质量数和高分辨过滤分值 (HRF) 进一步过滤谱库检索结果, 智能完成化合物识别结果和讨论本研究的目的是采用非目标全扫描模式分析乙酰化尿液样品, 从而使用谱库检索样品中可能存在的化合物图 1 总结了完整的工作流程在高灵敏度和质谱图宽动态范围下, 采集全扫描数据, 从而可以筛查海量化合物这实现了数据回顾性分析以及在初次调查时没有筛查到的其他化合物检索这样一个宽范围筛查完全取决于质谱图库中化合物数量的多少和质谱图的质量在这样的情况下, 所使用的谱库包括 8670 个药物药物代谢物污染物以及其他生物分子的质谱图, 用于快速可靠检索化合物的数据文件, 生成候选化合物列表随后, 高分辨数据用于根据精确质量数智能过滤结果列表离仪器参数的其他细节显示在表 1 和 2 中表 1. GC 和进样口条件 TRACE 1310 GC 参数进样体积 (µl): 1 衬管 : 分流衬管入口 ( ): 250 载气 (ml/min): He, 1.2 分流比 : 20:1 柱温箱程序温度 1( ): 50 保持时间 (min): 1 温度 2( ): 325 速率 ( /min): 10 保持时间 (min): 8.5 对每个数据文件进行解卷积, 从总离子流色谱图 (TIC) 中提取每个峰从尿液样品获得的全扫描数据由于具有高化学背景从而变得十分复杂, 可参见某一样品 ( 分流比 20:1)( 图 2) 的总离子色谱图 TraceFinder 软件的自动解卷积功能从 TIC 背景中提取了所有特征, 去除了干扰, 降低了复杂性每个峰干净谱图中的解卷积结果只包括同一保留时间下强度最大的离子然后在 Maurer/Pfleger/Weber 质谱库中检索干净质谱图, 完成迭代化合物识别每个峰的迭代识别结果列表打分是基于正匹配 (SI) 分数和高分辨过滤分值 (HRF) 的组合 HRF 值是取自最佳库匹配结果的化学分子式对应的质谱图百分比表 2. 质谱仪条件 Q Exactive 质谱仪参数传输线 ( ): 250 离子化类型 : EI 离子源 ( ): 250 电子能量 (ev): 70 采集模式 : 全扫描质量数范围 (Da): 50 到 600 分辨率 (m/z 200 下的 FWHM): 60,000 锁定质量数, 柱流失 (m/z):

检测分离检索确认图 1. Q Exactive GC 系统的筛查工作流程图 2. 尿液样品的 GC-MS 总离子流色谱图 ( 分流比 20:1) 质谱图中观测的精确质量数库匹配以及解析离子百分比的组合, 为样品中化合物识别提供了一个快速可靠的方法图 3 中显示了化合物检测和识别的例子, 其中检出了肉豆蔻这里的峰识别表显示了 16.

3 检测分离检索确认图 1. Q Exactive GC 系统的筛查工作流程图 2. 尿液样品的 GC-MS 总离子流色谱图 ( 分流比 20:1) 质谱图中观测的精确质量数库匹配以及解析离子百分比的组合, 为样品中化合物识别提供了一个快速可靠的方法图 3 中显示了化合物检测和识别的例子, 其中检出了肉豆蔻这里的峰识别表显示了 min 下该峰的三种可能匹配如果只使用 SI, 则可能有好几个可能的匹配化合物但是, 当我们包括了 HRF, 根据组合分数再对列表排序, 这时最高分数结果 ( 肉豆蔻 ) 为 74.3% 其他五个结果都小于 < 51%, 可以不予考虑再进一步观察离子的质量数精度, 基峰的 m/z , 精度为 0.6 ppm, 可进一步确认匹配的化合物小于 1 ppm 的质量数精度可以确保快速准确的化合物识别

4 Figure 3. Identification of myristicin using TraceFinder. Spectral deconvolution of the TIC and library search index and the HRF score together with additional criteria are used for intelligent compound identification. The list of matched compounds (upper) is sorted based on a combined search index and high resolution filtering (HRF) score. 应用高分辨进行可靠药物筛查在 Maurer/Pfleger/Weber 谱库中筛查六个样品, 结果总结在表 3 中从这些样品中提取的信噪比大于 100 的解卷积峰数目在 824 到 1574 之间每个样品中至少匹配一个化合物的峰总数为 169 到 263 这个匹配数目相当大, 但是在预料之中, 因为这个库条目超过了 8000 这些匹配化合物不仅包括 DoA, 还包括类似尿液的复杂样品中可能存在的污染物和生物分子对于临床和法医学筛查而言, 全面表征一个样品, 并理解典型化学谱图的定义方式是非常关键的, 只有这样才可以识别出异常的峰如果分析人员只对滥用药物的筛查有兴趣, 可以使用更对于这 5 个样品, 匹配化合物列表可用于检索更需要关注的药物, 这些信息总结在表 4 中根据 Maurer/Pfleger/Weber 谱库条目匹配和分子离子 ( 若存在 ) 以及其他碎片离子的精确质量数, 自动识别这些化合物除了质谱图中的精确质量数, 我们可以将分子离子簇的同位素分布与理论分布进行匹配例如, 图 4 中, 由于拉莫三嗪 2AC 的阳性结果, 可以判断出尿液样品 C 中存在抗惊厥药拉莫三嗪测量的分子离子簇与理论值匹配度非常高, 而且观测出每个同位素的准确质量数这个匹配结果显示了尿液样品中该化合物存在的强有力证据进一步的确证可以通过评估化学标准品的保留时间, 尽管很多代谢物小的包括这些化合物的谱库可以用于筛查但是,DoA 筛查的认证标准品并没有市售的商品在这样的情况下, 精确质量非常复杂, 对于获取某个样品的更完整化学性质非常有利, 由此才可以得出结论, 分析对象服用了哪些药物以及这些药物在数和同位素识别都是化合物识别的强大工具, 这种方法的最大好处就是显著缩减了评估时间人体内的存在时长表 3. 解卷积峰的总数以及与含 8670 个条目的谱库中化合物匹配的峰数目样品解卷积峰总数匹配峰数 Urine A Urine B Urine C Urine D Urine E

5 表 4. 六个尿液样品中迭代识别出化合物总结样品化合物基峰 (m/z) HRF (%) 基峰质量数精度 (ppm) 分子离子质量数精度 (ppm) Cocaine Urine A Methadone Morphine Paracetamol Urine B Tramadol Urine C Mirtazapine Lamotrigine Urine D Morphine Paracetamol Urine E Myristicin Urine F Butyrfentanyl 图 4. 拉莫三嗪 2AC 分子离子簇的测量值和理论值每个同位素的元素分子式质量数精度均 < 1 ppm

6 如上所述当筛查尿液中药物时目标化合物可能浓度很高或围内都能提供出色检测性能图 5 显示的例子中从 TIC 中提者很低为了使筛查效率更高并且避免假阴性结果无论分取了对乙酰氨基酚和高香草酸峰对乙酰氨基酚峰面积比高香析物浓度如何检测系统必须提供同样出色的检测性能实验草酸峰约高出三个数量级但是两种化合物的质量数精度都保证明 Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统在很宽的动态范持了 0.5 ppm 的高水准图 5. 无论化合物浓度如何质量数精度均小于 1 ppm 乙酰氨基酚 BP m/z 下的质量数精度为 0.5 ppm 峰面积比高香草酸 BP m/z 下的质量数精度为 0.5 ppm 峰面积高出 930 倍 Figure 6. Butyrfentanyl C23H30N2O EI and PCI spectra at minutes sample F. PCI data supports identification of parent with formula above with sub 1 ppm mass accuracy. EI Fragments annotated with structures from MassFrontier 7.0.

识别非预期化合物在样品 F 中, 数据解卷积后被识别的峰, 没有匹配库中任何化合物此峰的基峰离子 m/z 146.09643 一般在芬太尼型谱图中存在, 因此可以快速排除 alpha 和 beta 甲基芬太尼, 因为谱库中没有任何谱图匹配 EI 和 CI 数据 ( 图 6) 的精确质谱图用于识别 m/z 351.

03 ppm 这是非常关键的一步, 出色的质量数精度可用于减少可能的化学分子式的数量这个精度水平可以显著减少需要筛查的分子式数量, 同时提高结果置信度该化合物的建议分子式 C 23 H 31 N 2 O, 使用在线化学数据库 Chemspider TM 中检索该分子式, 发现它可能是一个芬太尼的类似物, 即 butyrfentanyl 这个芬太尼类似物在谱库中没有条目, 因此没有匹配结果

7 识别非预期化合物在样品 F 中, 数据解卷积后被识别的峰, 没有匹配库中任何化合物此峰的基峰离子 m/z 一般在芬太尼型谱图中存在, 因此可以快速排除 alpha 和 beta 甲基芬太尼, 因为谱库中没有任何谱图匹配 EI 和 CI 数据 ( 图 6) 的精确质谱图用于识别 m/z 的 [M+H] + 离子, 所建议分子式为 C 23 H 31 N 2 O, 质量数差值 0.03 ppm 这是非常关键的一步, 出色的质量数精度可用于减少可能的化学分子式的数量这个精度水平可以显著减少需要筛查的分子式数量, 同时提高结果置信度该化合物的建议分子式 C 23 H 31 N 2 O, 使用在线化学数据库 Chemspider TM 中检索该分子式, 发现它可能是一个芬太尼的类似物, 即 butyrfentanyl 这个芬太尼类似物在谱库中没有条目, 因此没有匹配结果最后, 采用 MassFrontier 7.0 对 butyrfentanyl 进行理论裂解, 再将裂解结果与 EI 和 CI 质谱图中小于 1 ppm 的质量数精度的测量碎片进行匹配, 确认了该识别结果该质谱图可以被加入自定义谱库中用于以后的样品筛查通过过滤这些峰 ( 包括碎片 m/z 和 ) 的解卷积峰列表, 快速识别了 16 个 butyrfentanyl 代谢物从 CI 质谱图中识别出最大的代谢峰 ( 保留时间 14.4 min), 从 [M+H] + 离子推导出的 CHON 元素组成, 质量数差值为 0.8 ppm 这可能是在所述的样品制备过程中, 发生了一个乙酰化的氧化反应 butyrfentanyl 的代谢物也可以被加入筛查的质谱图库中结论本研究结果表明,Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS 系统结合 TraceFinder 软件是一个强大的分析工具, 可用于滥用药物的日常筛查以及复杂尿液样品分析 Orbitrap 质谱仪为所有组分提供出色质量数精度, 无论化合物浓度高低, 提供快速准确的识别结果使用独特的自动峰检测质谱图解卷积以及化合物识别工作流程对六个尿液样品中的药物进行筛查在样品中检测出多个药物使用准确质量数信息, 根据质谱图库匹配和碎片归属, 识别出多个目标化合物这个方法显著缩短了评估时间, 并提供更加快速可靠的报告结果稳定的亚 1 ppm 质量数精度结合高灵敏度, 使得样品中的已知和未知化合物识别结果非常可靠使用准确的 EI/CI 数据, 可以推测样品 F 中存在 butyrfentanyl 无论复杂基质中样品浓度高低,60,000 FWHM 的日常分辨率以及很宽的质谱图动态范围, 实现复杂基质中的高选择性, 消除同位素干扰, 提高结果置信度参考文献 1. Hammett-Stabler CA, Pesce AJ, Cannon DJ. Urine drug screening in the medical setting. Clin Chim Act, 2002, 315, M.R. Meyer, F.T. Peters, H.H Maurer Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System for GC-MS Screening for Drugs, Poisons, and Metabolites in Urine, Clinical Chemistry, 2010, 56, (4), Maurer HH. Forensic screening with GC-MS. In: Bogusz M, ed. Handbook of analytical separation sciences: forensic science. 2nd ed. Amsterdam: Elsevier Science. 2007, p Hans H. Maurer, Karl Pfleger, Armin A. Weber. Mass Spectral Library of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and Their Metabolites Orbitrap 组学俱乐部赛默飞小分子质谱应用技术群赛默飞世尔科技 ( 中国 ) 有限公司全国服务热线 : ( 支持手机用户 ) AN 10495_C_GCMSMS_1_201608Y

GC 和进样口条件 TRACE 1310 GC 进样体积 (µl): 1.0 衬管 : SSL 单锥形 (P/N:453A2342) 进样口 ( ): 240 进样模块和模式 : 不分流进样载气 (ml/min): He,1.2 柱温箱温度

GC 和进样口条件 TRACE 1310 GC 进样体积 (µl): 1.0 衬管 : SSL 单锥形 (P/N:453A2342) 进样口 ( ): 240 进样模块和模式 : 不分流进样载气 (ml/min): He,1.2 柱温箱温度基于三重四极杆 TSQ 8000 Evo 平台的快速方法将婴儿食品中的农药残留的分析效率提高三倍应用文献 10432 Cristian Cojocariu, 1 Michael T. Hetmanski, 2 Paul Silcock, 1 and Richard J. Fussell 2 1 赛默飞世尔科技, 英